Krooninen sairaus

tiivistelmä

Pään ja kaulan alueen okasolusyöpä (HNSCC) on 7

th yleisin syöpä maailmassa. Vaikka uusien terapeuttisten aineiden, kuten monoklonaalisia vasta-aineita, ennuste ei muutu viime vuosikymmeninä. Kylmä ilmakehän plasma (CAP) esittelee lupaavin uusi tekniikka syövän hoidossa. Tässä tutkimuksessa tehoa pinnan mikro purkaminen (SMD) plasman laitteessa kahta pään ja kaulan alueen syöpä solulinjoissa todistettiin. Vaikutukset solujen elinkykyä, DNA: n fragmentoituminen ja apoptoosin induktio arvioitiin MTT-määritystä, emäksinen mikrogeelidispersion elektroforeesi (comet) ja anneksiini-V /PI värjäystä. MTT-analyysi paljasti, että CAP hoito vähentää merkittävästi solun elinkelpoisuuden kaikissa testatuissa hoitoon kertaa (30, 60, 90, 120 ja 180 s). IC 50 saavutettiin maksimaalinen 120 sekunnin CAP hoitoa. Comet määritys osoitti annosriippuvaisen korkea DNA pirstoutuminen on yksi tärkeimpiä toimijoita syövän vastaista aktiivisuutta CAP. Anneksiini-V /PI-värjäys paljasti apoptoosin CAP käsiteltiin HNSCC solulinjoissa, mutta ei ole merkittävää annoksesta riippuvuutta havaittiin. Niinpä vahvistettiin, että SMD Plasma tekniikka on varmasti lupaava uusi lähestymistapa syövän hoidossa.

Citation: Welz C, Emmert S, Canis M, Becker S, Baumeister P, Shimizu T, et al. (2015) Cold Ilmakehän Plasma: Lupaava Täydentävä terapia Squamous pään ja kaulan alueen syöpä. PLoS ONE 10 (11): e0141827. doi: 10,1371 /journal.pone.0141827

Editor: Michael Hamblin, Massachusetts General Hospital, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 21 huhtikuu 2015; Hyväksytty: 13 lokakuu 2015; Julkaistu: 20 marraskuu 2015

Copyright: © 2015 Welz et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: työtä tukivat Friedrich-Baur-Stiftung Munich (GrandNumber 40/13) [https://www.baur-stiftung.de/front_content php? idcat = 76]. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Vaikka kirjoittajat J. Zimmermann T. Shimizu ja G. Morfill ei liity terraplasma GmbH tuolloin, että tutkimukset tehtiin, nykyinen työllisyys edustaa koettu taloudellinen kilpailevan etua yhtiön ja sen työntekijät todennäköisesti hyötyvät menestyksestä kylmän ilmakehän plasmatekniikka. Tietenkin sama pätee minkä tahansa määrän plasman yrityksiä, joiden osalta tulosten julkaisua tarjoaa ilmaisen tutkimuksen panos sekä toimintavapauden.

Johdanto

Pään ja kaulan alueen okasolusyöpä (HNSCC), mukaan lukien pahanlaatuisten suuontelon, nielun ja kurkunpään, on 7

th yleisin syöpä maailmassa vaikuttavat yli 4% koko määrä uutta syöpätapausta vuonna 2012. Tämä tarkoittaa, lähes 600.000 uusia tauteja diagnosoidaan vuosittain maailmanlaajuisesti [1]. 2014, 55,070 uutta tapausta ja 12000 kuolemantapausta arvioidaan USA: ssa. Keskimääräinen 5 vuoden pysyvyys on noin 50%, mikä on lähinnä korkea etäpesäkkeiden, toinen maligniteetit ja erityisesti paikallisen uusiutumisen näistä kasvaimista [2]. Huolimatta uusia lähestymistapoja hoitoon pään ja kaulan alueen syöpä, kuten monoklonaalisia vasta-aineita yleisen eloonjäämisen ei voitu olennaisesti lisääntynyt viime vuosikymmeninä, joka pyytää kehittämään uusia kasvaimia torjuvan lähestymistapoja ja tekniikoita. Koska sen ominaisuudet, kylmä ilmakehän plasmaa (CAP) on lupaavin ja mahdollinen kehittyminen tällä alalla.

Plasma voidaan yksinkertaistettu kuvata osittain tai kokonaan ionisoitunut kaasu. Synteettinen syntyy plasmaa kuten argon plasma coagulator ovat jo työkaluja lääketieteessä [3]. Kuitenkin, koska niiden korkean lämpötilan ( 10.000 ° C) niitä voidaan käyttää vain ablaatiota tai hyytymisen varten [4]. Koska muutaman vuoden plasmaa voidaan muodostaa ionin lämpötilassa, joka on lähellä huoneen lämpötilaa. Nämä niin kutsutut kylmä ilmakehän plasmat ovat jo osoittautuneet valtavan antimikrobisia kliinisissä kokeissa ja avannut monenlaisia ​​lääketieteellisiin sovelluksiin erityisesti kaikille lämpöherkän ja elintärkeää pintoja kuten ihmisen ihon tai limakalvon [5-10].

lisäksi Mikrobien sovellus, viimeaikaiset tulokset esiin kasvaimia torjuvaa potentiaalia CAP. Biologisia vaikutuksia ja mekanismeja yhä puutteellisia [11-15]. Jotkut kirjoittajat kuvaavat apoptoosin induktio reaktiivisen hapen (ROS) [13,14]. Muut kirjoittajat selittävät plasma vaikutuksia mekanismeilla kuten kuolion ja solujen irtoaminen [12]. Lisäksi jotkut tutkimukset osoittaneet vaikutusta solusyklin, kuten solukierron pysähtymisen tai induktion vanhenemisen mekanismien CAP [15,16]. Lisäksi meidän työryhmä osoitti palauttaminen herkkyyden kemiallis-resistenttien glioomasoluihin CAP [17]. Vertailu ja tulosten tulkinta näiden eri CAP tutkimukset koskien ”anti-syöpä ominaisuus” on hyvin vaikeaa. Tämä liittyy myös käyttöön eri teknologioiden (pinta micro purkaminen (SMD), dielektrinen purkaminen (DBD), plasmasuihkujen tai neuloja) ja niiden sovelluksia. Näin ollen eri kemia, koostumus ja pitoisuudet plasmassa tuotteiden, reaktiivisen hapen ja typen lajit, elektroneja, ioneja, UV-valon ja lämpötilan tutkittiin. Kuitenkin, lähes kaikki tutkimukset voisivat nähdä kasvaimia torjuvaa vaikutusta moniin eri pahanlaatuisia soluja. Lisäksi vaikutus näkyy spesifisyys kasvainsolujen [13-15,18,19].

korostaen tätä hypoteesia meidän työryhmä osoitti, että CAP hoito terveen ihmisen limakalvon kudosviljelmissä (nielun ja nenän) indusoi vain vähäinen sytotoksisuus, mutta ei merkittävää genotoksisia vaikutuksia jopa 120 sekuntia plasmakäsittely [20].

tämän tutkimuksen tavoitteena oli arvioida kasvaimen kasvua estävän tehon meidän CAP laitteen kahta squamous pään ja kaulan syöpäsolujen linjat ( OSC-19 ja Fadu) sekä tutkia mahdollisia mekanismeja aiheuttaa tämän vaikutuksen. Järjestelmällinen keskitytään sytytettiin akuutti sytotoksisuuteen (MTT-määritys), DNA-pirstoutuminen (Comet määritys) ja apoptoosin induktio (anneksiiniV /PI). Plasmakäsittely suoritettiin käsin ja akkukäyttöinen laite, joka toimii pintaan Micro Discharge (SMD) tekniikka [21].

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

Fadu solulinja, joka on peräisin matalan porrastettu kielen syöpä [22], hankittiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). OSC 19 solulinja saatiin 1989 peräisin hypopharyngeal syöpä kasvaa in vivo hyvin eriytetty okasolusyöpä suurella nopeudella etäpesäkkeiden [23] ja ostettiin JCBR Cell BANK. OSC 19-soluja kasvatettiin DMEM /Ham’s F-12 (Biochrom AG, Berliini, Saksa) ja Fadu solut DMEM (Biochrom). Molemmat solulinjat myös täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (Gibco, Carlsbad, CA, USA) ja 10 U /ml penisilliiniä-streptomysiiniä (Biochrom). Fadu solut lisäksi täydennetty 1% ei-välttämättömiä aminohappoja (Invitrogen, Karlsruhe, Saksa) ja jokainen 1%: lla L-glutamiinia ja natriumpyruvaattia (Biochrom). Soluja pidettiin 37 ° C: ssa 5% CO

2 alle kostutetussa olosuhteissa.

Plasma Hoito

Tutkimus toteutettiin ns MiniFlatPlaSter®, kädessä pidettävä CAP laite joka käyttää Surface Micro Discharge (SMD) tekniikka plasman tuotannon ilmassa [21] (kuvio 1). Tiedot laitteen ja sen plasma kemian julkaistu Welz et al. [20] ja Maisch et ai. [24]. Taulukossa 1 on esitetty tärkein, muodostaa tuottaman plasman laitteen.

pitoisuus reaktiivisten lajien mitattiin ajan funktiona; edellä mainitut arvot ovat keskiarvoja yli 1 minuutin.

SMD elektrodi koostuu lasista epoksi aluksella, joka on kerrostettu kuparifoliokerroksen ja ruostumattomasta teräksestä Verkkokuvioitu. Soveltamalla korkea pulssi kaltainen jännite 7 kV (huipusta huippuun), jonka toistotaajuus 6,75 kHz plasma tuotetaan homogeenisesti on Verkkokuvioitu puolella ilmassa. Siten syntyy lajit kuljetetaan soluihin diffuusiolla. Toisin kuin sähköeristeessä (DBD) laitteet-käytetyistä SMD laitteita valmistaa hyvin pienillä virroilla (taulukko 1), joka takaa turvallisen käytön, jos käytetään in vivo.

kokeissa 5×10

5 syöpäsolut olivat sijoitetaan 6-kuoppaisille levyille ja annettiin kiinnittyä 24 h tunnin ajan samoissa olosuhteissa edellä kuvatulla tavalla. Ennen CAP hoidon, solujen viljelyväliaine poistettiin, niin että solut weren’t nesteen peitossa. CAP-elektrodi on rakennettu, jonka halkaisija on 28 mm, niin, että se sopii täydellisesti vanteen yksi hyvin. Tämä suljettu tilavuus kunnossa koko YMP hoito rajoittaa tuotetun laji (kuvio 2) sisälle. Välinen etäisyys elektrodin ja solut vastasi 17,5 ± 0,5 mm. Lämpötila kaivon pohjalle ei kasva enempää kuin yhden asteen Celsius jälkeen 180 s CAP hoitoa. Yhdessä hakemuksen diffuusion, nestehukka vaikutuksia solujen katsotaan olevan epätodennäköistä. CAP hoitoajat 30, 60, 90, 120 ja 180 s käytettiin. Sulkea pois plasman epäspesifiset vaikutukset (esimerkiksi ”kuivaus vaikutukset”) mahdollisena bias, erillinen ohjaus jokaiselle hoitoaika suoritettiin. Tämä tarkoittaa, että vastaavat kontrollit käsiteltiin samalla tavalla kuin vastaava plasmakäsittely kokeissa, paitsi että ohjaus solut eivät saa plasmakäsittely. Solujen alustaa lisättiin kaikkiin kuoppiin heti CAP altistuksen.

elinkykyyn /MTT-määritys

Sytotoksisuus mittaukset suoritettiin käyttäen Cell Proliferation Kit I Roche Diagnostics (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Saksa) mukaan käyttöohjeen. Seurata solujen elinkelpoisuuden muutoksia sen jälkeen, kun eri CAP hoidon kertaa, kuten edellä on kuvattu, käsiteltyjen solujen ja vastaavien verrokkien trypsinoitiin ja ympättiin 8000 solua /kuoppa (100 ui) 96-kuoppaiselle levylle. Cell myrkyllisyys mitattiin 24 tunnin kuluttua plasmakäsittely korvaamalla viljelyalustaa 10 ui merkintöjä alustassa, joka sisälsi 0,5 mg /ml MTT. 4 h inkuboinnin kostutetussa atmosfäärissä (37 ° C: ssa, 5% CO

2), 100 ui MTT-värjäys lisättiin kuhunkin kuoppaan, jota seuraa inkubointi yön yli. Violetti formatsaanikiteet väriaine kvantitoitiin käyttäen VERSAmax ™ ELISA- Reader (Molecular Devices GmbH, Biberach, Saksa) aallonpituudella 550 nm. Viittaus aallonpituus vastaa 690 nm. Jokainen koe sisälsi kolmena mittauksia solujen elinkelpoisuuden väheneminen jokaisen plasmakäsittely kerta. Lisäksi kukin koe toistettiin viisi kertaa (mittaukset kullekin hoidolle hetkellä n = 15). Keskimääräinen solujen elinkelpoisuuden väheneminen käyrät standardoitu alentuneesta prosenttiosuus eläviä soluja, kun taas kontrolli solut asetettiin 0%.

DNA-vaurioita /Comet määritys

määrällisesti DNA vahingoista jälkeen eri CAP hoidon arviointi emäksinen mikrogeelidispersion elektroforeesi (Comet määritys) suoritettiin. Periaatteessa protokolla pystyy tunnistamaan DNA-säikeen katkoksia yksittäisissä soluissa, alkali-labiili sivustoja (ALSs) ja epätäydellinen Leikkauskorjauksessa [25].

Mittauksissa trypsinointi tehtiin heti CAP hoidon inkuboimalla 1 ml trypsiini /EDTA-liuosta 8-10 min. Neutraloinnin jälkeen ja sentrifugoimalla (10 min, 900 U /min), solujen laskenta ja solujen elinkyky näytön trypaanisinieksluusiolla testi suoritettiin. Jokaisena dia 200.000 solut levitettiin ja peitettiin 0,5% normaalia sulaminen agaroosia (Biozym) varmistaa vakautta agaroosin kerroksiin. Solujen hajottamista varten levyt peitettiin emäsliuoksella 1 h (10% DMSO, 1% Triton-X, 2,5 M NaCl, 10 mM Trizma-Base, 100 mM Na

2 EDTA ja 1% N -lauroylsarcosine natriumsuola) . Sitten levyt pantiin geelielektroforeesilla kammion (Renner, Dannstadt, Saksa) ja inkuboitiin 20 minuutin ajan alkalisella puskuriliuosta, joka sisälsi 300 mM NaOH: a ja 1 mM Na2EDTA, pH 13,2. Tämän jälkeen DNA purkautumisen aikana, elektroforeesi aloitettiin 0,8 V cm-1 ja 300 mA, ja jatkettiin 20 min, minkä jälkeen neutralointi (Trisma emäs, 400 mM, pH 7,5, Merck, Saksa).

Ennen määritystä DMLB mikroskooppi (Leica, Bensheim, Saksa) fluoresoiva DNA värjäys suoritettiin 75 ul etidiumbromidia (Sigma; [51 uM]). 80 soluytimet per slide (2 liukuu kohti CAP hoitoaika) valittiin satunnaisia ​​kuvio ja digitoitu liitteenä yksivärinen CCD-kamera (Cohu Inc., San Diego, CA, USA).

Korkea DNA pirstoutumista /DNA-vaurion johtaa nopeammin ja kulkeutumisen edelleen sähkökentässä, koska ehjän DNA: n ei siirry (kuvio 3). DNA-muuttoliikettä mitattiin kuva-analyysi-ohjelmisto Komet ++ (Kinetic Imaging, Liverpool, UK) käyttämällä% DNA hännän. Että% hännän DNA on mitta suhteellinen fluoresenssin voimakkuus pään ja hännän.

Vahingoittumatonta OSC-19 solujen ehjän DNA ja Hikoilematon. DNA: n fragmentoituminen johtaa nopeampaan ja edelleen kulkeutuminen sähkökentän, joka johtaa kuvassa muotoinen komeetta ehjä DNA pään ja vaurioitunut DNA häntää (B + C). Kirkkaampi ja pidempään hännän, korkeamman tason DNA pirstoutuminen. B OSC-19 solu kohtuullisella CAP aiheuttama DNA-vaurioita. C Edustavia kuva korkean DNA-pirstoutuminen.

Apoptosis havaitseminen

Apoptoosin 24 tunnin kuluttua CAP hoidon tutkittiin fluoresenssimikroskopialla käyttäen anneksiini V-FITC havaitseminen pakki (PromoKine , Heidelberg). CAP hoito ja trypsinointi suoritettiin edellä kuvatulla tavalla. Kokeisiin 1×10

5 solut suspendoitiin uudelleen 500 ul: aan sitovaa paisuttimeen liuosta ja inkuboitiin 5 minuutin ajan punaista valoa 5 ui anneksiini V-FITC: llä ja 5 pl propidium- iodid (PI). Translokaatio phosphatidylserin (PS) sisäisestä ulkoiseen pintaan solukalvon on varhainen vaihe, Apoptosis. Anneksiini-V on kalsium-riippuvainen fosfolipidin sitova proteiini, jolla on korkea affiniteetti PS, joten sitä voidaan käyttää herkkä leima apoptoottisten solujen. Yhdistämällä anneksiini V merkintöjä, joiden PI-värjäys mahdollistaa erottelu elinkelpoinen, varhainen apoptoottiset ja myöhäinen apoptoottiset /nekroottisia soluja (kuvio 4). 100 solua kohti CAP hoidon laskettiin ja varhaisen apoptoottiset solut tunnistettiin ja indeksit laskettiin.

saadut tulokset fluoresenssimikroskopialla osoittavat, että varhainen apoptoottisia soluja ovat sitoutuneet anneksiini-FITC on phosphatidylserin kalvon pinnalle (vihreä solu) . Apoptoosin edetessä, solukalvon eheyden katoaa, ja propidiumjodidin kykenee sitoutumaan Nukleotidi DNA, niin, että myöhään apoptoottisten tai nekroottisten solujen näkyy punaisena.

Tilastollinen analyysi

Ellei muualla huomattava tiedot ilmoitettiin aritmeettinen keskiarvo ± SEM. SigmaPlot ohjelmisto Windows versio 12.0 (2011 Systat Software Inc. CA, USA) käytettiin tilastollisiin analyyseihin. Laskemiseksi tilastollista merkitystä tulosten Friedmanin toistettujen mittausten varianssianalyysi riveissä ja All Pairwise Multiple vertailumenettelyjä (Student-Newman-Keuls menetelmä) käytettiin. Erot katsottiin merkittävästi p-arvot 0,05, ennen tilastollista analyysiä.

Tulokset

annosta riippuvainen väheneminen solujen elinkelpoisuuden jälkeen CAP hoidon

Kuvio 5 esittää väheneminen elinkelpoisuutta OSC-19 ja Fadu syöpä solut sen jälkeen, kun CAP altistuminen hoitoja 30, 60, 90, 120 ja 180 s verrattuna käsittelemättömiin kontrolleihin. Solujen elinkyky kvantitoitiin käyttäen MTT-määritys, kuten on kuvattu menetelmät jaksossa. Vähentäminen elinkelpoisuuden asetettiin 0% siten, että tulokset -expressed negatiiviseen prosenttia ohjaus- mahdollistavat ulkoasun vertailun kahden solulinjoista. Sillä Fadu solujen solujen elinkelpoisuus heikkeni huomattavasti eli 4,8% (p 0,05) on CAP käsittelyaika 30 s verrattuna kontrolleihin. Käsittelyaika on 60 s aiheuttamaa vähennystä 23,4% (p 0,05), joka oli tilastollinen merkitsevyys kontrolleihin verrattuna ja 30s. Pidemmät hoitoajat 90 s ja 120 s putosi elinkelpoisuus 43,6 vastaavasti 49,2%. Verrattuna kontrolleihin ja ennen lyhyemmät hoitojen kertaa 30 s ja 60 s nämä vähennykset olivat erittäin merkitsevä (p 0,001). Käsittelyaika on 180s vähenee Fadu elinkelpoisuutta 51,4%. Kun kyseessä on 90 s ja 120 s tämä oli merkittävä väheneminen verrattuna kontrolleihin ja käsittelyajat jopa 60 s (p 0,05). Vertailu 90, 120 ja 180 s osoitti enää merkittävästi solujen elinkelpoisuuden väheneminen (p 0,05).

Sekä HNSCC solulinjoja elinkelpoisuuden pienenee lisäämiseksi CAP hoitoajat. Keskivirheet keskiarvon, kuvattu parta blots.

OSC 19 solujen elinkelpoisuus aleni 20%, kun käsittelyaika on 30 s ja 31,2% 60 s vastaavasti. Pidemmät hoitoajat (90 s ja 120 s) indusoi edelleen vähentämään solujen elinvoimaisuuden 51,7% (90) ja 64,1% (120 s). Kaikki elinkelpoisuus vähennykset olivat tilastollisesti merkitseviä verrattuna käsittelemättömiin kontrolleihin ja tunnetun lyhyemmät käsittelyajat (p 0,05). 180 s hoidon johtavat edelleen vähennys 73,3%, mikä oli merkittävä verrattuna kontrolleihin ja käsittelyajat jopa 90 s (p 0,05).

induktio DNA-vaurioita CAP

tutkia, ajasta riippuva vähennys solujen elinkelpoisuutta ja kiihtyvällä vauhdilla apoptoosin johtuu CAP aiheuttama DNA vahingoittaa emäksinen mikrogeelidispersion elektroforeesi määritys suoritettiin. Kuviot 6 ja 7 esittävät prosenttiosuus hännän DNA kunkin solulinjan yksityiskohtaisesti.

Standard box-kaavioita (alakvartiili, mediaani, yläkvartiili) käytettiin kuvaavat tuloksia. Dots tarkoittavat lievä tilastollinen harha (1,5 ja 3 kertaa kvartiiliväli (IQR)); tähdellä tarkoittavat äärimmäisen tilastollinen harha (yli 3 kertaa IQR).

Standard box-kaavioita (alakvartiili, mediaani, yläkvartiili) käytettiin havainnollistamaan tuloksia. Dots tarkoittavat lievä tilastollinen harha (1,5 ja 3 kertaa kvartiiliväli (IQR)).

analyysi kokeiluja käyttäen Fadu solulinja (kuvio 6) ei paljastanut mitään merkittävää lisäystä DNA-vaurioita kontrolleihin verrattuna (4,2%; p 0,05) 30 s plasman hoitoa (4,8% DNA: tail). 60 s merkittävää lisäystä% hännän DNA (7,6%) verrattuna käsittelemättömiin kontrolleihin (p 0,05) ja CAP kesto 30 s (p 0,05) havaittiin. Pidempiaikaisen lisäsi DNA pirstoutuminen 14,8% (90 s) vastaavasti 17,9% (120 s). Verrattuna kontrolleihin, 30 s ja 60 s CAP hoito tämän lisäys oli tilastollisesti merkitsevä (p 0,05). Lisääntyvä DNA-vaurioita 90 s 120 s YMP hoidon havaittiin tilastollisesti merkittävä samoin. CAP kesto 180 s johtaa edelleen DNA pirstoutumista 20,5% DNA: häntää. Verrattuna käsittelemättömiin kontrolleihin ja kaikki muu käsittely kertaa tämä lisäys 180 s oli tilastollisesti merkitsevä (p 0,05).

OSC 19 solut 30 s plasmakäsittely indusoi DNA: n fragmentoituminen 4,0%, mikä ei ollut merkittävä verrattuna käsittelemättömiin kontrolleihin (3,1%; p 0,05). Pidemmät CAP hoito (60 t ja 90 t) indusoi kasvua DNA-vaurioita 6,5% (60) ja 9,6% (90 s). Samanlainen Fadu solulinjakokeissa tämä lisäys osoitti merkitys (p 0,05) verrattuna kontrolleihin ja kukin ennen hoitoa kerta. Todellakin, 120 s ja 180 s edelleen kasvua DNA-fragmentaation havaittiin (9,8% 120 s, 12,7% 180: n), mutta tämä lisäys ei ollut merkitsevä verrattuna ennen kesto 90 s (p 0,05). Kuvassa 7 on esitetty% hännän DNA OSC 19 soluja yksityiskohtaisesti.

CAP aiheuttaman apoptoosin

selvennetään jos aikariippuvainen lisäys DNA-vaurioita aiheuttaa apoptoosia ja jos vähennys solujen elinkelpoisuus voidaan selittää by ohjelmoidun solukuoleman, anneksiiniV /PI värjäys suoritettiin 24 tunnin kuluttua CAP hoidon. Kuten on esitetty kuvioissa 8 ja 9, plasma indusoi apoptoosia sekä solulinjoissa. 180 s plasman hoito johti yli 4-kertainen nousu varhaisen apoptoottisten solujen verrattuna kontrolleihin (p ≤ 0,002). Yksityiskohtaisesti, ja Fadu-solulinjassa (kuvio 8) käsittelemätön kontrolli osoitti, keskimäärin 1,9% apoptoottisia soluja. Jälkeen CAP käsittelyaika on 30 s lievää kasvua apoptoosin (3,6%) havaittiin, mikä oli merkittävä kontrolleihin (p 0,01). 60 sekunnin kuluttua keskimäärin 5,5% soluista oli apoptoottisia ja kesto 90 s korotettiin apoptoottisten solujen 7,3%. Kontrolleihin verrattuna ja kullekin lyhyempi käsittelyaika tämä nousu oli tilastollisesti merkitsevä (p 0,05). Pidemmät hoitoajat 120 s ja 180 s osoitti yhä hinnat apoptoottisten solujen 8,5%, vastaavasti 7,5%. Verrattuna tarkastuksia ja käsittelyajat jopa 60 s nämä hinnat olivat tilastollisesti merkitseviä (p 0,05), mutta ei ole merkitystä nähtiin verrata toisiinsa ja 90 s (p 0,05).

käsittelemätön OSC 19 solut osoittivat keskimäärin 2,6% apoptoottisia soluja (kuvio 9). CAP hoitoajat 30 s, lievää kasvua apoptoosin 4,4% havaittiin, mutta nämä tiedot eivät ole merkittäviä. Korkki käsittelyaika on 60 s osoittivat keskimäärin 5,5% apoptoottisia soluja, mikä on merkittävä kasvu kontrolleihin verrattuna (p 0,05). 90 s hoito korotettiin apoptoottisten solujen 5,9% ja 120 s 6,4%. Molemmat kestot osoitti merkittävää lisäystä apoptoottisten solujen korko verrattuna hoitamattomiin soluun (p 0,05), mutta ei ole merkitystä nähtiin verrattaessa sitä lyhyemmät hoitoajat. Hoito aika 180 s indusoi 11,3% apoptoottisia soluja. Tämä lisäys oli tilastollisesti merkitsevä kontrolliin verrattuna ja kaikki aikaisemmat käsittelyajat (p 0,05).

Keskustelu

on yksi eniten potentiaalia aineita vastaan ​​mikro-organismi ja todiste sen kliinisissä kokeissa, CAP lääketiede on nopeasti kasvava tutkimuskohde ja kehittää merkityksen kasvaessa terveydenhuollossa. Syövän hoito on lupaavin uusi lääketieteelliseen käyttöön CAP. In vitro ja in vivo tutkimuksissa erilaisissa kasvaimissa paljasti vahvan ja erityisiä vaikutuksia syöpäsolujen ja estäminen syövän kasvua [14-16,18,19]. Näyttää siltä, ​​että CAP voi aiheuttaa solusyklin pysähtymiseen ja riittävän suurina annoksina aiheuttaa apoptoosin ja nekroosin syöpäsoluissa. Kuitenkin tarkka mekanismit CAP vaikutuksista jäävät epäselviksi.

tuotanto reaktiivisen typen ja hapen lajien CAP ajatellaan olevan keskeinen toimija aloittamista havaitut suorat kasvaimen kasvua estävä vaikutus. Useat julkaisut viittaavat solunsisäisen ROS /RNS tasojen päälle CAP hoito, aiheuttaen siten DNA-vaurioita ja apoptoosin kasvainsoluissa [13,14,26]. Vandamme et ai. osoittivat annos riippuen apoptoosin induktion jälkeen CAP pahanlaatuisen gliooman (U87MG) ja peräsuolen karsinooma (HCT-116) solujen [14]. Apoptoottisen solukuoleman selitetään myös seurauksena ROS vaikutuksia. Paitsi ROS aiheuttama DNA-vaurioita seuraa apoptoosin on kuvaavia tietoja akuutti sytotoksinen /nekroottinen vaikutus [12]. Kuten tänään ei ole tietoja, joiden tehosta SMD plasma laitteiden tuottaman CAP vastaan ​​pään ja kaulan alueen syöpäsoluja. Kuitenkin erityisesti elimet luonnon aukon kuten ihon ja limakalvon ylemmän aerodigestive suolikanavan (suuontelon, nielun, osat hypopharynx ja kurkunpään) CAP paljastaa erittäin voimakkaita hoitovaihtoehtoja syöpä pään ja kaulan. Lisäksi meidän handheld SMD laite, tuottaa plasmaa ympäröivässä ilma pääsee HNSCC diffuusion kautta välttäen kantokaasun tai kaasun virtausta. Täten oletamme, että laite voi aiheuttaa hoidon ajan riippuen solukuoleman HNSCC solulinjoissa.

solunelinkykyisyysmäärityksen osoittivat, että CAP oli merkittävä kasvainten vastainen aktiivisuus Fadu ja OSC-19-solulinjojen kanssa IC

50 120 s (Fadu) ja 90 sekuntia (OSC-19) valotusaikaa. In OSC-19 solulinjat, kesto 180s johti noin 75% solukuolemaan. Nämä tulokset ovat linjassa useita tutkimuksia, jotka osoittivat kasvaimen vastaisen aktiivisuuden CAP eri pahanlaatuisten solulinjojen lukien melanooma, gliooma, hepatosellulaarinen, ja kolorektaalisyövän [11,13,14,27-30]. Vertailun vuoksi myös tutkimuksia terveillä limakalvojen soluviljelmissä samalla laitteella ja samoissa koeolosuhteissa osoitti vain solun elinkelpoisuuden väheneminen 15% sen jälkeen 120 s plasmakäsittely [20]. Näin osoitimme, että SMD plasma laite tehoaa HNSCC solulinjoja kun terveitä soluja pysyä lähes muuttumattomana.

Lisäksi leikkaus, sädehoito (RT) on merkittävä välinettä ensisijainen HNSCC hoidossa ja välttämättömiä adjuvantti strategioita [31] . Tärkein mekanismi syövän vastaista aktiivisuutta vastaavasti kyky sädehoidon ovat säteilyn aiheuttaman DNA vahingoista joka aloittaa solusyklin muutoksia ja signaali kaskadeja lopulta johtaa solun kuolemaan. Sen selvittämiseksi, CAP pystyy myös aiheuttaa DNA-vaurioita HNSCC soluissa, jotka voisivat olla vastuussa käsittelyaika riippuvainen elinkelpoisuuden väheneminen, emäksinen mikrogeeli elektroforeesi tekniikka (Comet määritys) suoritettiin on hyvin herkkä havaitsemaan yksittäisen DNA-säikeen katkoksia (SSBs) , kaksinkertainen säikeen katkoksia (DSB: t) ja alkali-labiili sivustoja (ALSs). Koska SSB ja /tai ALS esiintyy todennäköisemmin kuin DSB ja muut DNA muutokset, kuten DNA-siltoja tai intercalations, emäksinen mircogel elektroforeesi on erittäin herkkä kvantifioimiseksi alhainen DNA-vaurioita, mikä tekee siitä ylivoimainen muihin genotoksisuuskokeiden [25,32] . Tästä huolimatta suuri herkkyys on syytä mainita, että DNA-korjausmekanismit ja niiden seurauksena solun elinkelpoisuuden ei pidetä tällä menetelmällä Meidän testissä havaittiin merkittävä käsittelyaika vastaavasti annosriippuvainen lisäys DNA-vaurioita molemmissa HNSCC solulinjoissa. Verrattuna terveille limakalvon solukkoviljelmät CAP [20], joka on jopa nelinkertaisesti DNA pirstoutuminen syöpäsoluissa havaittiin. Siksi tuloksemme osoittavat, että CAP tai sen tuotteiden vuorovaikutuksessa DNA HNSCC solulinjojen, ja pystyy aiheuttamaan tappavan DNA-vaurioita, mikä voi selittää annosriippuvainen syövän vastaista aktiivisuutta meidän SMD plasman laitteessa.

analyysit annoksesta riippuva DNA-vaurioita indusoi apoptoosia ja onko hoito ajasta riippuva väheneminen solujen elinkelpoisuuden on seurausta apoptoottisen prosessin olemme suorittaneet anneksiiniV /PI-värjäyksen. 60 sekunnin kuluttua hoidon ajan ja pidempään, meidän CAP laite indusoi apoptoottisen solukuoleman molemmissa solulinjoissa verrattuna käsittelemättömiin kontrolleihin. Kuitenkin vertaamalla hoitoa kertaa erikseen, ei ollut merkittävää annoksesta riippuvainen kasvua apoptoottisten solujen. Vain pitkät hoitoajat vastaavasti suuri plasma annokset indusoivat korkea apoptoottisten solujen OSC-19-solulinja, joka on sopusoinnussa tulosten Arndt et al. Tässä tutkimuksessa, joka suoritettiin samalla plasma laitetta käytimme (MiniFlatPlaSter®), ja sen vuoksi oli sama plasmafysiikkaan ja kemiallinen koostumus, hoitoajat 120 s aiheuttaa DNA-vaurioita ja voimakkaasti lisääntynyt apoptoosin melanoomasolulinjoja. Mikäli lyhyempiä hoitoajat lähes apoptoottisen solu- oli havaittu mutta paljastui vanhenemista induktio [16].

jälleen korostaa, että vertailu eri kokeista suoritettiin erilaisilla CAP laitteilla on vaikeaa, koska eri CAP parametrit ja malleja eli DBD tekniikka, ladontatekniikkaa, tehontarve, jännite, taajuus, kantokaasun jne tuloksena merkittäviä eroja tuotannossa niiden osia. Mutta kokeet suoritetaan yhtä suuri plasman laite myös johtaa erilaisiin tuloksiin, kun eri solulinjoissa (pahanlaatuinen /ei-pahanlaatuinen) kohdistetaan. Kuitenkin selektiivinen sytotoksinen vaikutus syöpäsoluihin on syntymässä korrelaatio tulosten erilaisia ​​kokeiluja CAP pahanlaatuisiin soluihin [14,15,18,19]. Tämän mekanismia valikoivuus jää epäselväksi. Mutta meidän tutkimuksia epiteelisolujen, CAP näyttää yhtäläisyyksiä syövän vastaisen mekanismeja säteilylle osoittaa korkea DNA-vaurioita ja solukuolemaa korkea lisääntyvien syöpäsoluissa, kun taas vähäinen lisääntyvien terveen limakalvon näyttää vaikuttavan vähemmän sama kohtelu . Kuitenkin vaatia valikoivuus koskevat HNSCC solujen ja tervettä kudosta, lisää vastaavia tutkimuksia syöpäsoluihin pään ja kaulan ja limakalvon ovat suoritettava [20] .Tämä on ensimmäinen tutkimus, jossa arvioidaan vaikutuksia SMD laitteiden tuottaman maatalouspolitiikkaan HNSCC solulinjat. Annoksesta riippuva korkea väheneminen solujen elinkelpoisuuden havaittiin, joka osittain aiheuttaman apoptoosin induktion. Lisäksi hoito aika riippuu korkea DNA pirstoutuminen havaittiin, joka on luultavasti avainasemassa koskevat syöpäsolun kuoleman. Näillä tuloksilla olemme vahvistaneet, että SMD plasma tekniikka on erittäin lupaava uusi lähestymistapa pään ja kaulan syövän hoitoon.

tukeminen Information

S1 File. Raw Data.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0141827.s001

(XLSX)

S2 tiedosto. Tilastoraportti.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0141827.s002

(DOCX) B