Krooninen sairaus

tiivistelmä

Plakoglobin (PG) on Armadillo proteiini, joka assosioituu sekä klassisia ja desmosomien kadheriinit, mutta on pääasiassa keskittynyt kypsä desmosomeihin epiteeli. Vaikka alhaisempia PG on raportoitu paikallista ja hormoneille resistentti eturauhasen kasvaimia, toiminnallinen Näiden muutosten merkitystä ei tunneta. Kirjoittajat raportoivat, että PG ilmentymistä vähennetään näytteitä eturauhasen kasvain kudoksen array ja korreloi käänteisesti etenee kasvain potentiaalia 7 PCa solulinjoissa. Ektooppisesti ilmaisi PG parannettu solujen välistä tartuntalujuus, ja vaimennetaan motiliteettia ja hyökkäys aggressiivinen solulinjojen, kun taas hiljentäminen PG vähemmän kasvaimia synnyttäviä soluissa oli päinvastainen vaikutus. PG säädellään myös solu-alustaan ​​tarttumista ja liikkuvuus kautta soluväliaineen (ECM): sta riippuvainen inhibitio Src, mikä viittaa siihen, että PG: n vaikutukset eivät johdu pelkästään lisääntynyt välistä adheesiota. PG hiljentäminen johti kohonneet ECM-proteiinin vitronektiini (VN), ja altistetaan PG-ilmentävien solujen VN indusoitu Src-vaikutuksen. Lisäksi lisääntynyt VN tasot ja Src aktivointi korreloi vähentynyt ilmentyminen PG potilaan kudoksissa. Niinpä PG voi estää Src pitämällä VN alhainen. Tuloksemme viittaavat siihen, että menetys välistä adheesiota alentuneen PG ilmaisu saattaa pahentaa aktivointi Src kautta PG-riippuvaisen mekanismin. Lisäksi PG alassäätöä aikana PCa eteneminen voisi edistää tunnetun VN-riippuvainen edistäminen Eturauhassyövän eteneminen ja metastaasit, jotka osoittavat uutta toiminnallista vuorovaikutusta desmosomien solu-soluadheesion ja solun alustan tarttumisen signalointi akseleita eturauhassyöpää.

Citation: Franzen CA, Todorović V, Desai BV, Mirzoeva S, Yang XJ, Green KJ, et al. (2012) desmosomiproteiinin Armadillo Protein Plakoglobin säätelee Eturauhassyöpä Cell Adhesion ja Liikkuvuus kautta Vitronektiini riippuva Src Signaling. PLoS ONE 7 (7): e42132. doi: 10,1371 /journal.pone.0042132

Editor: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 21. 2012 Hyväksytty: 3. heinäkuuta 2012 Julkaistu: 30 heinäkuu 2012

Copyright: © Franzen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Cancer Institute (NCI) Prostate SPORE avustus P50 CA90386, Zell Foundation, tukea Rosenberg Seed Grant (ja JCP), R01s CA122151, AR041836 ja JL Mayberry lahjoitusvarat (ja KJG), National Institutes of Health (NIH) koulutus avustukset T32 CA070085 (ja CAF ja VT) ja F32 AR055444 (VT) ja American Cancer Society (ACS) postdoctoral apurahan PF-10-235-01-CSM (CAF). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä (PCA) on toiseksi suurin syy syövän kuolleisuus Yhdysvalloissa [1], mikä johtuu pääasiassa metastaattisen muodossa tauti [2]. Alkuvaiheessa tuumorisolujen etäpesäkkeiden liity modulaatiota solu-solu- ja solu-alustan Kiinnittyvyysominaisuudet helpottamaan solujen irtoaminen kudoksesta alkuperä- ja hyökkäys paikallisten ja distaalisen kudosten [3]. Alas-säätely solu-solu adheesiomolekyylien on yksi tärkeimmistä vaiheista paikallisten ja distaalisen eturauhassyövän hyökkäystä. Erityisesti muutokset ilmentymistä ja toimintaa kadheriineja ja niihin liittyvien proteiinien ovat saaneet huomiota kriittisiksi sääntelyviranomaisten syövän etenemisen [4], [5]. Menetys vyöliitos molekyyli, P-kadheriinin, on varhainen tapahtuma useimmat eturauhasen syöpiä [6], [7], kun taas alentunut ilmentyminen E-kadheriinin on liitetty kehittyneempiä ja aggressiivinen muoto taudista [8]. Kuitenkin huolimatta niiden ilmentymisen eturauhaskudoksiin [9] – [11], tiedetään vähän roolista desmosomien kadheriineja käynnistymiseen ja etenemiseen Eturauhassyövän.

Muutokset ilmentymistä kadheriinin liittyvien proteiinien armadillo perhe on myös yhdistetty kasvaimen etenemiseen ja /tai poistaminen [12] – [14]. Eräs tällainen proteiini on läheistä sukua β-kateniinin kutsutaan plakoglobin (PG, tunnetaan myös nimellä γ-kateniini), jotka voivat sitoutua sekä klassisia ja desmosomien kadheriinien, vaan se havaitaan pääasiassa desmosomit ja on ratkaisevan tärkeää, että morfogeneesiin ihon ja sydän [10]. PG on raportoitu vaimennin tumorigeneesin kohdunkaulan [15], virtsarakon [16] ja rintasyövän [17], ja kliiniset tiedot osoittavat, että PG on säädellä vähentävästi lokalisoitu ja useimmissa hormoniresistentti kasvaimia eturauhassyöpäpotilailla [18] . Mielenkiintoista on, että joissakin hormoneille resistentti kasvaimia, mutatoitunut versio PG on havaittu ytimet korreloivat lisääntynyt Bcl2 ilme ja lisääntynyt solujen eloonjäämistä [18]. Olipa nämä havaitut muutokset PG olla syy rooli PCA etenemisessä ei ole määritetty.

Aiemmissa työssä, osoitimme, että PG inhiboi keratinosyyttien liikkuvuutta, osittain säätelemällä solu-solu- ja solu-alustan tarttumisen komponentti ilmaisun [19], [20]. Analysoimalla PCa potilaiden kudosnäytteistä ja joukko in vitro voitto-ja-toiminnan menetys tutkimuksia, meidän tiedot viittaavat malliin, jonka PG säätelee solu-alustan vuorovaikutusten ja solu-soluadheesion lieventävien vitronektiinissä (VN) -riippuvaisella aktivointi Src. Tämä on ensimmäinen raportti, joka desmosomien molekyylejä voidaan säädellä eturauhassyövän vuorovaikutus solunulkoisen microenvironment. Lisäksi meidän data esiin mahdollisuuden, että PG alassäätöä aikana PCa eteneminen voisi edistää tunnetun VN-riippuvainen edistäminen Eturauhassyövän eteneminen ja metastaasit luuhun [21].

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja Culture

LNCaP-solut ovat toiminnallisesti eriytetty, androgeeni-herkkä ihmisen eturauhasen adenokarsinooma peräisin olevat solut imusolmuke etäpesäke [22]. C4-2B solut ovat androgeenista riippumaton, luu metastaattisen johdannainen LNCaP [23]. DU145 solut kohtuullisesti erilaistunut, androgeeni-inedpendent ihmisen eturauhasen adenokarsinoomasolua peräisin aivometastaasi [24]. PC-3-solut ovat huonosti eriytetty, androgeenistä riippumaton ihmisen eturauhasen adenokarsinoomasoluja peräisin selkärangan etäpesäkkeitä [25]. PC3-M on erittäin metastaattinen variantti PC-3-solulinjassa [26]. ARCaP solut ovat androgeenin tukahdutettu soluja, jotka ilmentävät funktionaalisia androgeenireseptorin [27]. ARCaP

E solut ovat epiteelin variantti vanhempien ARCaP solujen alhainen tuumorigeenisyyteen ja ARCaP

M-solut ovat erittäin metastaattinen mesenkymaalisten variantti vanhempien ARCaP soluihin [28]. PC3-M-solut, LNCaP, PC-3-solut (kaikki lahjana Dr. Raymond C. Bergan, Northwestern University, Chicago, IL), DU145 solut (lahja Dr. Lester F. Lau, University of Illinois, Chicago, IL) ja C4-2B-soluja (lahja tri RS Taichman, University of Michigan, Ann Arbor, MI) viljeltiin RPMI 1640 -elatusaineessa (Mediatech), joka sisälsi 10% lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia (FBS) (Invitrogen, Carlsbad , CA), 100 yksikköä /ml penisilliiniä, ja 100 ug /ml streptomysiiniä (Mediatech). ARCaP

E ja ARCaP

M-soluja (Novicure) viljeltiin MCaP media (Novicure), joka sisälsi 5% lämmöllä inaktivoitua FBS: ää, 100 yksikköä /ml penisilliiniä, ja 100 ug /ml streptomysiiniä (Mediatech).

Reagenssit ja vasta-aineet

pSrc (Y416) polyklonaalisia vasta-aineita ja Src monoklonaalisia vasta-aineita (Länsi-blottaus ja immunofluoresenssitutkimukset solulinjoissa) olivat Cell Signaling Technologies (Danvers, MA). pSrc polyklonaalisia vasta-aineita (TMA-värjäys), Kollageeni I polyklonaaliset vasta-aineet olivat Abcam (Cambridge, MA). PG kana polyklonaalisia vasta olivat Aves Labs (Eugene, OR). GAPDH monoklonaalinen vasta-aine oli peräisin Millipore (Temecula, CA). HRP-konjugoitua vuohen anti-hiiri, ja vuohen anti-kaniini-vasta-aineet olivat Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA). HRP-konjugoitua vuohen anti-kana sekundäärinen vasta-aine oli peräisin Kirkegaard Perry Laboratories (Gaithersburg, MD). Vitronektiini (VN) monoklonaalinen vasta-aine, fibronektiini polyklonaalisia vasta, laminiini monoklonaalisia askitesneste, ja VN ihmisen plasmasta oli Sigmalta. PP2 selektiivinen Src-estäjällä oli Calbiochem (San Diego, CA). Dispaasi II entsyymi saatiin Roche (Basel, Sveitsi). PG siRNA allas ja ohjaus siRNA # 2 ei-kohdennussekvenssin saatiin Dharmacon (Lafayette, CO). caSrc adenovirus oli antelias lahja tri Paul L. Stein (Northwestern University). JM-quik Stain asetettiin Dade Behring.

Adenoviraaliset konstruktiot ja transduktio

pAdEasy adenovirus pakkausjärjestelmä, ystävällisesti tri Warren G. Tourtellote (Northwestern University Feinberg School of Medicine) oli käytetään tuottamaan aikaisemmin tunnettu myc-merkityn, täyspitkä ihmisen PG [29] julkaistujen menetelmien mukaisesti [30]. Cell-tartuntojen määrä seurattiin käyttämällä GFP: n ilmentymisen rinnalla PG; vähintään 30% uudelleen päällystetty solujen vielä säilyttänyt GFP: n ilmentymisen.

siRNA Transfektiot

ARCaP

E, LNCaP ja C4-2B solut kasvatettiin 30% konfluenssiin ja sitten transfektoitiin joko yksilön tai altaan 4 pienet häiritsevät oN-TARGETplus RNA (siRNA) ihmisen PG tai # 2 ohjaus ei-kohdesekvenssin (Dharmacon, Lafayette, CO) lopullisessa pitoisuudessa 20 nM käyttäen Dharmafect 1 transfektioreagenssia (Dharmacon) valmistajan suositusten mukaisesti. PG siRNA-sekvenssit olivat seuraavat: 5′-AGACAUACACCUACGACUC-3 ’; 5’-UGAGUGUGGAUGACGUCAA-3 ’; 5′-CCACCAACCUGCAGCGACU; 5’-UGUACUCGUCGGUGGAGAA-3 ’.

Scratch Haavan Pitoisuus

PC3-M ja ARCaP

M-solut maljattiin 24-kuoppaisille levyille ja niiden annetaan kiinnittyä ja levitä. Solut transdusoitiin GFP- tai PG sisältävän adenoviruksen. Klo 24 tuntia transduktion jälkeen, naarmu haava tehtiin raaputtamalla yksisolukerroksena kanssa 20 ul pipetin kärki. Src-esto-tutkimuksia varten solut käsiteltiin elatusaineella, joka sisältää Src-estäjällä PP2 tai DMSO-liuotin-ohjaimen 24 tuntia ennen tyhjästä haavan tehdään. Solut kuvattiin heti haavoitti ja 24 tunnin kuluttua haavoittaen. 24 tunnin kuluttua haavan tekemisen, solut lyysattiin Urea Sample Buffer (USB) ja lysaatit käytettiin testaamaan ilmentymisen PG. ARCaP

E ja C4-2B solut maljattiin 24-kuoppaisille levyille ja niiden annetaan kiinnittyä ja levitä. Solut transfektoitiin kontrolli tai PG siRNA. Naarmu haava tehtiin 96 tuntia transfektion jälkeen. Src aktivointi tutkimuksia, ARCaP

E solut transdusoitiin GFP-adenovirus tai konstitutiivisesti aktiivisia Src (caSrc) -adenovirus 24 tuntia ennen naarmu haava tehdään. Solut kuvattiin heti haavoitti ja 18 tuntia (C4-2B solut) tai 24 tuntia (ARCaP

E solut) jälkeen haavoittaen. 24 tunnin kuluttua haavan tekemisen, solut lyysattiin USB ja lysaatit analysoitiin Western blot -menetelmällä testaamiseksi ilmentymisen PG. Prosenttiosuus haavan määritettiin käyttäen ImageJ ohjelmistoa.

Matrigel Invasion Pitoisuus

Matrigel invaasiomääritys suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [31], seuraavin muutoksin. Sisempi kuoppa Transwell-irto-(0,8 um; BD Biosciences) päällystettiin 100 ul: Matrigel tyvikalvon Matrix (BD Biosciences) ja annettiin läpäiseviksi huoneenlämpötilassa 1 tunti. Jäljellä oleva neste poistettiin, ja suodattimet pestiin seerumittomalla alustalla ja niiden annettiin kuivua ilmassa. Eturauhassyövän solut irrotettiin mukaan solulinjaan erikoisprotokollia (ARCaP

E, ARCaP

M, C4-2B, DU145, ja PC-3-solut irrotettiin käyttäen trypsiiniä, kun taas LNCaP ja PC3-M-solut irrotettiin käyttäen kalsium sitomista) ja pestiin seerumittomalla alustalla, ja 5 x 10

5 solua lisättiin sisäistä hyökkäystä kammioon. Solujen annettiin tunkeutua 24 h; ei-tunkeutuvat solut poistettiin sisäinen kaivoista vanupuikolla, ja valtaavat solujen kiinnittynyt pohjaan kalvon kiinnitettiin ja värjättiin käyttäen Diff-Quik -värjäyspakkausta (DADE AG). Hyökkääviä solut laskettiin mukaan pystyssä stereo mikroskoopilla käyttäen 10x tavoite (Nikon).

Immunoblottausmääritys

ARCaP

M, C4-2B, ja PC3-M-solut levytettiin 6- kuoppalevyille ja annettiin kiinnittyä ja levitä. Solut transdusoitiin GFP sisältävän adenoviruksen tai PG sisältävä adenovirus, kerättiin 24 tuntia myöhemmin USB ja alistettiin SDS-PAGE: lla. Siirron jälkeen nitroselluloosamembraanille, immunoblot-analyysi suoritettiin vasta-aineilla PG, pSrc, Src, LN, FN, VN, ja GAPDH. ARCaP

E ja C4-2B solut maljattiin 6-kuoppaisille levyille ja niiden annetaan kiinnittyä ja levitä. Solut transfektoitiin PG siRNA tai # 2 ohjaussekvenssi siRNA. 96 tunnin kuluttua solut lyysattiin USB ja alistettiin SDS-PAGE, siirrettiin nitroselluloosamembraanille, ja sen jälkeen niille immunoblot-analyysi vasta-aineilla PG, VN, FN, Col IV, ja GAPDH. Kvantitaatiot of kaistaintensiteettejä suoritettiin käyttäen Analysoi geelit väline ImageJ ohjelmiston.

mekaaninen kestävyys (Dispaasi) Pitoisuus

LNCaP, C4-2B, ja PC3-M-solut levytettiin 6- kuoppalevyille, ja niiden annetaan kiinnittyä ja levitä. Viljelmät transdusoitiin GFP sisältävän adenoviruksen tai PG sisältävän adenoviruksen, ja 24 tunnin jälkeen dispaasi määritys suoritettiin. Src-esto-tutkimuksia varten solut käsiteltiin alustassa, joka sisälsi PP2 (10 uM) tai DMSO: ta (liuotin kontrolli) 24 tunnin ajan ennen suorittamista dispaasi määritys, kuten on kuvattu [32]. Lyhyesti, konfluentit soluviljelmät pestiin PBS: llä ja inkuboitiin 2,4 U /ml dispaasi 30 min ajan 37 ° C: ssa. Julkaistu yksikerroksia tehtiin lievä mekaanista rasitusta, ja sen jälkeen kiinnitetään formaliinilla. Fragments laskettiin kanssa dissecting laajuus (Leica, MZ6) kuvatulla [32] tai kuvaamisen kanssa Hamamatsu Orca digitaalikamera (malli C4742-95) ja analysoitiin käyttäen MetaVue kuvankäsittelyohjelma (Molecular Devices). Tiedot ilmaistaan ​​keskimäärin fragmenttien ± SEM. Tilastollinen analyysi tehtiin käyttäen Studentin

t

testiä.

Hanging Drop aggregaatiotesti

riippuvan pisaran määritys suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [32], seuraavin muutoksin. Viljelmiä PCa solulinjoja erillinen kuten edellä on kuvattu, sentrifugoitiin ja suspendoitiin uudelleen sopivassa kasvualustassa. Tippaa (20 ui) solususpensioiden ympättiin sisäpinnalle 35 mm: n viljelymaljalle kannen ja viljeltiin 20 tuntia. Haihtumisen rajoittamiseksi, 2 ml PBS: ää lisättiin pohjaan viljelyastioista. Verrata samankaltaisia ​​tiheyksiä solujen ripustettu pudota, 4 x 10

3 soluja tutkittiin. Tutkia solujen kyky muodostaa aggregaatteja 24 tunnin kuluttua, viljelymaljasta kannet käännettiin ylösalaisin, ja roikkuu tippaa litistettiin lasipeitinlevyllä kuvantamiseen. Tutkia tartuntalujuus soluaggregaateiksi, rinnakkaisia ​​viljelmiä trituroitiin 10 kertaa läpi 20 ui pipetin kärjen (pre-huuhdeltiin 0,1% Triton X-100 /PBS) ja sitten huuhdeltiin 3 kertaa PBS: ssä ennen kuvausta. Viisi sattumanvaraisesti aloilla vaiheittain kontrastin kuvia kustakin riippuva pisara hankittiin käyttäen Zeiss Axiovert 200 -käänteismikroskoopissa Zeiss AxioCam kamera ja Zeiss Axiovision ohjelmistoja. Kokonaismäärä soluklusterien laskettiin kolminkertaisista roikkuu tippaa.

Immunofluoresenssikoe

ARCaP

E, ARCaP

M, LNCaP, C4-2B, DU145, PC-3, ja PC3-M-soluja kasvatettiin lasipeitinlevyille, huuhdottiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja kiinnitettiin vedettömässä metanolissa 2 minuutin ajan -20 ° C: ssa. Ne inkuboitiin sitten kanan anti-PG (1407) (1:1000) ja hiiren anti-E-kadheriini (HECD-1) vasta-aineet (1:100) yön yli 4 ° C: ssa. Ensisijainen vasta-aineet visualisoitiin käyttämällä Alexa Fluor 350, 488- ja 568-vuohen sekundaarinen vasta-aineita hiiren, kanin ja kanan IgG (1:400), tässä järjestyksessä. Peitelaseja tutkittiin Leica pystyssä mikroskooppi malli DMR (Deerfield, IL), ja kuvat otettiin käyttäen Hamamatsu Orca digitaalikamera malli C4742-95 (Bridgewater, NJ) ja Metamorph 7,6 (Molecular Devices) kuvankäsittelyohjelmalla.

Tissue microarray värjäys, Imaging, ja loisteputki Intensity Analysis

parafinoidut eturauhasessa mikrosiru (BC19021), joka sisältää 72 ytimet 20 tapausta ostettiin USA Biomax (Rockville, MD), ja käsiteltiin immunohistokemiallista värjäystä kuten on kuvattu [33]. Antigeeni haku suoritettiin kuumentamalla lasilevyllä 95 ° C: ssa 0,01 M sitraattipuskurissa. Microarray blokattiin 2% normaalia vuohen seerumia (Jackson ImmunoResearch Laboratories) ja 1% BSA 60 min 37 ° C: ssa, sitten niitä inkuboitiin primääristen vasta-aineiden PG, VN ja pSrc yön yli 4 ° C: ssa kostutetussa kammiossa. Microarray inkuboitiin AlexaFluor-konjugoidun sekundaarisen anti-kana (633), hiiri (488) ja kaniinin (568) vasta-aineiden kanssa 60 minuuttia 37 ° C: ssa, ja peitelevy on asennettu polyvinyylialkoholia. PG, VN, ja pSrc visualisoitiin käyttämällä konfokaalimikroskopia (Cell Imaging Facility, Northwestern University), 3 päivän kuluessa käsittelyn. Identtiset hankinta asetukset olivat käytetään kaikissa kuvissa, jotta kuvan pikseli voimakkuus voidaan verrata. Kuvat otettiin 40X suurennus, jossa on vähintään 4 kuvaa kohden kudosta ydin otettu. Suhteellinen loisteputki voimakkuudet määritettiin käyttäen MetaMorph 7,6 ohjelmistoa (Molecular Devices), kuten aiemmin on kuvattu [34] seuraavin muutoksin. Jokainen raaka, tyydyttymättömiä kuva asetettiin 16-bittinen alue (asteikolla 0 matala- ja 255 korkean) ja sen kokonaisvaltaisesti kynnysarvo. Toimenpide Grid toiminto käytettiin valita alueita kasvaimen analysoitavaa. Jokainen verkkoon oli 40 × 40 neliöitä (30,86 um

2 /neliö). Keskimääräinen intensiteetti kynnystetty-alueiden lasketaan automaattisesti MetaMorph kullekin ruudukon. Koordinaattiruuduissa intensiteettiin 0 jätettiin pois miedommilta laskenta koko verkkoon. Tuumorin luokitus on ollut ominaista US Biomax- mukaan TNM asteikon käyttää UICC [35]. Ensisijainen kasvain (T) lavastus perusteet eturauhassyövän käytettiin seuraavasti: T1, kliinisesti unapparent kasvain; T2, kasvain rajoittuvat eturauhanen; T3, kasvain ulottuu läpi eturauhasen kapselin; T4, kasvain tunkeutuu viereisiin rakenteisiin muu kuin rakkularauhaset. Yksityiskohtainen kuvaus kudosten käytetään mikrosiru saattaa löytyä yhtiön verkkosivuilla https://www.biomax.us/tissue-arrays/Prostate/BC19021. Lisäksi eturauhasadenokarsinoomaa luokiteltiin asiantuntija urogenitaalinen patologi (Ximing J. Yang) käyttäen Gleason pisteytysjärjestelmä, joka perustuu yksinomaan arkkitehtonisia piirteitä syöpäsoluja.

tilastolliset menetelmät

Soluviljely kokeet suoritettiin vähintään 3 rinnakkaista. Arvot annetaan tarkoitan virhepalkkien osoittavat SEM. Tilastolliset analyysit suoritettiin käyttämällä GraphPad Prism-ohjelmiston versiota 5.02 Windowsille (San Diego, USA). Kaikki tilastolliset testit olivat 2-puolinen. Studentin t-testiä pylväsdiagrammi vertailuja suoritettiin. Lineaarinen regressio suoritettiin linjan vertailevia kaavioita ilmaus VN ja PG tai pSrc ja PG, jossa R squared arvo edustaa hyvyyttä sovitus linjan. p 0,1 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

PG on Mislocalized ja sen Expression pienenee eturauhassyöpäkudoksen Näytteet ja Solulinjat

Useat raportit kirjallisuudessa ovat ehdottaneet että PG ilmentyminen vähenee kliinisissä PCa näytteissä verrattuna normaaliin kudokseen [18], [36], [37]. Kuitenkin onko modulaatio PG ilmaus on vastuussa fysiologisista ja molekyylitason tapahtumia PCa kasvainten synnyssä ei ole vielä mekaanisesti tutkittu. Tämän kysymyksen ja ymmärtää paremmin välisestä suhteesta PG ilmaisun ja laajuus ensisijainen eturauhasen syövän leviämisen, PCA kudos microarray 72 ydintä 20 eturauhassyöpäpotilaalla analysoitiin PG ilme. Havaitsimme vähenemisen yleisessä PG ilmentymisen kaikissa pahanlaatuinen näytteissä verrattuna normaaliin kudokseen, sekä katoaminen PG solusta-solujen rajat, jossa se on tavallisesti paikallinen (Fig. 1A). Analyysi PG fluoresenssin intensiteetti paljasti keskimäärin -50% vähemmän PG primaarikasvaimen näytteet kaikista Gleason asteet ja lavastettuja T1 T3, verrattuna normaaliin kudokseen (Fig. 1 B-C). Lisäksi invasiivisia T4 kasvaimissa oli ylimääräinen -30% lasku PG (Fig. 1 C). Nämä havainnot osoittivat, että PG ilmentyminen väheni ja mislocalized perusterveydenhuollossa eturauhassyöpäkudoksen verrattuna normaaliin eturauhasen kudosta. Lisäksi menetysten PG invasiivisia (T4) kasvain näytteet nostaa esiin mahdollisuuden, että PG on rooli tukahduttamaan PCa hyökkäystä.

A-C. Eturauhasen kudosta mikrosiru värjättiin vasta-aine PG. A, edustaja immunofluoresenssilla kuva osoittaa PG ilmentymisen normaalissa eturauhasessa kudoksessa (ylhäällä) ja T3 (alhaalla) eturauhasessa. Palkki edustaa 50 um. B. kvantifiointi PG ilmentymisen normaalissa eturauhasessa kudoksessa verrattuna kudoksen eturauhasen kasvaimia Gleason luokan vähemmän kuin tai yhtä suuri kuin 6 (6 kasvaimet), 7 (5), tai suurempi tai yhtä suuri kuin 8 (33). PG ilme on korkea normaalissa kudoksessa (musta) ja vähenee -50% kasvainkudoksessa kaikista Gleason laadut. Gleason Arvostelu suoritettiin kirurgisen patologi Ximing Yang. C. kvantifiointi PG ilmentymisen normaalissa eturauhasessa kudoksessa verrattuna vaiheeseen T eturauhasen kasvain kudosta. PG on erittäin ilmaistaan ​​normaalissa kudoksessa (musta) ja ilmaisun väheni -40% vaiheen T1-T3 eturauhasen kasvain kudosten ja lähes 70% T4 eturauhasen kasvain kudosta. Tuumorin luokitus on luonnehdittu mukaan TNM asteikon käyttää UICC [35]. Primaarikasvaimen (T) pysähdyspaikan kriteerit eturauhassyövän käytettiin seuraavasti: T1, kliinisesti unapparent kasvain (3 kasvaimet); T2, kasvain rajoittuvat eturauhanen (33); T3, kasvain ulottuu läpi eturauhasen kapselin (9); T4, kasvain tunkeutuu viereisiin rakenteisiin muu kuin rakkularauhaset (3). Lisäksi oli 8 normaalin eturauhasen kudosnäytteitä jono. Käyrät edustavat keskiarvoja +/- SEM. * P 0,05; ** P 0,002; *** P 0,0005; **** P 0,0001, jonka pariksi t-testillä.

Seuraavaksi PG ekspressiotasot ja jakelu arvioitiin paneeliin seitsemän PCa solulinjojen vaihtelee niiden kasvaimia synnyttäviä ominaisuuksia. Yleensä solulinjat on kuvattu kirjallisuudessa, joissa on enemmän metastaattinen potentiaali (ARCaP

M, C4-2B, ja PC3-M) oli moninkertaisesti pienempi PG ilmaisu kuin ei vähemmän aggressiivisia linjat (LNCaP ja ARCaP

E). Vaikka kohtuullisesti erilaistunut DU145-solut ekspressoivat enemmän PG kuin muut solulinjat, PG osoitti enemmän diffuusi sytoplasman ja tumalokalisaatio sen sijaan, että keskitetty solu-solu-rajapintoihin (Fig. 2A, B). Samoin aggressiivinen ARCaP

M ja C4-2B linjat näytteillä himmeä ja diffuusi värjäytyminen PG. Lopuksi, metastaattista variantti PC-3-solulinjan, PC3-M-solut, ilmaistuna vähemmän PG kuin PC-3-solut (Fig. 2A, B). Mielenkiintoista on, että vaikka niillä oli alhaisemmat PG tasoilla kuin PC3-M-solut, C42B solut edelleen joitakin tuman värjäytymisen (Fig. 2B). Kaiken kaikkiaan nämä tiedot viittaavat siihen, trendi laski PG ilmaisun ja menetys solu-solu raja lokalisoinnin PG aggressiivinen PCa solulinjoissa.

. Eturauhassyöpäsolulinjoissa lyysattiin ja suoritettiin SDS-PAGE, jota seurasi immunoblottaus vasta-aineita PG: n ja GAPDH. PG-tasot määritettiin normalisoimalla GAPDH tasot kutakin solulinjaa Image J. immunoblot osoittaa, että ilmaus PG eturauhassyöpäsolulinjoissa käänteisesti korreloi aggressiivisuuden asteen solulinjan. B. Eturauhassyöpäsolulinjat maljattiin peitelaseja ja annettiin kiinnittyä ja levitä. Immunofluoresenssikoe suoritettiin käyttäen vasta-aineita PG osoittaa lokalisoinnin PG ARCaP

E, ARCaP

M, LNCaP, C4-2B, DU145, PC-3, ja PC3-M solulinjoissa. Immunofluoresenssitutkimukset näkyy heikompi värjäystä ja menetys solu-solu raja lokalisoinnin PG aggressiivisempi solulinjoissa (ARCaP

M, C4-2B, ja PC3-M). Edustajat vähintään kolme riippumatonta immunobloteilla esitetään, numeroin edustaa GAPDH normalisoidut PG proteiinin tasot blot esitetty. Kaikki PG proteiinin tasot normalisoitiin ARCaP

E jotka kullakin blot. Keskimääräinen taso ja keskihajonta PG proteiinin tasot paneeli A on seuraava: ARCaP

E 1.0, ARCaP

M 0,3 +/- 0,2, LNCaP 1,5 +/- 0,5, C4-2B 0,5 +/- 0,2 , DU145 3,4 +/- 1,2, PC-3 1,0 +/- 0,4, PC3-M 0,5 +/- 0,2.

PG edistää solujen-solujen Adhesion Eturauhassyövän Cells

Kun otetaan huomioon, että tunnusmerkki kohdunkaulan syöpä on kyky pahanlaatuisten solujen koordinoida heikkenemisestä niiden solu-solu-kiinnikkeistä muutosten toiminnalliset vuorovaikutukset alla olevan alustan [3], tutkimme seuraavaksi kokeellisen manipuloinnin PG tasoilla (Fig. S1 ja S2) vaikuttaa solu-solu-adheesion PCA-soluissa. PC3-M-solut, C4-2B soluja, ja LNCaP-solut transdusoitiin PG-ilmennä adenoviruksen ja dispaasi määritys suoritettiin mittaamiseksi solujen välistä tartuntalujuus (Fig. 3A). Cell-soluadheesiota lisääntyi merkitsevästi kaikissa soluissa transdusoitiin PG-ilmennä adenoviruksen (PG OE) verrattuna soluihin transdusoitu ohjaus (GFP) adenovirus (Fig. 3A-B).

. Edustavia kuva dispaasia määritystä PC3-M-solujen transduktion jälkeen PG OE adenovirus tai kontrolloida GFP adenovirus. B. kvantitaatiot of dispaasia määritykset suoritettiin kolmena kappaleena; LNCaP, C4-2B tai PC3-M-solut maljattiin 6-kuoppaisille levyille, ja niiden annetaan kiinnittyä ja levitä. Viljelmät transdusoitiin GFP sisältävän adenoviruksen (GFP) tai PG sisältävä adenovirus (PG OE), ja 24 tunnin jälkeen dispaasi määritys suoritettiin. N yli-ilmentyminen PG kaikissa 3 solulinjoissa vahvistaa solu-soluadheesion. C. LNCaP-solut maljattiin 6-kuoppaisille levyille ja niiden annetaan kiinnittyä ja levitä. Sitten solut transfektoitu ohjaus siRNA tai PG siRNA allas. Dispaasi Määritys suoritettiin 96 tuntia transfektion jälkeen. Suppressio PG ilmaisun johtaa heikkenemiseen solu-soluadheesion LNCaP-soluissa. D. edustaja kuva riippuvan pisaran määritystä DU145 soluissa transfektion jälkeen ohjaus tai PG siRNA allas. E-F. Kvantitointi riippuva pisara määritykset suoritettiin kolmena kappaleena; C4-2B ja PC3-M-soluja transdusoitiin GFP- tai PG sisältäviä adenovirukset (E), ARCaP E, LNCaP, DU145 ja PC3-solut transfektoitiin ohjaus siRNA tai PG siRNA allas (F). Aggregaatiotutkimuksissa tehtiin 24 h (E), tai 96 h (F) käsittelyn jälkeen. Käyrät edustavat keskiarvoja +/- SEM. * P 0,06; ** P 0,005; *** P 0,0007, jonka pariksi Student t-testillä.

Mielenkiintoista, yliekspressio PG LNCaP-soluissa, jotka jo ilmentävät huomattavia määriä PG, johti lisääntymiseen entisestään väliseen adheesioon voimaa ja solujen -solujen risteyksessä värjäys E-kadheriinin (Fig. 3B ja kuvio. S3), mikä viittaa siihen, että on muita PG voi lisäksi vakauttaa vyöliitos PCA. Lisäksi, ARCaP

M soluja, yliekspressio PG johti ylössäätöä desmosomiproteiinin komponentin desmoplakin (Fig. S3), mikä viittaa mahdolliseen vakauttava vaikutus PG desmosomien liittymissä PCA samoin. Toisaalta, kaatamalla PG ilmentymistä LNCaP johtanut melkoiseen heikentymiseen solu-solu kiinnikkeistä (Kuva. 3C). Lisäksi säätely alaspäin PG vähensi sekä E-kadheriinin ja desmosomien kadheriinin desmogleiini 2 ARCaP

E-soluissa (kuvio. S3), korostetaan jälleen tärkeyttä PG vakaudelle adherens ja desmosomien risteyksen PCa . Nämä tulokset yhdessä tukevat käsitystä, että PG ilmentyminen vahvistaa solu-solu-adheesion PCa soluissa.

varmistamiseksi edelleen vaikutusta PG PCa solu-solu-adheesion, teimme yhdistäminen (riippuva pisara) määritykset soluja suspensiossa (Fig. 3d). Tämä määritys aikaisemmin käytetty määrällisesti tartuntalujuus eri epiteelisolujen, kuten A431, MDCK- ja SCC68 [38] – [40]. Voit testata solu-solu tartuntalujuus me altistetaan aggregaatteja leikkaus voimaa. Sirpaleiden määrä on tuotettu leikkaamalla aggregaattien väheni huomattavasti solulinjoissa, jotka yliekspressoivat PG kontrolliin verrattuna (kuvio. 3E). Lisäksi koputtaa alas PG johti merkittävään lisääntymiseen palasia, mikä viittaa heikentyminen solu-soluadheesion kestävyys leikkaus- voima (Fig. 3d, F).

PG Estää Liikkuvuus ja Invasion PCa Cell Lines

heikkeneminen solu-solu-kiinnikkeistä on raportoitu lisäävän solun liikkuvuus [41], tutkimme seuraavaksi PG tila soluissa korreloi niiden suhteellinen liikkuvuus. Tätä tarkoitusta varten teimme naarmu haava määritys verrata motiliteettia PC3-M, ARCaP

M, ARCaP

E, ja C4-2B soluja. Määritys osoitti, että PC3-M ja ARCaP

M solut olivat hyvin liikkuvien (yli 50% haavan kiinni 24 h), kun taas ArCaP

E ja C4-2B solut olivat vähemmän liikkuvia (noin 20% suljettu 24 h) (Fig. 4A, B). Sitten yli-ilmentynyt PG PC3-M ja ARCaP

M soluja, mikä vähensi niiden liikkuvuutta 2-kertaiseksi kontrolliin verrattuna (kuvio. 4A). Samaan aikaan, pudotus ja PG ARCaP

E ja C4-2B solujen johti noin 50% ja yli 2-kertainen nousu niiden liikkuvuuteen, vastaavasti (Fig. 4B). Nämä havainnot yhdessä tukevat käsitystä, että ektooppisesti ilmentävät PG inhiboi motiliteetti Eturauhassyövän soluja, kun taas hiljentäminen PG lisää niiden liikkuvuuteen.

. PC3-M ja ARCaP

M maljattiin 24-kuoppalevyille ja annettiin kiinnittyä ja levitä. Sitten solut transdusoitiin GFP sisältävän adenoviruksen tai PG sisältävän adenoviruksen, ja 24 tunnin kuluttua naarmu haava oli tehty. Kuvat otettiin 0 ja 24 tuntia, ja%: een haavan sulkeutumiseen laskettiin vertaamalla haavan koko 24 tuntia 0 tunnin kohdalla kunkin kunnossa. Yliekspressio PG estää liikkuvuuden näissä kahdessa solulinjassa. B. ARCaP

E ja C4-2B solut maljattiin 24-kuoppaisille levyille ja niiden annetaan kiinnittyä ja levitä. Sitten solut transfektoitiin kontrolli-siRNA tai PG siRNA-allas, ja 72 tuntia transfektion jälkeen, naarmu haavat tehtiin. Tukahduttaminen PG johtaa lisääntymiseen potevilla ARCaP

E ja C4-2B soluja. Scratch haavan määritys tehdään kolmena kappaleena eturauhassyövän solulinjoissa jälkeen yliekspressio tai knockdovvn PG. C. ARCaP

M, C4-2B, DU145 ja PC3-M-soluja transdusoitiin GFP sisältävän adenoviruksen tai PG sisältävä adenovirus, ja 24 tunnin kuluttua maljattiin Matrigel pinnoitetut siirtokuoppaan kalvoja varten invaasiomääritys. Yliekspressio PG estää hyökkäyksen näissä neljässä solulinjoissa. D. ARCaPE, LNCaP, C4-2B, DU145, PC-3 ja PC3-M-solut transfektoitiin ohjaus siRNA tai PG siRNA-allas, ja 72 tunnin kuluttua transfektion maljattiin Matrigel pinnoitetut siirtokuoppaan kalvoja varten invaasiomääritys. Tukahduttaminen PG johtaa lisääntymiseen hyökkäyksen näissä kuudessa solulinjoissa.