Krooninen sairaus

tiivistelmä

tulehdusta proteiini anneksiini A1 (ANXA1) on liittynyt syövän etenemiseen ja etäpesäkkeitä, mikä viittaa sen rooli säätelyssä kasvainsoluproliferaation. Tutkimme mekanismi ANXA1 vuorovaikutus formyloidun peptidin reseptorin 2 (FPR2 /ALX) valvonta, peritumoraalista ja kasvaimen kurkunpää kudosnäytteitä 20 potilasta, kvantitoimiseksi neutrofiilien ja syöttösolut, ja arvioimaan proteiinin ilmentymisen ja kolokalisaation ANXA1 /FPR2 näissä tulehdussolujen ja kurkunpään okasolujen immunosolukemiallisella. Lisäksi olemme suorittaa in vitro kokeita tutkia tarkemmin toiminnallista roolia ANXA1 /FPR2 lisääntymisessä ja etäpesäkkeiden Hep-2-soluissa, solulinjassa päässä kurkunpään epidermoidikarsinooma, käsittelyn jälkeen ANXA1

2-26 (anneksiini A1 N-terminaalisen peptidin), Boc2 (antagonisti FPR) ja /tai deksametasoni. Näissä hoidot, taso Hep-2-solujen lisääntymistä, pro-inflammatoristen sytokiinien, ANXA1 /FPR2 co-localization, ja prostaglandiini signalointi analysoitiin käyttämällä ELISA, immunosytokemia ja reaaliaikaisella PCR: llä. Virtaa neutrofiilien ja degranulated syöttösoluja havaittiin Tuumorinäytteissä. Näiden inflammatoristen solujen peritumoraalista ja kasvainnäytteet, ANXA1 /FPR2 ilmentyminen oli merkittävästi pahentaa kuitenkin kurkunpään karsinooma soluissa, tämä ilmaus on alas-säädellä. ANXA1

2-26 hoito vähensi leviämisen Hep-2-soluissa, vaikutus on estetty Boc2, ja säädelty ANXA1 /FPR2 ilme. ANXA1

2-26 hoito vähensi myös tasoja proinflammatoristen sytokiinien ja vaikuttaa ilmentymistä metalloproteinaasien ja EP-reseptoreita, jotka ovat mukana prostaglandiini signalointi. Kaiken kaikkiaan tämä Tutkimuksessa tunnistettiin mahdollisia rooleja molekyylitason mekanismi ANXA1 /FPR2 vuorovaikutusta kurkunpään syöpä, mukaan lukien sen suhde prostaglandiinin-reitin, joka tarjoaa lupaavia lähtökohdat tulevalle tutkimukselle. ANXA1 voi osaltaan sääntelyn kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden kautta parakriinisten mekanismien välittyvät FPR2 /ALX. Nämä tiedot voivat johtaa uusien biologisten kohteita terapeuttiselle interventiolle ihmisen kurkunpään syöpään.

Citation: Gastardelo TS, Cunha BR, Raposo LS, Maniglia JV, Cury PM, Lisoni FCR, et al. (2014) Tulehdus ja syöpä: rooli Annexinia A1 ja FPR2 /ALX in leviämisen ja metastaasin Human Kurkunpään Okasolusyöpä. PLoS ONE 9 (12): e111317. doi: 10,1371 /journal.pone.0111317

Editor: Hiroshi Miyazaki, Virginia Commonwealth University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 06 joulukuu 2013; Hyväksytty: 30 syyskuu 2014; Julkaistu: 09 joulukuu 2014

Copyright: © 2014 Gastardelo et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP (avustukset 2008 /08187-4 SMO ja 2008 /01655-2 TSG) ja Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – CNPq (avustus 302768 /2010- 6 SMO). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Kurkunpään syöpä on yksi yleisimpiä pään ja kaulan kasvaimia, jotka on korkea kuolleisuus ja huono ennuste [1]. Yli 12500 uutta tapausta kurkunpään syöpä diagnosoidaan vuosittain ja 3560 vuotuinen kuolemista tapahtuu [2]. Kehitetään parempi hoito sekä parempia diagnostisia ja ehkäiseviä lähestymistapoja vaatii parempaa ymmärtämistä monimutkaista kurkunpään kasvaimen kehittymisen.

Vain 5%: sta 10% kaikista syövistä johtuvat perinnön mutatoitujen geenien, kun taas loput 90%: sta 95%: ssa tapauksista on yhdistetty geneettisiin ja epigeneettiset muutokset aiheuttamat elintapojen ja ympäristötekijöiden, kuten tupakointi ja alkoholin käyttö [3], [4]. Se on nykyään hyvin tunnustettu, että tulehdus on riskitekijä useimpien syöpien, kuten kurkunpään karsinoomat [5], [6]. Krooninen tulehdus on yhdistetty eri vaiheista kasvainten synnyssä, kuten solutransformaatioon, edistäminen, leviämisen, invaasio, angiogeneesi, ja etäpesäkkeiden [7], [8]. Hanahan ja Weinberg, uusimmissa tarkastelun [9], että tulehdus uudeksi tunnusmerkki syöpä, joka edistää useita kasvain ominaisuuksia.

Tulehdussolut erittävät lukuisia sytokiineja, kemokiinien ja kasvutekijöitä, jotka voivat stimuloida, estävät apoptoosin, indusoivat morfogeneesiä ja tuottaa DNA: ta vaurioittavien reaktiivisia happiradikaaleja [7], helpottaa genomin epästabiilisuuden [10]. Lisäksi nämä solut syntetisoivat verisuonten endoteelin kasvutekijä (VEGF), angiopoetin, metalloproteinaasien ja muut proteiinit, jotka voivat edistää verisuonten endoteelisolujen mitoosin ja soluväliaineen remodeling [11]. Siksi tulehdus aiheuttaa paitsi muutoksia mikroympäristössä edistää syövän vaan myös muutoksia, jotka stimuloivat neoplastisia etenemistä.

On osoitettu, että syöttösolut ja neutrofiilit voivat ottaa palvelukseen syöpäsoluja. Lisääntynyt määrä syöttösoluista on raportoitu nisän [12] ja keuhkojen karsinoomat [13], muun kasvaimia. Kokeellisesti on ilmoittanut, että aktivoitu syöttösolut vapauttavat angiogeenisten kasvutekijöiden ja sääntelyviranomaiset, prostaglandiini, metalloproteinaasien ja sytokiinien [14], ja se voi olla kaksoisrooli edistämisessä tai estämällä kasvaimen kasvua riippuen paikallisista strooman olosuhteet [15], [16]. Solutyypeistä asuvat kasvaimen mikroympäristössä, kasvaimeen liittyvä neutrofiilien (tans) ovat saaneet vähän huomiota [17]. Vaikka on olemassa näyttöä siitä rooli neutrofiilien tiiviimpään taudin etenemistä tietyillä ihmisen kasvaimista, suhde neutrofiilikeräytymän ja ennusteeseen ihmisen syövässä ei ole systemaattisesti tutkittu [18]. Rooli neutrofiilien taudin etenemiseen yhä kiistanalainen [19] lähinnä siksi nämä solut ovat molemmat kasvain edistäviä ja kasvaimia tuhoavaa toimintoja riippuen läsnäolosta transformoivan kasvutekijä beeta (TGF-β) [20], [21].

näiden tutkimusten perusteella on selvää, että erilaiset tulehduksen välittäjäaineiden ilmentyvät differentiaalisesti useita syöpiä, ja voi edistää taudin etenemiseen [22]. Siten aineet, jotka tukahduttaa nämä tulehdusvälittäjiä edustavat potentiaalisia syövän hoitoon. Anti-inflammatorinen proteiini anneksiini 1 (ANXA1), 37-kDa jäsen anneksiini superperheen, on steroidi säätelemä proteiini, joka on osallisena välittämässä joitakin hyödyllisiä toimintoja glukokortikoidien [23], mukaan lukien solujen jakautumisen [ ,,,0],24], erilaistumiseen [25] ja etäpesäkkeiden [26].

dysregulaatio ANXA1 on raportoitu useita kasvaimet, mikä viittaa siihen, että tämä proteiini voi olla tärkeä rooli kasvaimen kehittymisessä ja etenemisessä [27]. ANXA1 yliekspressoituu rintasyövän [28] ja maksasyövän [29], mutta on selvästi alassäädetty ruokatorven [30], [31] ja pään ja kaulan alueen karsinoomat [32]. Kuitenkin molekyylitason mekanismit, joilla ANXA1 moduloi soluvasteita ei ole täysin selvitetty.

Advances tällä alueella ovat osoittaneet, välillä on toiminnallinen yhteys anti-inflammatoriset ominaisuudet ANXA1 ja reseptorin formyyli-Met-Leu-Phe (fMLP) FPR [33], tietyn luokan G-proteiiniin kytketty 7-transmembraaninen reseptorit [34]. Ihmisissä kolme perheen jäseniä on tunnistettu, FPR1, FPR2 /ALX (FPRL1) ja FPR3 (FPRL2) [35]. Joitakin vaikutuksia eksogeenisen ANXA1 voidaan vaimentaa Boc2, antagonisti sekä FPR1 ja FPR2 [33]. Viime aikoina on osoitettu, että ANXA1 N-terminaalinen peptidi, ANXA1

2-26, edistää migraatiota WS1 ihmisen ihon fibroblastit [36], ja invasiivisuus ja SKCO-15 ja peräsuolen adenokarsinooma soluihin [24] kanssa tapahtuvan vuorovaikutuksen kautta FPRs. Ei kuitenkaan ole käytettävissä tietoja rooli ANXA1 ja FPRs vuonna kurkunpään okasolusyöpä.

Useat signalointipolkujen välittävät tulehdukseen liittyvä kasvaimien syntyyn. Esimerkiksi syklo-oksigenaasi-2 (COX-2), entsyymiä, joka osallistuu muuntaminen arakidonihapon prostaglandiinien, pidetään tärkeä rooli syövän kehittymisessä moduloimalla solujen proliferaation ja muita tärkeitä biologisia prosesseja kautta niiden aineenvaihduntatuotteita, G-proteiiniin kytketyn reseptoreihin ja loppupään efektorien [37]. COX-2 on säädelty useilla maligniteettien [38] – [40], kuten pään ja kaulan karsinoomat [41]. Itse asiassa, Abrahao et ai. (2010) ovat osoittaneet, että proinflammatoristen COX-2 metaboliitin prostaglandiini E2: n ja sen EP3-reseptori voi aktivoida pään ja kaulan karsinooman solut lisääntyvät, ja on potentiaalinen kohde ennaltaehkäiseviä lähestymistapoja. Ottaen huomioon, että glukokortikoidit ovat erittäin tehokkaita estäjiä COX-2 ilmaisun [42], steroidi säätelemä proteiini anneksiini A1, joka on sekaantunut välittämisessä joitakin toimintoja glukokortikoidien, voi myös olla mukana tulehduksellinen verkossa liittyy COX-2.

koska mahdollinen rooli ANXA1 useina kasvaimet kuten solujen jakautumisen, erilaistumisen ja etäpesäkkeiden keskityimme molekyylitason mekanismeja, joilla ANXA1 moduloi nämä soluvasteita. Tässä raportissa, osoitimme että ANXA1 proteiini alassäädetty ihmisen kurkunpään syöpä ja voi säädellä kasvainten kasvua parakriinisesti joka välittyy reseptori FPR2 /ALX. Tämä tutkimus osoittaa mahdollista merkitystä tämän ANXA1 /FPR2 vuorovaikutuksen kasvainten synnyssä. Kaiken kaikkiaan tämä tutkimus tunnistettu potentiaalisia rooleja molekyylitason mekanismi tämän proteiinin vuorovaikutuksen kurkunpään syöpä, mukaan lukien sen suhde prostaglandiinin-reitin, joka tarjoaa todisteita potentiaalin ANXA1 terapeuttisena kohteena ja lupaavia lähtökohtia tulevalle tutkimukselle.

Materiaalit ja menetelmät

Tissue näytteitä

Ihmisen invasiivisen kurkunpään syöpä kudokset saatiin 20 potilaalta, kurkunpään okasolusyöpä joita hoidettiin sairaalassa de Base São José do Rio Preto, Brasilia . Potilaat oli miehiä, alkoholi- tupakoitsijat, heidän ikänsä vaihteli 50 80 vuotta ja yksikään niistä ei ollut saanut sädehoitoa tai kemoterapiaa ennen intervention. Kunkin potilaan (n = 20), kirurginen kasvaimen kerättiin päässä kurkunpään Kasvaimen peritumoraalista näytteet kerättiin kasvaimen reuna-, ja ohjaus kerättiin alueen vapaa syöpäsoluja. Koska suuri heterogeenisyys kurkunpään syöpä, kasvain kudokset leikeltiin ja tarkistaa vanhempi patologi ja luonnehdittiin kohtuullisesti erilaistunut, invasiivisia karsinoomia. Nämä kudosnäytteet käytettiin aiemmassa tutkimuksessa, joka tehtiin laboratoriossamme, ja potilaiden määrä oli riittävä saamaan tilastollisesti merkittävää tietoa [32]. Tutkimuksen protokolla hyväksyi komitean eettisen Research Federal University of São Paulo, School of Medicine, Brasilia (CEP-0300/08), ja kirjallinen suostumus saatiin kaikki potilaat mukana.

Cell Culture

Hep-2-solulinja, joka perustettiin alun perin peräisin epidermoidikarsinooma kurkunpään, käytettiin tässä tutkimuksessa (ATCC, Rockville, Maryland, USA). Solulinja todennus suoritettiin käyttäen AmpFLSTR Identifiler PCR Amplification Kit (Life Technologies) klo Special laboratorio, sairaala Israelita Albert Einstein (LATE -HIAE), Sao Paulo. Huomasimme, 100%: n identtisyys meidän solulinjan verrattuna American Type Culture Collection (ATCC) tietokantaan. Solut siirrostettiin tiheydellä 2 x 10

6 soluja 75-cm

2 viljelypulloon (Corning, NY, USA) ja inkuboitiin MEM-Earle väliaineessa (Cultilab, Campinas, SP, Brasilia) , pH 7,5, jota oli täydennetty 20% vasikan sikiön seerumia (Cultilab), 1% ei-välttämättömiä aminohappoja ja 0,1% antibiootti /antimykoottiliuoksella (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA), 37 ° C: ssa kosteassa ilmakehässä 5% CO

2 [43].

Drug Treatment

farmakologisia kokeita, Hep-2-solut ympättiin, kuten aiemmin on kuvattu. Kaksikymmentäneljä tuntia myöhemmin, kun solut olivat jo tarttunut, niitä inkuboitiin seerumittomassa väliaineessa synkronoida solusyklin. Sen jälkeen vielä 24 tuntia, väliaine korvattiin täydellisen kasvualustan, joka sisältää seuraavat: (a) 1 uM ANXA1

2-26-peptidi (Ac-AMVSEFLKQAWFIENEEQEYVQTVK) (Invitrogen); (B) 1 uM ANXA1

2-26-peptidiä ja 10 gM Boc2, joka on ei-selektiivinen FPR-antagonisti (N-t-BOC-MET-LEU-PHE) (MP Biomedicals, Aurora, OH); (C) 0,01 uM deksametasonia (glukokortikoidi; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA); (D) 0,01 uM deksametasonia ja 10 uM Boc2; tai (e) 10 uM Boc2 yksin. Lääkkeet liuotettiin ensin pieniä määriä dimetyylisulfoksidia (DMSO) ja laimennettiin sitten väliaineessa (lopullinen DMSO-konsentraatio ei ylittänyt 1%). Pitoisuudet huumeiden valittiin perustuvat alustaviin kokeisiin ja kirjallisuuden tietojen [32], [44]. Ohjaus-soluja käsiteltiin täydellistä elatusainetta, jolla on sama DMSO-pitoisuus, jota käytetään laimentamaan huumeita. Välein 2 päivää, kasvualusta korvattiin tuoreella kasvualustalla, joka sisälsi lääkkeet samalla annoksella; solun morfologia havaittiin päivittäin [43]. Kun 6, 24, 48, 72 ja 96 tuntia, ohjaus ja käsitellyt solut otettiin talteen ja laskettiin käyttäen kreivitär Automated Cell Counter (Invitrogen).

Fixation, käsittely, ja upottaminen varten valo- ja elektronimikroskopialla

Kurkunpään näytteitä ja Hep-2-solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydi, 0,5% glutaraldehydiä ja 0,1 mol /l natriumkakodylaattia (pH 7,4) 24 tuntia 4 ° C: ssa, pestiin natriumkakodylaatti, kuivattu kautta lajitellut prosentteja etanolia, ja upotettu LRGold (Lontoo Resin Co, Reading, UK). Histopatologista ja morfologiset analyysit, kudosleikkeiden (0,5-pm paksu) leikattiin koskevasta ultramikrotomilla (Reichert Ultracut, Leica, Itävalta), värjättiin 1% toluidiinisinisellä 1% booraksia ratkaisu (TAAB Laboratories, Aldermastonin UK) ja tutkittiin käyttäen Axioskop 2-Mot Plus ZEISS mikroskooppi (Carl Zeiss, Jena, Saksa). Elektronimikroskopiaa, kohdissa (~90 nm) leikattiin koskevasta ultramikrotomilla ja saatetaan nikkeliä johtoihin immunokulta merkintöjä [45].

immunokulta leimaaminen Post-sulautettujen kudosten

Immunosytokemia reaktio (double merkinnät) käytettiin havaitsemaan ilmaisun ja kolokalisaation ANXA1 ja FPR2 /ALX vuonna syöttösolut, neutrofiilit, ja ohjaus sekä syöpäsolujen kurkunpään kudoksista ja Hep-2-soluissa.

Hep-2-soluja inkuboitu vertailualustassa, ANXA1

2-26 ja ANXA1

2-26 + Boc2. 48 tunnin kuluttua viljelmä talteen, ja solut upotettiin LRGold hartsi immunosytokemiallista analyysiä varten. Ultraohuet osat kurkunpään kudosten ja Hep-2-soluja inkuboitiin askel-askeleelta tavalla käyttäen seuraavia reagensseja ja /tai olosuhteet huoneenlämpötilassa: 1) tislattua vettä; 2) 0,1 mol /l fosfaattipuskuria, joka sisälsi 1% munan albumiini (PBEA); 3) 0,1 mol /l PBS: llä, joka sisälsi 5% PBEA 30 minuuttia; 4) lampaan polyklonaalista vasta-ainetta LCPS1, nosti vastaan ​​N-terminaalinen segmentti ANXA1 (1:500 in PBEA) ja kanin polyklonaalinen vasta-aine FPR2 /ALX (Abcam, Cambridge, UK) (1:500 in PBEA) 2 tuntia; normaalia lampaan ja kaniinin seerumia käytettiin kontrollina (1:500); 5) kolme pesua PBEA, joka sisältää 0,01% Tween 20; 6), aasin anti-lammas-IgG (Fc-fragmentti-spesifinen) vasta-ainetta (1:100 in PBEA) konjugoituna 15 nm kolloidisen kullan (British BIOCELL, UK) lisättiin havaita ANXA1, ja vuohen anti-kani-IgG (Fc-fragmentti erityinen) vasta-aine (1:100 in PBEA) konjugoituna 10 nm kolloidisen kullan (British BIOCELL) lisättiin havaitsemiseksi FPR2 /ALX). 1 tunnin jälkeen, leikkeet pestiin PBEA, joka sisältää 0,01% Tween 20, ja sitten tislatussa vedessä [46]. Leikkeet värjättiin uranyyliasetaatilla ja lyijusitraatilla ennen tutkimista on ZEISS LEO 906 elektronimikroskoopilla (Carl Zeiss, Jena, Saksa).

Multiplex Analyysit

määrällisesti proinflammatoristen sytokiinien interleukiinit 6 (IL-6) ja IL-8 sekä monosyyttien kemotaktinen proteiini-1 (MCP-1), että Hep-2-solujen viljelysupernatanteista, käytimme multiplex väline LUMINEX xMAP MAGPIX (Millipore Corporation, Billerica, MA, USA) . Soluja inkuboitiin vertailualustassa, ANXA1

2-26, ANXA1

2-26 + Boc2, Dexa Dexa + Boc2 tai Boc2. 48 tunnin kuluttua hoidon, viljelmän supernatantit poistettiin, sentrifugoitiin ja säilytettiin -20 ° C: ssa. Vasta-aine helmiä, valvonta, pesupuskuri, seerumin matriisi ja standardit valmistettiin seuraten valmistajan ohjeita (MILLIPLEX HCYTOMAG-60K kit). Seuraavaksi 200 ui pesupuskuria, lisättiin kuhunkin kuoppaan magneettinen 96-kuoppaisen levyn ja sekoitettiin sekoittimessa 10 minuutin ajan. Pesupuskurilla dekantoitiin, ja 25 ui standardeja, kontrollit ja näytteet lisättiin kuoppiin. Seuraavaksi 25 ui määrityspuskuria, joka lisättiin näytteitä, ja 25 ui seerumia matriisin lisättiin standardit. Lopuksi, 25 ui magneettisten helmien (päällystetty tietyn sieppaavaa vasta-aine) lisättiin kaikkiin kuoppiin ja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa ravistelijassa. Seuraavana päivänä, levy pestiin pesupuskurilla ja inkuboitiin 25 ui tunnistus vasta-aineiden 1 tunnin ajan ravistelijassa. Seuraavaksi 25 ui streptavidiini-fykoerytriinin lisättiin kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin 30 minuuttia ravistelijassa. Levy pestiin ja inkuboitiin 150 ui ajaa nesteen 5 minuuttia ravistelijassa. Lopuksi levy analysoitiin MAGPIX kanssa xPONENT ohjelmistojen [47].

Reaaliaikainen PCR

Hep-2-soluja inkuboitiin vertailualustassa, ANXA1

2-26 tai ANXA1

2-26 + Boc2 ja korjattu 48 tunnin kuluttua. Kokonais-RNA uutettiin käyttäen TRIzol reagenssia (Invitrogen) mukaisesti valmistajan protokollaa. Genominen DNA poistettiin DNaasikäsittely mukaan valmistajan kuvaus (Promega). Alikvootit (2 ug) RNA: n ohjaus ja käsiteltyjä soluja käytettiin kaksisäikeisen cDNA-synteesi käyttäen High Capacity cDNA Archive Kit (Applied Biosystems) mukaan valmistajan ohjeiden. Neljä ilmentyvät eri geenit (

EP3

tai

PTGER3

,

EP4

tai

PTGER4

,

MMP2

ja

MMP-9

) valittiin kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR kokeiden mukaan niiden suora tai epäsuora osallistuminen tulehdus- ja metastaattisen prosessit perustuvat Gene ontologia tietokanta (https://www.geneonthology.org/). Reaaliaikainen PCR suoritettiin kolminkertaisena käyttäen 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Reaktioseos koostui 20-ul: n kokonaistilavuudessa, joka sisälsi 10 ui of Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems), 1 uM liuosta kutakin aluketta ja 20 ng cDNA: ta. PCR-olosuhteet olivat 50 ° C 2 min ja 95 ° C: ssa 10 min, jota seurasi 40 sykliä 95 ° C 15 s ja 60 ° C 1 min. Sulamiskäyräanalyysi suoritettiin kunkin geenin tarkistaa erityispiirteet ja identiteetti RT-PCR-tuotteet. Kunkin alukesarjaa, reaaliaikainen PCR tehokkuutta (E) mitattiin kolmena kappaleena siitä sarjalaimennoksia samasta cDNA näytteestä kaavalla E = [10 (-1 /kaltevuus)]. Tuloksena arvot vaihtelivat 1,96-2,02. Jokainen transkriptio taso normalisoitiin sisäisen standardin

GAPDH

, ja arvot olivat loki2 transformoitujen (y-akseli) siten, että kaikki arvot alle -1 osoitti alassäätöä geeniekspressiossa, kun taas arvot yli 1 edusti ylössäätöä verrattuna säätökennoja [43].

tilastollinen analyysi

arvot koskevat määrällisesti syöttösolujen ja neutrofiilien in vivo kudosnäytteet ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM solujen lukumäärä per mm

2 kolme osaa 0,5 um (jättäen tila 40 um välillä kussakin osassa) kullekin potilaalle (n = 20 potilasta).

Hep-2-solut laskettiin käyttäen kreivitär Automated Cell Counter (Invitrogen). Pitoisuus sytokiinien määritettiin käyttäen MAGPIX Xponent ohjelmistoa (Millipore Corporation). In vitro-analyysit toistettiin vähintään kolme kertaa.

Mikroskooppitutkimus ja immunosytokemia ilmentymisen ANXA1 ja FPR2 määritettiin käyttämällä kymmentä solua kullekin ryhmälle tutkittu. Alueella Kunkin soluosastoon määritettiin käyttäen Axiovision kuvankäsittelyohjelma (Zeiss). Tumassa ja sytoplasmassa, tiheys kolloidisten kultahiukkasten laskettiin keskiarvo ± SEM hiukkasten lukumäärä per um

2. Solukalvossa, tiheys kolloidisten kultahiukkasten laskettiin keskiarvo ± SEM hiukkasten lukumäärä per um.

merkittäviä eroja avulla määritettiin käyttäen varianssin analyysiä. Tämä testi seurasi Bonferronin post-hoc testi tiettyinä koeryhmään käyttäen Graph Pad Prism 4.0 (Graph-Pad, San Diego, CA, USA). Todennäköisyys arvo alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Läsnäolo Degranulated Mast Cells ja neutrofiilien tulva Osoittaa Tulehdus kasvaimen mikroympäristössä

tarkistaa vuorovaikutus tulehdussolujen kurkunpään kasvainsolujen, teimme histologiset analyysit kurkunpään kudosnäytteiden määrällisesti syöttösolujen ja neutrofiilien merkittäviä solujen tulehdusvastetta. Kontrollinäytteissa, havaitsimme ehjät syöttösoluista kanssa metakromaattisen rakeita läheisyydessä verisuonia (Fig. 1A). Vuonna peritumoraalista ja kasvaimen peruskudosta, me todennettujen läsnäolo degranulated syöttösolujen (Fig. 1, B ja C). Lisäksi havaitsimme neutrofiilien, jotka olivat transmigrated osaksi tuumorisektioiden (Fig. 1 D).

(A-D) Kuvat ovat (alkuperäinen suurennos, × 63) Toluidine Blue-värjätty kudososat kurkunpään näytteistä. (A) Ohjaus kurkunpään näyte osoittaa ehjät syöttösolujen (käyrä nuolet) lähellä verisuonia. Peritumoraalista (B) ja kasvaimen (C) näytteiden degranulated syöttösolujen (avoin käyrä nuolet). (D) Kasvaimen solut mitoosi toimintaa (avoin nuoli) ja tulehdussolujen, kuten suonten ulkopuoliseen neutrofiilien (nuolet). (E) kokonaismäärä syöttösoluja. (F) Ehjä ja degranulated syöttösoluja. (G) kokonaismäärä neutrofiilien. (H) Extra ja suonensisäisen neutrofiilejä. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM solujen määrä per mm

2 (n = 20 potilasta ryhmää kohti). Yksisuuntainen ANOVA seurasi Bonferronin testi paljasti merkittävän eron ryhmien kesken. ***

P

0,001

vs.

Ohjaus, ###

P

0,001

vs.

Peritumoraalista. Mittaviivat: 5 um.

Tilastollinen analyysi osoitti, että oli olemassa suuri määrä maston solujen Ohjausosuudet kurkunpään ja merkittävästi vähemmän masto soluja peritumoraalista ja kasvaimen alueilla (

P

0,001; Kuva. 1 E). Lisäksi ehjät syöttösolut oli runsaampaa vertailunäytteet sekä huomattavasti alhaisempi peritumoraalista ja kasvainleikkeissä (

P

0,001; Kuva. 1 F). Käyttämällä kvantitatiivinen analyysi neutrofiilien, olemme varmistaneet, että oli merkittävä kasvu näissä soluissa kasvainkudoksessa (

P

0,001) verrattuna ohjaus ja peritumoraalista kudoksissa (kuvio. 1G). Tutkiminen neutrofiilien ohjaus ja peritumoraalista kohdat osoittivat, että suurin osa näistä soluista olivat paikallisia verisuonissa (Fig. 1 H). Sen sijaan kasvaimen näytteissä, havaitsimme merkittävän määrän transmigrated neutrofiilien strooman (

P

0,001 verrattuna ohjaus ja peritumoraalista näytettä) (Fig. 1 H).

Up -Regulation of ANXA1 /FPR2 että tulehdussolujen of Human Kurkunpään kasvaimia

Ultrastructural immunosytokemiassa osoittivat ensimmäistä kertaa ilmaisua FPR2 /ALX ja sen kolokalisaation kanssa ANXA1 in syöttösolujen (Fig. 2, A- C). Syöttösolujen ja neutrofiilien näytetään ANXA1 ja FPR2 /ALX immunoreaktiivisuuden solukalvon, sytoplasmaan ja tumaan (Fig. 2, A-F). Ei immunokulta leimaus havaittiin kohdissa, jotka inkuboitiin nonimmune seerumilla (tietoja ei esitetä). Näiden tulehdussolujen, me vahvistanut merkittävästi ylös-säätely ANXA1 ja FPR2 /ALX ilmaisun peritumoraalista ja kasvaimen näytteitä verrattiin vastaavaan kontrolliin kudoksissa (Fig. 2, G-L).

immunoleimaus 10 -nm (FPR2 /ALX) ja 15 nm: n (ANXA1) kolloidisten kultahiukkasten. Syöttösolujen (A-C) ja neutrofiilien (D-F), jotka osoittavat solunosasijaintia ANXA1 (nuolet) ja FPR2 /ALX (nuolenpäät), ja co-localization (käyrä nuolet) on solukalvon, solulimassa ja tumassa (N) ohjaus, peritumoraalista ja kasvaimen kudokset. Tiheys Kultapartikkeleiden konjugoitu ANXA1 ja FPR2 /ALX in syöttösolujen (G-I) ja neutrofiilien (J-L). Data ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM kolloidisten kultahiukkasten per um solukalvon ja per um

2 sytoplasmassa ja tumassa solujen (n = 10 solua per ryhmä). Yksisuuntainen ANOVA seurasi Bonferronin testi paljasti merkittävän eron ryhmien kesken. *

P

0,05, **

P

0,01, ***

P

0,001

vs.

Ohjaus, ##

P

0,01, ###

P

0,001

vs.

peritumoraalista. Värjättiin uranyyliasetaatilla ja lyijusitraatilla. Mittaviivat: 1 um.

kvantitatiivinen analyysi paljasti, että on olemassa suurempi ilmaus ANXA1 ja sen reseptorin sytoplasmassa ja tumassa verrattuna, että solukalvon (Fig. 2, G-L). Kolokalisaation ANXA1 ja FPR2 /ALX havaittiin solukalvon, sytoplasmaan ja tumaan syöttösolujen ja neutrofiilien (Fig. 2, G-L); mutta siellä oli huomattava ero vain solukalvon peritumoraalista neutrofiilien (Fig. 2J).

ANXA1

2-26 Estää FPR2 /ALX-reseptorivälitteisen leviämisen Hep-2 Kurkunpään Cancer Cells

Noin 87%: sta 97%: n Hep-2 solut olivat elinkelpoisia koeolosuhteissa (kontrolli, ANXA1

2-26, ANXA1

2-26 + Boc2, Dexa Dexa + Boc2 ja Boc2) ( S1 Kuva). Kuitenkin kasvukäyrä näiden solujen osoitti merkittäviä eroja tutkituissa olosuhteissa (Fig. 3).

Hoito ANXA1

2-26 vähensi solujen kasvua. Antagonisti Boc2 osittain inhiboi anti-proliferatiivista vaikutusta ANXA1

2-26. Soluja käsiteltiin Boc2 yksinään osoitti tason leviämisen samanlainen kuin ohjaus. Hep-2-soluja siirrostettiin MEM-Earle tiheydellä 2 x 10

6 solua 75 cm:

2 viljelypulloon, ja sitten inkuboitiin seerumittomassa elatusaineessa 24 tuntia, ennen kuin lisättiin of ANXA1

2-26 (1 uM), ANXA1

2-26 (1 uM) + Boc (10 uM) tai Boc (10 uM) yksin. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena kappaleena tulosten varmistamiseksi. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM solujen määrä x 10

6. **

P

0,01 ja ***

P

0,001

vs.

Ohjaus, ##

P

0,01 ja # ##

P

0,001

vs.

ANXA1

2-26 + Boc.

hoito peptidillä ANXA1

2-26 vähensi leviämisen Hep-2 kurkunpään syöpäsolujen kontrolliin verrattuna soluihin (

P

0,001 48 ja 96 tuntia, ja

P

0,01 72 tuntia). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin hoidon jälkeen Dexa ja Dexa + Boc2 (S2 kuvassa). Kuitenkin yhdistelmä hoito ANXA1

2-26 ja Boc2 (ANXA1

2-26 + Boc) merkittävästi täydennetty solujen kasvuun verrattuna ANXA1

2-26-käsitellyt solut (

P

0,001 96 tuntia), mikä osoittaa, että Boc2 heikennetty antiproliferatiivinen aktiivisuus ANXA1

2-26. Boc2 käsiteltyjä soluja oli lisääntymisnopeus joka oli samanlainen kuin kontrolli solut (Fig. 3).

menettäminen ANXA1 /FPR2 Proteiini Kurkunpään Kasvain kudoksia ja Up-regulation jälkeen

In vitro

hoito ANXA1

2-26 Peptide

epiteelisolujen ohjaus, peritumoraalista ja kasvaimen kurkunpään kudoksiin näkyy immunoreaktiivisuus on ANXA1 ja FPR2 /ALX sekä yhteistyössä lokalisoinneissa proteiinien, että solukalvon, sytoplasmaan ja tumaan (Fig. 4, A-C). Vuonna peritumoraalista ja kasvain näytteet, havaitsimme selvää vähenemistä ANXA1 ja FPR2 /ALX proteiinin ilmentymisen verrattuna vastaavaan kontrollisilkkipaperia (Fig. 4, H ja I). Kvantitatiivinen analyysi paljasti, että oli suurempi ekspressio ANXA1 ja sen reseptorin sytoplasmassa ja tumassa, ja alempi ilmaisun solukalvon (Fig. 4, G-I). Erot aste ANXA1 /FPR2 kolokalisaation ei saavuttanut tilastollista merkittävyyttä joukossa kurkunpään näytteistä (Fig. 4, G-I).

immunoleimaus 10-nm (FPR2 /ALX) ja 15 nm: n (ANXA1) kolloidisten kultahiukkasten. (A-C) Epithelial ohjaus, peritumoraalista ja kasvainsolujen kurkunpään kudoksista. (D-E) Hep-2-soluissa, joka esittää immunoreaktiivisuus on ANXA1 (nuolet), FPR2 (nuolenpäät), ja co-lokalisoinneissa (käyrä nuolet) on solukalvon, solulimassa ja tumassa (N). Desmosomeja (avoin käyrä nuolet) havaitaan näiden solujen. (F) puuttuminen immunoreaktiivisuus on ANXA1 ja FPR2 /ALX soluissa inkuboitu nonimmune seerumin. Tiheys kultahiukkasia konjugoitu ANXA1 ja FPR2 /ALX epiteelisoluissa (G-I) ja Hep-2-soluja (J-L). Hep-2-soluja siirrostettiin MEM-Earle tiheydellä 2 x 10

6 solua 75 cm:

2 kasvatuspulloihin, ja sitten inkuboitiin seerumittomassa elatusaineessa 24 tuntia ennen kuin lisättiin ANXA1

2-26 (1 uM) ja ANXA1

2-26 (1 uM) + Boc2 (10 uM). Data ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM kolloidisten kultahiukkasten per um solukalvon ja per um

2 sytoplasmassa ja tumassa solujen (n = 10 solua per ryhmä). Yksisuuntainen ANOVA seurasi Bonferronin testi paljasti merkittävän eron ryhmien kesken. *

P

0,05, **

P

0,01, ***

P

0,001

vs.

Ohjaus, #

P

0,05, ##

P

0,01, ###

P

0,001

vs.

ANXA1

2- 26. Värjättiin uranyyliasetaatilla ja lyijusitraatilla. Mittaviivat: 1 pm.

Hep-2-solut, jotka oli käsitelty ANXA1

2-26 tai ANXA1

2-26 plus Boc2 osoitti immunoreaktiivisuus ANXA1 ja FPR2 /ALX (Fig . 4, D ja E). Kolokalisaation kahden proteiinin havaittiin solukalvon, sytoplasmaan ja tumaan näiden solujen, mutta ei Boc2-käsitellyissä soluissa (Fig. 4, D ja E). Ei kulta merkintää ei havaittu soluissa, jotka inkuboitiin nonimmune seerumin (Fig. 4 F). ANXA1 /FPR2 ilmentymistä säädellä vähentävästi solukalvon mutta lisättiin sytoplasmassa ja tumassa Hep-2-solut (Fig. 4, J-L). Hoito ANXA1

2-26 näytetään säätely ylöspäin ANXA1 ja FPR2 sytoplasmassa ja tumassa verrattuna vastaaviin kontrolli solut (Fig. 4, J-L). Lisäksi havaitsimme huomattavaan vähenemiseen ANXA1 proteiinin ja sen reseptorin jälkeen ANXA1

2-26 + Boc2 hoitoon verrattuna ANXA1

2-26-käsitellyt solut (Fig. 4, J-L).