Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Syöpä kantasolut (CSCS) uskotaan olevan vastuussa kasvaimen uudistumista kemoterapian jälkeen, vaikka välitön vahvistus tämä on edelleen tulevan. Siksi tutkittiin, onko lääkehoito voi rikastuttaa ja ylläpitää CSCS ja onko korkea tumorogeenistä ja metastaattisen kyvyt CSCS perustuivat merkittyihin kykyyn tuottaa kasvua ja angiogeenisten tekijöiden ja ilmaista sukulais reseptoreita stimuloivan kasvainsoluproliferaation ja strooman muodostumista.

Menetelmät /havainnot

keuhkosyövän kasvainsolujen doksorubisiinin, sisplatiinin tai etoposidin johti valinnassa huumeiden eloonjääneiden solujen (DSC). Nämä solut ilmaisivat CD133, CD117, SSEA-3, TRA1-81, Oct-4, ja ydin- β-kateniinin ja menetti ilmaus Differentiaatiomarkkerien sytokeratiineja 8/18 (CK 8/18). DSCt pystyivät kasvamaan kasvainten aloilla, säilyttää kyky uusiutua, ja erilaistua. Eriytetyn esiasteita menetti ilmaisua CD133, sai CK 8/18 ja hankittu huumeiden herkkyys. Läsnäollessa huumeita, erilaistuminen DSC kumottiin mahdollistaa etenemisen solujen CSC kaltaisia ​​ominaisuuksia. Lung DSCt osoitti korkea tumorogeenistä ja metastaattista potentiaalia seuraavan inokulaatiokokein SCID hiiriin, jotka tukevat niiden luokittelun CSCS. Luminex-analyysi ihmisen ja hiiren sytokiinien sonikoitiin lysaateissa parental- ja CSC-johdettu kasvainten paljasti, että CSC-johdettu kasvainten sisälsi kaksi- kolme kertaa korkeammat tasot ihmisen angiogeenisten ja kasvutekijöitä (VEGF, bFGF, IL-6, IL- 8, HGF, PDGF-BB, G-CSF, ja SCGF-β). CSCS osoitti myös kohonneet ilmentymisen ihmisen VEGFR2: n, FGFR2, CXCR1, 2 ja 4 reseptoreihin. Lisäksi ihmisen CSCS kasvava SCID-hiirissä stimuloi hiiren stroman tuottamaan kohonneet angiogeenisten ja kasvutekijöiden.

Johtopäätökset /merkitys

Nämä havainnot viittaavat siihen, että kemoterapia voi johtaa leviämistä CSCS ja ehkäisy niiden erilaistumista. Korkea tuumorigeenisemmiksi ja metastaattisen potentiaalit CSCS liittyy tehokas sytokiinien verkoston tuotanto, joka voi edustaa tavoitteeksi lisätä tehoa syövän hoidossa.

Citation: Levina V, Marrangoni AM, DeMarco R, Gorelik E, Lokshin AE ( 2008) Drug-Selected Human Lung Cancer Kantasolut: Sytokiini Network, Kasvaimia synnyttävä ja Metastasoitunut Properties. PLoS ONE 3 (8): e3077. doi: 10,1371 /journal.pone.0003077

Editor: Nils Cordes, Dresdenin teknillinen yliopisto, Saksa

vastaanotettu: toukokuu 25, 2008; Hyväksytty: 08 elokuu 2008; Julkaistu: 27 elokuu 2008

Copyright: © 2008 Levina et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Näitä tutkimuksia tukivat avustuksia RO1 CA098642, R01 CA108990, Avon (NIH /NCI), Susan Komen Foundation (AEL), ja DOD BC051720 avustusta, avustusta Harry Lloyd hyväntekeväisyysjärjestönä Hillman Foundation ja Pennsylvania Department of Health (EG).

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

viime vuosina merkittävää kokeellista näyttöä on luotu tueksi roolin pienen populaation itseuudistuvien soluja, jotka voivat ylläpitää pahanlaatuinen kasvain [1], [2]. Tämä populaatio kutsuttiin syöpään aloittamista soluja tai syövän kantasolut (CSCS) niiden suuri kapasiteetti itseuudistumisen, multilineage erilaistumista ja ylivoimainen tasot maligniteetti. CSCS on tunnistettu ja eristetty eri pahanlaatuisia sairauksia, kuten rinta-, aivo-, eturauhas-, haima-, keuhko-, ja paksusuolen syöpä [3] – [11].

CSCS tunnistettiin käyttämällä virtaussytometrialla perustuva solujen lajittelu ja NOD /SCID-hiiriin ksenografti. CSCS ilmaista kudosspesifisiä solunpintamarkkereiden: esimerkiksi rintojen CSCS ilmaista CD44 + /CD24

alhainen [3], ja aivot, eturauhasen, keuhkojen ja haiman CSCS ilmaista CD133 + [2], [4], [7], [8 ], [10].

virtaussytometrialla-pohjainen solujen lajittelu, joka mahdollistaa eristäminen ”puolella väestö” (SP) kanssa rikastettua syövän kantasoluja aktiivisuus kuvattu Goodell et ai [12]. SP solut on ominaista selvä alhainen Hoechst 33342 väriaine värjäystä, johtuu ilmaus ABCG2, ATF-sitova kasetti (ABC) transporter [13]. SP-soluissa osoittavat myös suurempaa tuumorigeenistä kapasiteettia kuin ei-SP-solujen [13] – [15]. Virtaussytometrialla perustuvat menetelmät lajittelu CSCS, käyttämällä erityisiä kudosta CSC markkereita sekä muodostumista pallomaisten klustereita itsereplikoituvan soluihin [16] – [18], sallivat eristyksen solupopulaation rikastettu alussa esisolujen /kantasoluja .

Koska niiden korkea lääkeresistenssin ja tuumorigeenisyystesti, CSCS uskotaan olevan vastuussa kasvaimen uudistumista kemoterapian jälkeen [19], [20], vaikka välitön vahvistus tämä on vielä tulossa. Siksi hypoteesina, että CSCS voidaan rikastaa ja sen jälkeen eristetään kasvainsolupopulaatioissa seuraavat lääkehoitoa.

Esillä olevassa tutkimuksessa lääkkeen eloonjääneiden solujen (DSC) eristettiin ihmisen syöpäsolulinjasta sisplatiinia, doksorubisiini tai etoposidi . Eristetty DSCt näytteillä korkea klonogeeniset valmiuksia, rikastettu SP soluja, ilmentyminen CSC solun pinnan ja kantasolujen markkereita, kapasiteetti itseuudistumisen, sukupolven eriytetyn jälkeläisten, ja korkea Tuumorigeenisuustutkimuksissa seuraavat SCID elinsiirron. Olemme päätellä, että nämä DSCt olivat CSCS.

On myös ehdotettu, että CSCS on suuri metastaattista potentiaalia [21]. Äskettäin suhde haiman CSCS ja kasvaimen etäpesäkkeiden osoitettiin [8]. Olemme osoittaneet, että huumeiden eristetty keuhko CSCS on korkea metastaattinen potentiaali.

On edelleen epäselvää, mitä ominaisuuksia CSCS antaa lisääntynyt tuumorigeenisyyteen ja metastaattisen potentiaalia. Oletimme, että kasvaimia ja metastaattisen kyvyt CSCS perustuivat niiden selvää kykyä tuottaa kasvua ja angiogeenisten tekijöiden, jotka stimuloivat kasvainsolujen proliferaatiota sekä muodostumisen edistämiseksi kasvaimen verisuoniston jotta happea ja ravinteita paikallista kasvaimen kasvun tai kaukainen kasvun jälkeen levittäminen kasvainsolujen eri anatomisia paikoissa. Siten tehokkaan tuotannon kasvun ja angiogeenisten tekijöiden on perustavanlaatuinen ominaisuus kasvaimeen aloittamista soluihin. VEGF on voimakas angiogeeninen tekijä [22], kun taas kasvutekijät, kuten bFGF, EGF, ja HGF voi stimuloida ei ainoastaan ​​kasvainsoluja, mutta myös endoteelisoluissa ja näin ollen ilmeisen proangiogeeninen ja antiapoptoottisten vaikutukset [23]. Osa tiedoista osoittaa, että kemokiinien, kuten IL-8 (CXCL8), MCP-1 (CCL2), ja RANTES (CCL5), ei vain edistää maahanmuuttoa, mutta myös lisääntymistä kasvaimen ja stroomasolujen, mukaan lukien endoteelisolujen [24]. Äskettäin on osoitettu, että IL-8 esittelee voimakas angiogeeninen aktiivisuus kautta transaktivaation VEGF-reseptori 2 (VEGFR2) [25]. Näin ollen erilaisia ​​kasvaimen tuottaa tekijöiden (sytokiinien, kemokiinien, angiogeeninen ja kasvutekijöitä) on päällekkäisten edistää kasvaimen kasvua. Lukuisat kokeelliset ja kliiniset tiedot osoittavat, että neutralointi kasvun tai angiogeenisten tekijöiden, tai estää niiden reseptorin signalointi, voi estää kasvaimen kasvua ja vahvistavat näiden tekijöiden kasvainsoluproliferaation [26]. Siten tuotannon kasvusta ja angiogeenisten tekijöiden CSCS näkyy välttämättömiä heidän tuumorigeenisemmiksi ja metastaattisen potentiaalin. Kuitenkin tämä CSC sytokiinien ja kasvun /angiogeenisen tekijän verkko ei ollut aiemmin tutkittu.

Siksi tässä tutkimuksessa, suoritimme kattavan analyysin erilaisten sytokiinien, kemokiinien ja kasvutekijät tuottama vanhempien H460 kasvainsoluja ja eristetty CSCS käyttäen multiplex xMAP tekniikkaa (Luminex Corp., Austin, TX), mikä mahdollistaa samanaikaisen analyysi lukuisia liukoisen tekijät. Tämä analyysi suoritettiin

in vitro

viljeltyjä soluja ja

in vivo

hyödyntäen ihmisen kasvaimen ksenosiirrettyjä malli SCID-hiirissä. Ihmisen kasvaimet kasvavat SCID-hiirissä koostuvat ihmisen kasvainsoluissa ja hiiren strooman. Sonikoitiin otteita ksenosiirrettyjä ihmisen kasvaimista sisälsi tuottamat sytokiinit ihmisen kasvainsoluissa sekä hiiren stroomasoluissa. Pitoisuudet kunkin sytokiinien voidaan analysoida multiplex sarjat kehitetty erityisesti havaitsemiseksi ihmisen tai hiiren sytokiineja. Tämä voisi antaa tietoja sytokiiniverkoston tuottama CSCS ja niiden kyky stimuloida strooman muodostumiseen.

tutkimukset osoittavat, että lääke elossa keuhkojen kasvainsolujen ovat luonteeltaan CSCS, ja tuottavat kohonneet useiden sytokiinien, kemokiinien, kasvuun ja angiogeenisten tekijöiden ja niiden reseptorien. Nämä havainnot tuovat uutta tietoa meidän mekanismien ymmärtämistä vastaavan korkean tuumorigeenisemmiksi ja metastaattisen potentiaalin keuhkojen CSCS ja niiden kyky selviytyä kemoterapiaa.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat

Ihmisen viljeltyjä syöpäsolulinjoissa, OVCAR-3 (munasarja), MCF-7 (rinta), ja H460 (keuhko), saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). Soluja kasvatettiin elatusaineissa, suosittelema ATCC, täydennetty 20% FBS (Millipore Inc., Billerica, MA).

reagenssit

sisplatiini, doksorubisiini, etoposidi ja Hoechst 33342 olivat Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Fluorikromi-konjugoituja vasta-aineita ihmisen CD24, CD34, CD44, CD24, CD117, CD90, VLA-4, ja VLA-5 olivat Beckman Coulter (Fullerton, CA). Vasta-aineet FGFR2, VEGFR1, VEGFR2 ja CXCR1, 2, 4 olivat R fluoresenssi mitattiin 515 nm: n puolella väestön suodatin (Hoechst sininen) ja 608 EFLP optisen suotimen (Hoechst punainen). Instrument voitot säädettiin asettaa tärkein solu kohortin, jossa suurin osa soluista, jotka sisältävät yhden kopion DNA keskellä tonttien. CD133 + solut lajiteltiin vanhempien keuhkosyöpään H460 käyttävästä väestöstä MoFlo taussytometrin ja vakioprotokolla immunofluoresenssivärjäyksellä.

Soluvärjäys menettely Cellomics ArrayScan automatisoitua kuvantamisen

Solut fluoresoivasti värjättiin edellä kuvatulla [27]. Lyhyesti, soluja kasvatettiin 96-kuoppalevyillä, pestiin FACS-puskurilla, inkuboitiin vasta-aineita CD24, CD34, VLA-4, VLA-5, VLA-6, CD44, CD87, CD90, CD117, FGFR2, VEGFR1 ja VEGFR2 konjugoitu FITC, PE, tai PC5, 1 h, kiinnitettiin 2% PFA: ssa 20 minuutin ajan, pestiin PBS: ssä, ja värjättiin Hoechst 33342. testaamiseksi CD133, CXCR1, CXCR2 ja CXCR4 ilme, soluja inkuboitiin kunkin ensisijaisen vasta-aineiden ja sitten sekundaarinen vasta konjugoitu Alexa 488, 546 tai 680 fluorokromit (Molecular Probes /Invitrogen) 1 tunti. Sitten solut värjättiin Hoechst 33342.

havaitsemiseksi solunsisäisiä proteiineja, solut kiinnitettiin, permeabilazed, ja inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla vastaan ​​alkion kantasoluja markkereita, β-kateniinin, ja sytokeratiineja 8/18 1 h ja toissijainen vasta konjugoitu Alexa 488, 546 tai 680 fluorokromit (Molecular Probes /Invitrogen) 1 tunti. Sillä Aktiinisytoskeletonin värjäystä, soluja inkuboitiin Alexa Fluor 488 falloidiinia 1 tunti. Solutumat värjättiin Hoechst 33342 2 ug /ml 20 min tunnistaa yksittäiset solut ja optimoida keskittyen.

tahrata kasvaimen aloilla, kaikki käsittelyt tehtiin alla mikroskooppisen ohjaus: kasvaimen aloilla asetettiin hellävaraisesti yksittäisiin kuoppiin ultra low tarttuva 96-kuoppalevyille, ja inkubointi ensimmäisen ja toisen vasta-aineet olivat samat kuin edellä on kuvattu adherenttiviljelmiä.

Kaikki inkuboinnin ja kiinnittäminen menettelyt suoritettiin huoneen lämpötilassa.

Cellomics ArrayScan automatisoitu kuvantamisen

Cellomics ArrayScan HCS Reader (Cellomics /ThermoFisher, Pittsburgh, PA) käytettiin keräämään tietoa jakelusta fluoresoivasti leimattuja komponenttien värjättyjen solujen. ArrayScan HCS järjestelmä skannaa useita kenttiä yksittäisissä kuopissa, hankkiminen ja analysointi kunkin kennon kuvien mukaan määriteltyjen algoritmien. Skannerin on varustettu päästöjen ja herätesuotimet (XF93, Omega Optical, Brattleboro, VT, USA) selektiivisesti kuvantamisen fluoresoivat signaalit. Data otettiin kiinni, uutettu ja analysoitu ArrayScan II tietojen hankinnan ja tietojen Viewer versio 3.0 (Cellomics), Quattro Pro versio 10.0.0 (Corel, Ottawa, Ontario, Canada), ja MS Excel 2002 (Microsoft, Redmond, WA).

Culture keuhkosyöpään pallojen

Jousitus kasvu arvioitiin metyyliselluloosa-pohjainen (MC-pohjainen) väliaineessa kuvatulla [16], [17]. Lyhyesti, H460-soluja ja huumeiden valitut solut suspensoitiin uudelleen 0,8% MC-pohjainen seerumittomalla väliaineella (Stem Cell Technologies, Vancouver, Kanada), johon oli lisätty 20 ng /ml EGF: ää (BD Biosciences), bFGF, ja 4 ug /ml insuliinia (Sigma ) ja maljattiin 500-10000 solua /ml ultra low kiinnittyvä 24-96 kuoppalevyille (Corning, Corning, NY). EGF, bFGF (20 ng /ml), ja insuliinin (4 ug /ml) lisättiin joka toinen päivä kahden viikon ajan. Elatusaine korvata tai täydentää tuoreella kasvutekijöiden kahdesti viikossa. Voidakseen arvioida itseuudistuvien potentiaali solujen palloja kerättiin varovasti sentrifugoimalla, hajotetaan yksisolususpensioi-, suodatetaan ja viljeltiin edellä kuvatuissa olosuhteissa.

eriyttäminen

Solut erillään aloilla (kolmannen sukupolven) maljattiin 1 x 10

4 solua /ml 96-kuoppaisille levyille, jotka on esipäällystetty kollageeni IV (BD Biosciences) viljelyväliaineessa, johon on lisätty 10% FBS: ää ilman kasvutekijöitä ja siirrettiin uudelle levylle, kun viljelmät saavuttivat yhtymäkohta. Testata itseuudistuvien potentiaalin erilaistuneita soluja, solut siirrettiin semi- seerumittomassa alustassa, johon oli lisätty EGF, FGF, ja insuliini ja niiden kyky muodostaa kasvaimen palloja arvioitiin kuten edellä on kuvattu. Suorittaa fenotyyppinen karakterisointi solujen aloilla ja solujen erilaistumisen jälkeen, solut siirrostettiin 96-kuoppalevyille (5 x 10

3 solua /kuoppa) ja värjättiin erilaisia ​​vasta-aineita, kuten edellä on kuvattu.

Chemotherapy vastus tutkimukset

H460 emosoluista, jotka oli saatu keuhkosyöpä aloilla, ja kolmen viikon kuluttua CSCS erilaistumisen solut maljattiin 96-kuoppaisille levyille, jotka on esipäällystetty kollageeni IV (BD Biosciences) ja niitä viljeltiin RPMI 1640-alusta täydennettynä 10% FBS: ää. 24 tunnin kuluttua doksorubisiinin ja sisplatiini lisättiin loppupitoisuuksiin (0,016-025 ug /ml ja 0,165-3,30 g /ml, vastaavasti). 72 tunnin kuluttua hoidon, solut värjättiin Hoechst 33342, ja solujen lukumäärä kuoppaa kohti laskettiin Cellomics Array Scan VTI (Cellomics /ThermoFisher, Pittsburgh, PA), kuten on kuvattu [27].

Migration ja invaasiomääritys

migraatio ja hyökkäys aktiivisuutta kasvainsolujen vastauksena ihmisen rekombinantti IL-8 (100 ng /ml) mitattiin BD BioCoat Matrigel Invasion Chambers (BD Biosciences, San Jose, CA) mukaan valmistaja protokollaa.

Analyysi tuumorigeenisemmiksi ja metastaattisen ominaisuudet DSCt ja H460 kasvainsolujen

Kokeet suoritettiin mukaisesti antamat ohjeet Pittsburgh University Institutional Animal Care ja Käytä komitea (IACUC) ja National Institute of Health Guide for Care ja koe-eläinten käytön. SCID-hiiriin, 7-8 viikkoa vanhoja (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME), pidettiin eläimen laitoksen yliopiston Pittsburgh Cancer Institute (UPCI).

Jos haluat vertailla tuumorigeenisia ominaisuuksia, H460-solujen ja DSCt kerättiin ja injektoitiin (200 ui PBS: ää) ihon alle (sc) SCID-hiirissä, joiden pitoisuudet ovat 5 x 10

3-5 x 10

5 solua per hiiri (5 hiirtä ryhmää kohti) ilman Matrigel. Kasvaimet mitattiin kahdesti viikossa. Hiiret lopetettiin, kun niiden kasvaimet mitataan noin 2 cm halkaisijaltaan.

analysoida kyky H460-solujen ja CSCS muodostaa etäpesäkkeitä, 5 x 10

4-solut ympättiin suonensisäisesti (iv) häntälaskimoon SCID-hiirten. SCID hiiret olivat T, B, ja NKT solujen puutteesta vaan oli aktiivinen NK-solut, jotka voisi poistaa ihmisen kasvainsoluja veressä stream. Heikentävistä NK-solut, SCID-hiiriin istutettiin intraperitoneaalisesti (i.p.) 0,2 ml: lla anti-asialo-GM1-IgG (laimennettu 1:20) 24 tunnin ajan ennen i.v. ymppäyksen kasvainsolujen [28]. 60 päivän kuluttua hiiret tapettiin; keuhkot, maksa, ja munuaiset poistettiin ja kiinnitetty Bouinin ratkaisu; ja etäpesäkenystyröiden laskettiin alla preparointimikroskooppia.

valmistaminen kasvainuutteiden

kasvaimia kasvanut s.c. SCID-hiirissä poistettiin ja pikajäädytettiin nestemäisessä typessä. Jäädytetyt kasvaimen kudokset leikattiin, sonikoitiin 20 s, ja sentrifugoitiin 15000 g: ssä 10 min solujätteiden poistamiseksi. Kasvaimen uutteet säilytettiin -80 ° C: ssa.

Multiplex analyysi sytokiinien

analyysi ihmisen sytokiinien ja kasvutekijöiden solukasvatusväliaineessa ja sonikoitiin kasvaimen lysaateissa suoritettiin käyttäen multiplexing xMAP tekniikkaa (Luminex Corp., Austin, TX). Multiplex sarjat havaitsemiseksi 49 ihmisen sytokiinien: IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12p40, IL -13, IL-15, IL-17, GM-CSF, IFN-α, TNFa, MCP-1, MCP-2, MCP-3, IP-10, MIP-1α, MIP-1β, RANTES, VEGF, bFGF G-CSF, eotaksiini, HGF, MIG, GROα, sIL-2R, sVCAM-1, CTACK, LIF, M-CSF: n, NGF, PDGF-BB: SCF, SCGF-β, SDF-1α, TNF-β, TRAIL IFN γ, EGF, TNFRI, TNFRII, DR5, IL-1Rα, ja sIL-6R hankittiin BIO-RAD Laboratories (Hercules, CA). Multiplex kit toteamiseen SFA sFasL, TGFa, fraktalkiini, sCD40L, TRAP, CS154, MIF, sVCAM-1, sICAM-1, MPO, Adiponectin, MMP-9, ja tPAI-1 hankittiin Linco /Millipore (St. Louise, MO). Kitti havaitsemiseksi MMP-2 ja MMP-3 ostettiin R 0,05.

Tulokset

eristäminen CSCS perustuu niiden vastustuskyky kemoterapeuttisia lääkkeitä

Munasarjojen OVCAR -3, rinta MCF-7, ja ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) H460-soluja käsiteltiin sisplatiinin (1-5 uM), etoposidi (1-5 uM) tai doksorubisiinin (0,067-0,125 ug /ml) 3 päivää. Suurin osa soluista kuoli. Yli seuraavien 7 päivän joitakin eloonjääneiden solujen muistuttivat senescent solujen laajentunut ja litistetty morfologia [30]. Nämä ”senescent” solut kasvoivat kooltaan suurempia ja kuoli viikoilla 2-4. Ensimmäisen viikon aikana, kun lääkehoitoa, pieni, pyöreä, tai kara-muotoinen solut pienemmillä sitoutuminen havaittiin, ja niiden kasvava pesäkkeitä vähitellen korvannut ”senescent” solujen lääkettä saaneissa syöpäsolun populaatioiden (kuvio 1A). Oletimme, että huumeiden elossa pienet solut CSCS. Tämän varmistamiseksi laajennetun lääke eloonjääneiden solujen (DSC) analysoitiin niiden klonogeeniset kapasiteettia, SP fenotyyppi, CSC markkereita, kyky uusiutua, kyky erilaistua, ja tuumorigeenisemmiksi ja metastaattinen potentiaali.

, morfologia vanhempien MCF7, OVCAR3 ja H460-solujen ja huumeiden selviytyi soluja (DSC).

MCF-7 ja H460-soluja käsiteltiin doksorubisiini (0,125 ug /ml); OVCAR-3 soluja käsiteltiin sisplatiinin (3,3 ug /ml). 48 tunnin kuluttua lääkkeiden poistettiin ja huumeisiin eloonjääneiden solujen (DSC) viljeltiin 3-4 viikkoa.

B, Lisääntynyt pesäkemuodostuksen DSCt eristetty vanhempien MCF7 (rinta), H460 (keuhko) ja OVCAR-3 (munasarja) syöpäsolun linjat.

Solut ympättiin 0,5 solua /kuoppaa kohti 96-kuoppalevyillä elatusaineita täydennetty 10% FBS: ää ja soluja kasvatettiin kaksi viikkoa. Prosenttiosuus pesäkemuodostuksen laskettiin. *** – P 0,001.

C, analyysi puolella väestöstä (SP) yleensä DSC ja vanhempien MCF7, OVCAR-3 ja H460 solulinjoissa

. Tuumorisolut värjättiin 5 ug /ml Hoechst33342 (HO). Joitakin soluja esikäsiteltiin 10 uM fumitremorgin C (FTC) 10 min ennen Hoechst lisäksi (HO + FTC). Solut suspendoitiin uudelleen RPMI 20% FBS: ää ja 2 ng /ml propidiumjodidia ja lajitellaan käyttäen MoFlo-sytometrillä. Tiedot elävät solut analysoitiin muuttujien korrelaatiot ja selityksin käyttämällä FCS Express.

kyky muodostaa klooneja DSCt

klonogeeniset kapasiteetti vanhempien H460, OVCAR3, ja MCF7-solut ja DSC populaatioiden testattiin kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Alle 40% emosoluilta pystyivät muodostamaan klooneja, kun taas klooni muodostava kapasiteetti DSC oli yli kaksinkertaiseksi suurempi (kuvio 1 B).

Analyysi SP fenotyypin

analyysi SP jakeet paljasti, että testattu vanhempien solulinjat erosivat osuuden SP fraktion, jotka vaihtelevat 0,6% OVCAR3, 0,5% MCF7, 5,2% H460-soluissa (kuvio 1 C). SP solufraktiois- olivat huomattavasti korkeammat DSC populaatioissa vaihtelee 10,7% MCF7, 15,6% vuonna OVCAR3 35,3% H460. Erillinen pieni Hoechst 33342 värjäytymistä SP solujen syyksi on ilmaus ABCG2, ATF-sitova kasetti (ABC) transporter [13]. Arvioidaan ABCG2 transporter toimintaa, fumitremorgin C (FTC), joka on ABCG2 spesifinen estäjä käytettiin. SP osa DSC solujen väheni merkittävästi läsnä ollessa FTC (kuvio 1 C), mikä vahvistaa säätelyä ABCG2 kuljettajan yleensä DSC.

Analyysi CSCS ja alkion kantasolujen (ESC) merkkiaineiden

Cellomics Array Scan HCS Reader (Cellomics /ThermoFisher) käytettiin kuvantaminen ja analyysi ilmaisun CSCS ja alkion kantasolujen merkkiaineita yleensä DSC. Tämä lähestymistapa perustuu yhdistelmään mikroskopia ja virtaussytometrialla menetelmät 96-kuoppaisen. Edut lähestymistapaan kuuluu: 10 kertaa vähemmän soluja tarvitaan kuin virtaussytometriseen analyysiin, multi-spektrin fluoresenssi mikro-kuvantaminen on automatisoitu, ja kuvat tallentuvat, visualisoidaan ja analysoitiin käyttämällä tehokkaita ohjelmistosovelluksia.

analyysi paljasti, että DSC väestön MCF-7-solut olivat CD44 positiivisia, joilla on alhainen CD24 ilmentymisen (tietoja ei ole esitetty), joka vastaa aiemmin tunnistettu fenotyypin rintojen CSCS [3]. DSCS munafollikkelista OVCAR-3 line ilmaistaan ​​CD44 + ja ES merkki Oct-4 (tuloksia ei ole esitetty).

Tähän mennessä ihmisen keuhkojen CSCS huonosti ominaista [10], [15]. Siksi keskittyneet seuraavaksi luonnehdinta CSC kiinteistöjen DSCt keuhkosta H460 kasvainsolulinja. CD34, CD24 /CD44, CD87, ja CD90 solunpintamarkkereiden ei osoittanut differentiaalikaavojen välillä H460- vanhempien ja DSC väestö (tuloksia ei ole esitetty), kun taas eristetty ihmisen keuhkojen DSCt rikastettiin varten CD133 + väestöstä (kuviot A, B). Me seuraavaksi analysoitu ilmentymisen alkion kantasoluilla (ESC) markkereita, podocalyxin antigeenejä, TRA-1-60, TRA-1-81, glykolipidisurfaktanttia antigeenejä, vaiheessa antigeenejä SSEA-3, 4, ja transkriptiotekijä Oct-4, H460 vanhempien soluissa ja eristyksissä DSCt. Korkeampi ilmentymä TRA-1-81, SSEA-3, ja Oct-4 havaittiin eristetyissä DSCt verrattuna vanhempien H460 soluja (kuvio 2C, D), joka tukee meidän oletetaan, että DSCt ilmeinen merkkiaineita, jotka liittyvät lyhytsanomapalvelukeskukset.

H460-solujen ja DSCt, kasvaa 96-kuoppalevyillä, kiinnitettiin ja inkuboitiin ensisijaisen Abs vastaan ​​CD 133, TRA-1-81, SSEA-3, Oct-4, tai cytokeratins8 /18 ja sitten johdetun Abs. Solujen tumat värjättiin Hoechst 33342. Cell kuvat hankittiin käyttämällä Cellomics ArrayScan HCS Reader (20X, 40X tavoitteet) ja analysoitiin käyttämällä Target Activation BioApplication Software Module.

A Immunofluoresoivat kuvia syöpäsolujen. B, fluoresenssin intensiteetti (pix) on CD133 piirrettiin kohdealueeksi.

Jokainen piste edustaa yksittäinen solu. Solut oikealla punainen viiva ovat CD133 + (edellä IgG kontrolli värjäys).

C, Kuvat syöpäsolujen immunofluorescently värjätään kasvainsolut TRA-1-81, SSEA-3 ja Oct-4

ES-solujen markkereita. D. Fluoresenssin intensiteetti TRA-1-81, SSEA-3 ja Oct-4, funktiona kohdealueeksi. Jokainen piste edustaa yhden solun. Solut oikealla punainen viiva ovat positiivisia (yli IgG kontrolli värjäys). E,

Kuvia immunofluorescently värjätään kasvainsolut cytokeratins8 /18.

F,

Fluoresenssin intensiteetti cytokeratins8 /18 H460-soluissa (mustat pisteet) ja DSC (harmaa pistettä) piirrettiin kohdealueen

.

Alhainen differentiaatiomarkkeri sytokeratiineja (CK) ilmentyminen DSCt

Keuhkosyöpä solujen tiedetään ilmaista tyypin I CK18 ja tyypin II CK8 sytokeratiineja, tunnettu Differentiaatiomarkkerien näissä soluissa [31]. Vertasimme ilmaus CK8 /18 H460-soluissa ja DSCt. Verrattuna vanhempien H460 solulinjaan, DSC ilmaisi hyvin alhainen CK8 /CK18 (kuvio 3D, E), mikä osoittaa alhainen eriyttäminen tilan eristetyn DSCt.

Solut kiinnitettiin ja inkuboitiin Alexa Fluor® 488 phalloidin tai primaaristen Abs vastaan ​​β-kateniinin ja johdetun Alexa Fluor 488 konjugoitu Abs. Seuraavaksi solut värjättiin Hoechst33342. Cell kuvat hankittiin käyttämällä Cellomics ArrayScan HCS Reader (20X tavoite) ja analysoitiin käyttämällä Compartment Analysis BioApplication Software Module ja Target aktivointi BioApplication Software Module.

A Kuvia H460-solujen ja DSCt immunofluorescently värjättiin β-kateniinin (A).

B,

keskimäärin fluoresenssin voimakkuus ydin- β-kateniinin H460 (musta viiva) ja DSC (harmaa viiva)

.C,

keskimäärin fluoresenssin voimakkuus solun fosfori- β-kateniinin H460 (musta viiva) ja DSC (harmaa viiva). D, Cytoskeleton kuvia H460- solujen ja DSCt immunofluorescently värjättiin phalloidin ja Hoechst33342.

β-kateniinin ilmaisu

Wnt signalointia proteiinien on osoitettu olevan rooli säätelyssä kantasolujen itseuudistumisen. β-kateniinin on keskeinen toimija Wnt koulutusjakson, lähettävät Wnt signaaleja tumaan ja ratkaiseva rooli kasvainten synnyssä [32] – [34]. Tässä olemme analysoineet solunsisäistä jakelua β-kateniinin H460-soluissa ja DSC. DSC osoitti huomattavasti korkeampia koko ja ydinvoiman β-kateniinin kuin vanhempien H460-solut (kuvio 3A, B), kun taas fosforyloitu β-kateniinin oli läsnä matalalla tasolla DSCt verrattuna vanhempien H460 soluja (kuvio 3C). Tiedetään, että erilaistuneet solut, joissa Wnt signalointi puuttuu, taso β-kateniinin säätelee multiproteiinikompleksissa ”tuhoa monimutkainen”, joka sitoo ja fosforyloi β-kateniinin, mikä kohdistaminen sen ubikinaation ja proteolyyttisen hajoamisen [32]. Kantasoluja, jossa Wnt ligandit esitetään, tämä ”tuhoa kompleksi” estyy, mikä estää β-kateniinin fosforylaation ja hajoamista, mikä johtaa vakautus- ja ydinvoiman translokaation β-kateniinin [32] – [34]. Siten korkea ydinvoiman kertyminen β-kateniinin ja alhainen fosforyloidun β-kateniinin viittaavat aktiivisen Wnt signalointia DSCt.

Analyysi solumigraation ja ilmaisun VLA adheesiomolekyylien

morfologinen analyysi DSCt ja vanhempien H460 soluja paljasti eroja solujen muoto ja liimausominaisuuksiensa viittaa mahdolliset erot niiden solun tukirangan organisaatiossa. Tämän hypoteesin testaamiseksi käytimme Alexa 488 phalloidin visualisoida F-aktiini. Kuten kuviossa 3D, vanhempien H460 solut ovat pyöreä muoto ja tasainen jakautuminen F-aktiini sytoplasmassa, kun taas jotkut DSC on lamellipodial laajennus ja aktiini piikkejä kärjessä solujen. Nämä tulokset viittaavat siihen, että DSCt on suurempi ”vaeltavat fenotyyppi” kuin vanhempien H460-soluissa. Olemme tutkineet muuttavien kapasiteettia H460- solujen ja DSCt käyttäen

in vitro

maahanmuutto- ja invaasiomääritys käyttäen IL-8 kemoatrak-. Kun taas vain 13,7% vanhempien H460 solujen tunkeutuneet läpi matrigeelin, 87,5% ja DSC olivat invasiivisia.

Adheesiomolekyylit, kuten integriinit, helpottaa solujen selviytymistä signalointi ja osallistuvat liikkuvuudessa, solujen välistä adheesiota, kemotaksista, ja etäpesäkkeiden [35]. Vertasimme ilmaisu integriinien VLA-4, VLA-5, ja VLA-6 H460-soluissa ja DSCt. Huomasimme, että DSCt oli merkittävästi korkeampi VLA-5 ja alempien VLA-6 verrattuna vanhempien soluihin, kun taas VLA-4-tasot olivat samanlaiset sekä alapopulaatioiden (kuvio 4D). Menettämään kasvainsolujen tarttumisen voi laukaista apoptoosin. Tämä apoptoosin muodossa, indusoi seurauksena menetys solun tarttumisen alustaan, nimettiin anoikis. Alhainen tarttuvuus DSCt voivat vähentää niiden riippuvuutta jotkut elossa signaaleja ja johtaa vastustuskyvyn anoikis. Anoikis-resistentit solut osoittivat suurempi metastaattisen kyvyn [36].