Krooninen sairaus

tiivistelmä

BORIS /CTCFL kuuluu syövän kiveksen antigeeniperheen normaalisti ilmaistu sukusoluilla. Kasvaimissa, on poikkeavasti ilmaisi, vaikka sen toimintoja ole täysin hyvin määritelty. Jotta ymmärtää paremmin tehtävät Boris syövän, valitsimme alkion syöpäsolut mallina. Käyttämällä molekyylimajakan, joka kohdistuu erityisesti

BORIS

mRNA, olemme osoittaneet, että BORIS positiiviset solut ovat pieniä alapopulaatio kasvainsolujen (3-5% kokonaismäärästä). BORIS-positiiviset solut eristetään käyttäen BORIS-molekyylimajakka- ilmaistuna korkeampi telomeraasi

hTERT

, kantasolu- (

Nanog, Oct4, Sox2

) ja syövän kantasolujen markkerigeeni (

CD44

ja

ALDH1

) verrattuna BORIS-negatiivisten kasvainsolujen. Jotta voitaisiin määrittää toiminnallista roolia BORIS, vakaa BORIS-köyhdytettyä alkion syöpäsolut kertyi.

BORIS

hiljentäminen voimakkaasti alassäädetty ilmaus

hTERT

, kantasolu- ja syövän kantasolujen markkerigeeni. Lisäksi BORIS knockdown lisääntynyt solujen vanhenemista alkion syöpäsoluja, paljastaen otaksuttu rooli Boris vuonna Vanheneminen biologinen ohjelmaa. Tuloksemme osoittavat yhdistys Boris ilmentävien solujen subpopulaatio ilmentymisen kanssa stemness geenien korostaen kriittinen rooli BORIS alkion kasvainsairaus.

Citation: Alberti L, Renaud S, Losi L, Leyvraz S, Benhattar J (2014) korkea ilmentäminen

hTERT

ja Stemness Geenit Boris /CTCFL Positiivinen eristetyt solut Alkion syöpäsoluja. PLoS ONE 9 (10): e109921. doi: 10,1371 /journal.pone.0109921

Editor: Gabriele Saretzki, Newcastlen yliopisto, Yhdistynyt Kuningaskunta

vastaanotettu: 20 kesäkuu 2014; Hyväksytty: 12 syyskuu 2014; Julkaistu: 03 lokakuu 2014

Copyright: © 2014 Alberti et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Swiss National Science Foundation (lupanumeroon: 31003A-113505, www.snf.ch); ja Emma Muschamp Foundation (www.s-a-v.org/-Fondations-associees-.html). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Yksi kirjoittajien (JB) työskentelee molekyyli- patologian laboratorio (Biopath Lab ). Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

veli regulaattorin on merkintä sivustoja (BORIS) myös suunniteltu CTCFL, CCCTC sitova tekijä kaltainen, on DNA: ta sitova proteiini, jonka toiminnot syövän ei täysin ymmärretä. CTCF on erittäin konservoitunut, ilmentyy kaikkialla, monitoiminen kromatiinin tekijä, jolla on merkitystä, koska kasvainsuppressorigeenin [1] – [3]. BORIS on nisäkkään paralogi on CTCF, niillä on sama 11 sinkki-finger domain mutta eroavat N- ja C-päissä. Tässä sinkki sormen domain, BORIS ja CTCF näytteille 70% homologia [4]. Normaaleissa kudoksissa,

BORIS

ilmentyminen rajoittuu sukusolujen, jossa se on mukana epigeneettisiä uudelleenohjelmointi [4], [5].

BORIS

ilmaistaan ​​spermatosyyteiksi aikana mies iturataa kehitystä, ilmeisesti ilman CTCF [4]. Kasvaimissa, BORIS on poikkeavasti ilmaistaan ​​ja sen transkription havaittiin eri tasoilla useissa syöpäsolulinjoissa ja primaarikasvainten [6]. Koska sen rajoitetun ilmentymisen normaaleissa siemennestettä kudoksissa ja sen uudelleen ilmentymisen erilaisia ​​kasvaimia, BORIS kuuluu syöpä kives antigeenin (CTA) perhe. On osoitettu, että BORIS indusoima muiden CTA geenejä, MAGE-A1, NY-ESO-1 [7], [8] ja Spanx [9], mutta ei kaikissa kasvaimissa [10], [11]. Lisäksi olemme aiemmin osoittaneet, että BORIS aktivoitu

hTERT

ilmentymistä sitoutumalla ensimmäistä eksonia

hTERT

telomeraasin geenin alkion ja munasarjojen tuumorisoluissa [12]. Lisäksi tutkimuksissa eksogeenisen BORIS ilmentymisen normaalissa BORIS-negatiivisia soluja, olemme osoittaneet, että nämä transfektoidut solut osoittivat korkean tason

hTERT

mRNA [12]. Kaikki nämä tulokset paljastivat tärkeä rooli Boris vuonna kuolemattomiksi prosessin aikana tuumorigeneesin. Mielenkiintoista, nykyinen raportit osoittavat korrelaatiota

hTERT

ilmaisun ja kantasolujen kaltaisia ​​ominaisuuksia [13] – [17]. Lisätutkimukset koskien korrelaatio BORIS toimintojen ja tärkeimmistä tehtävistä hTERT vuonna kuolemattomiksi ja stemness ominaisuuksia on suoritettava. Toinen kysymys ole vielä vastattu yksiselitteisesti, kuinka monta solua kuluessa tuumorisolulinja, ilmaista

BORIS

. Tässä artikkelissa, me näitä kysymyksiä. Tätä tarkoitusta varten valitsimme käyttää molekyylimajakka (MB) kuvantamisen tekniikkaa, koska se on hyväksytty menetelmä havaita ja visualisoida mRNA: n ilmentymisen [18]. Mt ovat oligonukleotidit rakenteeltaan varsi-silmukka hiusneula fluoresenssin sammuttaja toisessa päässä, ja vastakkaisessa päässä, joka on fluoresoiva väriaine kutsutaan myös fluorofori. Koska niiden erityinen rakenne, MBs emittoivat fluoresenssia lähetetään vain, kun sitoutuvat kohteisiinsa. Tutkia taajuus Boris-positiivisten solujen tuumorisolulinjoja, ensin suunnitelleet

BORIS

mRNA kohdistamista MB, ja sitten analysoitiin

BORIS

ilmentymistä ihmisalkion ja munasarjojen tuumorisolulinjoissa, vastaavasti NCCIT ja OVCAR3. Sen jälkeen tarkistetaan, että BORIS-MB mahdollistavat FACS lajittelua BORIS-positiivisten solujen, osoitimme, että eristetty BORIS-positiivisten solujen ilmaistuna korkeamman mRNA tasolla

hTERT

ja stemness geenejä verrattuna BORIS-negatiivisia ja ei-lajiteltu NCCIT soluissa . Olemme edelleen vahvistaneet tämän tuloksen

BORIS

hiljentäminen tutkimuksia. Lisäksi osoitimme, että BORIS suojaa vanhenemista prosessia. Kaikkiaan meidän tiedot vahvistavat suora rooli Boris alkion kasvainsairaus.

Materiaalit ja menetelmät

Solut

Ihmisen solulinjat (BJ, esinahka fibroblasti, HeLa, kohdunkaulan adenokarsinooma, NCCIT, alkion karsinooma, OVCAR3, munasarjasyöpänäytteissä) hankittiin American Type Culture Collection (ATCC). Soluja viljeltiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2 joko Dulbeccon muokatussa Eaglen elatusaineessa (DMEM, Gibco, Invitrogen) ja HeLa ja BJ soluja, tai RPMI-1640-väliaineessa (Gibco, Invitrogen) ja NCCIT ja OVCAR3 , täydennetty 10% lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia (Invitrogen) ja 1% penisilliini-streptomysiiniä (Gibco, Invitrogen).

Molecular beacon (MB) suunnittelu

sekvenssit Boris-MB1 Boris-MB2 suunniteltiin käyttäen Beacon Designer (Premier Biosoft).

BORIS

mRNA sekundäärirakenteiden ennustettiin käyttämällä mFOLD ohjelmistoa (mFOLD, https://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/) ja spesifisyys määritettiin BLAST-(NCBI). Kohdesekvenssi Boris-MB1 sijaitsee eksonin 2 ja Boris-MB2 sijaitsee eksonissa 11

BORIS

mRNA. Nämä sijainnit on valittu, koska ne ovat ulkopuolella sinkki-finger domain eivätkä rajat hybridisoituvat CTCF homologian alueille. Lisäksi edellinen tutkimus on osoittanut, että lähtö- ja päättyy alueet mRNA ovat helpommin MBS hybridisaatio [19]. RANDOM-MB, jota käytettiin negatiivisena kontrollina ei vastaa mitään nisäkkään sekvenssien [19]. Sekvenssit olivat seuraavat: BORIS-MB1 5′-CGCTGTCTCTGCACACTCCGTCTTCAGCG-3 ’; BORIS-MB2 5’-CAGCCATTCCTCTTTGACTCTGGCTG-3 ’ja RANDOM-MB 5′-CGACGCGACAAGCGCACCGATACGTCG-3′ (alleviivattu emäkset mainitaan ne täydentävät kohdesekvenssien). Fluorofori (Cy3 tai ATTO647) oli 5′-konjugoidun ja Black Hole Quencher (BHQ-2) liitettiin 3’-päähän. MBS hankittiin Sigmalta ja ne puhdistettiin suuren paineen nestekromatografialla.

In vitro

määritys MB spesifisyys

Oligoja suunniteltu erityisesti MBS tavoitteet (BORIS-MB1 erityistä tavoitetta: 5′- AAGACGGAGTGTGCAGAGAGA-3 ’; BORIS-MB2 erityistä tavoitetta: 5′- CAGCCAGAGTCAAAGAGGAA-3′ ja RANDOM-MB erityistä tavoitetta: 5’- TATCGGTGCGCTTGTCG-3 ’). Ei-spesifinen oligoa käytettiin

in vitro

testi eri megatavua. Tämä ei-spesifinen oligo 5′-CGATGCCGAACCAATTCTCCAC-3 ’, vastaa transkriptio variantti CTCF. Testata spesifisyyden liuoksessa, 200 nM MB sekoitettiin tai ei 1 uM oligo 10 ui Opti-MEM-alustassa (Invitrogen).

Päästöjen fluoresenssiprofiilit jälkeen saatiin kuumentamalla MB-tavoite oligo mix progressiivisen lämmönnousun välillä 15 80 ° C: ssa käyttäen 1 ° C: n askelin. Fluoresenssi signaali hankittiin lopussa kunkin yhä enemmän ja huomataan Cy3 kanavalla käyttäen Roottorin Gene 6000 Real-Time PCR-järjestelmä (Corbett Life Science).

MB toimitus ja solujen fluoresenssikuvantamisella

solut irrotettiin käyttäen 0,05% trypsiini-EDTA: ta (Invitrogen) ja suspendoitiin uudelleen seerumittomaan DMEM-alustassa pitoisuutena 10

6 solua /ml. Ensinnäkin, Cy3-BORIS-MB tai Cy3-RANDOM-MB (200 nM) inkuboitiin huoneen lämpötilassa, kun läsnä on 1 ul /ml Lipofectamine RNAiMAX siRNA transfektioreagenssia (Invitrogen) käyttäen Opti-MEM-elatusainetta. Lipofectamine RNAiMAX reagenssia käytettiin kuljetusvehikkelinä, koska meidän olosuhteissa se antoi vähemmän tausta verrattuna muihin reagensseja, kuten streptolysiini (tuloksia ei ole esitetty). 10 minuutin kuluttua, transfektion seos lisättiin suspendoidut solut ja yhdessä inkuboitiin 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Hoechst 33342 (Invitrogen) lisättiin pitoisuudessa 5 ug /ml viime 10 min inkubaation jälkeen. Sitten solut pestiin käyttäen fosfaattipuskuroitu suolaliuos (PBS, Invitrogen) ja suspendoitiin uudelleen PBS: ään, 5 mM EDTA: ta. Transfektoidut solut cytocentrifugated päälle lasilevyllä käyttäen Sytospin sentrifugia ja tutkitaan fluoresenssimikroskoopilla (Axioplan2 Imaging, Zeiss). Fluoresenssi signaali Cy3-coniugated MB analysoitiin käyttämällä punaista kanavaa ja Hoechst 33342 fluoresenssiemissio havaittiin alle sinisen kanavan.

FACS-analyysi ja lajittelu käyttäen MB

FACS-analyysi ja solujen lajittelu, käytimme MBs konjugoitu ATTO 647, väriaine ominaista sen erinomainen valostabiilisuus [20]. Solut valmistettiin ja niitä inkuboitiin Mt kuten edellä on kuvattu (paitsi, että Hoechst 33342 ei lisätty) ja analysoitiin suoraan käyttäen Gallios virtaussytometriä (Beckman Coulter). Vähintään 10000 tapahtumia kerättiin ja analysoitiin Kaluza Software. BORIS-positiivisia ja BORIS-negatiiviset populaatiot lajiteltiin, jolle ei kuolleiden solujen propidiumjodidia (PI) värjäys käyttäen FACSAria I (Becton Dickinson) instrumentin virtaussytometria Facility UNIL (University of Lausanne, Sveitsi). Vaihteluvälit 2 x 10

4-9 x 10

4 BORIS-positiivisten solujen ja 2 x 10

5-9 x 10

5 BORIS-negatiiviset solut lajiteltiin.

BORIS knockdown by indusoituva shRNA lentiviraalinen järjestelmä

Stable solulinjoissa indusoituvan ilmentävät shRNAs kohdistaminen ihmisen

BORIS

mRNA luotiin käyttäen doksisykliini-indusoituvaa shRNA lentivirus järjestelmä, pINDUCER [21]. Lentivirusvektorin pINDUCER11 konstitutiivisesti ekspressoi eGFP fluoresoiva reportteri proteiinia, joka mahdollistaa seurata solujen transduktio virus. Tämä vektori sisältää myös kasetin, jossa on doksisykliini-indusoituvan promoottorin, joka ohjaa transkription tRFP reportterigeenin kanssa shRNA, jonka avulla voidaan todeta solujen doksisykliini aktivoitu shRNA transkription [21]. Neljä eri shRNAmiR (shRNA) erityisesti suunnattu

BORIS

, eikä sen parolog

CTCF

(BORIS-SH1: 5′-ATTCACCAAGATCAAAGAACTC-3 ’, BORIS-SH2: 5’-GTTCTCACAGTTTCAAATTCAA-3 ’, BORIS-SH3: 5′-TTCATCCCGACTGTTTACAAAT-3’, BORIS-SH4: 5’TCCGACAGAAGCAACTTCTAAA-3 ’), ja ohjaus- shRNA kanssa sekoitetun sekvenssin (CTR sh: 5’CAGAGCTAACTCAGATAGTACT3’) syntetisoitiin (Sigma). Ne monistettiin PCR: llä ja kloonattiin pINDUCER11 selkäranka käyttäen

EcoRI

ja

Xhol

restriktioentsyymeillä. Sekvenssit kaikki konstruktit varmistettiin sekvensoimalla. Lentivirus luotiin kotransfektoimalla sopiva shRNA rakentaa yhdessä pakkauksessa vektorit (pMD2G-VSVg, pCMV-dR8.74) HEK-293T-soluihin käyttäen FuGENE 6-reagenssia (Roche Diagnostics), mukaisesti valmistajan protokollaa. Viral supernatantit kerättiin 48 tuntia transfektion jälkeen, suodatettiin 0,45 um suodattimen, jonka huokoset, ultracentrifugated 1,5 tunnin ajan 19500 rpm Beckman SW28 roottoria ja suspendoitiin uudelleen RPMI-väliaineessa. Virussuspensio- yhdistettynä 8 ug /ml polybreeniä (Sigma) käytettiin infektoimaan kohdesolut (NCCIT). Kaksikymmentäneljä tuntia infektion väliaine korvattiin ja vakaasti tartunnan solut eGFP-lajiteltu käyttäen FACSAria I väline (Becton Dickinson) klo virtaussytometria Facility UNIL. Induktio shRNA ilmentyminen saatiin lisäämällä väliaineeseen 2 ug /ml doksisykliiniä (Sigma). Säilyttää pudotus, doksisykliini sisältävä väliaine päivitetään joka 3 päivä.

ektooppinen BORIS ilmentyminen HeLa-soluissa

päivää ennen transfektiota, HeLa-solut ympättiin tiheydellä 2 x 10

5 solua /kuoppa 12-kuoppaisille /levyt. Solut transfektoitiin 3 ug: lla on aiemmin kuvattu pCMV-BORIS vektori [12] käyttämällä Lipofectamine 2000 transfektioreagenssia (Invitrogen) seuraten valmistajan ohjeita. Solut kerättiin 2 päivää transfektion jälkeen solujen fluoresenssin kuvantamiseen.

Kvantitatiivinen RT-PCR

Kokonais-RNA eristettiin käyttämällä RNeasy Mini -kittiä (Qiagen) mukaan lukien sarakkeen DNaasikäsittelyä mukaan valmistajan ohjeita. RNA-pitoisuus määritettiin käyttäen Nanodrop 2000 (Thermo Scientific) ja Qubit Fluorescent Technology (Invitrogen).

Merkittävä rajoittava vaihe oli pieni määrä totaali-RNA eristettiin solulajittelulla. Tämän ratkaisemiseksi tekninen rajoitus, haimme menetelmä on jo kuvattu ja validoitu [22], [23]. Ensinnäkin, 200 ng kokonais-RNA: ta retro- transskriboidun käyttämällä sattumanvaraisia ​​heksameerejä ja Superscript III käänteistranskriptaasia (Invitrogen) lopullisessa tilavuudessa 20 ui. Sitten 2 ui cDNA: ta käytetään esivahvistus reaktio, johon on multiplex-PCR tehty sekoitus alukkeita (taulukko S1) 0,1 uM lopullinen pitoisuus, 0,5 yksikköä Platinum Taq DNA-polymeraasia (Invitrogen), 1 x PCR-puskuria ja 2 mM MgCl

2: n kokonaistilavuudessa 25 ui.

esivahvistus, PCR-syklien olosuhteet olivat: yksi denaturaatiovaiheen 95 ° C: ssa 5 min, jota seurasi 15 sykliä monistusta (45 sekuntia 95 ° C: ssa , 30 s 60 ° C: ssa, 1 min 72 ° C: ssa). Lopuksi, kvantitatiivinen PCR, esivahvistus reaktio oli 20-kertaisesti laimennettua ja 2 ui tätä laimennosta käytettiin mallina. Reaktio täydennettiin 0,5 yksikköä Platinum Taq-DNA-polymeraasia (Invitrogen), 1 x PCR-puskuria, 2,5 mM MgCl

2, 2,5 uM SYTO9 vihreä (Invitrogen) ja 0,1 uM kutakin geenin spesifisen alukkeen (Sigma) lopulliseen tilavuuteen 20 ui. PCR-olosuhteet olivat: 95 ° C: ssa 5 min, jota seurasi sykliä (5 s 95 ° C: ssa, 30 s 60 ° C: ssa, 45 sekuntia 72 ° C: ssa). Sulamiskäyräanalyysillä analyysit suoritettiin loppuun vahvistus tarkistaa puhtauden amplikonien. PCR-tuotteet ladataan myös agaroosigeelillä vahvistaa oikean koon monistettujen tuotteiden. Pyöräily ja Fluoresenssin tehtiin Roottorin Gene 6000 Real-Time PCR-järjestelmä (Corbett Life Science). Tietojen analysointi suoritettiin käyttäen Roottorin Gene 6000 ohjelmisto. Suhteellinen ilmentyminen-tasot määritettiin ΔΔCt menetelmällä ekspressiotasot normalisoitu

GAPDH

tasolla. PCR tehokkuus vaihteli 94-101%, jossa korrelaatiokerroin (r

2) vaihtelee 0,96-1,0, kaikki monistetun kohde geenejä. Ct-arvot

GAPDH

olivat suunnilleen samat (Ct = 10,07 ± 0,25) ja kaikki solut käytetään määrällisiä RT-PCR-kokeita.

Ihmisen spesifiset alukkeet (taulukko S1) on suunniteltiin käyttäen Primer3 (https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/) ja OLIGO Primer Analysis ohjelmisto. Spesifisyys varmistettiin BLAST-(NCBI). Suunniteltu alukeparia cross introni-eksoni rajojen välttää genomista DNA saastuminen. BORIS alukkeet valittiin (välillä eksonissa 8 ja 9), joka perustuu tuloksiin aikaisemmin saadut [24], jotta monistamiseen runsain

BORIS

isoformeja.

DNA metylointianalyysi

DNA uutettiin käyttäen DNeasy (Qiagen). Valikoima 200 ng (lajitelluista soluja) ja 500 ng DNA: ta käytettiin vetysulfiitilla reaktiolla käyttäen EpiTect bisulfiittimodifiointi (Qiagen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Modifioitua DNA: ta käytettiin monistamaan 123 bp: n fragmentin Boris-promoottorin.

metylaatiomääritystä suunniteltiin käyttäen PyroMark Assay Design Software 1,0 (Qiagen). Tämä määritys sallittu sekvensointi 50 bp (asennosta -968–918) sisälle promoottori B

BORIS

[25] ja mukana 10 CpG. Suorittamaan sekvensointi, 3 ui bisulfiitin käsitellyn DNA ensin PCR: llä. Sekvenssit PCR-alukkeet olivat: BORIS-pyro Forward 5 ’TGGTTTGTGGGTTTTGT 3’ ja Boris–pyro BIO Reverse 5 ’CCCTTCACCCCCCCTCTTT 3’. PCR-olosuhteet olivat seuraavat: 95 ° C 5 min; 45 sykliä 95 ° C 30 s, 58 ° C: ssa 15 s ja 72 ° C 1 min; ja lopullinen ekstensiovaihe 72 ° C: ssa 10 minuuttia. Sitten puhdistus ja sitä seuraava käsittely biotinyloidun yksijuosteisen PCR-fragmentti suoritettiin valmistajan suositusten mukaisesti. Pyrosekvensointi Tämän PCR-fragmentti suoritettiin PyroMark Q24 välineen avulla Pyrolle Gold Q24 Reagenssit (Qiagen). Pyrosekvensointi aluketta (5 ’GTGTTGTAGTTTATAGT 3’) käytettiin lopullisena pitoisuutena 0,3 uM. Tulokseksi saadut tiedot analysoitiin ja määrällisesti kanssa PyroMark Q24 ohjelmisto (Qiagen), joka laskee metylaation prosenttiosuus kunkin CpG-sivuston, jonka avulla määrällisiä vertailuja.

Soluproliferaatiomääritys

Solulisääntyminen arvioitiin MTT: llä . MTT (3- (4,5-dimetyyli-2-tiatsol) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidi, Sigma) reagenssia käytettiin mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, stabiilisti infektoituja soluja ympättiin tiheydellä 25 x 10

3 solua /kuoppa 24-kuoppaisille /levyt doksisykliinin sisältävää väliainetta. Jälkeen 3 päivää, soluja inkuboitiin MTT-reagenssia (200 ug /ml lopullinen konsentraatio) 3 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Sitten solut lyysattiin lisäämällä isopropanoli /HCl: ää 10 minuutin ajan, ja levyjä ravisteltiin varovasti 5 minuuttia. Absorbanssiarvot määritettiin käyttämällä mikrolevyn lukijaa (Synergy Mx, BioTek) aallonpituudella 570 nm. Kukin koe suoritettiin kolmena kappaleena ja 3 riippumatonta kokeita.

Apoptosis analyysi

Apoptoosi mitattiin kolmena rinnakkaisena käyttämällä anneksiini V Apoptosis Detection Kit (BD biotieteen) mukaan valmistajan protokollia. Lyhyesti, 5 x 10

4 solua /kuoppa siirrostettiin 12-kaivo /levyille ja kasvatettiin läsnäollessa doksisykliini konfluenssiin asti (5-7 päivää). Kelluvan solut sekä trypsinisoitiin solut kerättiin, pestiin PBS: llä ja suspendoitiin uudelleen 100 ul: Binding Buffer. Sitten 5 ui anneksiini V-V500 ja 5 ui 7AAD ja inkuboitiin solujen kanssa 30 minuuttia huoneenlämpötilassa. Kun oli lisätty 400 ui Binding Buffer näytteistä analysoitiin välittömästi Gallios -virtaussytometrillä (Beckman Coulter). Vähintään 5 x 10

4 tapahtumaa laskettiin kaikille näytteille. Prosenttiosuus apoptoottisten solujen arvioitiin sen jälkeen, kun portittamisella eGFP ja tRFP (transdusoitu ja doksisykliini aiheuttama, vastaavasti) positiiviset solut.

Western blot-analyysi

Koko solulysaateista saatiin käyttäen RIPA-puskuria (Sigma ) läsnäollessa proteaasiestäjäseostabletit (Sigma) ja mittaamaan BCA-määrityksellä (Thermo Scientific). Kolmekymmentä mikrogrammaa proteiinia ladattiin 10% SDS-polyakryyliamidigeelillä, mitä seurasi blottaus nitroselluloosakalvolle käyttäen puolikuivaa siirtolaitetta (BIO RAD). Epäspesifinen sitoutuminen estettiin inkuboimalla yön yli 5% rasvatonta maitojauhetta TBS-T-puskuria (0,1% Tween 20 tris-puskuroitu suolaliuos, TBS) 4 ° C: ssa. Sitten membraanit tutkittiin käyttämällä koettimena hiiren monoklonaalinen anti-humaani BORIS /CTCFL vasta-ainetta (valmistaja ja ystävällisesti toimitti Dr. Dmitri Loukinov, NIH /niaD) käytettiin 1: 1000 laimennoksena 1% estopuskuria (1%: vähärasvainen maitojauhe TBS -T-puskuri), ja inkuboitiin huoneenlämpötilassa 1,5 tuntia. Lastauksen ohjaus, hiiren anti-humaani β-aktiini-vasta-aine (Sigma) 1: 5000 laimennoksena 1%: estopuskurissa käytettiin ja inkuboitiin huoneen lämpötilassa 45 minuuttia. Membraanit pestiin 3 x TBS-T: n ja inkuboitiin huoneen lämpötilassa 1 tunnin ajan piparjuuren peroksidaasiin (HRP) leimattua kanin anti-hiiri-IgG: tä (Sigma), laimennettu 1: 5000 5% estopuskurissa. Kun 3 × pesun TBS-T, kalvot kehitettiin käyttämällä WesternBright Quantum (Advansta) ja näkyväksi Fusion FX Chemiluminescence System (Vilber Lourmat).

Vanheneminen liittyvä β-galaktosidaasin värjäys

Vanheneminen liittyvä β-galaktosidaasi (SA-β-gal) värjäys suoritettiin käyttäen β-galaktosidaasi-värjäykseen tarkoitettua reagenssipakkausta (BioVision), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, 5 x 10

4 solua /kuoppa siirrostettiin 12-kaivo /levyt läsnäollessa doksisykliini ja kasvatettiin konfluenssiin asti (5-7 päivää). Sitten solut huuhdeltiin PBS: llä, kiinnitettiin 15 minuutin ajan ja inkuboitiin juuri valmistettua SA-β-Gal-värjäys liuokseen 37 ° C: ssa 24 tunnin ajan. PBS-pesun jälkeen, SA-β-gal-aktiivisuus havaittiin käyttäen käännettyä mikroskooppia (Nikon) havaitsemaan sinistynyt soluja. Ainakin 10 erillistä kentät valittiin. Kunkin kentän numero sinistyy solujen määrä ja koko solut laskettiin. Tulokset ilmaistaan ​​prosentteina SA-β-gal-positiivisten solujen lasketaan seuraavasti: (sinisten solujen lukumäärää /lukumäärä solua yhteensä) x 100.

Telomeraasiaktiivisuus

Telomeraasiaktiivisuus mitattiin käyttäen TRAPEZE RT telomeraasin havaitseminen kit (Millipore). Tämä määritys määrällisesti telomeraasiaktiivisuutta by SYBR Green reaaliaikaisella kvantitatiivisella PCR [26]. Lyhyesti, solut hajotettiin 200 pl CHAPS-puskuria ja proteiinikonsentraatiot määritettiin Nanodrop 2000. alikvootit solulysaatin (1,5 ug proteiinia /näyte) käytettiin. Inaktivoitu näytteitä, ei-mallia reaktioita, ja positiivisena kontrollina tutkittiin myös laadunvalvonta. Standardikäyrä valmistettiin laimentamalla toistuvasti TSR8 ohjaus mallin valmistajan ohjeita noudattaen. Reaaliaikainen monistukset suoritettiin käyttäen Platinum Taq DNA Polymerase (2 yksikköä /näyte, Invitrogen). Pyöräily ja Fluoresenssin tehtiin Roottorin Gene 6000 reaaliaikainen PCR-järjestelmä (Corbett Life Science). Telomeraasiaktiivisuuteen laskettiin vertaamalla keskimääräinen Ct-arvoja kustakin näytteestä vastaan ​​standardikäyrä tuottamat TSR8 valvonnan mallia.

Tilastollinen

Tilastollinen merkittävyys arvioitiin käyttäen kaksisuuntainen opiskelija t-testiä analyysi. P-arvo 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

In vitro

validointi molekyylimajakoissa (MBS) B

Kaksi eri megatavua erityisiä että

BORIS

mRNA (BORIS-MB1 Boris-MB2) ja RANDOM-MB käytettiin tässä kokeessa. Hybridisaatio lämpötilat ja spesifisyys MBs testattiin ensin liuoksessa. Fluoresenssiemissio Näiden megatavua seurattiin lämpötila-alueella 25-80 ° C, eri olosuhteissa: MB yksin, MB, kun läsnä on erityinen tavoite, läsnä ollessa ei-spesifisten kohde- tai läsnä ollessa plasmidi, joka sisältää BORIS cDNA (pCMV-BORIS). Kuten kuviossa S1, havaittavissa fluoresenssin signaalia ei havaittu vain silloin, kun Mt sekoitettiin niiden erityiset tavoitteet. Optimaalinen fluoresenssiemissiossa hyväksyttävän signaali-tausta suhde ( 4) havaittiin alle 40 ° C. Määritys osoitti myös, että BORIS-MBs syrjiä yksi- ja kaksijuosteiset rakenteita, koska ne eivät aiheuta fluoresenssia kun inkuboidaan pCMV-BORIS plasmidiin. Nämä tulokset osoittivat, että Mt hybridisoituvat spesifisesti niiden kohdesekvenssien ja viittaavat vahvasti siihen, että nämä Mt voisi sitoutua spesifisesti mRNA: han ja ei genomisen DNA: n.

havaitseminen

BORIS

mRNA käyttäen BORIS-MB

ensimmäinen tarkastettiin, BORIS-MBs voi pystyä määritellä negatiivisten BORIS ilmentävien solujen elävissä soluissa. Kvantitatiivinen RT-PCR havaittu vahva tasot

BORIS

mRNA NCCIT ja OVCAR3 solulinjoissa, kun taas tämä taso oli erittäin alhainen HeLa-soluissa eikä havaittavissa BJ soluissa (kuvio 1A), mukaisesti aikaisempiin tutkimuksiin [12 ]. Siksi tutkia spesifisyys MBs, NCCIT käytettiin positiivisena kontrollina soluja ja BJ negatiivisena kontrollina. NCCIT solut transfektoitiin BORIS-MB1 tai BORIS-MB2 ja fluoresenssiemissiot mitattiin virtaussytometrialla. Keskimääräinen fluoresoivat signaalit transfektoitujen solujen BORIS-Mt oli suurempi kuin keskimääräinen fluoresenssisignaali transfektoitujen solujen RANDOM-MB. Kasvua 23,2 ja 4,7 havaittiin BORIS-MB1 Boris-MB2, vastaavasti (kuvio 1 B-C). Koska BORIS-MB1 tarjotaan suurempi (5-kertainen) tarkoittaa fluoresenssisignaali verrattuna Boris-MB2, BORIS-MB1 valittiin myöhempää analyysiä varten. Sieltä eteenpäin BORIS-MB1 kutsutaan kun Boris-MB. Kuten odotettua, kun BORIS negatiivinen BJ-solut transfektoitiin Boris-MB, ne eivät osoittaneet mitään fluoresenssin signaalia (kuvio 1 D).

(A)

BORIS

ilmentymistä ihmisen solulinjoissa. Kokonais-RNA eristettiin ihmisen kasvaimen solulinjojen: NCCIT (alkion), OVCAR3 (munasarjan), HeLa (kohdunkaulan) ja normaali BJ (fibroblasti) soluja. mRNA tasot

BORIS

analysoitiin qRT-PCR. Tulokset normalisoitiin

GAPDH

ja liittyvät NCCIT soluihin. BJ ja NCCIT pidettiin negatiivisina ja positiivisina kontrolleina vastaavasti. Virhepalkit edustavat keskiarvoja ± SD 3 riippumattoman kokeen. (B) fluoresoiva signaalit mitattiin virtaussytometrialla NCCIT transfektoitujen solujen ATTO647-BORIS-MB1 (tummanharmaa huippu) ja ATTO647-RANDOM-MB (valkoinen huippu). (C) Fluoresoivat signaalit mitattiin virtaussytometrialla NCCIT transfektoitujen solujen ATTO647-BORIS-MB2 (heikko harmaa huippu) ja ATTO647-RANDOM-MB (valkoinen huippu). (D) loisteputki signaaleja mitattiin virtaussytometrialla BJ soluja käsiteltiin ATTO647-BORIS-MB1 (heti tarkoitetuista BORIS-MB, harmaa huippu) ja ATTO647-RANDOM-MB (valkoinen huippu). (E)

BORIS

ilmentyminen HeLa-soluissa käyttäen BORIS-MB. Edustavat kuvat HeLa-solujen transfektoitiin ohimenevästi Boris-ekspressiovektori pCMV-BORIS (alhaalla) ja ei-transfektoiduista kontrolli-solut (ylhäällä), 20-kertaisella suurennuksella. (F)

BORIS

ilmentymistä ihmisen solulinjoissa havaittiin käyttäen BORIS-MB. Edustavat kuvat BJ, NCCIT ja OVCAR3 soluja, 20-kertainen suurennus. Fluoresenssin kuvantamisen, 1 x 10

6 soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa 1 tunnin ajan seerumivapaassa DMEM-alustassa, jossa Cy3-BORIS-MB (200 nM). Hoechst 33342 5 ug /ml, lisättiin viime 10 min inkubaation jälkeen. Objektilasit analysoitiin fluoresenssimikroskopialla.

edelleen haastavat spesifisyyden BORIS-MB, HeLa-solut, jotka ilmensivät

BORIS

mRNA alhaisella tasolla, transfektoitiin lyhytaikaisesti kanssa pCMV BORIS ilmentämisplasmidi, joka sisältää ihmisen BORIS cDNA fuusioituna vihreä fluoresoiva proteiini (GFP) geenin. Kuten odotettua, transfektoidut solut esitetään korkea fluoresenssisignaalien sekä GFP- BORIS (kuvio 1E). Yhdessä nämä tulokset vahvistivat kapasiteetin BORIS-MB luotettavasti ja erityisesti havaita

BORIS

mRNA elävissä soluissa.

Näin ollen solulinjat transfektoitiin BORIS-MB visualisoida

BORIS

mRNA ilmentymisen fluoresenssikuvantamisella. Kuten voidaan nähdä kuviosta 1F, fluoresenssisignaali Boris-MB oli selvästi näkyvissä NCCIT ja OVCAR3 soluja, joissa vain osa soluista oli fluoresoivia. Prosenttiosuus BORIS positiivisten solujen näissä solulinjoissa havaittiin olevan välillä 3 ja 5%. Kuten odotettua, BJ normaalissa solulinjassa ei fluoresoivia soluja havaittiin. HeLa-soluissa, määrä BORIS positiivisten solujen oli erittäin alhainen, alle 0,1% (kuvio 1 E). Kaiken nämä kokeet osoittivat, että sisällä tuumorisolulinjoja,

BORIS

mRNA ei ole läsnä kaikissa soluissa, vaan pikemminkin esiintyy vain osajoukko soluja.

eristäminen solupopulaation ilmentävien

BORIS

mRNA käyttäen BORIS-MB

NCCIT solulinjaa käytettiin eristämiseen BORIS-positiivisten solujen. FACS lajittelu suoritettiin jälkeen solutransfektiolle Boris-MB. Boris–positiivisia ja Boris–negatiivisia soluja (8,4 ± 1,5 ja 41,5 ± 7,2% koko, vastaavasti; keskiarvo ± SD) on järjestetty (kuvio 2A).

(A) NCCIT solut transfektoitiin ATTO647- RANDOM-MB (valkoinen huippu) ja ATTO647-BORIS-MB (harmaa peak). Kaksi alapopulaatioiden, BORIS-negatiivisia ja Boris–positiiviset solut valittiin vertaamalla fluoresoiva signaali RANDOM-MB että Boris-MB. Jolle ei kuolleita soluja PI värjäystä, kaksi fraktiota lajiteltu. (B)

BORIS

ilmaus eristetyn BORIS-negatiivinen Boris-positiiviset fraktiot analysoitiin qRT-PCR. Tulokset normalisoitiin

GAPDH

ja muussa kuin lajiteltu NCCIT soluissa. Virhepalkit edustavat keskiarvoja ± SD 3 riippumattoman kokeen. Tähti osoittaa tilastollisesti merkittävä ero (p 0,05) välillä BORIS-positiivisia ja ei-lajitellut solut.

BORIS

ilmentymisen analyysi osoitti, että

BORIS

mRNA taso lajiteltu BORIS-positiivisia soluja oli 20 kertaa suurempi kuin ei-lajitellut solut (kuvio 2B). Tämä tulos osoitti tehokkuutta lajittelun menetelmän ja onnistunut rikastamiseen solupopulaation, joka ilmaistaan ​​

BORIS

mRNA.

Eristetty BORIS-positiivisia ja Boris–negatiiviset solut ovat samanlaisia ​​metylaatio BORIS promoottori B

Aikaisemmassa tutkimuksessa olemme osoittaneet, että

BORIS

ilmentymistä kontrolloi kolme vaihtoehtoista promoottorit, jotka vastaavat transkription aloituspaikkoja on -1447, -899 ja -658 bp ylävirtaan ensimmäinen ATG ja nimetty promoottorit kuten A, B ja C, vastaavasti [25]. Mielenkiintoista on, että on havaittu, että kasvaimet, demetylaatio Boris promoottori B, on yleensä korreloi ilmentymisen

BORIS

, mikä ei ole asianlaita promoottorit C ja A [25]. Näin ollen meillä kuulusteltiin mahdollinen korrelaatio metyloinnin promoottorin B ja

BORIS

ilmaisun lajitellut solut. BORIS metylaatio taso tämän promoottorin mitattiin pyrosekvensointi jälkeen bisulfiittimodifikaatio DNA uutetaan BORIS-positiivisia ja BORIS-negatiivisia soluja. Pyrosekvensointi tulokset osoittivat, että molemmat fraktiot CpG: t olivat raskaasti metyloitiin (85-100% metylaatio) ja eroja ei havaittu (kuvio 3A). Tämä vahvisti, että NCCIT soluissa,

BORIS

ilmentymistä ei säännellä promoottori B ja ehdotti, että eri ilmentymistä

BORIS

joukossa lajitellut jakeet ei ohjaa DNA metylaatiostatuksen promoottori B mutta pikemminkin osallistuvat muut valvonnan taso.

(A) metyloituvuutta 10 CpG saarilla

BORIS

promoottorialue (B promoottori). Edustaja graafinen näyttää prosentteina metylaation kunkin CpG saaren eristetyn BORIS-positiivinen (valkoinen), -negatiivinen (harmaa) ja ei-lajitellaan (musta) NCCIT soluja. (B) ekspressio analyysi eristetty BORIS-positiivinen (valkoinen) ja BORIS-negatiivinen (harmaa) fraktioita. Ilmoitettu geenit analysoitiin qRT-PCR.