Krooninen sairaus

tiivistelmä

erityisiä mekanismeja miten keuhkosyöpäsoluissa kätkeminen kasvutekijän reseptorin (EGFR) aktivoivat mutaatiot voi selviytyä hoito EGFR-tyrosiinikinaasin estäjät (TKI), kunnes ne lopulta hankkia hoito-vastus geneettisiä mutaatioita ovat epäselviä. Fenotyypin monimuotoisuus syöpäsolujen aiheuttamia geneettisiä tai epigeneettiset muutokset (kasvaimensisäisellä epäyhtenäisyys) annetaan hoidon epäonnistumisen ja saattaa edistää kasvainten kehittymistä läpi Darwinian valinnan. Viime aikoina olemme löytäneet DDX3X kuin proteiini, joka ilmentyy hiiren melanooma syöpä kantasolujen (CSC) kaltaisia ​​fenotyypit mukaan proteomianalyysi. Tässä tutkimuksessa olemme transfektoituja PC9, ihmisen keuhkosyöpä solut kätkeminen EGFR exon19 poisto, jossa koodaava cDNA DDX3X ja totesi, että DDX3X, ATP-riippuvaista RNA helikaasi, indusoi CSC kaltainen fenotyyppien ja epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) kera menetys herkkyys EGFR-TKI. DDX3X ilmentyminen liittyi säätelyä Sox2 ja kasvun syöpäsolujen näytteille CSC kaltaisia ​​fenotyyppejä, kuten kiinnittymisestä riippumaton leviämisen, vahva ilmaus CD44, ja aldehydi (ALDH). EMT siirtymiseen E-kadheriinin N-kadheriinin myös helpotti DDX3X. Joko ligandista riippumatonta tai ligandin indusoiman EGFR fosforylaatiota estyi keuhkojen syöpäsolut voimakkaasti ilmaistu DDX3X. Puute EGFR-signaalin riippuvuus johti resistenssiä EGFR-TKI. Lisäksi löysimme pienen tarttumaton alapopulaatio että voimakkaasti ilmaisseet DDX3X mukana samassa kantasolun kaltaisia ​​ominaisuuksia ja EMT vanhempien PC9 soluissa. Ainutlaatuinen alapopulaatio puuttui EGFR signalointi ja oli erittäin vastustuskykyinen EGFR-TKI. Lopuksi tuloksemme osoittavat, että DDX3X voi olla kriittinen rooli indusoimiseksi fenotyyppisten monimuotoisuutta, ja että hoito kohdistaminen DDX3X voi voittaa ensisijainen vastustuskykyä EGFR-TKI johtuvat kasvaimensisäisellä epäyhtenäisyys.

Citation: Nozaki K, Kagamu H, Shoji S, Igarashi N, Ohtsubo A, Okajima M, et al. (2014) DDX3X indusoi Ensisijainen EGFR-TKI Resistance Perustuen kasvaimensisäisellä heterogeenisuus Lung Cancer Solut, EGFR-aktivointi mutaatiot. PLoS ONE 9 (10): e111019. doi: 10,1371 /journal.pone.0111019

Editor: Pier Giorgio Petronini, University of Parma, Italia

vastaanotettu: 10 maaliskuu 2014; Hyväksytty: 26 syyskuu 2014; Julkaistu: 24 lokakuu 2014

Copyright: © 2014 Nozaki et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperin.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Grant-in-tuki Scientific Research opetus-, tiede- ja Japanin kulttuuri (# 20590915, # 23591141, # 24591157, # 26293196), sekä tutkimusrahoitusta Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: tutkimus osarahoitteinen Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

Hoidot kohdistaminen signaali riippuvuus aiheuttama onkogeenisten kuljettaja mutaatio ovat johtaneet ennennäkemättömän tuloksia kliinisessä ympäristössä. Käyttö kasvutekijän reseptorin (EGFR) -tyrosiinia estäjien (TKI) on merkittävästi parantunut ilman taudin etenemistä keuhkosyöpäpotilaiden kätkeminen aktivoivia EGFR mutaatioita; kuitenkin, se on edelleen vaikea saavuttaa paranna keuhkosyöpää, erityisesti potilailla myöhäisvaiheen tauti [1], [2]. Fenotyypin monimuotoisuus syöpäsolujen perustuu sekä geneettiset ja nongenetic tekijöitä ja tuloksia eloonjäämiseen hoito-resistentit solut. Useimmat hankittu resistenssi kuvastaa valinta syöpäsolujen kätkeminen stokastinen vastus antavan geneettisiä muutoksia. Kuitenkin mekanismeista, joiden avulla syöpäsolut selvitä vasta hankinta ylimääräisiä mutaatioita ovat epäselviä. Sharma et ai. osoitti, että pieni alapopulaatio palautuvasti huumeiden sietävien solujen olemassa kaikissa tutki syöpäsoluissa ja että huumeiden sietävien solujen käyttäytyi kantasolujen, synnyttää lääkeresistenttiä solujen kätkeminen ylimääräisiä mutaatioita [3].

DEAD /H (Asp-Glu-Ala-Asp /His) laatikko polypeptidi 3, X-linked (DDX3X) on jäsenenä DEAD-laatikko perheen ATP-riippuvaista RNA helikaasit ja sijaitsee X-kromosomissa [4]. DEAD-box helikaasit on useita toimintoja, kuten Silmukointi, mRNA vienti, transkription ja translaation sääntely, RNA rappeutuminen, ribosomien biogeneesiä, ja miRNA asetus [5], [6]. Siten DDX3X arvellaan osallistuvan epigeneettiset geenin ilmentymisen säätelyyn. Aikaisemmat Proteomi analyysit tunnistettu DDX3X kuin proteiini ilmentyy puhdistetussa CD133

+ B16-melanoomasoluja, joilla oli syöpä kantasolujen (CSC) kaltaisia ​​ominaisuuksia [7], [8]. Vaikka DDX3X on alun perin raportoitu tukahduttaa kasvaimen kasvua säätelemällä

p21

WAF /CIP1

geenin ilmentymisen [9], DDX3X on myös osoitettu olevan suoraan korreloivan kasvaimen synnyssä [10], [11]. Äskettäin kokonaisen exome sekvensointi tunnistaa DDX3X tavoitteeksi kuljettajan geenimutaatioita, jotka välittävät patogeenisten β-kateniinin signaloinnin medulloblastoma, joka tukee CSC teoriaa [12] – [16].

Tässä tutkimuksessa etsittiin tutkia roolia DDX3X in annetaan EGFR-TKI resistenssin keuhkosyövän soluja. Meidän tiedot osoittivat, että DDX3X voi edustaa uutta terapeuttinen kohde voittamiseksi kasvaimensisäisellä heterogeenisyys keuhkosyöpäpotilaita kätkeminen EGFR-aktivoivia mutaatioita.

Materiaalit ja menetelmät

tuumorisoluja

PC9 soluja keuhkoadenokarsinooma -solut EGFR-eksonin 19 deleetiomutaatio, hankittiin Riken Bioresource Center ja ylläpidetään elatusaineessa (CM), joka sisälsi RPMI 1640 -elatusaineessa, jota oli täydennetty 10% lämmöllä inaktivoitua (LPS) -qualified vasikan sikiön seerumia (FCS), 0,1 mM ei-välttämättömiä aminohappoja, 1 uM: lla natriumpyruvaattia, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiinisulfaattia (kaikki yhtiöltä Life Technologies, Inc., Tokio, Japani). HCC4006 keuhkoadenokarsinooma -solut EGFR-eksonin 19 deleetiomutaatio hankittiin American Type Culture Collection ja viljeltiin CM.

transfektio PC9 solujen

DDX3X

cDNA

Transfektio keuhkosyövän soluja

DDX3X

cDNA tehtiin käyttämällä Myc-FLAG-merkitty avoimen lukukehyksen (ORF), klooni ihmisen DDX3X transkriptin variantti 1, kun transfektio-valmis DNA: ta (Origene Technologies, Inc., Rockville, MD , USA) valmistajan protokollan. Kokeellinen soluja inkuboitiin tuoretta väliainetta, joka sisälsi G418: aa (600 ug /ml, Promega, Madison, WI, USA), ja elatusaine korvattiin tuoreella G418: aa sisältävässä väliaineessa välein 3-4 päivää, kunnes pesäkkeet tunnistettiin.

knockdovvn DDX3X tekijänä shRNA

knockdovvn DDX3X suoritettiin käyttäen shRNA lentiviruksen (pLKO.1-puro) plasmidi (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), jolla on seuraava DDX3X kohdesekvenssin: 5′-CCGGACGTTCTAAGAGCAGTCGATTCTCGAGAATCGACTGCTCTTAGAACGTTTTTTG. PC9 solut maljattiin tuoreessa elatusaineessa ja heksadimetriinibromidi (8 ug /ml) lisättiin kuhunkin kuoppaan. Solut kotransfektoitiin pLKO.1-puro-plasmidin plus pakkaus mukaisen vektorin valmistajan protokollaa. Väliaine vaihdettiin noin 16 h transfektion jälkeen, ja soluja viljeltiin vielä 48-72 tuntia. Kokeellinen soluja inkuboitiin tuoretta väliainetta, joka sisälsi puromysiiniä (2,0 ug /ml), ja elatusaine korvattiin tuoreella puromysiinin sisältävä väliaine joka 3-4 päivä, kunnes pesäkkeet tunnistettiin. Vähintään viisi puromysiiniresistenttiä pesäkkeet poimittiin, ja kunkin kloonin laajennettiin määritystä varten. Tehokkuutta DDX3X pudotus määritettiin immunoblottauksella.

monoklonaalisia vasta-aineita (mAb: t) ja virtaussytometria

PE-konjugoitu anti-CD44 (IM7), anti-E-kadheriini (67A4), ja anti-vimentiinista (GF2); fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC) konjugoidulla anti-N-kadheriinin (8C11) hankittiin BD Pharmingen (San Diego, CA, USA). Analyysi solun pinnan fenotyypit tehtiin suoraan immunofluoresenssivärjäyksellä on 0,5-1 x 10

6 solua edellä mainittu fluorofori-konjugoidulla mAb: t, ja sitten sitä käsiteltiin 1% paraformaldehydillä. Kussakin näytteessä, 1 x 10

4 solut analysoitiin käyttämällä FACScalibur virtauksen mikrofluorometrillä (Becton Dickinson, Sunnyvale, CA, USA). PE-konjugoitu alaluokka-täsmäsi vasta-aineita käytetään isotyyppikontrolleja hankittiin myös BD Pharmingen. Näytteet analysoitiin CellQuest-ohjelmaa (BD).

immunoblottaustestiä

Solut kerättiin ja lyysattiin Nonidet P-40-puskuria, joka sisältää proteaasi-inhibiittori-seosta (Sigma). Yhtä suuret määrät proteiinia tehtiin natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS-PAGE) on Mini-PROTEAN tgx väliä kD Precastin Geelit (BioRad, Hercules, CA, USA) ja sen jälkeen siirrettiin polyvinylideenidifluoridi kalvoja (Millipore, Bedford, MA, USA). Immunoblotit kasvaimen solulysaateista koetettiin vasta-aineita DDX3X (Sigma), EGFR, fosfo-EGFR (Tyr1068), fosfori-EGFR (Tyr1173), fosfori-EGFR (Tyr845), Akt, fosfo-Akt, Erk1 /2, fosforia ERK1 /2, ja β-aktiini (Sigma). Kaikki vasta-aineet, lukuun ottamatta anti-DDX3X ja anti-β-aktiini ostettiin Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA, USA). Toissijainen vasta-aineita muodostui anti-hiiri-IgG (BioRad) ja anti-kani-IgG: llä konjugoituna piparjuuriperoksidaasiin (Abcam, Cambridge, MA, USA). Immunoreaktiivisia Proteiinivyöhykkeet visualisoitiin käyttäen ECL (Pierce). Vähintään kolme toisistaan ​​riippumatonta koetta tehtiin kaikissa analyyseissä.

Aldefluor määrityksissä

ALDH-aktiivisuus havaittiin käyttäen ALDEFLUOR kit (StemCell Technologies Inc., Vancouver, Kanada) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, Aldefluor määritykset suoritettiin suspendoimalla solut Aldefluor määrityspuskuriin, joka sisälsi 1,5 uM BODIPY-aminoasetaldehydidietyyliasetaali, joka on ALDH substraatti. Soluja inkuboitiin sitten 30 min 37 ° C: ssa ja analysoitiin mikrofluorometrillä.

Solujen elinkelpoisuus määritykset

yhteensä 5 x 10

4 kasvainsoluja siirrostettiin 24-kuoppaisille levyt päivänä 0. kaksikymmentäneljä tuntia ymppäyksen jälkeen, erlotinibi tai ajoneuvon lisättiin. Määriä eläviä ja kuolleita soluja laskettiin trypaanisinisellä värjäystä. % Survival kertoo prosentteina elävien solujen, joka jättää trypaanisininen värjäystä, joka perustuu solujen kokonaismäärä hyvin. Näytteet valmistettiin kolmena kappaleena.

MTT määrityksissä

Tuumorisolut ympättiin 5 x 10

3 solua kuoppaa kohti tasapohjaiset 96-kuopan kasvatuslevyillä ja viljeltiin CM. Seuraavat 24 tunnin inkuboinnin aikana, jotta ne pitävät soluviljelylevyille, soluja käsiteltiin erlotinibin 48 tuntia. Viljelmä Levyjä sentrifugoitiin kiinnittymättömien kasvainsolujen ja väliaine poistettiin niin paljon kuin mahdollista, ja korvattiin 100 ul: lla tuoretta elatusainetta. 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidia (MTT) solujen elinkelpoisuuden suoritettiin lisäämällä 10 ui MTT-reagenssia per kuoppa 2 tuntia 37 ° C: ssa, minkä jälkeen lisättiin 100 ui /kuoppa väriaine liuotettavaksi pesuainetta reagenssia. Supernatantti imettiin pois, ja absorbanssi mitattiin 570 nm: ssä. Tulokset edustavat kolmen erillisen kokeen.

LEF /TCF Reporter määritykset

PC9 soluja transfektoitiin ohimenevästi lentivirus- vektori, mukaan lukien TCF /LEF

Monkey

lusiferaasireportteri- konstrukti ja sisäisen ohjaus

Renilla

lusiferaarikonstrukti, tai ei-indusoituva

Firefly

lusiferaasireportterista konstruktio ja sisäisen valvonnan

Renilla

lusiferaarikonstrukti (Cignal TCF /LEF Reporter kit, Qiagen). Solut transfektoitiin Lipofectamine 2000 ja valittiin 2 päivää puromicin. Transfektoidut solu sitten ne siirrostettiin uudelleen 24 kuopan levyille 30000 solua /kuoppa ennen hoidon rekombinantti Wnt3a (100 ng /ml; R 0,05. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta.

DDX3X välittämän EGFR-TKI vastus

Koska kantasolut käyttää kantasolujen-signalointia; Näin ollen, CSC-like fenotyyppien voi liittyä aktivointi eri signalointireittien muita kuin EGFR signalointi johtaa muutoksiin herkkyys EGFR-TKI. Niinpä seuraava tutkimme EGFR-TKI herkkyyttä A-1-soluissa. Kuten on esitetty kuviossa. 2A, on merkittävä vastus 48-h hoito EGFR-TKI erlotinibin havaittiin A-1-soluissa. Knockdovvn DDX3X palauttaa herkkyys EGFR-TKI (Fig. 2B). Vaikka laskua% elävien solujen havaittiin A-1-soluissa, kun solut käsiteltiin erlotinibin, pitoisuus on suurempi kuin 20 nM, ei ollut selvää, jos solut kuolevat tai ei. Voit testata, onko A-1 solut näytteille vähentynyttä elinkykyisyyttä tai yksinkertaisesti pienentää leviämisen seuraavat 72-h erlotinibi hoitoon, kuolleet solut värjättiin propidiumjodidilla (PI) ja analysoitiin mikrofluorometrillä. Vaikka kuolleiden solujen määrä lisääntyi vanhempien PC9 soluja, ei lisätä havaittu A-1-solut (Fig. 2C). Ilmiö vahvistettiin laskemalla solujen määrä kolmen päivän käyttämällä trypaanisinieksluusiolla menetelmällä (Fig. 3A). Kuolleiden määrä PC9 solujen lisääntyi merkitsevästi läsnäollessa erlotinibin pitoisuuksina yli 20 nM. Sen sijaan A-1-soluissa pysähtyi lisääntyvissä altistuessaan erlotinibille pitoisuuksina yli 20 nM, mutta kuollut A-1 solujen määrä ei erota käsittelemättömissä soluissa, vaikka kolmen päivän altistumisen 2000 nM erlotinibi. Kaikki muut kloonit, jotka oli käsitelty yliekspressoimaan DDX3X osoittivat saman vastuksen erlotinibille A-1-solut (Fig. 3B).

. MTT-analyysi vanhempien PC9 solujen ja A-1-soluissa. Syöpäsolut käsiteltiin ilmoitetun pitoisuuden erlotinibin 48 tuntia. Näytteet valmistettiin kolmena kappaleena. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD. B. MTT-määritystä vanhempien PC9 solujen, A-1-soluissa, ja A-1-solujen knockdovvn DDX3X. Syöpäsolut käsiteltiin ilmoitetun pitoisuuden erlotinibin 48 tuntia. Näytteet valmistettiin kolmena kappaleena. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD. C. Virtaussytometriaa analyysi syöpäsolujen käsiteltiin 20 nM erlotinibin 72 tuntia.

. Yhteensä 5 x 10

4 kasvainsoluja siirrostettiin 24-kuoppaisille levyille päivänä 0. Kaksikymmentäneljä tuntia ymppäyksen jälkeen, erlotinibi tai vehikkeliä lisättiin ilmoitettuina pitoisuuksina. Määriä eläviä ja kuolleita soluja laskettiin trypaanisinisellä värjäystä. % Survival kertoo prosentteina elävien solujen, joka jättää trypaanisininen värjäystä, joka perustuu solujen kokonaismäärä hyvin. Näytteet valmistettiin kolmena kappaleena. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD. * Käytetään osoittamaan merkitystä. B.% Survival syöpäsolujen käsiteltiin 20 nM erlotinibia osoitettiin. A-1, 2, 3, 4, ja 5 esittävät kloonia numerot, jotka transfektoitiin cDNA, joka koodaa DDX3X. Että% Survival ilmaisee prosenttiosuuden elävien solujen, jotka suljettiin pois trypaanisinistä tahra, joka perustuu solujen kokonaismäärä hyvin. Näytteet valmistettiin kolmena kappaleena. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD. **

p

0,001.

DDX3X vähennetään EGFR signalointi syöpäsoluissa kätkeminen EGFR-aktivoivia mutaatioita

selviytymistä ja proliferaatiota PC9 solut ovat riippuvaisia EGFR signalointi riippuvuus koska PC9 soluilla kuljettaja mutaatiot

EGFR

geeni, joka parantaa tyrösiinikinaasiaktiivisuuden [18], [19]. Näin ollen meidän on tutkinut, onko EGFR signalointi vaikuttivat DDX3X yli-ilmentymisen. Yhdenmukaisia ​​aiempien raporttien Tyr1068 EGFR fosforyloitui vanhempien PC9 soluissa ja mock transfektantit, vaikkei EGR (Fig. 4A); kuitenkaan juuri mitään EGFR fosforylaatiota ei havaittu A-1-soluissa. Lisäksi knockdovvn DDX3X A-1-soluissa palautettu EGFR fosforylaatiota. Sen vahvistamiseksi, että tämä ilmiö ei rajoitu PC9 solulinjaan, me transfektoitu HCC4006, ihmisen keuhkoadenokarsinooma kätkeminen EGFR eksonin 19 poisto, jossa koodaava cDNA DDX3X (HCC4006 S1, HCC4006 S2). HCC4006 S1 ja S2 menetti EGFR fosforylaatiota (kuvio. S1B). EGFR hallussaan useita Tyr jäännökset, jotka käyvät läpi fosforylaatio. Esimerkiksi Grb2 sovitin proteiini sitoutuu aktivoituu EGFR on fosforyloitu Tyr1068 [20], ja fosforyloitu Tyr1173 tarjoaa telakka sivusto Shc rakennusteline-proteiinia, joka on mukana mitogeeniaktivoidun proteiinikinaasin (MAPK) aktivaatiota [21]. Lisäksi, Tyr845 voidaan fosforyloida muita kinaaseja, mukaan lukien Src, ja sen on osoitettu fosforyloituvan monissa gefitinibin kestävä EGFR-mutantit [22] – [24]. Siksi tutkimme seuraavaksi fosforylaation todetaan näiden kolmen tyrosiinitähteitä (Tyr845, Tyr1068, ja Tyr1173), kun läsnä on EGF. Mielenkiintoista, löysimme alentunut fosforylaatiota kaikki tarkastellut tyrosiinijäännös EGFR A-1-solut (Fig. 4B).

. Immunoblottaus analyysi EGFR, fosfo-EGFR (Tyr1068), ja DDX3X syöpäsoluissa ilman EGF täydentämistä. B. immuuniblottausanalyysi fosfo-EGFR at Tyr1068, Tyr1173, ja Tyr845 vanhempien PC9 soluissa ja A-1-soluissa. C. kineettinen analyysi EGFR signaloinnin vanhempien PC9 soluissa ja A-1-soluissa. EGFR, fosfo-EGFR (Tyr1068), Akt, fosfo-Akt, ERK1 /2, ja fosfo-ERK1 /2 tasot analysoitiin immunoblottaamalla 0, 15, 30, 60, 120, ja 900 min sen jälkeen, kun on lisätty 100 ng /ml EGF.

läsnäollessa 100 ng /ml EGF, EGFR fosforylaatiota (Tyr1068) nostettiin vanhempien PC9 soluissa (Kuva. 4C). Sen sijaan, ligandin indusoiman EGFR fosforylaation ja myöhempää ekstrasellulaarisen signaalin säädelty kinaasi (ERK) fosforylaatioon oli merkittävästi heikennetty A-1-soluissa.

Sen lisäksi, että säädellään fosforylaatio EGFR voi tuottaa signalointia fosforylaation muiden ihmisen epidermaalisen kasvutekijän reseptori (HER) proteiinit muodostamalla heterodimeerejä. Päällepuhuminen Met kanssa EGFR signalointireitille on myös osoitettu olevan osallisena EGFR-TKI kestävyys [25]. Niinpä testasimme ovatko HER2, HER3 HER4, ja Met fosforyloitiin. Ei kuitenkaan eroja fosfory- valtioiden HER2 tai Met välillä ei havaittu vanhempien PC9 solujen ja A-1-soluissa (kuvio. S1C, D). Lisäksi, HER3 ja HER4 ei fosforyloitu näissä soluissa (tuloksia ei ole esitetty).

pieni alipopulaatio PC9 solujen ilmentyy voimakkaasti DDX3X ja näytteillä CSC-like fenotyypit

koottua näyttöä siitä, on osoittanut, että lähes kaikki kasvainsolut näyttää huomattavaa vaihtelua fenotyypit perustuvat geneettiset ja epigeneettiset heterogeenisyys [26]. Jos DDX3X todellakin on merkitystä indusoi kantasolun kaltainen tila ja signaalin kytkennän, pienen populaation DDX3X yliekspressoivia vanhempien PC9 soluja voi olla olemassa. Näin ollen, koska A-1 solut osoittivat taipumusta lisääntyä käytettäessä kiinnittämisestä riippumattomalla tavalla, tutkimme pieni alapopulaatio tarttumattomat PC9 soluja. Yllättäen tämä tarttumaton populaatio vanhempien PC9 solujen näytteillä lähes samalla tasolla DDX3X ilmentymisen A-1-solut (Fig. 5A). Olemme tutkineet ilmentymisen ALDH, oletetun CSC markkeri (kuvio. 5B). Vaikka vain 0,47% tarttuvien PC9 solujen ilmaistaan ​​ALDH, 23,0% adherenttien soluista osoittivat ALDH aktiivisuutta. Toisaalta, 15,8% kiinnittyneet A-1-soluja ja 23,8% adherenttien A-1 solut olivat ALDEFLUOR positiivisia. On todennäköistä, että ALDEFLUOR-positiivisten solujen olemassa vain solupopulaation, joka ekspressoivat vahvasti DDX3X. Lisäksi, suurin osa tarttumattomat solut, mutta eivät tarttuneet solut osoittivat voimakasta ilmentymistä CD44, toisen oletetun CSC markkeri (Fig. 5C).

. Immunoblottaus analyysi DDX3X ilmaisun tarttuu ja tarttumattomat vanhempien PC9 soluja ja A-1-soluissa. B. ALDEFLUOR määritykset suoritettiin suspendoimalla solut Aldefluor määrityspuskuriin, joka sisälsi 1,5 uM BODIPY-aminoasetaldehydidietyyliasetaali, joka on ALDH substraatti. Sitten soluja inkuboitiin 45 min ajan 37 ° C: ssa ja analysoitiin valmistajan ohjeiden mukaisesti. C. Virtaussytometrianalyysi tarttuvien ja tarttumattomat vanhempien PC9 soluja ja A-1-soluissa. Histgrams osoittavat CD44 ilme. Pisteviivat osoittavat isotyyppikontrollia, ohuet viivat osoittavat kiinnittyneet solut, ja paksut viivat osoittavat tarttumattomat solut. D. Virtaussytometrianalyysi fraktioimatonta, joka tarttuu, ja tarttumattomat solut ovat peräisin vanhempien PC9 soluista ja A-1-soluissa. X-akseli osoittaa fluoresenssin voimakkuus E-kadheriinin, ja Y-akseli osoittaa fluoresenssin voimakkuus N-kadheriinin. E. Virtaussytometrianalyysi adherenttien eristetyt solut vanhempien PC9 ja A-1-soluissa. Histogrammit osoittavat vimentiinista ilme aidatulla N-kadheriinin + soluja.

On osoitettu, että aikana EMT, E-kadheriinin on vaimentua samalla kun hermo kadheriinin (N-kadheriinin) on voimistunut, kutsutaan kadheriinin kytkin ja että kadheriinin kytkin edistää syövän eteneminen ja metastaasit kautta kasvava syöpä soluliikkuvuus [27] – [30]. Niinpä tutki E /N kadheriinilla kytkin indusoitiin DDX3X. Kuten on esitetty kuviossa. 5D, 15,5% fraktioimatonta A-1-soluissa ja 7,0% fraktioimatonta vanhempien PC9 solut ekspressoivat N-kadheriinin, joten on todennäköistä, että N-kadheriinin ilmentyminen edisti DDX3X. Kiinnittyneet solut E-kadheriinin yksi positiivinen ja N-kadheriinin

+ solujen kuului tarttumaton solupopulaatio. Mielenkiintoista, 43,1% adherenttien vanhempien PC9 solut ilmensivät sekä E-kadheriinin ja N-kadheriinin ja 29,2% oli E-kadheriinin

N-kadheriinin

+. Näyttää siltä, ​​että puutteellinen kadheriinin kytkin tapahtunut vanhempien PC9 soluissa. Sen sijaan 42,3% adherenttien A-1 soluja N-kadheriinin yksi positiivinen ja 10,8% oli E-kadheriinin

+ N-kadheriinin

+. 21,7% aidatulla N-kadheriinin

+ vanhempien PC9 soluissa, ja 47,7% aidatulla N-kadheriinin

+ A-1 solut ilmensivät vimentiinista (Fig. 5E). Yhdessä ainutlaatuisen alapopulaatio joka oli meneillään EMT olemassa tarttumattomat soluissa sekä A-1 ja vanhempien PC9 ja että DDX3X helpottanut E /N kadheriinilla kytkin seuraa vimentiinista ilme.

tarttumaton solupopulaation vanhempien PC9 puuttui EGFR signalointi ja oli resistentti EGFR-TKI

Kuten kuviossa. 6A, kaikki tarttumattomat solut puuttui EGFR fosforylaatiota kuin A-1-soluissa. Lisäksi tarttumaton populaatio vanhempien PC9 solujen oli resistentti EGFR-TKI erlotinibin, samanlainen Läpinäkyvät A-1-solut (Fig. 6B). Koska tarttumattomat solut voivat sisältää kuolleita soluja, tutkimme prosenttiosuudet kuolla soluja PI värjäystä. Kuva. 6C osoittaa, että 28,5% tarttuvien vanhempien PC9 solut kuolevat jälkeen 72-h erlotinibi hoitoon. Sen sijaan, prosenttiosuus kuolevat solut oli vain 14,1% tarttumattomat PC9 soluissa. Seuraavaksi viljelty vanhempien PC9 soluja kasvavien pitoisuuksien läsnä erlotinibin (jopa 3000 nM), jolloin saatiin resistentit solut. Sen jälkeen kun 3 kuukauden pituinen altistus erlotinibille, loimme R-PC9 soluja, jotka kykenivät selviämään CM sisältävä 3000 nM erlotinibi. Kuva. 7A osoittaa, että R-PC9 solut olivat merkittävästi resistenttejä erlotinibille. R-PC9 soluissa osoitti vahvaa ekspressiota DDX3X (Fig. 7B). Yhdessä meidän tiedot osoittivat, että vanhempien PC9 solut sisälsivät pienen populaation esillä vahva ilmaus DDX3X CSC kaltainen fenotyyppejä, EMT, ja ensisijainen vastustuskykyä EGFR-TKI. Vähäinen väestö voi elää pitkä hoito EGFR-TKI.

. Immunoblottaus analyysi EGFR ja fosfo-EGFR (Tyr1068) in pysyvä ja tarttumattomat syöpäsoluja. B. MTT määrityksiä käytettiin mittaamaan solujen proliferaatiota kiinnittyneet ja kiinnittymättömät PC9 solujen ja A-1-soluissa erlotinibi hoitoon. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD. Näytteet valmistettiin kolmena kappaleena. **

P

0,001. C. Virtaussytometrianalyysi PI värjäys käytettiin tutkimaan kuolee soluihin.

. MTT määrityksiä käytettiin määrittämään leviämisen kiinnittyneet ja tarttumattomat PC9 soluja, sekä R-PC9 soluja, jotka saatiin pitkäaikainen altistus kasvavien pitoisuuksien erlotinibin. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD. Näytteet valmistettiin kolmena kappaleena. * Tarkoittaa merkittäviä eroja kaksisuuntaisella ANOVA ja ad hoc-analyysi. B. immuuniblottausanalyysi DDX3X ilmentymisen vanhempien PC9 soluissa ja R-PC9 soluissa.

β-kateniinin signalointia aiheuttama DDX3X

Vaikka A-1-solujen puuttui EGFR fosforylaatiota ja myöhemmän signaloinnin ne osoittivat melkein sama leviämisen tahtiin kuin vanhempien PC9 solut

in vitro

. On todennäköistä, että EGFR signalointi korvataan muilla signaalinvälitysreittien. Kantasolut käyttää erityisiä signalointireittejä, kuten Wnt /β-kateniinin tai siili, sen sijaan, että reseptori tyyppi tyrosiinikinaasin signaloinnin; Lisäksi tietty osajoukko CSC ylläpito on riippuvainen Wnt /β-kateniinin signalointi [31], [32]. DDX3X vaaditaan Wnt /β-kateniinin signalointi, ja mutatoitunut DDX3X on osoitettu rooli patogeenisen β-kateniinin signalointi medulloblastoma [13], [33]. Siksi me seuraavaksi analysoidaan Wnt /β-kateniinin signalointi. TCF /LEF lusiferaasireportterigeenin määritys osoitti, että β-kateniinin signalointi edistettiin A-1-solujen läsnä tai poissa ollessa Wnt3a (Fig. S1E).

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa olemme tutkittiin miten DDX3X hankkimiseen EGFR-TKI vastus keuhkojen syöpäsoluja. Tuloksemme paljasti, että syöpäsolut kätkeminen EGFR-aktivoivia mutaatioita voi sammuttaa EGFR signalointi ja menettää EGFR-signaalin riippuvuus. Tyr jäämiä EGFR keuhkosyöpä solut yli-ilmentävät DDX3X ei fosforyloitu vaikka läsnä EGF. Tämä oli odottamaton ja yllättävä havainto, koska EGFR-aktivoivia mutaatioita aiheuttaa EGFR kinaasin domeenin pysyä aktiivisessa konformaatiossa, vaikka ligandit puuttuvat, jolloin fosforylaatiota tyrosiinitähteiden C-terminaalinen häntä segmenttejä. Tarkka mekanismi, jonka avulla DDX3X inhiboi fosforylaatiota tyrosiinitähteitä EGFR on epäselvä. Kuitenkin inhibitio tyrosiinikinaasin aktiivisuus on todennäköisesti mukana, koska ei vain tyrosiinitähteitä altistetaan autofosforyloituvan C-terminaalisen hännän segmentit, mutta myös Tyr845 kinaasidomeenissa, joka voidaan myös fosforyloida Src, eivät olleet fosforyloituja. Havainto, että DDX3X välittämä Wnt /β-kateniinin signalointi on yhdenmukainen hiljattain raportin, jossa kuvataan Wnt riippuvan stimulaation kaseiinikinaasi 1 ja edistäminen epäsiisti fosforylaation DDX3X nisäkässoluissa [33]. Lisäksi koko-exome analyysit tunnistettu DDX3X komponenttina patogeenisen β-kateniinin signalointi, vuonna Wnt alaryhmä medulloblastoma [12] – [14]. Yhdessä meidän nykyinen data ja nämä aikaisemmat tutkimukset osoittavat, että DDX3X on kriittinen tekijä Wnt /β-kateniinin signalointireitin ja että signaali kytkentä välillä EGFR riippuvuus p-kateniinin signalointia voitaisiin indusoida DDX3X keuhkojen syöpäsoluja kätkeminen EGFR- aktivoivia mutaatioita.

DDX3X on RNA-helikaasi, joka on erittäin konservoitunut hiivasta ihmisen ja moduloivat rakenteen RNA: [34]. Siten RNA helikaasit uskotaan osallistua RNA transkriptio, silmukointi, ja kääntäminen. Ihmisen DDX3 on kaksi läheistä sukua geenien, DDX3X ja DDX3Y, jotka on koodattu X ja Y-kromosomia, vastaavasti. DDX3Y on ainutlaatuinen ilmaistaan ​​sukusolujen ja on välttämätön siittiöiden [35]. Kiinnostavaa kyllä, havaitsimme, että DDX3X indusoidun syöpäsolujen mukana varsi kaltaiset fenotyypit, kuten voimistunut ilmentyminen Sox2, ALDH, ja CD44. Lisäksi ankkurointi riippumaton leviämisen, kadheriinin vaihtamalla E-kadheriinin N-kadheriinin, vimentiinistä ilme, havaittiin näissä soluissa. Vastaa meidän havaintojen kasvaimet kätkeminen ilmen- tymisen lisääntymisen DDX3X on raportoitu olevan varsi-kaltaisia ​​ominaisuuksia ja /tai näyttöä EMT melanooma, rintasyöpä, ja leukemia [8], [10], [12], [36]. Erityisesti, medulloblastooma, jossa DDX3X on osoitettu toimivan kuljettajan geeni, on samanlainen ulkonäöltään ja erilaistumisen potentiaalin hermostoputken kanta- ja progenitorisolujen. On kuitenkin ainutlaatuinen havainto, että käsittelemättömiä keuhkoadenokarsinooma solut sisälsivät alapopulaatio voimakkaasti ilmentävien DDX3X ja mukana signaali kytkentä, CSC kaltainen fenotyyppejä, ja todisteet EMT.

Yhteenvetona, tässä tutkimuksessa edellyttäen ensimmäinen osoitus siitä, DDX3X aiheuttama menetys EGFR-signaalin riippuvuus johtaa vastustuskyvyn EGFR-TKI, mukana CSC kaltaisia ​​ominaisuuksia ja esiintyminen EMT keuhkojen syöpäsoluja kätkeminen EGFR-aktivoiva mutaatio.