Krooninen sairaus

tiivistelmä

Neoplastiset epiteelisolujen tuottavat eniten aggressiivinen syöpien, kuten sijaitsevat keuhko-, rinta-, paksusuoli-, eturauhas- ja munasarja. Aikana pitkälle edennyt eturauhassyöpä, epiteelisolut liittyvät ulkonäön androgeenista riippumaton kasvaimet, apoptoottinen kestävä fenotyypin lopulta overgrows ja edistää metastaattisen tapahtumia. Olemme aikaisemmin tunnistettu ja neurofysiologisesti ominaista uudenlainen Ca

2 + -permeable kanava aktivoida apoptoosin androgeenisäädellyn riippumaton eturauhasen epiteelin tasyöpäsolulinja, LNCaP. Lisäksi raportoimme ensimmäistä kertaa kloonauksen ja karakterisoinnin tämän kanavan kaltaisen molekyylin nimeltä apoptoosin säätelemä proteiini 2 (ARP2) liittyvät tappava tulva Ca

2+

Xenopus

varhaismunasolujen. Esillä olevassa tutkimuksessa, LNCaP-solut ja kiinanhamsterin munasarjasolut (CHO-solulinja), transfektoitiin

arp2-

cDNA indusoidaan läpikäymään apoptoosin esittää merkittävä vaikutus solujen elinkelpoisuuteen ja kaspaasien aktivaatio 3 ja 7 verrattuna seerumin riistää kasvanut solujen ja ionomysiinillä käsitellyt solut. Sijainti solussa on ARP2 CHO-soluissa, joissa apoptoosi tutkittiin konfokaalimikroskoopilla. Vaikka apoptoosin edetessä ARP2 aluksi lokalisoitu peri-ydin- alueen solujen kulkeutuu ajan kohti solukalvon alueella. Perustuen esillä olevat tulokset ja ne meidän aiempien tutkimusten, että ARP2 muodostaa uusi kationi kanava tukee. Näin ollen, ARP2 tulee arvokas tavoite moduloida virtaa ja kalsiumpitoisuuden sytoplasmassa epiteelisyöpäsolujen esittää apoptoottisten kestävä fenotyypin aikana puhkeamista apoptoottista tapahtumaa.

Citation: Mas-Oliva J, Navarro -Vidal E, Tapia-Vieyra JV (2014) ARP2, Novel proapoptoottisen proteiini ilmoitettuna epiteelikasvaimet Eturauhassyöpä LNCaP ja epiteelikasvaimet munasarja CHO transformoidut solut. PLoS ONE 9 (1): e86089. doi: 10,1371 /journal.pone.0086089

Editor: Antimo Migliaccio, II Università di Napoli, Italia

vastaanotettu: 15 maaliskuu 2013; Hyväksytty 11 joulukuuta 2013 mennessä; Julkaistu: 22 tammikuu 2014

Copyright: © 2014 Mas-Oliva ym. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat CONACyT (Grant 141588) ja DGAPA-UNAM (Grant IN-205711/2) myönnetään Jaime Mas-Oliva. Enrique Navarro-Vidal tukivat stipendejä Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, (CONACyT) (251040). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

karsinoomat että löytää niiden alkuperä epiteelisoluissa ovat yleisin syöpätyyppi aikuisilla ja muodostavat 80-90% kaikista syövistä, mukaan lukien ne, jotka sijaitsevat keuhko-, rinta-, eturauhas-, munasarja- ja paksusuolen. Epiteelisolujen muun lokalisoinnit, linja sisäisiä onteloita ja muodostavat limakalvon rauhas kudosten. Eturauhanen koostuu pääasiassa epiteelisolujen ja interstitiaalinen stroomasolujen, jotka kommunikoivat keskenään ja valvontaa, paitsi normaalia kehitystä rauhanen, mutta myös puhkeamista neoplastisen kasvun [1]. Eturauhassyöpä on yksi yleisimmin diagnosoitu noncutaneous syöpiä. Alkuvaiheessa eturauhassyövän etenemiseen riippuu androgeenit, jotka lisäävät leviäminen ja estävät apoptoosin. Siksi androgeenipuutteen hoito on ollut merkittävä hoidon toistuvia ja metastaattisen eturauhassyövän. Eturauhasen epiteelisolujen, jotka ovat ensisijaisesti luminaali sisältää sekä useiden solutyyppien, mukaan lukien perus- ja neuroendokriinisoluissa [2], [3], kun taas vieressä stroomasolut, joka koostuu seoksesta, fibroblastit, hermo-, ja sileän lihaksen soluissa [2], [ ,,,0],4], [5], puuttua kehittämiseen epiteelisyöpäsolujen ja vaikuttaa niiden reaktio hormonit [6]. Prosessin aikana syövän, vaikka määrä neuroendokriinisoluissa kasvaa myöhemmissä vaiheissa eturauhasen syöpä, epiteelisolujen edustaa suurimpia kasvainsolun tyyppiä ovat enemmän vastuussa androgeenin erottelua soluproliferaatiota [7]. Nämä solut esittää apoptoosin kestävä fenotyyppi, eivät läpikäy apoptoosia vasteena fysiologisten ärsykkeiden [8], [9], ja näin ollen eivät vastaa tavanomaisia ​​kemoterapia-aineiden [10] – [13].

Samalla, epiteelin munasarjasyöpä on todettu olevan kuudenneksi yleisin syöpä naisilla korkeimmat havaitaan Pohjois-Euroopan maissa ja USA: ssa, kun taas alhaisimmat löytyvät kehitysmaissa. Johtuen siitä, että patogeneesin epiteelin munasarjasyövän tunnetaan huonosti, varhainen havaitseminen on ollut pääosin hävinnyt ja uusia terapeuttisia lähestymistapoja niukasti. Koska munasarjan epiteelin syöpäsolujen on myös havaittu esittävät apoptoosin kestävä fenotyyppi johtuu yli-ilmentyminen anti-apoptoottisia geenejä, kuten Bcl-2, Bcl-xl ja surviviinin [14], löytämisen ja aktivointi uutta pro-apoptoottisten reittien on ollut tärkeä lähestymistapa valvontaan lisääntymistä ja kasvua tämän transformoidun solun tyypin [15].

apoptoosia, tyyppi ohjelmoidun solukuoleman [16] – [20], on osoitettu olevan kriittinen merkitys solun homeostaasin, alkion kehitykseen useita sairauksia, kuten syöpää [21], [22]. Apoptoosi aktivoidaan solutyyppispesifisten mekanismien [16], [22], ja sitä esiintyy useissa vaiheissa [19], [21], [23], [24]. Ensimmäinen vaihe on yhteydessä sisäiseen tai ulkoisten ärsykkeiden, kun taas toinen sisältää signaalinsiirtomekanismeissa. Kolmas vaihe koostuu suorituksen mekanismeja, joissa proteolyyttistä aktiivisuutta kaspaasien, biokemiallisen pohja apoptoottinen fenotyyppi [25] – [28], ja lopuksi neljäs vaihe, joka vastaa kondensaatiota ydinvoiman chromatin, ydin- pirstoutuminen ja fagosytoosia apoptoottiset kappaleet viereisten solujen tai makrofageissa [24], [29]. Kaiken jatkuvaan kasvuun [Ca

2+] i on osoitettu aktivoivan useita sytotoksisten mekanismien liittyy apoptoosin eri solutyypeissä [30], [31]. Koska apoptoosin on ehdotettu olevan mekanismi, joka säätelee kasvainten kasvua, modulaatio apoptoosin aktivoimiseksi mekanismien vuoksi on pidettävä arvokkaana kohteena hallita lisääntymistä ja kasvua epiteelisyöpäsolujen [32] – [36]. Tässä suhteessa, kunnosta riippuen solukalvon transformoituneiden solujen määrän ja ekstrasellulaarisen kalsiumin, joka tulee solulimassa, hieno tasapaino on saavutettu välillä puhkeamista apoptoottista tapahtumaa ja /tai aktivoinnin nekroottisen kuoleman reaktiotien [37 ], [38].

vastauksena kahteen eri indusoijat apoptoosin; ionomysiiniä ja seerumideprivaation, olemme aikaisemmin osoittaneet perustuu electrophysiological havaintojen aktivoitumista Ca

2+ läpäisevä, ei-selektiivisiä kationi kanava eturauhasen epiteelisolujen LNCaP [15]. Tutkimiseksi edelleen Näiden tulosten sarja Ca

2 + -permeable kanavaa ilmaistaan ​​apoptoosin aikana analysoitiin [15], [39] – [41]. Aikana näiden tutkimusten kaksi cDNA,

arp1

ja

arp2

, joka vastaa kahden molekyylin syntetisoitiin aikana indusoiman apoptoosin seerumideprivaatiolle, kloonattiin. Kun

arp2

mRNA ruiskutettiin

Xenopus laevis

munasolut, ARP2 ilmentyminen indusoitiin seurasi virtaa Ca

2+ solukalvon ja apoptoosin induktion [40].

kun otetaan huomioon, että useimmat epiteelisolujen jakaa kudos organisaation ominaisuudet sekä mekanismeja tuumorigeneesissä [42], esillä oleva tutkimus osoittaa, että

arp2

cDNA transfektio suoritetaan käyttäen alkuperäistä epiteelin syöpäsolujen (LNCaP-solulinja), josta proapoptoottisten kalsiumkanavan kuvattiin, edistää solujen kuoleman kautta apoptoottisen prosessin, kun solujen elävyyden ja caspases aktivointi mitataan. Jotta selvää, että apoptoottinen aloittamista ja saavuttamiseen mekanismit ovat yhteisiä monipuolinen epiteelisolujen tutkimuksemme on laajennettu transfektion kanssa

arp2

cDNA epiteelisolujen munasarjojen transformoitujen solujen (CHO-solulinja). Tulokset esitetään tässä tutkimuksessa tukevat aikaisempia havaintoja ja mahtuu ajatus, että ARP2, uusi kalsiumkanavan sijoitettu solukalvon solujen tapahtuman aikana, joka saattaa vaarantaa solujen elinkelpoisuuden ja johtaisi apoptoosin, voidaan pitää arvokkaana uusi tavoite kasvun kontrolloimiseksi aggressiivinen epiteelin syöpä solutyyppejä.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

ihmisen androgeeni-herkkä eturauhassyöpä-solulinjaa, LNCaP, ja kiinanhamsterin munasarja- solulinja, CHO (

Cricetulus griseus

), saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA), jossa ne todennetaan säännöllisesti genotyyppianalyysillä ja fenotyyppinen testejä. Alkuperäinen LNCaP solulinjat saatu ATCC mukana androgen-herkkien ja androgeenin tunteeton soluissa. Aikana niiden käyttö vuosien varrella, ne ovat esittäneet eriytetty vastauksia kasvun riippuen läsnäolo tai puuttuminen androgen analogien. Kaikki reagenssit soluviljelyalustoja saatiin Gibco BRL (Gaithersburg, MD, USA). Vektoreita, joita käytettiin olivat: pcDNA 3.1 /V5-His-TOPO-vektoriin (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), pcDNA3.1 /V5-His-TOPO

lacZ

-vektoriin (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA ), ja pEGFP-N1 vektorin (Clontech, Mountain View, CA, USA). Lipofectamine ja Fura-2 /AM saatiin Invitrogen /Life Technologies Corporation (Carlsbad, CA, USA). Bis-akryyliamidi, Nonidet-P40, etidiumbromidi, aprotiniini, fenyylimetyylisulfonyylifluoridia (PMSF), bentsamidiini, dimetyylisulfoksidi (DMSO), ionomysiini ja ditiotreitolia (DTT) saatiin Sigma (St. Louis, MO, USA). r

Tth

DNA-polymeraasia XL saatiin Roche Molecular Systems (Branchburg, NJ, USA) ja deoksiribonukleotidi dNTP: t Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Saksa).

Plasmidi rakenne ARP2 ilmaisu

monistamiseksi

arp2

cDNA, 20 pmol sense-aluketta (5′-TGACAGTGATGCGGGAGAAGG-3 ’) ja antisense-degeneroituneita aluke, joka vastaa konservoitunutta aluetta Trp perheen proteiinit (5’-TGY-TCK-MGC-AAA-YTT-CCA-YTC-3 ’) käytettiin [40], [43] – [45]. PCR-reaktiot myös 10 ng /ml linearisoitu pCR 4Blunt-TOPO-ARP2 plasmidi, 10 x puskuria, 25 mM MgCl

2, ja 10 mM dNTP: itä. Seuraavat sykliä: 94 ° C 5 min, 30 sykliä 94 ° C 45 s, 65 ° C: ssa 45 s, 72 ° C 2 minuuttia, ja viimeinen sykli 72 ° C: ssa 10 min. PCR-tuotteet erotettiin ja visualisoitiin 1% w /v agaroosigeeleillä, jotka sisältävät etidiumbromidia, ja juovat leikattiin irti ja puhdistettiin käyttämällä Concert geeliä poistojärjestelmä (Gibco, Gaithersburg Maryland). PCR-tuotteet kloonattiin pcDNA 3,1 /V5-His-TOPO-vektoriin sitten tuotettu

E. coli

DH5a -soluihin (American Type Culture Collection, Manassas VA, USA). Saatu plasmidi nimettiin pcDNA3.1 ARP2 V5-His. CDNA, joka koodaa tehostetun vihreän fluoresoivan proteiinin (

eGFP

) Sitten väliin

Xhol-

ja

Xbal

sivustoja pcDNA3.1 ARP2 V5-His-plasmidi, mikä kasvattaisi pcDNA3.1 ARP2-eGFP V5-His-plasmidi.

Soluviljely ja transfektiot lyhytaikaista ekspressiota

androgeenin tunteeton LNCaP-solut ja CHO-soluja viljeltiin RPMI 1640 ja DMEM /F -12 medium, vastaavasti. Nämä elatusaineet myös täydennetty 10% v /v naudan sikiön seerumia (FBS), 2 mM L-glutamiinia, 0,2% w /v natriumbikarbonaattia, ja 1% v /v penisilliini-streptomysiiniä. Viljelmiä ylläpidettiin 37 ° C: ssa ja 5% CO

2, kunnes solut saavuttivat 60-70% konfluenssin. Apoptoosi indusoitiin inkuboimalla soluja viljelyalustassa riistää FBS eri aikoja. Ionomysiini valmistettiin 5 mM varastoliuokset DMSO: ssa. Ionomysiini lopullisessa pitoisuudessa 10 uM käytettiin CHO ja LNCaP-soluja viljelmissä ja niitä inkuboitiin eripituisten ajanjaksojen ajan. Molemmat solulinjat transfektoitiin pcDNA3.1 ARP2 V5-His (transfektiotehot: TE /LNCaP 32%; TE /CHO 46%) ja pcDNA3.1 /V5-His-TOPO

lacZ

plasmidit (TE /LNCaP 43%; TE /CHO 54%) aiheuttaa ohimenevän ilmentymisen ARP2-V5 ja β-galaktosidaasia V5, vastaavasti. Normalisoimiseksi solujen elinkelpoisuuden määritykset, sekä solulinjat transfektoitiin myös plasmidi pcDNA3.1 V5-His (ilman

arp2

cDNA) (TE /LNCaP 68%; TE /CHO 80%). CHO-solut transfektoitiin pEGFP-N1 (TE 82%) ja pcDNA3.1 ARP2-eGFP V5-His-plasmidit (TE 50%), jolloin saatiin eGFP ja ARP2-eGFP ilmaisu, vastaavasti. Transfektiot suoritettiin käyttäen Lipofectamine 2000 kuvatun pcDNA3.1 /V5-His TOPO TA Expression Kit insertin Invitrogen (Carlsbad, CA, USA).

[Ca

2+] i mittaukset kokonaan solususpensiot käyttäen Fura-2

androgeenin tunteeton LNCaP-solut ja CHO-solut, joita kasvatettiin kuten aiemmin on kuvattu, poistettiin viljelymaljoihin käyttäen sato puskuria, joka sisälsi 10 mM HEPES-puskuroidulla 0,9% suolaliuosta plus 0,05 EDTA, pH 7,4 mukaan Hirst, et al. [46]. Solut sijoitetaan jousitus, ja perustuu samoihin menetelmän sedimentoituu 500 x

g

in hitaille sentrifugoidaan 3-5 minuuttia ja huuhdeltiin kahdesti Krebs HEPES, joka sisälsi 140 mM Na

+, 4.7 mM K

+, 1,3 mM Mg

2 +, 125 mM CI

-, 25 mM HCO

3, 1,2 mM H

2PO

4, 1,2 mM SO

4

2-, 10 mM glukoosia, 0,1 mM EGTA: ta ja 10 mM HEPES, pH 7,4. Supernatantit poistettiin ja pelletit suspendoitiin uudelleen Krebs HEPES-puskuria. Fura-2 /AM (3 uM) kuormitusajan 30 min suoritettiin käyttäen Krebs HEPES-puskurissa 37 ° C: ssa pimeässä. Tämän jälkeen menettely on saatettu päätökseen, solut sedimentoitiin 500 x

g

, suspendoitiin uudelleen Krebs HEPES-puskurissa, ja inkuboitiin edelleen 20 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, jotta de-esteröimällä Fura-2 /AM.

käsittelyn jälkeen solut kahdesti sedimentoitiin 500 x

g

3 min ja suspendoitiin uudelleen Krebs HEPES-Ca

2+ puskurilla (ilman EGTA ja lisätään 2,5 mM Ca

2+ ). Fura-2 /AM valmistettiin kantaliuos (1 mM) liuottamalla dimetyylisulfoksidiin ja alikvootit (10 pl), säilytettiin -20 ° C: ssa, kunnes niitä tarvitaan.

Solususpensiot pidettiin jäissä ja kullekin kokeelle sijoitetaan kvartsikyvetteihin ja inkuboitiin 2 minuutin ajan 37 ° C: ssa ennen mittausta tapahtui. SLM-AMINCO spektrofluoro- (Rochester, NY) käytettiin käyttäen heräte suhde 340/380 nm ja korkeintaan fura-2 Fluoresenssiemission arvot 510 nm. Kalibrointi fluoresenssi toteutettiin lisäämällä 0,1% Triton X-100 tuottaa solun tuhoutumisen vapauttavaa fura-2 osaksi Ca

2+ tai EGTA sisältävässä väliaineessa. Suurin ja pienin Fluoresenssiarvot korvautuu Grynkiewicz, Poenie Tsien Yhtälön [Ca

2+] i [47].

Western blot-analyysi

lyhytaikainen ekspressio ARP2 ja β-Gal saavutettiin LNCaP-solujen ja CHO-solujen transfektiolla jossa

arp2

cDNA ja

lacZ

cDNA, vastaavasti. Nämä proteiinit ekspressoitiin fuusioproteiineina V5-epitoopin karboksyylipäässä kunkin (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Soluja viljeltiin 16, 24, 48, ja 72 tuntia, sitten kerätään ja rikotaan kanssa seuraavassa puskurissa: 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA: ta, 1 ug /ml aprotiniinia, 1 mM PMSF , ja 5 mM bentsamidiini. Proteiini kvantitointi suoritettiin käyttäen bikinkoniini- happoa menetelmä (BCA) (Pierce, Rockford, IL, USA), ja 20 ug kokonaisproteiinia ajettiin elektroforeesilla 10% SDS-PAGE-geeleillä. Proteiinit jälkeen sähköllä päälle 0,45 um nitroselluloosakalvoille (Trans-Blot Transfer keskipitkän BIO-RAD, Hercules, CA, USA), sitten blokattiin 1 tunti 37 ° C: ssa ”saturoituvalle” ratkaisu [Tris-puskuroitu suolaliuos (TBS) ( pH 7,6), 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 100 mM NaCl, 0,1% v /v Tween-20, ja 2,5% w /v rasvaton maito]. Ensisijainen anti-V5-monoklonaalinen vasta-aine (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) laimennettiin samalla saturoituvan liuosta (1:5000) ja inkuboitiin kalvojen kanssa 12 tuntia 4 ° C: ssa. Jälkeen kalvot pestiin kolme kertaa kyllästää liuoksen 37 ° C: ssa (15 min kukin pesu), membraaneja inkuboitiin 37 ° C: ssa 2 h anti-hiiri-vasta-ainetta (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) laimennettiin kyllästää liuoksen ( 1:5000). Kalvo pestiin sitten TBS /0,1% v /v Tween-20 kolme kertaa 15 minuutin ajan 37 ° C: ssa, minkä jälkeen neljäsosa pesu TBS: llä 37 ° C: ssa. Equal lastaus varmistettiin inkuboimalla kalvoja anti β-aktiini-aineella (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA). Visualisointi vasta-aineen sitoutuminen saavutettiin käyttämällä parannettuja kemiluminesenssin (ECL) havaitseminen (Pierce, Rockford, IL, USA) ja altistuminen kalvojen röntgenfilmin (Kodak, Rochester, NY, USA).

3- ( 4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidi (MTT)

Käsittelemättömät solut pidettiin elatusaineessa, jota oli täydennetty seerumin (negatiivinen kontrolli), kun taas apoptoottiset solut saatiin seerumin riistäminen (positiivinen kontrolli). -Soluja (2 x 10

4 /kuoppa) maljattiin 96-kuoppaisille levyille ja pidettiin viljelmässä 16, 24, 48, ja 72 h. Sitten 30 ui MTT-varastoliuosta (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA), lisättiin kuhunkin kuoppaan loppupitoisuuteen 0,5 mg /ml reagenssia. Levyjä inkuboitiin 37 ° C: ssa 4 tuntia, jotta kasvu formatsaanikiteet, joka on myöhemmin liukoiseksi lisäämällä lyysipuskuria [20% SDS, 50% N, N-dimetyyliformamidissa (pH 3,7)]. Levyjä inkuboitiin 12 h, ja absorbanssi mitattiin aallonpituudella 570 nm käyttäen mikrolevylukijaa. Elinkelpoisuuden transfektoiduissa soluissa plasmidin pcDNA3.1-V5-His pidettiin normalisoimiseksi elinkelpoisuuden tulokset pcDNA3.1 ARP2 V5-His-transfektoiduissa soluissa. Kukin koe toistettiin kolme kertaa (n). Opiskelijan kaksisuuntainen

t-

testiä käytettiin määrittämään tilastollista merkitystä erojen suhteen valvontaa. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona X ± SEM ja

p

0,05 pidettiin merkittävänä. Symbolit tarkoittavat:

#

p

0,05, *

p

0,01,

¶

p

0,001

trypaanisinistä solunelinkykyisyysmääritys

LNCaP-soluja inkuboitiin 16, 24, 48, 72, 96, ja 120 h, kun taas CHO-soluja inkuboitiin 16, 24, 48, ja 72 h. Solut värjättiin 0,1% v /v trypaanisinivärin sitten laitetaan Neubauer kammioissa. Yhteensä 300 solut laskettiin kullekin näytteelle käyttäen Motic Kirkas optisella mikroskoopilla. Solujen elinkelpoisuus oli transfektoitu plasmidilla pcDNA3.1-V5-His pidettiin normalisoimiseksi pcDNA3.1 ARP2 V5-His-transfektoiduissa soluissa. Jokainen koe toistettiin ainakin kolme kertaa (n). Opiskelijan kaksisuuntainen

t-

testiä käytettiin määrittämään tilastollista merkitystä erojen suhteen valvontaa. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona X ± SEM ja

p

0,05 pidettiin merkittävänä. Symbolit tarkoittavat:

#

p

0,05, *

p

0,01,

¶

p

0,001

toiminnan mittauksia kaspaasien 3 ja 7

CHO ja LNCaP-soluja (3 x 10

5 /kuoppa) maljattiin ja viljeltiin 16, 24, 48, ja 72 h. Solut pestiin PBS: llä, kerättiin ja altistettiin neljälle jäädytys-sulatus-syklillä lyysipuskuria (10 mM HEPES (pH 7,0), 40 mM b-glyserofosfaatti, 50 mM NaCl, 2 mM MgCI

2). Näytteitä sentrifugoitiin 30 minuutin ajan 15 800

x

g. Proteiinipitoisuus supernatantit kerättiin määritettiin käyttäen BCA-menetelmällä (Pierce, Rockford, IL). Näytteet (kokonaisproteiinia, 20 ug) laimennettiin määrityspuskurissa (50 mM HEPES, 10% sakkaroosia, 0,1% CHAPS, 10 mM DTT) lopulliseen tilavuuteen 1000 ui. Määrityspuskurissa lisättiin myös Z-Asp-Glu-Val-Asp-7-amino-4-trifluorimetyylikumariinia (Z-DEVD-AFC), joka on fluorogeeninen substraatti kaspaasien 3 ja 7, ja näytteitä inkuboitiin 10 min 30 ° C. Fluoresenssi mitattiin Molecular Probes protokollaa käyttäen luminesenssin spektrometrillä. Viritysaallonpituus oli 365 nm ja emission aallonpituus oli 505 nm. Maksimi absorbanssi aallonpituudella havaittiin olevan 488 nm. Fluoresenssi mitattiin solu-uutos nollanäytteet, jotta voidaan havaita signaali-kohina-suhde näytteitä. Jokainen koe toistettiin ainakin kolme kertaa (n). Opiskelijan kaksisuuntainen

t-

testiä käytettiin ratkaisevasti tilastojen merkityksen erojen suhteen valvontaa. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona X ± SEM ja

p

0,05 pidettiin merkittävänä. Symbolit tarkoittavat:

#

p

0,05, *

p

0,01,

¶

p

0,001

konfokaalimikroskopia ja ero häiriöitä kontrasti mikroskopia (DIC) B

konfokaali kuvat saatiin käyttämällä Spectral Fluoview FV 1000 laserkeilauksen confocal järjestelmä (Olympus, Tokio, Japani) kiinnitetty /rajapinta Olympus IX81 käänteisvalomikroskoopilla 10 × ja 40 × öljy-upotus tavoitteet. EGFP viritettiin 488 nm käyttäen krypton /argon laser linja ja pääsee fluoresenssi havaittiin välillä 515 nm ja 540 nm käyttäen kaistanpäästösuodatin. Laser Leikkaus suoritettiin pienellä teholla (97-99% vaimennus), joka vähentää huomattavasti fotobleknande ja valon aiheuttaman vaurion yksilöihin. DIC mikroskopia kuvat saatiin käyttämällä Olympus IX81 mikroskoopilla ja IX2-LWUCD kondensaattori 10 × ja 40 × tavoitteita. Konfokaaliset ja DIC kuvia tehtiin näkyviksi, käsitellään ja muunnetaan TIFF alustettu kuvia käyttämällä FV10-ASW 6.1 -ohjelmisto (Olympus).

Tulokset

ARP2 ilmaisun ja solujen elinkelpoisuuden LNCaP-soluissa

Western blot analyysit osoittavat ilmentymisen ARP2-V5 LNCaP-soluissa ensimmäisenä havaittiin 16 h transfektion jälkeen, ja korkeimmat ekspressiotasot havaittiin 72 tuntia transfektion (kuvio 1A). Tämä määritys osoittaa, vanteet, joiden molekyylipainot vähemmän kuin yksi fuusioproteiinin ARP2-V5 (54 kDa) havaittiin 24, 48, ja 72 h transfektion jälkeen. Nämä alueet ovat todennäköisesti liittyy hajoamistuotteiden ARP2-V5 syntyy apoptoosin aikana.

(A) Western-blotit havaittu ilmentyminen β-gal-V5 (112 kDa) ja ARP2-V5 (54 kDa) yhteensä solulysaateista. (B) Normalized solujen elinkelpoisuus% valvonnan arvioitiin käyttäen MTT-määrityksiä 2 x 10

4-soluja viljeltiin ilman seerumia tai transfektoitu

arp2

cDNA. Elinkelpoisuus Näiden kahden hoitoryhmän analysoitiin 16, 24, 48, ja 72 h ajankohtina. (C) Normalized solujen elinkelpoisuus% hallintalaitteiden analysoitiin käyttämällä trypaanisinieksluusiolla menetelmällä. Soluja viljeltiin ilman seerumia tai transfektoitu

arp2

cDNA ja analysoitiin 16, 24, 48, 72, 96, ja 120 h ajankohtina. Keskiarvot on esitetty (n = 3, X ± SEM),

#

p

0,05, *

p

0,01,

¶

p

0,001 verrattuna kontrolliryhmiin.

Normalized solujen elinkelpoisuus% valvonnan LNCaP-soluja viljeltiin ilman seerumia, samoin kuin LNCaP-soluja, jotka on transfektoitu

arp2

cDNA , mitattiin käyttäen MTT-määrityksissä. Solujen elinkykyisyys havaittiin vähenevän merkittävästi, kun 16 tuntia, ja lisäksi oli vähentynyt 72 h (kuvio 1 B). ~63%: N lasku solujen elinkelpoisuuden havaittiin

arp2

cDNA-transfektoituja soluja 72 h, joka on suurempi verrattuna ~23% lasku elinkelpoisuuden LNCaP-soluja viljeltiin ilman seerumia. Sen vuoksi on hyvin todennäköistä, että androgeeni-herkkä LNCaP-solujen puuttuessa seerumin aktivoida apoptoottisen mekanismeja myöhässä suhteessa

arp2

cDNA-transfektoiduissa soluissa. Normalisoitu solujen elinkelpoisuus% hallintalaitteiden arvioitiin myös käyttämällä trypaanisinieksluusiolla menetelmällä. Lievä väheneminen elinkelpoisuutta havaittiin ensimmäisten 24 tunnin molemmille koeolosuhteissa (kuvio 1 C). Solujen elinkelpoisuus edelleen vähentynyt seerumin riistää ja

arp2

cDNA-transfektoiduissa soluissa jopa 120 h, laskua ~44% ja ~42% solujen elinkelpoisuutta, vastaavasti.

ARP2 ilmaisun ja solujen elinkelpoisuuden CHO-soluissa

Western blot analyysit osoittavat ilmentymisen ARP2-V5 CHO-soluissa havaittiin ensimmäisen kerran 16 tuntia transfektion jälkeen, saavuttaa korkeimman 72 h transfektion jälkeen. Hajoamista ARP2-V5 (54 kDa), jota esitetään pienempi molekyylipaino kaistan havaitaan välillä 48 ja 72 tuntia transfektion jälkeen, viittaa siihen, että apoptoottinen tapahtuma tapahtuu myös tässä solutyyppi samalla tavalla kuin edellä esitetty LNCaP-soluja (kuvio 2A). On mielenkiintoista huomauttaa, että viive ulkonäön näiden hajoamistuotteiden, kun CHO-solut verrataan LNCaP-solut, voi liittyä siihen, että CHO-solut muodostavat erinomaisen mallin ilmentymisen heterologus-proteiineilla, koska proteiinien hajoaminen on mahdollisimman minimiin.

(A) Western-blotit havaittu ilmentyminen β-gal-V5 (112 kDa) ja ARP2-V5 (54 kDa) kokosoluliuotteissa. (B) Normalized solujen elinkelpoisuus% valvonnan arvioitiin käyttäen MTT-määrityksiä 2 x 10

4-soluja viljeltiin ilman seerumia tai transfektoitu

arp2

cDNA. Elinkelpoisuus Näiden kahden hoitoryhmän analysoitiin 16, 24, 48, ja 72 h ajankohtina. (C) Normalized solujen elinkelpoisuus% hallintalaitteiden arvioitiin käyttämällä trypaanisinieksluusiolla menetelmällä. Soluja viljeltiin ilman seerumia tai transfektoitu

arp2

cDNA ja analysoitiin 16, 24, 48, ja 72 h ajankohtina. Keskiarvot on esitetty (n = 3, X ± SEM),

#

p

0,05, *

p

0,01,

¶

p

0,001, verrattuna kontrolliryhmiin.

aikana solujen elinkelpoisuuden määritykset käyttämällä vähentäminen MTT, jatkuva väheneminen elinkelpoisuutta havaittiin CHO-solujen välillä 16 tuntia ja 72 tunnin viljelyn. 72 h, elinkelpoisuus väheni ~44% seerumin puutteellisissa soluissa, kun taas elinkelpoisuus

arp2

cDNA-transfektoiduissa soluissa laski ~51% (kuvio 2B). Trypaanisinistä solujen elinkelpoisuuden määritykset eivät osoita merkittäviä muutoksia CHO-soluissa havaittiin jopa 48 tuntia sen jälkeen seerumideprivaation. Kuitenkin dramaattiseen laskuun elinkelpoisuus havaittiin 72 tunnin kuluttua inkuboinnin, mikä viittaa siihen, että jopa tällä kertaa apoptoottista tapahtumaa alkoi vaikuttaa eheyden solukalvon. Sillä

arp2

cDNA-transfektoiduissa soluissa, asteittainen väheneminen elinkelpoisuutta välillä havaittiin 16 ja 72 tuntia transfektion jälkeen. Prosenttiosuudet eläviä soluja molemmissa ryhmissä 72 tunnin olivat hyvin samanlaisia, ja ~51% elinkelpoisuuden havaittu seerumin puutteellisissa soluissa ja ~53% elinkelpoisuuden havaittiin

arp2

cDNA-transfektoiduissa soluissa (kuvio 2C). Näin ollen, samoin kuin LNCaP-soluissa solukuolema indeksi CHO-soluja, näyttää olevan riippuvainen tasosta ARP2-V5 ilmentymistä. On mielenkiintoista huomauttaa, että kun kyseessä on

arp2

cDNA-transfektoituja soluja verrattuna seerumin puutteellisissa soluissa, saadut erot kahden määrityksiä käytetään arvioimaan solujen elinkelpoisuus on todennäköistä, jotka liittyvät siihen, että kriittinen metaboliatiet liittyvä solunsisäiseen kalsiumin ylikuormituksen ja menetys solunsisäisen organelle eheyden vaikuttavat ensisijaisesti, ennen solukalvon vaurioituu.

Fura-2 mittaus sytosolin vapaan Ca

2+ LNCaP ja CHO-soluissa

Koska käytön Fura-2 mittaamaan muutoksia solunsisäisessä kalsiumin käyttäen kokosolu suspensioita on ollut yksi menestyksekkäimmistä menettelyjen suunniteltu tähän tarkoitukseen, LNCaP ja CHO solususpensiot ladattiin Fura-2 ja [Ca

2+] i mitataan. Kuten on esitetty taulukossa 1, Fura-2 ladattu ohjaus altistettujen solujen ionomysiinillä (10 uM), kun läsnä on kalsiumia sisältävällä puskurilla, tuotetaan lyhyen ajan lisääntyminen [Ca

2+] i. Mielenkiintoista, LNCaP ja CHO

arp2

-transfected soluissa osoitti myös lisääntynyt [Ca

2+] i osoittavat parannettu kalsiumin läpäisevyys verrattuna hallita solulinjoja. Vaikka soluja inkuboitiin ilman naudan sikiön seerumia testattiin myös, vuoto Fura-2 sisältävistä soluista oli tärkeää ja siksi erot kokeissa liian suuri Tähän ryhmään kuuluu tuloksia.

Apoptosis etenemistä ja kaspaasien aktivaatio 3 ja 7 CHO- ja LNCaP-solut

kaspaasit 3 ja 7 on luokiteltu efektori kaspaasien aktivoidaan kaspaasien 8 ja 9 (tunnetaan myös initiaattoreita). Kaspaasit 3 ja 7 on myös osoitettu myötävaikuttavan apoptoosin aikana jakautuminen substraattien, kuten proteiineja, nukleiinihappoja ja lipidejä. Kuvio 3 esittää aktiivisuuden tasot havaitaan kaspaasin 3 ja 7. perustason edustaa kaspaasit aktiivisuutta ole hoidettu (kontrolli) soluissa, koska näytteiden käsittelyä kesti lähes 30 minuuttia ja tietty entsyymin aktivointi on aina havaita. Tiedot ilmaistaan ​​prosentteina arvot suhteessa positiiviseen kontrolliin. Seerumin riistää CHO-soluja, asteittainen kaspaasien aktivaatio 3 ja 7 havaittiin 24 tunnin ja 48 tunnin korkein aktivointitasoa havaittu 72 tunnin jälkeen ja aktivoitumisnopeudet 75% yli valvontaa. Vaikka

arp2

cDNA-transfektoituja CHO-soluja tai ionomysiinillä (10 uM) käsiteltiin CHO-soluja näytteille asteittainen nostaminen kaspaasin aktivaatio, lisääntyminen havaittu 24 ja 72 h kuluttua transfektion tai ionomysiinillä hoito oli pienempi kuin saadut tulokset CHO-soluja inkuboitiin ilman seerumia samalla ajankohtina (kuvio 3A). Mielenkiintoista on, kaspaasit aktivaation LNCaP viljeltiin ilman seerumia,

arp2

cDNA-transfektoituja soluja, tai ionomysiini käsiteltyjä soluja, osoitti samalla tasolla aktivointi, tuloksia, jotka korreloivat hyvin edellä elinkelpoisuuden tietoja. Nämä tulokset tukevat taas siitä, että LNCaP-solut näyttävät olevan vastustuskykyisiä puhkeamista apoptoottista tapahtumaa kuin CHO-soluja (kuvio 3B).

kaspaasi-aktiivisuus määritettiin käyttäen fluorometristä määritystä käytetään Z-DEVD-AFC kuten substraatti. (A) CHO-soluja kasvatettiin ilman seerumia, jotka oli transfektoitu

arp2

cDNA: ta tai inkuboitiin 10 uM ionomysiinin määritettiin 16, 24, 48 ja 72 tunnin aikapisteissä. (B) LNCaP-soluja kasvatettiin ilman seerumia, jotka oli transfektoitu

arp2

cDNA: n (72 h) tai inkuboitiin 10 uM ionomysiinin määritettiin 16, 24, 48 ja 72 tunnin aikapisteissä. Keskiarvot on esitetty (n = 3, X ± SEM),

#

p

0,05, *

p

0,01,

¶

p

0,001 verrattuna kontrolliryhmiin.

solunosasijaintia

jotta visualisoida solunosasijaintia ARP2, ilmaisuksi eGFP-leimatun ARP2 fuusioproteiinin CHO-solulinja kautta transfektio

arp2

–

EGFP

cDNA ja

EGFP

cDNA (valvonta) tutkittiin 24 tuntia transfektion jälkeen käyttäen 10 × objektiivilinssi. Verrattuna e

gfp

cDNA transfektoitiin CHO-kontrollisolut (kuvio 4A),

arp2-EGFP

cDNA-transfektoiduissa soluissa osoitti fluoresoivan signaalin lokalisoitu ympäri tumakalvon (kuvio 4C). Sama kentät analysoitiin käyttämällä DIC mikroskopialla (kuvio 4, B ja D).