Krooninen sairaus

tiivistelmä

Solun pinta glycoconjugates läsnä korjauksilla rakenteensa kroonisten sairauksien ja erillisiä oligosakkaridi epitooppeja on liitetty syöpään. Niistä typistetty glykaanien hetkellä terminaali ei-pelkistävä β-Nasetyyliglukosamiini- (GlcNAc) jäännökset, jotka ovat harvinaisia ​​terveitä kudoksia. Lektiinien epätavanomaisten lähteistä, kuten sienistä tai ALGI aikaan uusia markkereita, jotka sitoutuvat spesifisesti tällaisia ​​epitooppeja, mutta niiden saatavuus voi olla haastavaa. GlcNAc sitova lektiini päässä itiöemä sienen

Psathyrella velutina

(PVL) on tuotettu hyvällä saannolla Bakteeriviljelmässä. Vahva spesifisyys terminaali GlcNAc tähteiden näkyi glykaania array. Affinity saadut arvot mikrokalorimetria ja pintaplasmoniresonanssi osoitti mikromolaarista affiniteetti GlcNAcβ1-3Gal epitooppeja ja kaksiantenniset N-glykaanien kanssa GlcNAcβ1-2Man rajattu oksat. Kiderakenne PVL kompleksoitu GlcNAcβ1-3Gal vahvistettu rakenteellinen perusta erityispiirteet. Merkintöjä useita erilaisia ​​syöpäsoluja ja käytön estäjien glykaanin aineenvaihdunnan osoitti, että rPVL sitoutuu päätelaitteen GlcNAc mutta myös siaalihappoa (Neu5Ac). Analyysi Glykosylaasitransferaasitoiminnan ilmaisun vahvisti suurempi määrä GlcNAc läsnä syöpäsoluissa. rPVL sitoutuminen on spesifinen syöpä kudokseen ja heikosti tai ei lainkaan merkintää ei havaittu terveistä, paitsi mahan rauhaset, jotka ovat ainutkertaiset αGlcNAc esittelevien musiineja. Vuonna keuhko-, rinta- ja paksusuolikarsinoomat, selkeän jaon voitiin havaittu syövän alueiden ja ympäröiviin terveisiin kudoksiin. PVL on siten käyttökelpoinen väline merkintöjä agalacto-glykaanien in syöpää tai muita sairauksia.

Citation: Audfray A, Beldjoudi M, Breiman A, Hurbin A Boos I Unverzagt C, et al. (2015) rekombinantti Sieni Lectin varten Labeling Katkaistu glykaanien ihmisen syöpäsoluja. PLoS ONE 10 (6): e0128190. doi: 10,1371 /journal.pone.0128190

Academic Editor: Els JM van Damme, Gentin yliopisto, BELGIA

vastaanotettu: 28 tammikuu 2015; Hyväksytty: 24 huhtikuu 2015; Julkaistu 4. kesäkuuta 2015

Copyright: © 2015 Audfray et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja. PVL /ligandi-kompleksin on talletettu Protein Data Bank koodilla 4UP4.

Rahoittajat: Agence Natioale de la Recherche: myöntää NeoLect-11-BSV5 ja ANR-11-LABX-003 (http: //www .agence-nationale-recherche.fr /). Euroopan tiede- ja teknologia COST Action CM1102 (https://www.cost.eu/). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

muutokset solun pinnan glykosylaatiota tiedetään liittyvän useita kroonisia sairauksia ja syöpää glykaanien edustavat hyvin lupaava kentän biomarkkereiden löytö [1-3]. Korrelaatio tulehduksesta tai etäpesäkkeiden yliekspressioon sialyloiduissa ja fukosyloitujen epitoopit, kuten sialyyli Lewis x on käyty intensiivisen tutkimuksen. Kuitenkin muissa tapauksissa, erittäin aktiivinen aineenvaihduntaa ja Divison syöpäsolujen voi johtaa epätavallisen altistumisen kryptisiä epitooppeja. Tämä sisäinen osa glykokonjugaattien, jotka olisi koristeltu muut monosakkaridit normaaleissa soluissa, voi siis olla alttiina solun pinnalla ja tulevat saataville havaitsemisen vasta-aineita tai lektiinejä [4].

Nasetyyliglukosamiini- (GlcNAc ) on hiilihydraatti jäännös, joka on läsnä sisäosassa N-glykaanien, kuten ydin chitobiose liittyvät asparagiinitähde ja harvemmin kuin β1-4 liittyy ydin haarautunut mannoosi puolitettu N-glykaanien. GlcNAc on läsnä myös oksat näiden glykokonjugaattien joko β1-2-sidottu mannoosia (Man) on trimannose ytimen tai β1-3-sidottu galaktoosi (Gal) osana polylactosamine laajennettu oksat (kuvio 1A). Kuitenkin, koska toiminnan galaktosyylitransferaaseja ja sialyylitransferaaseista, nämä GlcNAc tähteet eivät ole terminaali tehtävissä normaaleissa kudoksissa. Samoin glykosfingolipidit sisältävät GlcNAcβ1-3 tai β1-6 liittyy Gal muttei alttiina terminaali asemissa. Epitoopit ovat samanlaisia ​​musiineilla Gal, siaalihapon (Neu5Ac) tai fukoosin (Fuc) tähteet rajaaminen päätteen epitooppeja. Ainoa poikkeus on harvinainen epitooppi koostuu α1-4 liittyy GlcNAc-lopetetaan musiineja päässä rauhas limakalvojen solujen vatsassa [5] (Kuva 1A).

. Esimerkkejä normaalia ja katkaistun oligosakkarideja, jotka löytyvät normaalia tai syöpä kudoksiin. Koodittavat kaavamainen esitys monosakkaridien on alempi osa kuvassa. Heptasaccharide käytetään sitoutumiskokeissa on merkitty ”hepta”. B. synteesi heptasaccharide atsidin 2 vastaa oligosakkaridirakenteisiin ”hepta” paneelissa A.

esiintyminen poikkeava βGlcNAc-päättämisestä epitooppeja on havaittu rajoitettu määrä syöpiä, mukaan lukien ihmisen leukemiasolujen [6 ]. IgG: t, joissa katkaistu N-glykaanien on raportoitu seerumin eturauhassyövän potilailla [7]. Altered musiineja liittimen GlcNAc kuviot ehdotettiin muodostamiseksi Tk epitoopin, paksusuolen kasvaimeen liittyvää antigeeniä [8]. Tarkin luonnehdinta korjauksilla glykosylaation altistuminen sisäisten GlcNAc suoritettiin glycome analyysi eri syöpä, osoittaen esiintyminen lyhyen typistetyn N-glykaanien lopetettiin GlcNAβ1-2Man molemmilla antenni ja GlcNAc-päätteisen lineaarinen ja haarautunut glykosfingolipidit erityisesti keuhkojen pienisoluisen karsinooman ja adenokarsinooma, mutta myös munuais-, rinta- ja munasarjan karsinooma [9] (kuvio 1A).

Lektiinit, yleensä peräisin kasveista, on osoitettu olevan erittäin tehokas havaitsemaan poikkeava glykosylaatio biologisista näytteistä. Uusi tekniikka on käyttää lektiinin matriiseja, jotka voivat sisältää lektiinit suuret spektrit spesifisyys ja siksi luonnehtivat vaihtelu glykosylaation [10]. Käyttö lektiinien saatu luonnon organismit voivat olla aikaa vievää ja saattaa tuottaa ongelmia saastumisen tai vaihtelua erien välillä. Näin ollen yhdistelmä-DNA-lektiini tekniikka alkaa kehittää [11]. Lektiinit, joita perinteisesti käytetään GlcNAc-sitoutumisen uutetaan kasveista, kuten vehnä (WGA), tomaatti (SLT) ja

Griffonia simplicifolia

(GSL-II). Uusi GlcNAc-lektiiniä (PVL) puhdistettiin itiöemiä ja rihmastoa sientä,

Psathyrella velutina

[12] ja rakenteellisesti tunnettu siitä, [13]. Läheisesti liittyvä proteiini, lektiini 2 alkaen sieni

Agrocybe aegerita

(AAL-2) on äskettäin kloonattu ja osoitettiin sitoutuvan hepatoomasolujen [14]. PVL rakenne olevan uusi kertaiseksi keskuudessa lektiinit, seitsemän β-levyt järjestetty β-potkurin kertaiseksi. Lektiini on näin ollen omaksunut donitsi muoto kuusi GlcNAc sitoutumiskohtia, ja odotetaan esittelevän vahva aviditeetti solujen pinnalla esitetään tiheässä terminaalista GlcNAc jäämiä.

käsillä olevan työn oli tuottaa rekombinantti PVL ja luonnehtimiseksi hienospesifisyyttä kohti eri GlcNAc päättyvä epitooppeja, jotka voivat olla läsnä patologiaan liittyviä typistettyjä muotoja ihmisen glykokonjugaattien. Aviditeetin lektiinin varten GlcNAc-koristeltu pinta arvioitiin paneelit. Lopuksi, kyky lektiinin merkitä syöpäsoluja ja syöpäkudosten kuvattiin myös.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaali

GlcNAc on ostettu Sigma-Aldrich. Disakkaridi GlcNAcβ1-3Gal, lakto-N-tetraoosia (Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc), lakto-N-trioosifosfaatti (GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc) chitobiose (GlcNAcβ1-4GlcNAc), chitopentaose (GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc ) on ostettu Elicityl (Crolles, Ranska). Sialidaasi alkaen

Clostridium perfringens

on ostettu Sigma-Aldrich (vrt. N2876) tai New England Biolabs (Ipswich, MA). ß-D-N-asetyyli-heksosaminidaasin

f iältään

Streptomyces plicatuksen

hankittiin New England Biloabs. Biotiini-leimatun siaalihapon lektiiniä MAH hankittiin Vector Labs (Burlingame, CA) B

synteesi N-glykaanin 2

Nonasaccharide atsidia 1 (kuvio 1 B) valmistettiin munankeltuainen seuraa entsymaattinen hydrolyysi ja atsidoinnin [15, 16]. 5,1 mg (3,1 umol) ja nonasaccharide 1 oli liuotetaan mahdollisimman 203 ui fosfaattipuskuria (100 mm, pH 6,8, 1 mm MgCI

2). 10 yksikköä lyofilisoidun β-galaktosidaasi (EY 3.2.1.23) lisättiin liuokseen. Seosta inkuboitiin 37 ° C: ssa 3 päivää (TLC: 2-propanoli, 1 m ammoniumasetaatti, 2: 1). Lyofilisoinnin jälkeen, jäännös puhdistettiin geelisuodatuksella (Superdex 30, 1,6 x 60 cm, 0,1 m NH

4HCO

3, 0,9 ml min

-1). Piikin, joka eluoitui 86 min, lyofilisoitiin ja suola poistettiin geelisuodatuksella (Sephadex G-25, 2,5 x 15,5 cm, 5% etanolia vedessä, 0,6 ml min

-1). Piikin, joka eluoitui 75 min, lyofilisoitiin, jolloin saatiin 2,9 mg (2,2 umol) ja heptasaccharide 2 (70%). [Α]

D

22 = -9,0 (c = 0,5, H

2O). Puhtaus varmistettiin 360 MHz

1H NMR D

2O (S1 kuvio)

1H-NMR (360 MHz, D

2O): δ = 5,03 (d,

J

1,2 1 Hz, 1H, H-1

4), 4,83 (d,

J

1,2 1 Hz, 1H, H- 1

4′), 4,68-4,64 (m, 2H, H-1

1, H-1

3), 4,53 (d,

J

1,2 = 7,7 Hz, 1H, H-1

2), 4,47 (d,

J

1,2 = 8,3 Hz, 2H, H-1

5, H-1

5 ’), 4,18-4,15 (m, 1H, H-2

3), 4,12-4,09 (m, 1H, H-2

4), 4,04-4,01 (m, 1 H, H- 2

4 ’), 1,99 (s, 3H, NAc), 1.97 (s, 9H, NAc). ESI-MS: m /z laskettu C

50H

83N

7o

35: 1341,49; havaittu 1342,62 (M + H)

+, 1365,86 (M + Na)

+

Rekombinantin PVL

nukleotidisekvenssin, joka koodaa peptidiä sekvenssin lektiinin välillä hedelmiä elin sieni

P

.

velutina

(GenBank, tulonumero DQ232759) [13] täydennettävä N-terminaalista asennossa aminohappojen MSVVVIS syntetisoitiin kodonioptimointi ilmentämiseen

Escherichia coli

(GenScript, Piscataway, NJ). Se vietiin ekspressiovektoriin pET25b käyttäen Ndel- ja Xhol-restriktiokohdat. PET25-rPVL vektori transformoitiin

E

.

coli

BL21 (DE3) (Novagen), ja solut, kätkeminen pET25-rPVL plasmidi kasvatettiin LB-liemessä, joka sisälsi 100 ug ml

-1 ampisilliinia 37 ° C: ssa, kunnes A600 saavutti 0,7. Soluja viljeltiin sitten 16 h kuluttua lisäämällä 0,5 mM isopropyyli-β-D-tiogalaktopyranosidilla. Sentrifugoinnin jälkeen (7000 x g 15 min), bakteerit suspendoitiin uudelleen tasapainotuspuskurilla (20 mM Tris /HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl) ja rikkoutuneiden solujen häiriöitä paineessa 1,7 kilobars (Constant Systems Ltd). Sentrifugoinnin jälkeen (50000 x g, 30 min 4 ° C: ssa) ja suodattamalla, affiniteettikromatografialla GlcNAc-agaroosi-kolonniin (ey laboratoriot inc.) Suoritettiin supernatantti. rPVL annettiin sitoutua immobilisoituun GlcNAc tasapainotuspuskurissa, ja pesun jälkeen (20 mM Tris /HCI, pH 7,5, 1 M NaCl), se eluoitiin 200 mM vapaata GlcNAc tasapainotuspuskurissa. Puhdistettu proteiini dialysoitiin ultrapuhdasta vettä 7 päivää, kylmäkuivattiin ja säilytettiin 4 ° C: ssa.

Glycan array

puhdistettua rPVL leimattiin Alexa Fluor 488 (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeita ja puhdistettiin uudelleen D-Salt polyakryyliamidi suolanpoistopylväässä (Pierce). Alexa-leimattu rPVL käytettiin glykaanitähteen array seulontaan standardin menettely Protein-Glycan Vuorovaikutus Core (H) Consortium for Functional glykomiikan.

Terminen shift analyysi

Terminen shift määritykset olivat suoritettiin käyttäen Mini Opticon, Real Time PCR kone (Bio-Rad Laboratories) 0,5 mg ml

-1 proteiinia laimennettuna 100 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7,5, 100 uM CaCl

2, kanssa tai ilman oligosakkaridia reaktion kokonaistilavuus on 25 ui. SYPRO Orange (Molecular Probes, CA) käytettiin fluoresoiva koetin havaitaan 530 nm: ssä. Lämpötila nostettiin käyttäen 1 ° C /minuutin välein 25 ° C: sta 100 ° C: seen ja fluoresenssia lukemat otettiin kullakin aikavälillä. Positiivinen ATm arvo tarkoittaa, että ligandi stabiloi proteiinin denaturaatio, ja siksi sitoutuu proteiiniin. Vähintään kaksi riippumatonta mittausta suoritettiin kullekin tilalle

mikrokalorimetria

Rekombinantti lyofilisoitu rPVL liuotettiin puskuriin (20 mM Tris /HCl, pH 7,5, NaCl 150 mM, 100 uM CaCl

2) ja josta oli poistettu kaasut. Proteiinipitoisuus tarkistettiin mittaamalla A280 käyttämällä teoreettista molaarinen ekstinktiokerroin 65890 M

-1 cm

-1. Hiilihydraatti ligandit liuotettiin samaan puskuriin, josta oli poistettu kaasut, ja ladataan injektioruiskuun. ITC suoritettiin ITC200 microcalorimeter (GE Healthcare). RPVL liuos pantiin 200 ul: n näyte solun 25 ° C: ssa. Titraus suoritettiin 20 injektioita 2 pl hiilihydraatti ligandeja jokaista 120 s. Kokeelliset tiedot sovitettiin teoreettiseen titrauskäyrään käyttäen Alkuperäinen ohjelmisto toimittamia GE Healthcare, jossa AH (entalpian muutos), Ka (yhdistys vakio) ja n (sitoutumiskohtien lukumäärä per monomeeri) kuin säädettävät parametrit. Free energian muutos (AG-) ja entropia maksut (TΔS) saatiin yhtälöstä AG-= AH – TΔS = -RT ln Ka (T kuin absoluuttinen lämpötila ja R = 8,314 J mol

-1 K

– 1). Kaksi itsenäistä titraukset suoritettiin kutakin testattua ligandin.

Pintaplasmoniresonanssianalyysi

Kaikki SPR kokeet suoritettiin Biacore X100 väline (GE Healthcare) 25 ° C: ssa HBS (10 mM Hepes /NaOH: lla, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20) täydennettynä 100 uM CaCl

2 virtausnopeudella 30 ul min

-1. Sitovat mitattiin resonanssiyksikköinä ajan kuluttua tyhjä vähennys-, ja tiedot arvioitiin sitten käyttäen Biacore X100 arviointiohjelmistoa, version 2.0. Dissosiaatiovakiot määritettiin piirtämällä vaste tasapainossa (Req, 10 s ennen loppua injektio) vastaan ​​analyytin pitoisuuden. Proteiinin päällystetty siru, 3500 resonanssi yksikköä rPVL (100 ug ml

-1, 10 mM asetaattipuskuria, pH 6,2) on immobilisoitu virtauskanavasta 2. tutkimus luokan CM5 sirun avulla standardin amiinikytkentää menettelyjä. Kanava 1 on aktivoitu /deaktivoitu. Kokeet koostuvat injektio (yhdistyksen 360 s, dissosiaatio 400 s) eri pitoisuuksia oligosakkarideja (2 kertainen cascade laimennoksina, 0-10 uM) molemmilla kanavilla.

proteiinikristallografia

kiteet rPVL kompleksoituna GlcNAcβ1-3Gal saatiin hanging drop-20 ° C: ssa. Lyofilisoitu proteiini liuotettiin 2,5 mg ml: ssa

-1 10 mM Hepes /NaOH-puskuria, pH 7,5, NaCl 150 mM, 100 uM CaCl

2 ja inkuboitiin 1 mM GlcNAcβ1-3Gal 1 h ajan huoneenlämpötilassa ennen co-kiteytys. Yksi suuri suorakaiteen kaltainen kide saatiin 20% PEG3350, 0,2 M natrium formaatti ja 0,1 M diammoniumfosfaatti useita kuukausia. Yksiosainen oli suoraan asennettu cryoloop ja flash-jäätynyt nestemäisessä typessä. Diffraktio kerättiin 100 K Eurooppa Synkrotronisäteily Facility (Grenoble, Ranska) asemalla BM30A käyttäen ADSC Q315r CCD-ilmaisin [17]. Tiedot prosessoitiin käyttäen XDS [18]. Kaikki ylimääräiset computing suoritettiin käyttäen CCP4-ohjelmistopakettia [19] Tietojen laatu tilastojen esitetty yhteenvetona S1 taulukossa. Molekyyli korvaava tekniikka käytettiin ratkaisemaan rakenne PHASER [20] ja koordinaatit natiivi PVL (Protein Data Bank koodi 2C4D) [13]. Rakenne tarkennettiin hillitty suurimman uskottavuuden hienous käyttämällä REFMAC 5.8 [21] iterated manuaalisella uudelleenrakentaminen Coot [22]. Sisällyttäminen Ligandin tehtiin tarkastuksen jälkeen MFO-DFC painotettu karttoja. Vesimolekyylit, käyttöön automaattisesti Coot, tarkastettiin manuaalisesti. Stereokemiallinen laatu malleja arvioitiin ohjelman Molprobity [23], ja koordinaatit talletetaan Protein Data Bank koodeihin 4UP4.

Solut linjat

Ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) (H358, A549, H441 ja H322), keuhkoputken epiteelin (HBEC-3KT), rintasyöpä (MCF-7, MDA-MB-231), munasarjasyöpä (OVCAR3), eturauhassyöpä (DU-145), ihon okasolusyöpä (A431), melanooma (A375, Colo829 ja SKMel28), ja paksusuolen syöpä (HT-29) solulinjat saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). M119 melanoomasolulinja oli lahja Dr. Nathalie Labarrière (Inserm U892, Nantes, Ranska). Soluja ylläpidettiin RPMI-1640-väliaineessa (Gibco, Cergy Pontoise, Ranska), paitsi MDA-MB-231 ja HT-29, joka oli kasvatettu DMEM-4,5 gl

-1 glukoosia (Gibco), ja HBEC-3KT , joka pidettiin keratinosyyttispesifisestä SFM väliaine (Gibco). Kaikki elatusaineet olivat täydennetty 10% lämmöllä inaktivoitua naudan sikiön seerumia (5% MDA-MB-231), ja soluja pidettiin kosteutetussa ilmakehässä 5% CO2, 37 ° C: ssa.

Flow cytometry

Solut trypsinoitiin, jaettiin osiin, sitten pestiin kahdesti PBS: ssä (Ca

2+ ja Mg

2 +). Inkuboinnin jälkeen rPVL-Alexa488 (5 ja 10 ug ml

-1), solut pestiin kaksi kertaa, ja analyysi suoritettiin koskevasta Accuri C6-virtaussytometrillä käyttäen CFlow-Plus Software (BD Biosciences). Vaihtoehtoisesti, biotinyloitu rPVL tai MAH käytettiin, jonka jälkeen streptavidiini-fykoerytriini (BD) ja analyysi tehtiin FACSCalibur kanssa CellQuest-ohjelmaa (BD). Milloin on osoitettu, soluja esi-teated sialidaasilla (Sigma) tai ß-DN-asetyyli-heksosaminidaasin 4 h 37 ° C: ssa.

inhibitio glykosylaation

A549-soluja ympättiin 6-kuoppaisille levyt ja käsiteltiin eri glykosylaation estäjät a fukosyylitransferaasin estäjä, 2-fluori-perasetyyli fukoosin (2FF) ja sialyyli-estäjä, 3-fluori-perasetyyli-neuramiinihappo (3F-Neu5Ac), joka on kuvattu viime aikoina [24] . Käsittely suoritettiin 4 päivän ajan 400 uM ja 100 uM 2FF ja 3F-Neu5Ac vastaavasti. Väliaine korvattiin ja inhibiittorit lisättiin uudelleen 2 päivää.

Tutkiakseen tyypin glykosyloidun ligandeja, jotka on tunnustettu rPVL, käytimme Kifunensin (Sigma), joka estää ER α-mannosidaasin ja on siten käsittely N-glykaanien; bentsyyli-2 asetamido-2 deoksi-alfa-D-galaktopyranosidi (bentsyyli-GalNAc, Sigma), joka estää O-glykosylaatio prosessi ja 1 R, 2R – (+) – 1-fenyyli-2-palmitoylamino-3-N-morpholine- 1-propanoli (PPMP; Avanti Polar Lipids, Alabaster, USA), joka estää synteesiä glykolipidit. Soluja käsiteltiin 5 uM Kifunensin ja 4 päivää kuten edellä. Sillä bentsyyli-GalNAc ja PPMP solut jätettiin kosketuksiin inhibiittorit, 6 mM ja 10 uM, yli 24 ajan, sitten elatusaine vaihdettiin ja soluja inkuboitiin vielä 1 vuorokausi ennen analyysiä. Kuten 2FF, 3F-Neu5Ac ja PPMP laimennetaan DMSO, puhdas DMSO lisättiin keskipitkällä Verrokkikuoppien, jotta sama DMSO-pitoisuus kussakin kuopassa.

Immunofluoresenssianalyysi

Cells ympättiin 4-kammioon kulttuuri dioja (4×10

4 solua per kammio). 24 tunnin jälkeen solut pestiin jääkylmällä PBS: llä ja kiinnitettiin 2% paraformaldehydillä 10 min ajan 4 ° C: ssa. Ennen ja jälkeen inkubaation 1% BSA /PBS: ssä (w /v), solut pestiin kylmällä PBS: llä kolme kertaa 5 min kukin. Sitten solut altistettiin immunofluoresenssivärjäyksen kanssa rPVL-Alexa488 1 tunti huoneenlämpötilassa ja pestiin sitten kylmällä PBS: llä kolme kertaa 3 minuuttia kukin. Soluja tarkasteltiin käyttäen BX41 mikroskooppia, jossa on DP-70 digitaalikamera (Olympus, Tokio, Japani), ja pseudo–konfokaalimikroskoopilla ApoTome varustettu AxioCam MRM (N /B).

Kudosleikkeet

Etanoli-kiinteä ihmisen henkitorvi, ruokatorvi, pohjukaissuolen risteyksessä, jejunum, paksusuoli-, haima-, maksa-, munasarja, kohtu ja emätin näytteet saatiin elinluovuttajilta. 18 kudosnäytteitä 10 eri yksilöiden valmistamiseen käytettiin kudoksen mikrosirulla (TMA) terveiden kudosten. Etanoli-kiinteä peräsuolen tuumorisektioiden saatiin syövän jälkeen leikkauksen. Formaliini-parafiiniin upotetut ihmisen NSCLC näytteitä (n = 3 okasolukarsinoomia, n = 3 adenokarsinoomat) saatiin myös. Rintasyöpä ja keuhkojen kasvain TMA (formaliinilla kiinnitetyt, 40 kasvaimet, 10 pariksi etäpesäke ja 10 pariksi viereisen ”normaali” kudos) ostettiin SuperBiochip (Seoul, Etelä-Korea). Formaliinifiksoidusta koirien nisäkasvaimia saatiin ”laboratorio eläinten histopatologia Nantesin Veterinary School, ONIRIS) immuunivärjäytyminen analyysi suoritettiin 3-pm paksun kudosleikkeiden.

Histochemistry

Kudos leikkeet poistettiin parafiini, sitten endogeeninen peroksidaasit blokattiin inkuboimalla kohdat PBS: llä, joka sisälsi 3% vetyperoksidia (v /v), 5 min. Tämän jälkeen leikkeet blokattiin BSA: lla 5% (w /v) 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa , jonka jälkeen inkuboitiin 0,7-1 ug ml

-1 biotinyloidun rPVL 1 h huoneen lämpötilassa (etanoli-kiinteä kohdissa) tai 2 ug ml

-1 biotinyloidun rPVL PBS: ssä 4 ° C: ssa 18 tunnin ajan ( ja formaliinilla kiinnitetyt kohdat). pesun jälkeen osat kahdesti PBS: llä, joka on epäsuora biotiini-streptavidiini-järjestelmän ja DAB (Ventana Medical Systems) tai AEC (Vector laboratories) detektiovälinepakkaukset käytettiin mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. kehitetty levyjä pestiin kaksi kertaa PBS: llä ja vastavärjättiin hematoksyliinillä. Kun oli pesty vedellä, leikkeet dehydratoitiin ja asennettu. Osiot havaittiin alle BX41 mikroskoopilla varustettu DP-70 digitaalikamera (Olympus, Tokio, Japani) tai kuvaamisen kanssa NanoZoomer dia-skanneri (Hamamatsu, Hamamatsu City).

hoidon glykosidaasit kohdat inkuboitiin (sen jälkeen, kun parafiini ja vetyperoksidi esto) ja 50 U sialidaasia (New England Biolabs) ja 25 U beta-DN-asetyyli-heksosaminidaasin 2 tuntia 37 ° C: ssa. Tuore entsyymit lisättiin sitten ja levyt inkuboitiin edelleen yön yli 37 ° C: ssa. Ohjaus liukuu valmistettiin rinnakkain vastaavaa entsyymiä puskurit (natriumsitraatti pH 6 ja 4,5 vastaavasti). Yön yli inkuboinnin jälkeen objektilasit pestiin kahdesti PBS: llä, blokattiin PBS-5% BSA: ta (w /v), värjättiin rPVL ja kuvattiin kuten edellä on kuvattu.

Ethics lausuntoja

Kaikki ihmisen etanoli-kiinteä kudokset kudokset kerättiin ja varastoitu ennen lain 88-138 20. joulukuuta 1988 resektio ihmisen kudosten kuoleman jälkeen tieteellisiin tutkimuksiin. Tästä syystä ei hyväksyntää Research eettisen komitean koskee. Näytteet saatiin Nantesin University Hospital Center for Biological Resources (https://relib.fr) nojalla syöpäoppi hyväksymän ohjelman ministeriön tutkimuksen (hyväksynnän DC-2011-1399). Kudospankkeihin ja tutkimuksen kulusta formaliinilla kiinnitys- ihmisen kudokset hyväksyi ministeriön tutkimuksen (hyväksynnän AC-2010-1129) ja alueellisen Institutional Review Board Comité de Protection de personnes (CPP) 5-Sud Est (alueellinen board) . Kaikki potilaat osallistuivat tähän tutkimukseen kunhan kirjallinen lupa. Nämä erityiset näytteet on aikaisemmin käytetty, kuten on kuvattu kirjallisuudessa [25, 26]. Mitä kudossiruina saatu Superbiochips Laboratories Ltd (Seoul, Korea), yhtiö todistaa, että ”ihmisen materiaali on poistettu tai kerätään luovuttajan etukäteen antamaa suostumusta ja että mitään maksua on ylipäänsä tehty jälkimmäistä”. Formaliinifiksoidusta kudosten koirien rinta- kasvaimia saatiin ”laboratorio eläinten histopatologia” Nantes Veterinary School (ONIRIS). Tapaukset tulevat patologian laboratorio eläinsairaala on Oniris käytettiin tässä tutkimuksessa. Omistajien kirjallinen suostumus ja hyväksynnän Oniris College of Veterinary Medicine paikallisen animal Welfare komitean saatiin ennen osallisuuteen. eläin hoito ja käytetystä protokollasta kiinni eurooppalaisen direktiivin numero 2010/063 sekä kansallisille Ranskan asetuksen (décret n ° 2013-118 du 1er février 2013 relatif à la suojaus des animaux Käyttää à des evät scientifiques).

tulokset

tuotanto ja luonnehdinta rPVL

PVL on tuotettu rekombinanttisesti (rPVL) in

E

.

coli

ja puhdistettu yhdessä vaiheessa on GlcNAc agaroosikolonnikromatografian lopullisen saanto 1 mg l

-1 kulttuurin. Kun analysoitiin kanin punasolujen, lektiini näkyy vahva hemagglutinaatiomääri- toiminta alas pitoisuuteen 2,3 nM. Rekombinanttiproteiini on vakaa ja osoittaa denaturaatiolämpötilassa 56 ° C lämpö- shift analyysi (S2 Kuva). Lisäksi stabilointi rPVL voidaan saada, kun läsnä on GlcNAc-, jossa on ligandit, kuten GlcNAcβ1-3Gal tai chitobiose, jossa Tm oli 60 ° C: ssa molempia, mutta ei, kun läsnä on ei-sitovia hiilihydraatteja, kuten galaktoosi ja sakkaroosi, vahvistaa GlcNAc sitova aktiivisuus.

rPVL on spesifinen oligosakkaridien päättämisestä GlcNAc jäämiä

spesifisyys rekombinantti PVL määritettiin sen nisäkkäiden Printed Array version 5.1 kanssa 610 glykaanien, enimmäkseen nisäkkäiden alkuperä. RPVL pitoisuus vaihtelee 0,2 mg ml:

-1-,2 ug ml

-1 ja neljä aineistot ovat saatavilla CFG sivuston primscreen_codes 5693, 5695, 5696 ja 4697 (http: //www.functionalglycomics .org). Fluoresenssisignaali oli erinomainen, ja pienin pitoisuus, oli riittävä määrittämiseksi suosivat oligosakkaridien kuljettaa GlcNAc niiden ei-pelkistävässä päässä (kuvio 2).

Jokainen isku on värjätty mukainen päätelaite disakkaridi . Edustavia oligosakkaridit on kaavamaisesti näyttöön. Peaks merkitty * vastaavat pieniä merkintöjä siaalihapon-happo lopetetaan oligosakkarideja. Täydellinen luettelo oligosakkaridien fluoresenssivoimakkuudet on saatavilla CFG kotisivuilta (https://www.functionalglycomics.org).

lektiini sitoutuu tehokkaasti GlcNAc läsnä kahdessa eri tehtävissä typistetty N- glykaanien: GlcNAcβ1-2Man ydin pentasakkarideja ja vielä voimakkaammin GlcNAcβ1-3Gal antennilla, joita pidennetään polylactosamine motiiveja. Koska monivalenssinen vaikutus, signaali oli maksimaalisesti multiantennary rakenteita (2-5 antenni) kanssa lactosamine toistoa, esiintyminen, joka liittyy syövän etenemistä [27]. Polylactosamine kahta tai useampaa antennaarisen N-glykaanien kanssa terminaalin GlcNAcβ1-3Gal sidottiin fluoresenssisignaalien yli 1500 RU, kun taas ne, joilla on terminaalivaiheen Galβ1-4GlcNAc ovat taustakohinaa, alle 150 RU. Ei sitoutumisen havaitun GlcNAcβ1-4Man motiivi esiintyy puolitettu N-glykaanien, mutta esiintyminen kahtiajakautuneen GlcNAc ei estä sitoutumista PVL naapurimaihin GlcNAc-päättynyt antenni. Lektiini myös sitoutunut musiinituoton motiiveja, jotka kantavat βGlcNAc asentoon 3 ja 6 GalNAc jäännöksen (tyyppi 4). Se sitoutuu vain heikosti sen chitobiose motiivi (GlcNAcβ1-4GlcNAc) kitiinin. Lektiini ei ole selektiivinen anomeerinen konfiguraatiota GlcNAc ja useita oligosakkaridien terminaalinen αGlcNAc tähteiden leimattiin myös. Sellaiset epitoopit ovat läsnä ihmisen heparaanisulfaatin (GlcNAc α1-4IdoA) ja musiineilla mahalaukun rauhasten (GlcNAc α1-4Gal) [5], mutta myös luokan III mukiinia carcinoma kudoksissa, jotka ilmentävät mahan fenotyyppiä [28]. Glykaanirakenteeseen array sisältää erilaisia ​​oligosakkarideja, joilla on terminaalivaiheen GalNAc mutta PVL sitoutumisen havaittiin vain disakkaridi GalNAcβ1-3GalNAc (# 97), joissa on vähäisiä intensiteetti.

Koska immobilisoitu villityypin PVL on raportoitu sitoutuvan sialyloituja glykoproteiineja [29], sitoutuminen oligosakkaridien kanssa sialyloidun rakenteiden tarkistettiin. Itse heikko sitova saattaa esiintyä kaksiantenniset N-glykaanien kanssa päättämisestä Neu5Acα2-3Gal epitooppien (# 603 kuvassa 2). Fluoresenssin taso oli lähellä melutaso (12% of maxium). Kuitenkin, kun tarkkailun glykaanirakenteeseen array saadut tiedot suurempaa PVL (0,1 mg ml

-1), sitoutuminen sialyyli-oligosakkaridien tuli selvästi näkyvissä.

affiniteetti rPVL eri GlcNAc sisältäviä oligosakkaridit testattiin sekä vapaan ja pinta-sitoutuneet proteiinit käyttäen titrausta mikrokalorimetria ja pintaplasmoniresonanssia, vastaavasti (taulukko 1 ja S3 kuviossa). Affiniteetti GlcNAc on samaa luokkaa kuin aikaisemmin mitattu ITC natiivi PVL eristetty sieni (Kd ≈200 uM) [13]. Kvantitatiivisia mittauksia vahvisti vahvempaa affiniteetti GlcNAcβ1-3Gal päättyvä rakenteita kuin GlcNAc ja chitooligosaccharides, joissa dissosiaatiovakio on noin 70 uM trisakkaridin lakto-N-trioosifosfaatti. Hyvä sopimus ei havaittu mittaamat molempia menetelmiä. Vain N-glykaanin heptasaccharide esittelee kaksi terminaalista GlcNAcβ1-2Man epitooppeja osoitti voimakkaampaa affiniteettia rPVL liuoksessa (Kd 34 pM) kuin SPR siru. Tämä saattaa johtua siitä, että kahdenarvoisen luonne tämän erityisen vuorovaikutuksen, joka voidaan helpommin perustettu proteiinin liuoksessa kuin kiinnitetty siru. Sitova sekä päätelaitteiden GlcNAc tähteet kaksiantenniset heptasaccharide varmistettiin vertaamalla stoikiometria lineaarisen GlcNAcβ1-3Gal (viisi ligandit kohden rPVL) ja kaksihaaraisen heptasaccharide (kaksi ligandia kohti rPVL). Termodynamiikka sitoutuminen oli myös erilainen, koska kaksihaaraisen glykaanin on ainoa esittää suotuisan entropia sitoutuminen (taulukko 1), jotka voisivat selittää preorientation kahden GlcNAc jäämiä tilaan.

Crystal rakenne rPVL /disakkaridin

rPVL kiteytyi monimutkainen GlcNAcβ1-3Gal, disakkaridi, joka peittää katkaistu polylactosamine N-glykaanien. Rakenne ratkaistiin klo 1.95 Ǻ resoluutio (S1 taulukko) ja näytetään odotettu seitsemän pyörittämään β-potkurin kertaiseksi (kuvio 3). Kaksi β-potkurit on läsnä asymmetrinen yksikkö, mutta koska ne ovat hyvin samanlaisia, vain A-ketju on kuvattu alla. Yleinen rakenne rekombinanttiproteiinin oli hyvin samankaltainen kuin se, jota on aiemmin kuvattu villityypin PVL [13]. Tärkein ero oli, että läsnä on lisäksi kalsiumionin koska rPVL esittää kalsiumin kolme silmukkaa. Kirkas elektronitiheys havaittiin varten GlcNAcβ1-3Gal viidessä sitoutumiskohdista samalla sivustolla 2 oli miehitetty ainoastaan ​​jonka GlcNAc jäännös (kuvio 3A ja 3B).

. β-potkurin kertainen rPVL kanssa peptidiketjun edustettuina nauha värillinen sinisestä (N-terminaali) vihreäksi (C-terminaali). Disakkaridit edustettuina tikku 2mFo-DFC elektronitiheys karttoja muotoiltu 1 σ (0,4 ε Å

-3). Kalsiumioneja edustettuina vaaleanpunainen pallo. B. Sama potkurin liuotinpääsyisellä proteiinin pinnalla. C ja D, yksityiskohdat vuorovaikutuksen sivusto 1 disakkaridin ja vesimolekyylejä. Vetysidoksia edustettuina pisteviivoilla paneelissa D. Kaikki grafiikka on laadittu ketju A painikkeilla PyMol ohjelmistoa (Schrödingerin).

Jokaisessa kuudesta sitoutumiskohtien, terminaali GlcNAc oli sama suuntaus kuin PVL /GlcNAc monimutkainen, ja vahvistetaan samassa verkossa vetysidosten. Galaktoosipitoisuutta Jäännös vuorovaikutuksessa matalaan alueella lähellä GlcNAc sitoutumiskohta (kuvio 3C). Vuorovaikutus galaktoositähteen eivät olleet kovin vahva, ja monipuolinen paikasta toiseen.