Krooninen sairaus

tiivistelmä

miRNA tasot ovat muuttuneet haiman adenokarsinooma (PDA), yleisin ja tappava haiman maligniteetin, ja ehjä miRNA käsittely on välttämätöntä sukuperää erittely aikana haiman kehitykseen. Kuitenkin rooli miRNA käsittely PDA ei ole tutkittu. Täällä tutkimme roolia miRNA biogeneesin PDA kehitystä poistamalla miRNA käsittely entsyymin Dicer PDA hiirimallissa ohjaavat onkogeeninen Kras. Huomaamme, että menetys Dicer kiihtyy Kras ajettu acinar erilaistamattomuuden ja acinar kohteeseen ductal metaplasiaa (ADM), prosessi, joka on osoitettu ennen ja edistää erittely PDA esiasteita. Kuitenkin rajoittamaton ADM näyttää myös korkea apoptoosin. Dicer menetys ei vauhdittaa kehitystä Kras ajettu PDA esiasteita tai PDA, mutta yllättäen, huomaamme, että hiiri PDA voi kehittyä ilman Dicer, vaikka kustannuksella proliferatiivisen kapasiteetin. Tuloksemme viittaavat siihen, että ehjä miRNA käsittely on mukana sekä rajoittaa pro-tuumorigeenisiä muutoksia haiman erilaistumista sekä säilyttää elinkelpoisuuden aikana PDA aloittamisen.

Citation: Morris JP IV, Greer R, Russ HA, von Figura G, Kim GE, Busch A, et al. (2014) Dicer säätelee eriyttäminen ja elinkelpoisuus aikana hiiri Haimasyöpä aloittaminen. PLoS ONE 9 (5): e95486. doi: 10,1371 /journal.pone.0095486

Editor: Murray Korc, Indiana University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 03 tammikuu 2014; Hyväksytty: 26 maaliskuu 2014; Julkaistu: 01 toukokuu 2014

Copyright: © 2014 Morris et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Work in Matthias Hebrok n Group tukivat avustusta AACR Haimasyöpä Action Network. www.pancan.org. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

haiman adenokarsinooma (PDA) tulee kehittää sarjan kautta ductal esiasteleesioita, mukaan lukien yleisin tyyppi, haiman intraepiteliaalinen neoplasia (PANIN). Sekä PanINs ja PDA näytteille Kras mutaatioita, jotka voivat olla alkutapahtumaa. Hiiri mallit tukevat tätä käsitystä tavoitteiden mukaisesti ja jatkuva ilmentyminen KRAS hiiren haiman epiteelissä sekä yhteenveto siitä Panin PDA järjestyksessä saaneilla ihmisillä, jota tarvitaan taudin huolto [1], [2], [3]. Todisteet hiiren malleissa viittaa siihen, että KRAS voi edistää PDA aloittamista kohdentamalla asinussolut kanavaan kuin sukujuuret mahdollista tulla PanINs via prosessia kutsutaan acinar kohteeseen ductal metaplasiaa (ADM) [4], [5], [6]. Tämä kyky muuttaa haiman plastisuus voi olla tärkeä askel PDA aloittamisen, kuten asinussolut on osoitettu olevan dramaattisesti herkempiä Kras riippuvainen Panin kehityksestä verrattuna tiehytsoluja [7]. Koska yrityksiä suoraan esto onkogeenisten Kras ovat yleensä epäonnistuneet [8], jossa määritellään kriittinen välittäjiä pro-tuumorigeenisemmiksi erilaistumista ja elinkelpoisuus alavirtaan KRAS voivat edustaa vaihtoehtoisia hoitomenetelmiä.

MikroRNA (miRNA) ovat luokan pienet, ei-koodaavat RNA: t, jotka säätelevät geenien ilmentymistä transkription jälkeen. Poikkeava miRNA arvot liittyvät kasvainten kehittymiseen, ja johtaa epätarkoituksenmukaiseen ilmentyminen onkogeenien ja tuumorisuppressoreita [9]. Syöpäliittynyt miRNA tasot johtuvat misexpression erityisten miRNA sekä vapauttaminen miRNA biogeneesiä polku [10]. miRNA yleensä vaimentua ihmisen syövissä [11], ja esti miRNA käsittely edistää kasvaimen kehittymisen [12]. Kuitenkin menetys miRNA käsittely saattaa olla ristiriidassa edistettiin noin kasvaimia [13], [14], [15], mikä viittaa siihen, että kriittiset kynnysarvot miRNA käsittely voidaan mukana ylläpitää elinkelpoisuutta aikana muutosta. Vaikka miRNA ovat misexpressed vuonna PanINs ja PDA, ja tiedetään säännellä väyliä, jotka edistävät PDA aloittamista ja etenemiseen [16], [17], [18], [19], rooli, että miRNA käsittely pelaa PDA kehitys ei ole ollut tutkittu.

poistamalla miRNA-käsittely entsyymin Dicer on Kras ajettu hiirimallissa PDA, huomaamme, että miRNA käsittely säätelee sekä erilaistumista ja elinkelpoisuuden aikana Kras ajettu haiman muutosta. Dicer poisto edistää Kras ajettu menetystä acinar identiteetin ja ADM vaan johtaa myös kohonneeseen apoptoosin ja vähentynyt ilmentyminen geenit säilyttämisessä elinkelpoisuuden aikana Panin kehitystä ja PDA. Yllättäen huomaamme, että hiiri PDA voi kehittyä ilman Dicer, vaikkakin vähentynyt proliferaatio. Yhdessä tämä työ viittaa kriittinen rooli miRNA jalostettavaksi Kras ajettu PDA aloittamista.

Tulokset

Dicer Loss Nopeuttaa Kras Driven Duktaalinen Metaplasia

Dicer poisto alussa haiman progenitorisolujen tulokset haiman agenesis ja synnytyksen jälkeisen kuoleman [20]. Siksi testasimme jos selvä Pdx1 ajettu Cre rasitusta,

Pdx1-Cre

Late

, sallittu haiman kehitys asettaminen menetys Dicer toiminto.

Pdx1-Cre

Late

johtaa viivästyneeseen kehitykseen aktiivisuuden verrattuna Pdx1-Cre kuljettaja palveluksessa Lynn

et al

, jolloin rekombinaatio rajatummassa joukko aikuisten solujen, erityisesti useimmissa acini, jotkut endokriiniset solut, ja harvoin tiehytsoluja [21]. Viittaa ajallinen vaatimukset Dicer haiman kehitykseen,

Pdx1-Cre

Late; Dicer

flox /flox

(

Dicer

Homo

) hiiret menestyneet ja näytetään selvästi normaalia haiman kehityksen p0 edes yhteydessä merkittävästi vähentynyt Dicer ilmentymisen verrattuna kontrolliin

Pdx1- Cre

Late; Dicer

flox /+

hiirillä (

Dicer

Het

) (Kuva S1 A, B, E).

3 viikon iässä, acini, kanavat, ja saarekkeet olivat tunnistettavissa

Dicer

Homo

hiiriä (kuvio 1A), joskin jonkin verran exocrine alueilla vähentynyt eosiinivärjäykset. Immunofluoresenssilla paljasti normaalin jakautumisen asinussolujen markkerin amylaasi, kanava markkeri CK19, ja β-solujen markkeri insuliini (kuvio 1 B). Exocrine morfologia oli häiriintynyt vaikka, kuten olemme usein epäjärjestyksessä rauhasrakkuloista pieniä, hajanaisia ​​soluja ei havaittu kontrolleissa (kuvio 1 B, kuva S2), samanlainen sekavaa asinussolut havaittiin somaattisten Dicer hypomorphs [22]. Haiman massa

Dicer

Homo

hiirillä vähensi myös (kuvio 1 D), jos havaitaan laski Dicer ilmaisun (kuvio 1 C). Huolimatta muutoksista morfologian, emme tarkkailla soluja samanaikaisesti ilmentävät amylaasi ja kohonneet CK19 kuten havaittiin rakkulasoluissa meneillään Kras ajettu ADM (kuva S3), mikä viittaa siihen, että sekavaa asinussolut eivät aktiivisesti käynnissä ADM.

(A). Hematoksyliinillä ja eosiinilla (H Dicer

Het n = 9, Kras ; Dicer

Homo

n = 14). (E). H Dicer

Het

ja

Kras; Dicer

Homo

hiirillä. Upotteet E-vasen, Rare painopiste metaplasiaa ja Panin; oikea, ductal metaplasiaa vuonna

Kras; Dicer

Homo

hiirillä. Mittakaava 100pM. (F) immunohistokemiaallisesti amylaasi, Sox9, CK19 3 viikkoa vanha

Kras; Dicer

Het

ja

Kras; Dicer

Homo

hiirillä. Mittakaava 100pM.

testaamiseksi vaikutuksen Dicer tappio Kras ajettu haiman muutosta, me syntyy

Pdx1-Cre

Late; LSL-Kras

G12D; Dicer

flox /flox

(

Kras; Dicer

Homo

) hiirillä. Kuten muutkin mallit kohdistaminen KRAS että alkion haima,

Pdx1-Cre

Late; LSL-Kras

G12D

hiiret vähitellen kehittyä ADM sekä PanINs, PDA syntyvät joidenkin eläinten pitkien latenssi [23]. Samanlainen tällaiset mallit [1], 3 viikon iässä, haima massa

Pdx1-Cre

Late; LSL-Kras

G12D; Dicer

flox /+

(

Kras; Dicer

Het

) hiirillä oli hieman, mutta huomattavasti, lisääntynyt verrattuna

Dicer

Het

hiiriä (Kuva 1D ). Eksokriinisessä lokero

Kras; Dicer

Het

hiiret näyttivät selvästi normaalia, pääasiassa koostuu amylaasi positiivisia asinussoluista, joilla on harvinainen alueita amylaasinegatiivista ADM ja huono laatu PanINs ilmentävät kohtalaisesta korkeita CK19 ja Sox9 (kuvio 1 F), ductal /haiman alkion progenitorimerkkiaineiden ominaisuus Kras ajettu ADM: n ja PANIN muodostumista [6]. Sen sijaan,

Kras; Dicer

Homo

haimoissa näkyy vähentynyt Dicer ilmaisu (kuvio 1 C), olivat atrofinen (kuvio 1 D), ja hallussaan laajaa korvaaminen exocrine lokeron metaplastiset kanavaan rakenteet muistuttavat harvinainen ADM

Kras; Dicer

Het

hiiriä (kuvio 1 E). Duktaalinen metaplasiaa in

Kras; Dicer

Homo

hiirillä näkyy vähentynyt ilmentyminen amylaasin, alhainen maltillinen ilmentymä CK19, ja voimakas ilmentyminen Sox9 (kuvio 1 F). Sox9 kertymistä havaittiin myös rakenteisiin säilyttää joissakin basaalisoluissa morfologia (kuvio 1 F). Duktaalinen metaplasiaa ei havaittu p0 in

Kras; Dicer

Homo

hiiriä (kuvio S1D), mikä viittaa siihen, että Dicer puute yhteydessä KRAS ei estä alkion acinar kehitystä, ja ADM tapahtuu syntymän ja 3 viikon iässä. Siksi Dicer tappio yhteydessä KRAS dramaattisesti kiihdyttää ADM, prosessi, joka on osoitettu sekä ennen ja edistää Kras ajetaan Panin muodostumista [4], [6], [24].

Dicer Loss Kompromisseja acinar Identiteetti ja Edistää Kras Driven acinar on Duktaalinen uudelleenohjelmointi

Tutkitaan miksi

Kras; Dicer

Homo

hiiret issa kiihtyi Kras ajettu ADM, kysyimme Dicer puutteellinen asinussolut sopimattomasti näyttää ominaisuuksia, jotka liittyvät ADM, kuten markkereita acinar stressiä ja menetys acinar identiteetin. Keskittyä soluilla, jotka oli tehty Cre rekombinaatiota me sisältyi Cre indusoituvan YFP alleeli ilmaisi ehdollisesti päässä Rosa26 lokuksesta (

R26-EYFP

). YFP värjäys paljasti, että molemmat eksokriinisessä osastoon

Pdx1-Cre

Late; Dicer

flox /flox; R26-EYFP

(

Dicer

Homo; YFP

) hiiret ja ADM

Pdx1-Cre

Late; LSL-Kras

G12D; Dicer

flox /flox; R26-EYFP

(

Kras; Dicer

Homo; YFP

) hiiriä johdettu soluista, joissa Cre oli aktiivinen, eikä laajentaminen un rekombinoitua väestöstä (kuvio 2B, D).

(A-D) Klusteriinin (sininen) ja YFP (vihreä) värjäys 3 viikkoa vanha

Dicer

Het; YFP

(A),

Dicer

Homo; YFP

(B),

Kras; Dicer

Het; YFP

(C), ja

Kras; Dicer

Homo; YFP

hiiret (D). Mittakaava 100gM (E) RT-PCR-analyysi Dicer miRNA-141 ja 216b (vasemmalla), acinar rikastettu geenit amylaasi ja Mist1 (keskellä), ja kanava rikastettu geenien CK19 ja Sox9 (oikealla) YFP +, CD49f +, CD133- soluja

Dicer

Het; YFP

(n = 4),

Dicer

Homo; YFP

(n = 4),

Kras; Dicer

Het; YFP

(n = 3), ja

Kras; Dicer

Homo; YFP

(n = 3) hiiret. Keskiarvo ± SD. P-arvot lasketaan kaksisuuntaisia, pariton t-testit vertaamalla

Dicer

Het

ja

Dicer

Hom °

CK19 ja Sox9 ilmaisun arvoja.

Voit selvittää Dicer menetys johti acinar stressi liittyvät ADM, tutkimme ilmaus klusteriinille, merkkiaine korosti, de-eriytetty acini [6], [25]. Klusteriinille oli pääosin poissa YFP + rakkulasoluissa valvonnan

Dicer

Het; YFP

ja

Kras; Dicer

Het; YFP

hiiriä, mutta oli läsnä harvinainen YFP + ADM

Kras; Dicer

Het; YFP

eläimet (kuvio 2A, C). Viittaa siihen, että Dicer vajaiden solujen on stressiä havaittiin ADM, klusteriinin ei ollut ainoastaan ​​tasaisesti havaittu YFP + ADM

Kras; Dicer

Homo; YFP

hiiriä, mutta myös laajasti ilmaistuna YFP + rakkulasoluissa in

Dicer

Homo; YFP

eläimet (kuvio 2B, D).

Voit testata acinar stressi vastasi vähentynyt rauhasrakkuloiden identiteetti, muutimme lajittelu protokolla aiemmin laaditut eristämiseen haiman esiasteita [26] nimenomaan erottaa eriytetyn acinar ja ductal soluja. Huomasimme, että aikuisen haimassa, aikuisten acini ja kanavat ilmentävät epiteelin merkki CD49f, vaikka eriytetty kanavat myös ilmaista CD133 (kuvio S4b, C). RT-PCR

Amylaasi-

ja

Mist1

, ja

CK19

ja

Sox9

rikastunut acinar ja tiehytsoluja vastaavasti paljasti, että perustuva lajittelu on CD49f ja CD133 mahdollisti tehokkaan erottamista näissä potilasryhmissä (kuvio S4A, 4D). Expression of Notch efektorien Hes1, Hey1, ja Hey2, rajoittuu centroacinar ja terminaali kanava solujen aikuisen haimassa [27], ilmestyi eristää kanssa CD49f + CD133 + kanavan väestöstä (kuvio S4E).

YFP +, CD49f + CD133- solut lajiteltiin kaikilta 4 genotyypit. 3 viikon iässä Dicer tasoja ja ilmentyminen 2 ilmentyy runsaana miRNA pienenivät huomattavasti soluissa lajiteltuna

Dicer

Homo; YFP

ja

Kras; Dicer

Homo; YFP

hiirillä verrokkeihin nähden ja ilman Kras (kuvio 2E vasemmalla). Voit selvittää vaikutus Dicer tappio eksokriinisessä erilaistumiseen, analysoimme ilmaus acinar merkkiaineiden Amylaasi- ja Mist1 ja kanavan markkereita CK19 ja Sox9, vuonna YFP +, CD49f + CD133- soluja. Lajiteltu soluja

Dicer

Homo; YFP

hiiret näytetä huomattavasti vähentynyt ilmentyminen

Amylaasi-

ja vähensi hieman

Mist1

verrattuna soluja

Dicer

Het; YFP

hiiret (kuvio 2E keskellä). Vaikka ekspressio merkkiaineiden asinussolujen erilaistumisen vähenivät, emme tarkkailla johdonmukaisesti kasvu tiehyen merkkiaineiden

CK19

tai

Sox9

näissä soluissa (kuvio 2E oikealla), joka on samanlainen puute laajalle levinnyt CK19 misexpression huomattava kuvassa 1D. Vuonna CD49f + CD133- soluja

Kras; Dicer

Homo; YFP

hiiret kuitenkin

Amylaasi-

ja

Mist1

ilmentyminen väheni edelleen, ja

CK19

ja

Sox9

ekspressio lisääntyi verrattuna soluihin kaikista muista genotyypit, sopusoinnussa histologinen kasvu ADM.

Kiinnostavaa kyllä, myös havaittu vaatimaton, mutta ei tilastollisesti merkitsevä, suuntaus vähentäminen Mist1 ilmentyminen soluissa lajiteltuna

Kras; Dicer

Het; YFP

hiirillä verrattuna

Dicer

Het; YFP

valvontaa, mikä viittaa siihen, että KRAS yksin voi alkaa vaarantamatta acinar identiteetin ennen induktio tiehyen geenien tai morfologiaan. Yhdessä tämä data viittaa siihen, että Dicer menetys vaarantaa acinar identiteetti ja indusoi korosti tila, joka nopeuttaa Kras ajettu duktaalisia uudelleenohjelmointi ja ADM.

Dicer Menetys ei kiihdytä Panin tai PDA Development

Menetys acinar identiteetti ja ADM kiihdyttää Panin kehitykseen [6], [24], [28], [29] ja kiihtyi ADM ja Panin kehityksen aiheuttama akuutti ja krooninen haimatulehdus esimerkiksi voi kuitenkin pienentää PDA latenssin [30], [31] , [32]. Siksi odotimme tarkkailla nopeammin Panin ja PDA kehitystä

Kras; Dicer

Homo

hiirissä kontrolliin verrattuna

Kras; Dicer

Het

hiirillä. Huolimatta dramaattinen ero ADM havaittu 3 viikkoa

Kras; Dicer

Homo

verrattuna

Kras; Dicer

Het

hiiriä, kvantifiointi Panin vaurioita pienessä ryhmä hiiriä 9 viikon paljastanut mitään tilastollisesti merkitsevää eroa taajuus Alcian Blue positiivinen ductal vaurioita, mikä viittaa siihen, että Dicer menetys ei kiihdytä Panin kehitystä (kuvio 3A , B, C). Pitkäaikainen taudin etenemistä myös lähentyneet riippumattomia ehdollinen Dicer tila. Emme löytäneet tilastollisesti merkitsevää eroa selviytymisen pieni kohortin aged

Kras; Dicer

Homo

ja

Kras; Dicer

Het

hiiriä (Eloonjäämismediaani 336 vs. 441,5 päivää, χ

2 = 0,2271, p = 0,6637, joka on laskettu käyttämällä logrank testi) (kuvio 3F). 6/7 on

Kras; Dicer

Het

hiirille kehittyi paikallisesti tai yleisesti invasiivisia PDA joka oli yleensä kohtalaisen eriytetty, mutta kuului yksi erilaistumaton syöpä. 4 out of 6

Kras; Dicer

Homo

hiirille kehittyi kohtuullisesti erilaistunut, paikallisesti tai laajasti invasiivisia, PDA samanlaisia ​​taajuudella etäpesäkkeiden ja solun morfologiassa (kuvio 3D, E, taulukko S1).

(A-B) edustaja Alcian Blue värjäys 9 viikkoa

Kras; Dicer

Het

(A) ja

Kras; Dicer

Homo

hiiret (B). f: rasva. Mittakaava 100pM. C, kvantifiointi alcian sininen positiivinen vaurioita 9 viikkoa vanha

Kras; Dicer

Het

ja

Kras; Dicer

Homo

hiirillä. Viivat osoittavat keinoin. P-arvo lasketaan kaksisuuntaista, paritonta t-testiä. (D, E) edustaja histologia Kämmentietokonesi

Kras; Dicer

Het

(D) ja

Kras; Dicer

Homo

hiiriä (E). Mittakaava 100pM. (F) Survival käyrä

Kras; Dicer

Het

(n = 7) ja

Kras; Dicer

Homo

(n = 6) hiirissä.

Dicer poistetaan-solujen on osoitettu olevan outcompeted jonka unrecombined solut muissa Endodermi peräisin elinten, maksan esimerkiksi [33] ja poistaminen rekombinoidun solujen voisi edistää puute odotettavissa eroa taudin etenemiseen

Kras; Dicer

Homo

versus

Kras; Dicer

Het

hiirillä. Toisin kuin 3 viikkoa aikaa vaiheessa, kun normaali asinussolut olivat paljon harvinaisempia

Kras; Dicer

Homo

versus

Kras; Dicer

Het

hiiriä, huomattavia alueita normaalin asinussolujen kudoksen todettiin Kras; Dicer

H

o

m

o

hiirillä tässä aikapisteessä (kuvio 3A, B). Totesimme myös mainittava rasvan korvaaminen haiman kudoksen joissakin

Kras; Dicer

Homo

eläimet (kuvio 3B). Tutkiminen kudoksen YFP jakelun haimassa

Kras; Dicer

Het; YFP

versus

Kras; Dicer

Homo; YFP

eläimet osoittivat huomattavaa laskua YFP jakeluun 9 viikon (kuvio S5), mikä viittaa siihen, kannan uudelleen soluilla, jotka eivät ole suorittaneet rekombinaatiota. Tästä syystä, vaikka aluksi edistää ADM että normaalisti nopeuttaa Panin ja PDA kehitystä, PDA eteneminen ei oleellisesti parannettu puuttuessa Dicer ja voi liittyä valinta vastaan ​​Dicer puute.

Dicer Loss kompromisseja Elinkelpoisuus aikana Kras Driven ADM

Dicer menetys johtaa lisääntyneeseen apoptoosin useissa endodermaalinen elinten (esim maksa ja suoli [33], [34]. Ongelman jos puute ennustettu nopeutuminen Panin kehityksen

Kras; Dicer

Homo

hiirillä saattaa liittyä lisääntynyt solukuolema, me tarkastaneet TUNEL + /YFP + soluja 3 viikon iässä. toisin kuin harvinainen kaksinkertainen positiivisia soluja

Dicer

Het; YFP

ja

Kras; Dicer

Het; YFP

hiiriä,

Dicer

Homo; YFP

hiirillä näkyy korkeamman suhteellisen nopeudella TUNEL + /YFP + soluissa (kuvio 4B, E). Lisäksi olemme löytäneet lisäkorotus kaksinkertainen positiivisten solujen

Kras; Dicer

Homo; YFP

hiirissä verrattuna

Dicer

Het; YFP

ja

Kras; Dicer

Het; YFP

hiiret (kuvio 4D, E). Mielenkiintoista on, Dicer menetys näytti synergisesti KRAS edistää solukuolemaa, kuten

Kras; Dicer

Homo; YFP

hiiret osoittivat merkittävästi enemmän apoptoosin kuin

Dicer

Homo; YFP

soluja (kuvio 4E). Näin ollen, vaikka ehjä Dicer käsittely kanssa pakottaa Kras ajetaan acinar on ductal uudelleenohjelmointi, jotkut Dicer riippuvaisia ​​signaaleja voidaan tarvita ylläpitämiseksi elinkelpoisuuden aikana Kras ajettu metaplasiaa.

(A-D) TUNEL (sininen) ja YFP (vihreä) värjäys 3 viikkoa vanha

Dicer

Het; YFP

(A),

Dicer

Homo; YFP

(B),

Kras; Dicer

Het; YFP

(C), ja

Kras; Dicer

Homo; YFP

hiiret (D). Mittakaava 100pM. E. kvantitointi TUNEL + YFP + soluja (A-D). Keskiarvo ± SD.

Dicer

Het; YFP

(n = 3),

Dicer

Homo; YFP

(n = 4),

Kras; Dicer

Het; YFP

(n = 3), ja

Kras; Dicer

Homo; YFP

hiiriä (n = 4). P-arvo lasketaan kaksisuuntaista, parittomalla t-testi TUNEL + YFP + solujen

Dicer

Homo; YFP

ja

Kras; Dicer

Homo; YFP

hiirillä. F. Rauhasrakkulasuspensiota rikastettu ja elinkelpoisuuden liittyvät geenit ilmaisun analyysi (vasemmalla). RT-PCR-analyysi Nupr1, Agr2, Itih4, ja Reg3b vuonna rakkulasoluissa rikastunut solujen

Dicer

Het; YFP

(n = 4),

Dicer

Homo; YFP

(n = 4),

Kras; Dicer

Het; YFP

(n = 3), ja

Kras; Dicer

Homo; YFP

(n = 3) hiiret (oikealla). Keskiarvo ± SD. P-arvo lasketaan kaksisuuntaista, paritonta t-testiä vertaamalla Agr2 ilmentymisen lajitellun solujen

Dicer

Het; YFP

ja

Kras; Dicer

Het; YFP

hiirillä.

Me tehdään ilmentymisanalyysiä seuloa Dicer riippuvaisten tekijöiden mahdollisesti mukana ylläpitää elinkelpoisuutta aikana Kras ajettu ADM. Paremmin synkronoida ADM

Kras; Dicer

Het

ja

Kras; Dicer

Homo

hiiriä, käytimme seruleiini aiheuttama haimatulehdus. Kuten ennustettiin aiemmista tutkimuksista [6], seruleiini hoidon ohjaus, 3 viikkoa vanha

Kras; Dicer

Het

hiirillä johti kehittämiseen kanavan rakenteita 2 päivää sen jälkeen hoidon (kuvio S6A), ja laajalle levinnyt korvaaminen exocrine lokeron ADM, PanINs, ja fibroosia, 21 päivän kuluttua hoidon (kuvio S6c). Peilaus puute nopeutetun Panin kehityksen välillä 3 ja 9 viikkoa

Kras; Dicer

Homo

hiiriä (kuvio 3F), havaitsimme vähemmän metaplasiaa ja huomattavasti normaalia acinar kudoksessa 21 päivää seruleiini hoidon

Kras; Dicer

Homo

hiiriä (kuvio S6D). RNA-Seq analyysi yhdistettiin RNA FACS eristetty YFP +, CD49f +, CD133- asinussolut 3 viikkoa vanha

Kras; Dicer

Het; YFP

(3 hiirtä) ja

Kras; Dicer

Homo; YFP

(5 hiirtä) hiirillä 2 päivää sen jälkeen seruleiini (kuvio S6E) paljasti ~120 geenien merkittävästi vaimentua välillä mutantin ja valvontaa. Tukeminen havainto, että menetys Dicer vaarantaa asinussolujen erilaistuminen, 42 geenejä, jotka liittyvät terminaalisesti erilaistuneita asinussolut merkittävästi vaimentua (kuvio 4F, taulukko S2, täydelliset tiedot asetetaan taulukko S3). Myös vähensi olivat geenit säilyttämisessä elinkelpoisuutta regeneraation aikana tai kasvaimen kehittymisen, kuten Nupr1 /P8 Agr2, Itih4, ja jäsenet REG3 proteiinin perhe (kuvio 4F, taulukko S2). Äskettäin molemmat Nupr1 ja Agr2 on osoitettu yli-ilmentyvän aikana Panin-PDA etenemistä ja rooli Panin kehittämiseen ja ylläpitämiseen PDA elinkelpoisuus [35], [36], [37]. REG3 perheen proteiinin ekspressio aktivoituu vasteena haimatulehdus [38], ja perheenjäsen Reg3b (tunnetaan myös nimellä PAP1) erikseen on liitetty ylläpitää acinar elinkelpoisuuden ja voi toimia alavirtaan Nupr1 [39], [40]. Vaikka Itih4 ei ole osallisena PDA kehitystä, se on osoitettu olevan osallisena ylläpitämiseen elinkelpoisuutta alavirtaan kriittisen PDA sovittelija c-myc [41] mallissa maksasyövän [42]. RT-PCR-analyysi näistä ehdokas geenien lajiteltu acini 3 viikon ikäisiä hiiriä ilmeni, että niiden ilmentyminen korreloi käänteisesti apoptoosin (kuvio 4F, oikealla). Nupr1, Agr2, Itih4, ja Reg3b ilmentyminen väheni lajitellun solujen

Kras; Dicer

Homo; YFP

hiiret vertailuryhmän

Dicer

Het; YFP

ja

Kras; Dicer

Het; YFP

eläimiä. Myös Agr2, Itih4, ja Reg3b ilmentyminen väheni lajitellaan soluja

Dicer

Homo; YFP

hiirillä verrokkeihin verrattuna. Mielenkiintoista, Agr2 oli myös merkitsevästi lisääntynyt soluissa lajiteltuna

Kras; Dicer

Het; YFP

hiirillä verrattuna soluja

Dicer

Het; YFP

hiirillä, mikä viittaa siihen, että Kras saattavat edistää Agr2 voimistumista jo ennen ADM tapahtuu. Siksi Dicer lauseke tarvitaan ylläpidosta kypsän acinar erilaistumisen valtion ja ekspressioon pro-elinkelpoisuuden geenien aikana Kras ajettu ADM.

Hiiri PDA voi kehittyä puuttuminen Dicer

Dicer tasot on osoitettu olevan tärkeitä säätelijöitä tuumorigeneesin, joka toimii haploinsufficient tuumorisuppressori yhteydessä KRAS sekä keuhko- kasvainten ja sarkoomat, sekä retinoblastoomaan [13], [14]. Kuitenkin, kasvaimia näissä malleissa näyttävät johtuvan soluja, jotka ovat säilyttäneet ilmentymistä vähintään yhden unrecombined ehdollisen alleeli. Sen määrittämiseksi, Dicer puutteelliset solut ovat omiaan aiheuttamaan Kras ajettu PDA testasimme Dicer ilmaisun ja genomista rekombinaationa 3 PDA solulinjoista syntyvät

Kras; Dicer

Het

ja

Kras; Dicer

Homo

hiirillä. RT-PCR: llä havaitsimme samanlaisia ​​Dicer ilmentyminen kaikissa kolmessa PDA johdetut solulinjat

Kras; Dicer

Het

hiirissä (kuvio 5A). Koska suuri määrä apoptoosin havaittu 3 viikon iässä, alennetun geenien ilmentymistä, jotka tukevat Panin kehitystä, ja puute kiihtyi taudin etenemiseen, odotimme tarkkailla säilyttäminen vähintään yhden alleelin PDA linjat johdettu

Kras; Dicer

Homo

PDA. Yllättäen huomasimme, että yksi rivi näytetä dramaattisesti vähentynyt Dicer ilmaisu, kun taas kahden jäljellä riviä ilmaistaan ​​joko samanlainen tai korkeampi, tasolla kuin

Kras; Dicer

Het

johdettu linjat. Alleeli PCR osoitti, että Dicer rekombinaatiota korreloivat suoraan ilme (Kuva 5B: ”Undel”, ei ehdollinen Dicer alleeli rekombinaationa ”Hemi”, rekombinaatio yhden alleelin; ”Homo”, rekombinaatio molempien alleelien). RT-PCR 3 kypsä miRNA raportoitu olevan yli-ilmentynyt ihmisen PDA [43], [44] paljasti väheneminen kaikissa 3 miRNA in homotsygoottinen poistetaan linjan alle 95%, joka ilmaistaan ​​poistamattomien linjan (kuvio 5C) . Siksi Kras ajettu PDA hiiren näyttää voisivat välttyä negatiivisen valinnan aikana tauti aloittamisen ja kehittyä ilman Dicer. Kuten ennustaa malleista, jotka osoittavat downregulation, mutta ei täydellinen menetys miRNA käsittely, voi parantaa kasvaimen kehittymisen [12], [13] hemizygous poistetaan linjan kasvoivat nopeimmin, kun taas homotsygoottinen poistetaan linjan hitain (kuvio 5D). Kaikki 3 solulinjat kykenivät myös muodostaa kasvaimia, kun ihonalaisesti immuuni hiirissä, joissa kinetiikka peilaus soluviljelmässä kasvu (kuvio 5E). Alleelispesifiset PCR osoitti, että kasvaimia ei johtunut soluista, jotka tehtiin spontaani rekombinaatio (UnDel, Hemi), tai kontaminoivan alapopulaatio Dicer kompetentteja soluja (Homo), vaikka ei tarkkailla läsnä WT Dicer amplikonin kasvaimia, jotka ovat peräisin hemi ja Homo linjat, osoittaa isännän strooman rekrytointi (kuvio 5F). Näin ollen vaikka Dicer poistaminen heikentää kannattavuutta aikana alkuvaiheista Kras ajettu neoplasian menetys Dicer ei ole toisiaan poissulkevia kanssa haiman muutosta.

. Dicer RT-PCR PDA solulinjoissa syntyvät

Kras; Dicer

Het

(sininen) ja

Kras; Dicer

Homo

(punainen) hiirillä. Jokainen pylväs edustaa tietoja 3 riippumatonta kaivoista kunkin solulinjan. Keskiarvo ± SD. B. PCR havaitsemiseksi WT, unrecombined (UNREC), ja poistetaan (DEL) Dicer genomisen lokuksen solulinjoissa A. Kontrollit monistetaan DNA hiiren alkion fibroblasteissa (MEF) on ilmoittanut Dicer genotyypin seuraavat adenoviruksen Cre hoitoa. C. miRNA QPCR varten miRNA-16, 107, 191 johdetut solulinjat

Kras; Dicer

Homo

hiirillä. Jokainen pylväs edustaa 3 riippumatonta kuoppiin kunkin solulinjan. Keskiarvo ± SD. D. kasvu PDA johdetut solulinjat

Kras; Dicer

Homo

hiirillä. Jokainen piste edustaa arvoja 3 itsenäisestä kaivoista. Keskiarvo ± SD. P-arvo lasketaan kaksisuuntaista, paritonta t-testiä vertaamalla solujen lukumäärä 72 tunnin viljelmiä Undel ja Homo soluja. E. ihonalainen kasvain kasvun PDA johdetut solulinjat

Kras; Dicer

Homo

hiirillä. Keskiarvo ± keskihajonta kussakin aikapisteessä. Undel (n = 7), Hemi (n = 7), Homo (n = 12). F. PCR havaitsemiseksi WT, UNREC, ja DEL Dicer genomisen lokuksen ihonalainen kasvaimia lopetuksen E. Kontrollit ovat Dicer

fl

O

x /+ MEF käsitelty adenoviruksen Cre kuten B. Kasvain DNA: t edeltää monistuksella DNA kantasolulinjoista.

keskustelu

Dicer toiminto on välttämätöntä kehityksen useisiin elimiin, mukaan lukien endodermistä peräisin olevan kudoksissa, kuten maksassa ja gut [33], [34]. Ylläpito Dicer ilmaisun alussa Pdx1 positiivinen haiman esiasteita tarvitaan kehittää sekä haiman exocrine ja hormonaaliset osastot [20]. Täällä, huomaamme, että Dicer toiminta säilyy tärkeänä koko haiman kehitys ja tärkeä rooli säätelyssä acinar identiteetin ja elinkelpoisuus. Mallimme hyödyntää kuljettaja linja, joka käynnistää Dicer rekombinaatio kehitysmaissa haima myöhemmässä alkion vaiheessa kuin Cre kuljettajan käyttämä Lynn ja työtovereiden [21]. Huomaamme minimaalinen brutto vaikutuksia haiman kehitykseen, mikä viittaa vaihe herkkä vaatimuksia miRNA käsittelyä perustamisesta ja laajentamalla exocrine ja hormonaaliset esisolujen. Kuitenkin asinussolut jotka eivät kehittää ovat epävakaita molemmat, niin niiden terminaaliin erilaistumista ja elinkelpoisuus. Elements of acinar identiteetti vaimentua, ja solujen stressiä ja apoptoosia ovat molemmat lisääntynyt. Siksi toimivaltaisten miRNA käsittely näyttää edelleen tärkeitä myös kypsillä eksokriinisessä osastoon.

Koska Dicer poisto tässä mallissa sallii haiman kehitys pystyimme tutkia roolia Dicer funktion Kras välittämän PDA kehitystä. Hiiri mallit ovat osoittaneet, että onkogeeniset Kras voi toimia ”master säädin” PDA kehityksen perustamisesta suvusta, joka voi aiheuttaa PanINs ja PDA ja loput kriittisiä etenemistä [1], [2], [3]. Huomattavaa näyttöä siitä, että asinussolut voi aiheuttaa PanINs käymällä läpi ADM, prosessi, jonka aikana asinussolut menettää terminaali erilaistumista kustannuksella de-eriytetty, kanava kaltainen tila [4], [5], [6], [7 ]. Kras ajettu ADM tapahtuu vähitellen, mutta sitä voidaan nopeuttaa vaarantamatta acinar erilaistumista. Solvauksia kuten haimatulehduksen, joka aiheuttaa uudistaminen liittyy erilaistamattomuuden [6], [45], aktivointi kantaisä liittyy väyliä (esim Notch [24]), ja inaktivoimalla geenejä jotka ylläpitävät acinar valtio [28], [29], [46] kaikki dramaattisesti nopeuttaa Kras ajettu ADM ja Panin kehitystä. Siksi menetys acinar identiteetti voi olla keskeinen este Kras riippuvainen erittely asinussolujen johdettujen PDA esiasteita. Tuloksemme viittaavat siihen, että menetys Dicer toiminto poistaa erilaistumisen este Kras ajetaan ADM. ADM tapahtuu 3 viikkoa

Kras;