Krooninen sairaus

tiivistelmä

Topoisomeraasit ovat perheen elintärkeä entsyymejä, jotka pystyvät ratkaisemaan topologinen ongelmien DNA aikana eri geneettinen prosesseja. Topoisomeraasin myrkyt, estää yhdistymistä katkaistun DNA-säikeet ja vakauttaa entsyymi välittämä DNA pilkkominen monimutkaisia, ovat kliinisesti merkittäviä antineoplastisia ja antimikrobivalmisteita. Kuitenkin nopea nousu lääkeresistenssin joka estää terapeuttista tehoa näiden elintärkeitä lääkkeitä tekee löydön uusien johtoyhdisteet yhä tärkeämpää. Raportoimme tässä helpolla tehoseulonnan järjestelmän tekijöille suunnattu ihmisen topoisomeraasi IIα (Top2α). Määritys perustuu mittaukseen anisotropia on 29 bp: fluorofori-leimattu oligonukleotidi duplex. Koska lääke-stabiloitua Top2α sitoutunutta DNA on suurempi anisotropia verrattuna vapaan DNA, tämä määritys voidaan toimia, jos voidaan käyttää erotusai- nimenomaan häiritä entsyymi /DNA binary komplekseja, mutta ei lääkettä stabiloitua kolmen komponentin komplekseja. Tässä osoitamme, että NaClO

4, kaotrooppisen aineen, palvelee kriittinen rooli meidän seulontamenetelmä erottamaan lääkkeen stabiloitua entsyymiä /DNA-kompleksit niistä, jotka eivät ole. Tämän strategian Seuloimme kemiallinen kirjasto 100000 yhdisteiden ja saadaan 54 positiivista osumaa. Olemme tunnettu kolme heistä tähän luetteloon ja osoittaneet vaikutuksia Top2α-välitteisiä reaktioita. Tuloksemme viittaavat siihen, että tämä uusi seulonta strategia voi olla hyödyllinen löytää ylimääräistä ehdokasta syöpälääkkeet.

Citation: Lin YS, Huang WC, Chen MS, Hsieh Ts (2014) Kohti löytää uusia syöpälääkkeet kohdistaminen Topoisomeraasi IIα A Facile seulonta strategia Soveltuu korkea suoritusteho Platform. PLoS ONE 9 (5): e97008. doi: 10,1371 /journal.pone.0097008

Editor: Maria Spies, University of Iowa, Yhdysvallat

vastaanotettu: 26 joulukuu 2013; Hyväksytty: 14 huhtikuu 2014; Julkaistu: 08 toukokuu 2014

Copyright: © 2014 Lin et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia National Research Program biofarmasiassa (ChemBank ja korkean tehon seulomiseen Resource Center, NSC-101-2325-B-001-029), ja NSC (NSC102-2325 ja NSC103-2811). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

DNA liiketoimet, jotka lähettävät ja palauttaa geneettinen informaatio vastaa aina purkautumista ja kelaus kaksinkertaisen kierteisen rakenteita. Koska topologinen välisen yhteyden toisen ja korkeamman asteen DNA rakenteet, kierteiset purkautuminen /kelaus tuloksen takertuminen ja lukituksesta kromosomien ja DNA. Nämä topologinen sotkuisia olisi ratkaistava ajoissa ja täsmällisesti, jota ilman solut eivät voi selvitä. Topoisomeraaseista ovat luonnon ratkaisu näihin näennäisesti hankala topologinen monimutkaisuutta [1] – [6]. He suorittavat nämä topologinen muutosten kautta sykli palautuvia transesteröinti välisen aktiivisen tyrosyylitähteen ja fosfaatti selkäranka DNA. Ohimenevä entsyymi /DNA-adduktia luo DNA-portin, jonka kautta toinen DNA-segmentti voidaan kuljettaa ja tulokset topologinen muutoksia. Perustuen rakenteen ja mekanismin, topoisomeraaseista luokitellaan kahteen tyyppiin: tyyppi I entsyymi välittää lohkon kulkeutumista yhden lohkon DNA veräjän tyypin II entsyymi kuljettaa DNA-segmentin kautta kaksinkertainen lanka portti. Molemmat topoisomeraaseista luokitellaan edelleen kaksi perhettä, A ja B, ja nämä entsyymit ovat läsnä kaikkialla luonnossa ja ovat olennaisia ​​toimintoja kasvun ja kehityksen kaikkien organismien [7], [8].

Mielenkiintoista, ohimeneviä ja palautuvia DNA taukoja välittämiä topoisomeraaseista, niin kriittinen niiden biokemialliset ja biologiset toiminnot, myös luoda akilleenkantapää soluille. Monet sytotoksiset aineet, ihmisen tai luonnon tuotettu, tavoite tässä vaiheessa topoisomeraasi reaktion ja vakauttaa pilkkominen väli- mikä tuottaa hengenvaarallisia DNA katkeamisen [5], [9] – [14]. Jotkut näistä topoisomeraasin-kohdentamisaineita ovat osoittautuneet kliinisesti merkittäviä syöpälääkkeet ja antibiootteja. Terapeuttinen teho näistä elintärkeitä lääkkeitä on usein vaakalaudalla nousu lääkeresistenssideterminantit kasvain- tai mikrobien solut. Etsivät uusia sääntöjä ja lääkkeitä tulee yhä tärkeämpää, jos haluamme pysyä uhka lääkeresistenssin. Koska olennaisia ​​rooleja topoisomeraaseista soluproliferaatioon, ja koska ne ovat osoittautuneet tavoitteet kliinisesti käyttökelpoisia lääkkeitä, on kohtuullista odottaa, että intensiivisesti olisi kohdistettava löydä lisää huumeita kohdistaminen topoisomeraaseja. Kuitenkin biokemialliset määritykset, jotka ovat useimmiten käytetään seurantaan topoisomeraasi toiminta ei ole helposti sovitettavissa automaatio- ja suurikapasiteettisten alustalla. Biokemiallisia määrityksiä monipuolisin määritykset perustuvat käyttöön agaroosigeelielektroforeesilla, koska se voi havaita DNA rakenteellisia siirtymiä, jotka liittyvät juosteen pilkkominen ja kulkua toimintaa topoisomeraaseja. Työvoimavaltaiset luonne ja hankala prosessi hankkimisessa tietojen tehdä geelielektroforeesilla epätodennäköistä menetelmän valinta automaation ja kvantifiointiin.

korjaamiseksi vaikeus, on olemassa useita lähestymistapoja kehitetty äskettäin, jotka ovat sovitettavissa automaattisia suurikapasiteettisten alustan tunnistamiseksi topoisomeraasin kohdistamisen yhdisteistä [15] – [18]. Ne ovat kaikki fluoresenssipohjaiset topoisomeraasi aktiivisuusmääritysten siten helpompia automaattiseen kvantifiointiin. Ne ovat kuitenkin myös ominaista, jossa käytetään plasmidi-DNA prosessissa määrityksissä. Raportoimme tässä pyrimme kehittämään uutta lähestymistapaa käyttäen fluorofori-merkitty Oligonukleotididupleksi substraattina määrittämällä muodostumista stabiloidun topoisomeraasi /DNA-komplekseja, kun läsnä on erityisiä ehdolla olevan aineen. Me kuvaamme aloitusnäyttö tällä määrityksiin tekniikkaa kemiallisen kirjaston 100000 yhdisteiden ja luonnehdinta kolme positiivisen osumia. Tämä seulontamenetelmä voi tarjota vaihtoehtoinen lähestymistapa löytää uusia topoisomeraasi-kohdentamisaineita ja rikastuttaa arsenaali torjua kasvaimia ja Mikrobipatogeenien.

Materiaalit ja menetelmät

puhdistaminen Ihmisen Top2α

Käytimme suunniteltu YEpWob6, vektorin, jossa heksahistidiiniliite–merkityn ihmisen Top2α alle

GAL1

indusoituva promoottori, ilmaista ihmisen rekombinantti Top2α hiivassa [19]. Hiivasoluja jälkeen galaktoosin induktion otettiin talteen, suspendoitiin uudelleen hypertoninen puskuriin (1 M sorbitolia, 20 mM kaliumfosfaatti pH 7,4, 20 mM 2-merkaptoetanoli) ja hajotettiin lisäämällä lyyttinen entsyymi (Zymolyase 100T, Amsbio). Tumat kerättiin sentrifugoimalla (20 min 55,000X

g

), suspendoidaan uudelleen puskurissa, jossa on 20 mM kaliumfosfaatti pH 7,4, 0,2% Triton X-100, 5 mM 2-merkaptoetanoli, jossa on proteaasiestäjäseostabletit mukaan lukien 1 mM PMSF, 2 ug /ml leupeptiiniä ja 1 ug /ml Pepstatin A, ja homogenoitiin. Poimimamme Top2α tumista lisäämällä NaCl-pitoisuus on 500 mM, ja poistetaan ydin pelletti sentrifugoimalla 15,000X

g

25 minuuttia. Supernatantti fraktioitiin 3 kromatografisia vaiheita (GE Healthcare). Ensimmäinen oli HisTrap FF raakaa Ni-kelatoivaan pylvääseen ja Top2α eluoitiin 40 mM imidatsolia gradientilla 20-200 mM imidatsoli, 20 mM kaliumfosfaattia, pH 7,4, 500 mM NaCl ja 0,1% Triton X-100. Yhdistetyt fraktiot laimennettiin kolme kertaa 20 mM kaliumfosfaatti pH 7,4, ja edelleen puhdistaa HiTrap SP sarakkeeseen. Top2α eluoidaan 500 mM NaCl gradientilla 200-800 mM NaCl. Yhdistetyt fraktiot laimennettiin kolme kertaa 20 mM kaliumfosfaatti pH 7,4, ja ladattiin Mono S 5/50 GL sarake. Top2α eluoitiin 500 mM NaCl, ja fraktiot yhdistettiin, dialysoitiin yön yli 50% glyserolia, 15 mM natriumfosfaatti, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM PMSF ja 5 mM 2-merkaptoetanolia, ja varastoitiin -20 ° C. Lopullinen Top2α osa on yli 90% puhdasta ja on spesifinen aktiivisuus vähintään 10

6 yksikköä /mg, jossa yksi yksikkö määritellään siksi määräksi entsyymiä, joka tarvitaan rentoutua 0,5 ug pUC19-DNA: ta 30 min.

DNA Pohjat

fluoresoiva DNA alustan (Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA) suunniteltiin samankaltainen kuin on kuvattu aiemmin (Smiley, Collins et al. 2007), 29-emäsparin Oligonukleotididupleksi sisälsi top2 katkaisukohta keskustassa ja Alexa Fluor 488 3’päähän. Plasmidi pUC19-DNA puhdistettiin CsCI double-juovia, fenoli-kloroformiuutto ja alkoholisaostuksella käytettiin rentoutumiseen ja pilkkominen määritykset (Sander ja Hsieh 1983).

Pre-HTS (tehoseulonnan) Anisotropiaa Pitoisuus

50 ui Top2 reaktiopuskuria, joka sisälsi 10 mM Tris-HCI, pH 7,9, 5 mM MgCl

2, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 0,5 mM ATP: tä. 50 nM Alexa Fluor 488-leimattua DNA: ta, 1,25 uM ihmisen Top2α, ja teniposidi (VM26) on konsentraatioalueella 60-300 uM, reaktioseosta inkuboitiin 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Ennen mittaamista anisotropia, NaClO

4: ää lisättiin, jotta saatiin lopullinen konsentraatio 250 mM. Kokeet testaus vaikutukset NaClO

4 pitoisuuksia osoitti, että alueella on 100-750 mM sillä on samanlainen vaikutus moduloinnissa fluoresenssianisotropia (säädetään yksityiskohtaisesti Tulokset osiossa).

vaikutusten testaamiseksi järjestystä lisäksi 50 nM Alexa Fluor 488-leimattua DNA, 250 nM ihmisen Top2α, ja 250 mM NaClO

4 kanssa tai ilman 300 uM VM26 otettiin käyttöön eri järjestyksessä 50 ui reaktiopuskuria. Yleinen Reaktioaika oli 30 minuuttia 37 ° C: ssa, ellei toisin ole mainittu.

tutkimiseksi positiivisen osumia anisotropia määrityksen mukaisesti irtotavaran olosuhteissa, reaktio suoritettiin 50 ul: ssa reaktiopuskuria, joka sisälsi 50 nM Alexa Fluor 488 leimattua DNA, 250 nM ihmisen Top2α, ja 15 uM testiyhdistettä. Reaktioseos inkuboidaan 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan ennen lisäämistä NaClO

4.

anisotropia määrityksissä mukaisesti bulk olosuhteissa mitattiin Fluorolog-3-spektrofluorometrillä (HIROBA Scientific) varustettu kahdella Polarisaattoreina polut virityksen ja emission käyttäen L-muoto menetelmällä. Viritys- ja emissioaallonpituus olivat 492 nm ja 515 nm, vastaavasti, joissa jokaisessa on raon leveys 2 nm, ja vahvistus G asetetun arvon 1.

korkea suoritusteho Anisotropiaa Screening

HTS , seulonnat tehtiin klo Genomics Research Center of Academia Sinica Taiwanissa jälkeen protokolla julkaistu aiemmin ja käyttämällä kemiallista kirjasto tuottaa ja siellä kerätyt [20]. Lyhyesti, seulonta suoritettiin 1536-kuoppalevyillä käyttäen high-throughput screening (HTS) jota valmistaa GNF järjestelmät (GNF, San Diego, CA). HTS järjestelmä on integroitu automaatit, 1536-pin siirtämällä työkalu, yrityshautomot ja ViewLux levylukijaa (Perkin Elmer Inc.). Reaktion tilavuus oli 4 ui per kuoppa, joka sisälsi 100 nM Alexa Fluor 488-leimatun DNA: n 150 nM ihmisen Top2α reaktiopuskurissa. 30 minuutin inkuboinnin jälkeen 37 ° C: ssa, 100 mM NaClO

4: ää lisättiin kuhunkin kuoppaan reaktion lopettamiseksi ja anisotropian arvo mitattiin. Seulonta suoritettiin edustava kirjasto 100000 kemikaalien pitoisuutena 12,5 uM. 300 uM teniposidi (VM26) otettiin mukaan positiivisena kontrollina, kun taas 5% DMSO: ta oli negatiivisena kontrollina. Z laskettiin käyttämällä seuraavaa formulaatiota:. SD MAX ja SD MIN ovat keskihajonta positiiviset ja negatiiviset kontrollit. Seulontamenetelmän sopiva HTS alustan on Z on suurempi kuin 0,5. Kun ensimmäinen kierros seulonta yli 100000 kemikaaleja, 107 testiyhdisteet teki positiivisia kriteerit, joita kuvataan tekstissä. Seulonnan toisella kierroksella suoritettiin testaamalla anisotropian lukemat 8 eri pitoisuuksia kunkin ehdokkaan yhdisteeksi käyttäen kaksinkertaisia ​​laimennoksia alkaen 12.5 uM. Vain yhdisteet tuloksena 20% nousu havaitaan signaalit negatiivisia kontrolleja, ja osoittaa annoksesta riippuvainen vasteita kahden tai useamman määriteltiin osumia. Oli 54 osumaa teki toisella kierroksella seulonnan.

Rentoutuminen Analyysit

20 ui Top2 reaktion, joka sisälsi 8,5 nM negatiivinen superkier- pUC19, 0,125 nM ihmisen Top2α joko 5% DMSO, tai 60 uM testissä yhdisteiden reaktiot suoritettiin 37 ° C: ssa 5, 10 tai 15 minuuttia, pysäytettiin lisäämällä SDS: ää 0,25%, EDTA 10 mM, ja proteinaasi K: 0,4 mg /ml, inkuboitiin edelleen 50 ° C: ssa 1 tunti ja analysoitiin elektroforeesilla 1,2% agaroosigeelissä.

lohkaisu määritykset

reaktio, joka sisälsi 8,5 nM negatiivinen superkierteistä pUC19, 3,75 nM ihmisen Top2α ja 150 uM teniposidi (VM26) tai määritelty teksteissä, reaktioita inkuboitiin 37 ° C: ssa 15 minuutin ajan, ja pysäytettiin lisäämällä SDS: ää 0,25%, EDTA 10 mM, ja proteinaasi K: 0,4 mg /ml, tai lisäämällä NaClO

4-500 mM 2 minuutin ajan, minkä jälkeen lisättiin proteinaasi K: 0,4 mg /ml. Inkubointia jatkettiin 50 ° C: ssa 1 tunnin ajan ja näytteet analysoitiin elektroforeesilla 1,2% agaroosigeelillä, joka sisälsi 0,15 ug /ml etidiumbromidia. Testaamiseen katkaisureaktioissa lineaarisella DNA-substraatin, pUC19 digestoitiin Scal: llä tuottaa yksikön pituutta molekyylin. Restriktioentsyymillä käsitellyn DNA puhdistettiin ja käytettiin katkaisureaktioissa.

vaikutusten testaamiseksi positiivisia osumia Lohkaisureaktion testiyhdisteet laimennettiin kolmeen eri pitoisuuksia, 16, 64 ja 256 uM, ja reaktiot toteutettiin ja analysoitiin edellä kuvatulla tavalla.

glyseroli gradient Sedimentation ja topoisomeraasi Detection immunoblot

3,5 ml glyserolia gradientilla 30-60% vuonna Top2 reaktiopuskuria valmistettiin polyallomeeriputkeen sentrifugiputkeen ja kerrostunut 80 ui Top2 reaktioseosten kuvatulla teksteissä. Sentrifugointi suoritettiin 55000 rpm 16 tuntia 20 ° C: TFT-80,4 Roottori (Thermo Scientific). 22-gaugen neulaa käytettiin lävistää putken ja fraktiot otettiin talteen pohjalta. 50 ul: n näyte kutakin fraktiota ladattiin Esiliotetuista PVDF-kalvolle käyttäen slot blot jakoputken (Hoefer PR 648) laitteeseen. Seuraavat lastaus, membraani blokattiin 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa 5% rasvatonta maitoa valmistettu TBS-puskurissa (25 mM Tris-HCI, pH 8,0, 125 mM NaCl). Estetty kaivoa inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa vuohen vasta-aineella ihmisen Top2α (1:5000; Santa Cruz Biotechnology, sc-5348). Sitten membraania käsitellään kemiluminoinnilla ECL-reagenssilla (Millipore, WBKLS0500) ja noudattamalla valmistajan suositusten mukaisesti.

Sytotoksisuusmääritvs

Sytotoksisuusmääritvs suoritettiin HCT116-soluissa käyttämällä CellTiter 96 AQ

ueous Yksi ratkaisu proliferaatiomääritystä mukainen pakkaus valmistajan protokollan (Promega). Lyhyesti, HCT116-solut ympättiin 96-kuoppalevyille solutiheyteen 7500 solua per kuoppa DMEM: ssä 24 tunnin ajan. Poistamisen jälkeen medium, eksponentiaalisesti kasvavia soluja inkuboitiin 1 ui testiyhdistettä 6 kaksinkertaisia ​​laimennoksia lopullisessa tilavuudessa 100 ui kuhunkin kuoppaan. Sen jälkeen, kun 72 tunnin inkuboinnin jälkeen 37 ° C: ssa, solut täydennetään tuoreella alustalla, joka sisälsi 10 ui MTS tetratsolium- ja inkuboitiin yksi tunti. Formatsaanisakka muunnetaan elävät solut tarkkailtiin 490 nm. Ohjaus solut sisältävät 1% DMSO ilman testiyhdistettä. Kaikki kokeet toistettiin vähintään kolme kertaa.

Tulokset

käytetään puhdistettua ihmisen täyspitkän Top2α ja fluoroforin-leimattu, kaksijuosteinen oligonukleotidi, joka sisältää topoisomeraasin sitoutumiskohta kehittää fluoresenssiin perustuva määritys (kuvio 1A). Järjestelmä on seulonta Top2α kohdistamisen yhdisteitä on kuvattu kaavamaisesti kuviossa 1B. Tämä määritys perustuu mittaukseen fluoresenssin polaarisuus (anisotropia) merkkinä siitä, proteiini sitoutuu fluoroforin merkitty DNA. Viritettäessä kanssa polarisoitunut valo, emission fluorofori DNA alustan jos oleskelee liikkumaton, on myös polarisoitunut. Pyörityksen diffuusio muuttaa suuntaa siirtymisen hetki ja aiheuttaa Depolarisaatio. Topoisomeraasi-DNA-kompleksi, kovalenttinen tai ei-kovalenttinen, on pienempi pyllähdys määrä ja johtaa suurempaan anisotropiaa. Toisaalta, vapaan DNA: lla on suurempi pyörivässä nopeudella ja siten pienempi anisotropia. Koska anisotropia määritys voidaan helposti automatisoida, voimme suorittaa korkea-seulonnan (HTS) tunnistaa mahdolliset lyijy tarkoitettua yhdistettä vastaan ​​Top2α. Kuitenkin yksi keskeinen haaste tälle Seulontamääritys toimii toivotusti on eriyttää lääke-stabiloitua Top2α-DNA-kompleksit päässä kaksijakoinen Top2α-DNA-kompleksit. Tulemme tarvitaan reagenssia häiritä jälkimmäisen monimutkainen mutta säilyttää entinen yksi.

(A) fluoresoiva DNA substraatti syntetisoitiin tunnetun Top2 katkaisukohta (osoitettu nuolilla). Alexa Fluor 488 merkitty tähdellä leimattiin 3′-päässä. (B) Kaaviokuva anisotropia-pohjainen Top2α lääkeseulontaan. Topoisomeraasi-DNA-kompleksi, kovalenttinen tai ei-kovalenttinen, on hitaampi rotaatio diffuusio ja johtaa suurempaan anisotropiaa. Sen jälkeen, kun on käsitelty proteiinia dissosioivan aineen, ei-kovalenttiset sitovat Top2α poistettiin, ja vapaa DNA on pienempi anisotropia. Jos Top2α-kohdistamisaineena stabiloitua kovalenttista entsyymi-DNA-kompleksit, anisotropia pysyy korkealla.

Hoito NaClO

4 voi johtaa anisotropian kasvua riippuu läsnäolo vastaisen syöpälääke teniposidi (VM26) B

Käyttämällä teniposidi (VM26) mallina yhdiste meidän seulomismäärityksessä testasimme useita yleisesti käytettyjä denaturoivaa reagenssien kuten alkali- ja SDS voivat sallia havaitsemiseksi parantaa vakautta Top2α DNA, komplekseja, kun läsnä on syöpälääke. Koska emästä lomakkeet hieno saostumia Mg

++ reaktiopuskurissa ja SDS tuottaa minimaalisia kuplia, molemmat reagenssit kestämättömiä esineitä varten mikrotiitterilevyn-pohjainen fluoresenssimääritysten. Olemme kuitenkin havainneet, että vahva kaotrooppinen reagenssi NaClO

4 täyttää vaatimukset dissosioivaa reagenssina fluoresenssimääritysten. Lisäyksen jälkeen NaClO

4-250 mM sitovia reaktioseokseen, vakautta Top2α-DNA-kompleksit, kuten seurataan fluoresenssin anisotropia osoittaa selvästi annoksesta riippuva lisäys VM26 pitoisuudet vaihtelevat 0-300 uM (kuvio 2A ). Lisäämättä NaClO

4 anisotropia pysyy samana riippumatta VM26 pitoisuus. Edelleen vahvistaa, että VM26 aiheuttama anisotropia muutos on entsyymi riippuvainen, suoritimme anisotropia mittaus ilman topoisomeraasin että muuten identtinen reaktio-olosuhteet. Näistä tuloksista on esitetty kuviossa 2B, olemme vahvistaneet, että huumeriippuvaisten lisäys anisotropian käsittelyn jälkeen NaClO

4 on Top2α-välitteisen.

(A) reaktiot Alexa Fluor 488-leimatun DNA ihmisen Top2α oli suoritetaan VM26 pitoisuuksilla 60, 120, 180, 240 ja 300 uM. Annoksesta riippuva anisotropian kasvua kasvavilla VM26 pitoisuuksien havaittiin jos reaktiot lopetettiin NaClO

4 (täytetty neliö), mutta ei ilman sitä (tyhjä kolmio). (B) Annosvasteinen lisäystä anisotropian lisääntyessä VM26 havaittiin, kun reaktiot sisälsivät ihmisen Top2α (täytetty neliö), mutta ei ilman sitä (tyhjä neliö).

lisäys NaClO

4 kumotaan Top2α DNA: han sitoutumisen, mutta säilyttää lääke-stabiloitua entsyymiä DNA kolmen komponentin komplekseja

jotta voidaan tutkia, onko lisäys anisotropian lisäämisen jälkeen NaClO

4 tulee Top2α sidottu DNA-kompleksit, testasimme vaikutuksia muuttamalla lisäämisjärjestyksestä avainkomponenttien näissä reaktioissa. Koska NaClO

4, anisotropia DNA-entsyymi-kompleksit on 0,19 (kuvio 3A-II), ja lisäksi NaClO

4 vähentää anisotropia 0,06 (kuvio 3A-III), joka on arvo lähellä sen, että vapaata oligonukleotidia (kuvio 3A-I). Tämä tulos osoittaa, että NaClO

4 pystyy tapahtuu erillään entsyymin DNA. Vaikka muodostumista entsyymin DNA: n ja teniposidi (VM26) ternäärinen kompleksi johtaa NaClO

4-resistenttejä anisotropia (kuvio 3A-IV), inkubointi ilman Mg

++ (kuvio 3A-V) tai esi-inkuboitu entsyymin NaClO

4 ennen DNA: n lisäämisen, riippumatta läsnä VM26, johtaa alempaan anisotropia (kuvio 3A-VI ja VII). Tämä tulos viittaa siihen, että NaClO

4 kykenee inaktivoimaan entsyymin ja estää entsyymin kykyyn muodostaa sitoutuneen DNA komplekseja. Koska Mg

++ tarvitaan entsyymiaktiivisuuksien topoisomeraaseista, vaatimuksen Mg

++ viittaa siihen, että yksinkertainen sitova ei riitä muodostumista NaClO

4-resistenttejä monimutkainen. Lukuun ottamatta VM26-stabiloitua tertiäärisiä komplekseja käsittely NaClO

4 kaikissa muissa olosuhteissa vähentää anisotropia arvoon samanlainen vapaata DNA alustan, joka vahvistaa, että NaClO

4 kykenee häiritä entsyymi-DNA-kompleksit ilman Top2α-kohdistamisaineena. Osoittaa riippuvuutta pitoisuudesta ja NaClO

4, jotta erityisesti havaitsemiseksi VM26-stabiloitua entsyymiä-DNA-kompleksit, olemme analysoineet anisotropia binary kompleksin lisäämisen jälkeen eri määrä NaClO

4 (kuvio 3B). Maksimaalinen dissosiaatio tasot saavutetaan jo NaClO

4 pitoisuuteen 100 mM, jossa IC

50 40 mM, ja siellä on vain vähän vaihtelua jopa 750 mm. Olemme siis osoittaneet, että NaClO

4 on tehokas aine häiritä proteiini /DNA-kompleksit, joilla on laaja pitoisuusalueella välillä 100-750 mM, ja se voidaan sovittaa käytettäväksi HTS varten Top2α-kohdentamisaineita.

(EN) VM26 riippuvainen anisotropian kasvua havaittiin, kun reaktio lopetettiin NaClO

4 (reaktio IV vs Reaction III), mutta ei silloin, kun NaCIO

4 lisättiin, kun läsnä oli Top2α ennen lisäämällä DNA, riippumatta lisäämällä VM26 (Reaktiot VI ja VII vs Reaction IV). Anisotropia havaittu kontrolleissa oli DNA vain (Reaction I), DNA /Top2α ilman VM26 (reaktio II), ja inkubointi ilman Mg

++ (reaktio V). (B) optimointi NaClO

4 pitoisuuden anisotropian määritys. Reaktio suoritettiin 50 ul: ssa Top2 reaktiopuskuria 300 uM VM26, 50 nM Alexa Fluor 488-DNA: n ja 250 nM ihmisen Top2α. Reaktioseos inkuboidaan 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Ennen mittaamista anisotropia, NaClO

4 lisättiin kuhunkin reaktioseokseen, jolloin saatiin lopullinen pitoisuus 750 mM. Maksimaalinen laajuus dissosiaation saavutettiin konsentraatiossa 100 mM tai enemmän. (C) Anisotropiaa havaittujen etoposidia (VP16), mAMSA, mitoksantronia (MXT), ja teniposidi (VM26) positiivisina verrokkeina, käsittelyn jälkeen 200 mM NaClO

4. Pitoisuudet Näiden tunnettujen Top2α lääkkeitä käytetään tässä olivat 300 uM VP16 ja VM26, ja 15 uM mAMSA ja MXT.

Voit testata, että anisotropia määritykset voivat olla tehokkaita tunnistamaan muita tunnettuja Top2α kohdistaminen syöpälääkkeet lisäksi teniposidi (VM26), mittasimme anisotropia, kun NaCIO

4-hoidon etoposidia (VP16), mAMSA, ja mitoksantroni (Fig. 3C). Samanlainen että mitattuna teniposidi, kaikki kolme tunnetut syöpälääkkeet tuotettu anisotropia readouts yläpuolella valvontaa.

NaClO

4 voi edistää sukupolven nicked DNA lääke-stabiloitua Top2α kolmen komponentin komplekseja

vaikutukset NaClO

4 häiritsemään Top2α sidottuja DNA-kompleksit tutkittiin oligonukleotidin kanssa alustan tarkkaillaan fluoresenssianisotropia määrityksiä. Tutkia edelleen mahdollisia mekanistinen roolit NaClO

4 Top2α reaktioita, me päätämme käyttää plasmidi DNA alustan, joka tarjoaa soveltamista agaroosigeelielektroforeesilla tutkia DNA rakenteellisia muutoksia. Joilla on vahva denaturointiaine SDS lopettaa reaktioita plasmidi-DNA, kun läsnä on syöpälääke, kuten teniposidi (VM26) voi sulkea sisäänsä lohkeavan komplekseja ja lisäävät tuotteiden linearisoidaan ja nick-DNA: ta. Olemme suorittaa kokeita tutkia DNA tuotteita tuotetaan reaktioseoksesta, joka sisältää Top2α-DNA-VM26 kolmen komponentin komplekseja, jotka lopetettiin joko SDS: n tai NaClO

4. Poistaa proteiinit, jotka liittyvät DNA-käsittelyn jälkeen nämä dissosioimalla reagenssien, pysäytetty reaktioseokset käsiteltiin proteinaasi K: lla ennen niiden analyysi agaroosigeelielektroforeesilla. Reaktiotuotteet jälkeen päättyy SDS osoitti odotetun kuvion ulkonäön linearisoidun DNA pääasiassa, ja jotkut koloja lajien sekä (kuvio 4A). Mielenkiintoinen sijaan reaktiotuotteet tuotetaan NaClO

4 hoito tuotti enemmän kolhiintuneita DNA tuotteita ja vähemmän linearisoitu muoto. Jossa NaClO

4 pysäyttää reaktioita, tuotannon koloja ja linearisoitua muotoja kasvoi samaan nostettaessa VM26 pitoisuudet näissä reaktioissa (kuvio 4B), jotka osoittavat, että molemmat tuotteet olivat todennäköisesti saaduilla VM26: n toimintaa entrapping lohkeavan komplekseja. Edellinen kertomus jo osoitti, että VM26 edistää muodostumista yksijuosteista DNA lovia lisäksi kaksijuosteiseen taukoja, riippuen concertedness katkaisun kahdesta protomeereissä in Top2 dimeeri [21]. Sekä biokemialliset ja rakenteelliset biologiset tiedot osoittivat, että kukin protomeeri voi sitoa yhden lääkkeen molekyylin, jonka läsnäolo voi vaikuttaa katkaisun /uudelleenligaatiolla välittyy dimeerinen entsyymi [22], [23]. Tuloksena että NaClO

4 taipumus tuottaa vähemmän linearisoidun pilkkoutumistuotteet, ja lisää kolhiintuneita muodossa, on mahdollisesti johtuu, että se on vähemmän voimakas denaturanttia kuin SDS ja tehottomampia indusoivan muodostumista pilkkominen komplekseja. Voidaan siis olettaa tarkkailla enemmän linearisoitu tuotteita ja useamman entsyymin ja consequentially enemmän lohkeavan komplekseja. Voisimme osoittaa, että lisäämällä entsyymin DNA stoikiometria, linearisoitu DNA tuotteiden kasvoi samanaikaisesti kanssa nicked muodossa, kun reaktiot lopetettiin NaClO

4 (kuvio 4C). Samoissa reaktio-olosuhteissa, mutta lopetettiin SDS, linearisoidun tuotteet olivat hajoaa edelleen, jolloin saatiin DNA-fragmentit pienempi kuin yksikön pituus molekyylin. DNA lohkominen ja nicking aiheuttama NaClO

4 eivät rajoitu pyöreään DNA substraatteja. Voisimme helposti osoittaa DNA pilkkomalla lineaarinen alustaan ​​suuremmilla entsyymiä /DNA-suhteet (kuvio 4D). DNA: n hajoamisen tuottaa Saharan täyspitkää molekyylien NaClO

4 kohtelu johtuu pieni etäisyys kahden lovia rinnakkain osa ja myös joitakin kaksijuosteisen pilkkominen tällaisissa olosuhteissa. Kuitenkin samoissa olosuhteissa lisäämällä SDS voi aiheuttaa laajempia DNA heikkenemiseen, mikä osoittaa, että SDS on vahvempi denaturanttia ja tehokkaampi puhkeamisessa Top2α lohkeamisreaktiossa. Mielenkiintoista, kun SDS ja NaClO

4 lisättiin peräkkäin, SDS voi edistää sukupolven pienempien DNA osalta, vaikka se lisättiin jälkeen NaClO

4. Tämä tulos taas viittaa siihen, että NaClO

4 ei täysin häiritä entsyymiä /DNA /huume kolmen komponentin komplekseja, silti säilyttää niiden herkkyyttä SDS edistämisessä enemmän pilkkominen komplekseja.

(A) Reaktiot ihmisen Top2α ja pUC19 plasmidi DNA lopetettiin joko NaClO

4 tai SDS. Lisääminen NaClO

4 100 mm johtaa muodostumista enemmän kolhiintuneita DNA tuotteita ja lisäämällä SDS johtaa mieltymys lineaarisen niistä. Reaktiot suoritettiin 8,5 nM pUC19, 3,75 nM Top2α, ja 100 uM VM26, lopetettiin lisäämällä joko NaClO

4 tai SDS, reaktiotuotteet käsiteltiin proteinaasi K: lla, ja analysoitiin elektroforeesilla 1,2% agaroosigeelissä joka sisälsi 0,15 ug /ml etidiumbromidia. (B) DNA-pilkkominen määritykset suoritettiin samanlaisissa olosuhteissa, paitsi kasvavien pitoisuuksien kanssa VM26, minkä jälkeen lisättiin NaClO

4. Nostamalla nicked DNA pilkkoutumistuotteet havaittiin suurempia määriä VM26. (C) Plasmidi-DNA katkaisun määritykset suoritettiin käyttäen erilaisia ​​entsyymi DNA-suhteet kuten on osoitettu. Lineaarinen DNA tuotteet (täyspitkää tai osa-täyspitkää) SDS hoidon ja molemmat kolhiintuneita ja lineaarinen DNA NaClO

4 hoito lisääntyä entsyymiä DNA-suhteet. (D) Reaktiot, kun läsnä on eri pitoisuuksia VM26 sisälsi lineaarisen pUC19 substraattina entsyymin kanssa /DNA-suhde 20, ja lisäämällä sen jälkeen NaClO

4 tai SDS: ää, tai molempia peräkkäin, lopettaa reaktioita. Kokomerkkiaineiden, ja lineaarinen pUC19 lastattiin äärimmäisenä vasemmalla kaksi kaistaa. Sijainnit DNA oli merkitty NC (koloja pyöreä), L (lineaarinen), NSC (negatiivinen superkierteisessä), ja RC (rento).

NaClO

4-käsiteltyjen kolmen komponentin komplekseja analysoitiin ultrasentrifugoimalla glyseroliin kaltevuudet

sovellettu ultraentrifugoimalla glyseroli kaltevuudet tutkimaan vakautta Top2α-DNA-kompleksit käsittelyn jälkeen NaClO

4, ja vaikutuksen on syöpälääke. Glyseroli gradienttisentrifugoinnilla käytettiin usein erillinen makromolekyylien perustuu niiden koko ja muoto. Olemme inkuboitiin Top2α kanssa plasmidi-DNA: joko läsnä ollessa tai puuttuessa VM26, ja soveltaa sitä glyseroli gradientti suoraan tai käsittelyn jälkeen NaClO

4. Fraktiot kerättiin sentrifugoinnin jälkeen ja sijaintipaikat Top2α määritettiin western blotit vastaisella vasta-aineella Top2α. Puuttuessa VM26, Top2α sedimentoitiin enemmän kohti pohjaa ilman NaClO

4 hoito (kuvio 5, kaistat 1 vs 3). Läsnäolo NaClO

4 siirtyy Top2α kevyempi jae, vuonna vastaavaan asentoon vapaan entsyymin (kuvio 5, kaistat 3 vs 5), mikä vahvistaa kykyä NaClO

4 häiritä entsyymi-DNA monimutkainen puuttuessa syöpälääke. Läsnä ollessa VM26 hoito NaClO

4 ei selvästi muuta laskeutumisen Top2α, viittaa siihen, että NaClO

4 säilyttää yhä suurimman osan kolmen komponentin komplekseja (kuvio 5, kaistat 2 vs 4). Kokeet sekä fluoresenssianisotropia ja glyserolia kaltevuus sedimentaatio tukevat käsitystä, että NaClO

4 hoito tarjoaa keinon erottaa vakautta Top2α-DNA-kompleksit riippuen läsnäolo syöpälääkettä, mikä tarjoaa meille lähestymistavan automatisoitu seulontaan määritys ja mikä mahdollistaa käytön HTS alustalla.

glyserolia kaltevuus liuos kerroksittain polyallomeeriputkeen putkessa alkaen 60%: sta 30% glyserolia. Reaktio Top2α /DNA-kompleksin muodostumisen suoritettiin 80 ul: ssa liuosta, joka sisälsi 100 uM VM26, 34 nM pUC19 ja 3,75 nM ihmisen Top2α. Reaktioseos ladattiin päälle 30-60% glyserolia kaltevuus, ja putki kruunasi mineraaliöljyä.