Krooninen sairaus

tiivistelmä

DLC2 (poistetaan maksasyöpä 2), joka on Rho GTPaasia aktivoivan proteiinin, oli aikaisemmin osoitettu olevan ali-ilmentynyt ihmisen maksasyövän ja on tuumorisuppressoriproteiinia toimintoja soluviljelymalleissa. Olemme syntyy DLC2-hiirillä tutkimaan tuumorisuppressorigeenin rooli DLC2 on hepatokarsinogeneesin ja toiminta DLC2 in vivo. Tässä tutkimuksessa havaittiin, että, toisin kuin homologiset DLC1, joka on välttämätön sikiön kehityksen, DLC2 oli tarpeeton alkion kehitykseen DLC2-hiirissä voisi selviytyä aikuisuuteen. Myös eivät havainneet suurempi ilmaantuvuus maksakasvaimien syntymisen tai diethylnitrosamine (DEN) aiheuttaman hepatokarsinogeneesin in DLC2-hiirillä. Olemme kuitenkin havaittu, että DLC2-hiirillä olivat pienempiä ja oli vähemmän rasvakudoksen kuin villityypin hiirillä. Nämä fenotyypit eivät johdu vähentämistä solun koon tai vika adipogeneesi, kuten havaitaan 190B RhoGAP puutosta hiirimallissa. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että puute DLC2 yksin ei paranna hepatokarsinogeneesin.

Citation: Yau TO, Leung THY, Lam S, Cheung OF, Tung EKK, Khong PL, et al. (2009) Poistettu Liver Cancer 2 (DLC2) oli tarpeeton kehitys ja sen puutos kirjataan ei pahentaa hepatokarsinogeneesin. PLoS ONE 4 (8): e6566. doi: 10,1371 /journal.pone.0006566

Editor: Alfred Lewin, University of Florida, Yhdysvallat

vastaanotettu 7 huhtikuuta, 2009; Hyväksytty: 10. heinäkuuta 2009; Julkaistu: 10 elokuu 2009

Copyright: © 2009 Yau et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimus rahoittivat Hong Kong Research Grants neuvosto General Research Fund (HKU 7436 /04M) ja RGC Collaborative Research Fund (HKU 1 /06C). I.O.L. Ng on Loke Yew professori Pathology. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

maksasolusyövän (HCC) on ensisijainen maligniteetti ja on yksi yleisimmistä syövistä Aasiassa ja Afrikassa. Infektio hepatiitti B tai C virusinfektion ja altistuminen aflatoksiini B1 on hyvin dokumentoitu tärkeimpiä syitä. Kuitenkin taustalla molekyylitason mekanismit johtavat kehittymistä ja etenemistä HCC jäädä epäselväksi.

inaktivointi tuumorisuppressorigeeneille on tunnusmerkki syöpäsoluja. Vuonna pyrkimys tuumorisuppressoreilla mukana hepatokarsinogeneesin, olemme tunnistaneet uuden geenin

DLC2

(poistetaan maksasyöpä 2) kromosomialueen 13q12.3, joka on usein menetetään HCCs [1]. Samanlaisia ​​sen homologi DLC1, DLC2 on ali-ilmentynyt ihmisen HCCs ja on tuumorisuppressoriproteiinia toimintoja viljellyissä soluissa [1], [2].

DLC1 ja DLC2 ovat Rho GTPaasia aktivoivat proteiinit (GAP). Heillä on kolme toiminnallista verkkotunnuksia, katalyyttinen RhoGAP verkkotunnuksen [1], [3], steriiliä alfa motiivi (SAM) proteiinin vuorovaikutus domain [4], [5] ja lipidejä sitovat StAR liittyvien lipidien-siirto (START) domain [6], [7]. Rho perhe GTPaasit on 18 jäsentä, mukaan lukien kolme hyvin tutkittu edustajia, Rac1, RhoA, ja Cdc42. Nämä pienet GTPaasit säätelevät solujen eri signalointireittejä [8], [9]. On ehdotettu, että Rho proteiinit tärkeitä rooleja onkogeenisen välittämä transformaatio Ras ja muiden onkoproteiineja säätelemällä aktiinisytoskeletonin organisaatio, solujen lisääntymisen ja solujen eloonjäämistä [10], [11]. Lisäksi ne stimuloivat kasvainsolun invaasiota ja etäpesäkkeiden [9]. Rho GTPaasia aktivoivia proteiineja (GAP) inaktivoivat ne muuntamalla aktiivisen GTP: hen sitoutuneen tilasta inaktiivinen GDP-sitoutunut yksi aktivaation kautta luontainen GTPaasi-aktiivisuus Rho-proteiinit. GAP on siksi ehdotettu olevan tuumorisuppressoreilla jotka kumoavat onkogeenisiä Rho proteiineja.

On ollut useita rivejä in vitro todisteita tuumorisuppressori rooli näiden kahden Rho GAP proteiineja, DLC1 ja DLC2 [ ,,,0],1], [2], [3], [5], [12], [13], [14], [15], [16]. Eläinmalleja, joita voidaan hyödyntää tutkimaan tuumorisuppressori toiminnot nämä kaksi proteiinia ovat vielä rajalliset. Durkin et ai. [17] on herättänyt DLC1 puutosta hiirimallissa tutkia biologisten toimintojen DLC1. Kuitenkin DLC1 puute johtaa alkion kuolleisuutta mukaan midgestation. Sordella ym [18] osoitti, että alkioita puuttuu p190B RhoGAP oli noin 30% pienempi ja toimitti näyttöä siitä, että tämä väheneminen alkion koko oli pienenemisen vuoksi solun kokoa. He osoittivat myös, että hiiren sikiön fibroblasteja, jotka ovat peräisin näistä alkioista oli puutteellinen adipogeneesi verrattuna villityypin vastine [19].

Tässä tutkimuksessa olemme syntyy DLC2-hiirillä tutkia biologisten toimintojen DLC2 ja sen rooli hepatokarsinogeneesin in vivo. Toisin kuin DLC1 tyrmäys malli, DLC2 oli tarpeeton alkion kehitykseen DLC2-hiirissä voisi selviytyä aikuisuuteen. DLC2-hiirillä ei ilmennyt korkeampi esiintyvyys hepatokarsinogeneesin tai diethylnitrosamine (DEN) aiheuttaman hepatokarsinogeneesin. Kuitenkin DLC2-hiirillä olivat huomattavasti pienempiä ja oli vähemmän rasvakudoksen kuin villityypin hiirillä. Analyysi adipogeneesi of DLC2 puutteesta ja villityypin hiiren alkion fibroblasteja eivät osoittaneet merkittävää eroa niiden välillä. Lisäksi meillä ei havainnut mitään merkittävää eroa solun kooltaan G1 vaiheen DLC2 puutteesta ja villityypin ikuisti fibroblastien virtaussytometrialla.

Materiaalit ja menetelmät

Generation of DLC2-hiirissä

PAC-klooni, joka sisältää hiiren

DLC 2

genomin alueella saatiin Sanger Centre (Cambridge, Yhdistynyt kuningaskunta). Rakentaa hiiren

Dlc-2

geeninkohdennusvektori, 2,8 kb

Eco

RI /

Bam

HI-fragmentti, joka on 3′-eksoni 5, kloonattiin

Eco

RI /

Bam

HI sivustolla pPNT (kuva 1a). Alukepari (eteenpäin, 5′-ttactcgagttgctgatgcacaggtcttc; käänteinen 5′-ttactcgagttctcgtgttaggaatgggg) käytettiin monistamaan genomista aluetta, 2,7 kb kooltaan, ja 5 ’eksoni 5 (kuva 1a). Fragmentti kloonattiin sitten pPNT [20]. Kohdennusvektorin linearisoitiin

Ei

I ja sen elektroporaatiolla AB2.2 alkion kantasolujen (ES) solulinja (129s7 /SvEBrd-HPRT b-m2), ja soluja viljeltiin ES-solujen elatusaineeseen täydennetty G418 ja fialuridine. Resistentit kloonit analysoitiin Southern blottauksella (katso alla) tunnistaa

DLC2

-targeted klooneja.

(a) Kaaviokuva osoittaa geenin kohdistaminen strategiaa. Mustat laatikot eksonit hiiren DLC2 geeni (eksoni numerot kirjoitetaan yläreunassa); harmaa laatikot, DNA-sekvenssi neomysiiniresistenssigeeni on kohdennuskonstruktissa; valkoinen laatikko, DNA-sekvenssi tymidiinikinaasin geenin kohdentamista konstruktin. Restriktioentsyymidigestio sivustot: B, BamHI; Bg, Bglll; E, EcoRI; N, Ncol; Vain diagnostiset restriktiokohdat on esitetty yksinkertaisuuden vuoksi. (B) Southern blot-analyysi. BglII hajotusta tutkittiin 5 ’koetin kuten; koot diagnostisten bändejä: villityypin alleeli, 4,7 kb; kohdennettu alleeli, 5,7 kb. NcoI hajotusta tutkittiin 3 ’koetin kuten; koot diagnostisten bändejä: villityypin alleeli, 9,1 kb; kohdennettu alleeli, 5,7 kb. (C) PCR genotyypitys; koot bändejä: villityypin alleeli, 414 emäsparia; kohdennettu alleeli, 339 emäsparia. (D) RT-PCR havaitsemiseksi DLC2 ilmentymistä sydämen, maksan ja luustolihasten.

Kaikki tutkimukseen liittyy eläimen työtä hyväksyi valiokunnan elävien eläinten käyttö opetuksessa ja tutkimuksessa (Culata) yliopiston Hong Kong. Solut näistä klooneista injisoitiin C57BL /6N blastokysteihin. Kimeerat pariutua C57BL /6N hiiriä, ja jälkeläiset sisältävät

DLC2

-targeted alleelin havaittiin. Hiiret sekavin geneettiset taustat olivat back-ristissä C57BL /6N vähintään viiden sukupolven ajan.

Southern blot -analyysin, PCR genotyypitys ja RT-PCR

Southern blot-analyysi, kaksi koetinta, 5 ’ja 3’ ulkoinen, käytettiin (kuvio 1 a).

Bgl

II hajotus seulottiin 5’anturin ja koot diagnostisten bändit olivat 4,7 kb villityyppisen alleelin ja 5,7 kb kohdennettuja alleelin.

Nc

Oi hajotus seulottiin 3’anturi, ja koot diagnostisten bändit olivat 9,1 kb villityyppisen alleelin ja 5,7 kb kohdennettuja alleelin.

Kaksi paria alukkeet olivat käytettiin PCR genotyypitys. Havaitsemiseksi villityypin alleelin, eteenpäin (5′-AATGGAAGCACCATGTAGCC) ja reverse-aluke 5′-AATGGAAGCACCATGTAGCC) käytettiin, ja odotetun kokoinen PCR-tuotteen 414 ep. Havaitsemiseksi kohteena alleelin, eteenpäin (5′-CTGGGAAGACAGGGAACAAA) ja reverse-alukkeita (5′-GGGGGAACTTCCTGACTAGG) käytettiin, ja odotetun kokoisia PCR-tuotteen ollessa, 339 bp.

semikvantitatiivinen RT PCR-analyysi, valmistettiin kokonais-RNA hiiren kudoksista käyttäen TRIzol reagenssia (Invitrogen). Ensimmäisen juosteen cDNA syntetisoitiin 1 ug kokonais-RNA: sta käyttämällä sattumanvaraisia ​​heksameerejä kanssa GeneAmp RNA PCR Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA). Kaksi ui cDNA: ta käytettiin sitten havaitsemaan ekspressiotasot

DLC1, DLC2

ja

DLC3

käyttäen seuraavia alukkeita: Jos hiiri

DLC1

geenin, forward-aluketta (5 ’- CCCATTCAGTCAGTCCACCTTGA) ja käänteinen aluke (5’GAGTCTCCCTCGTCGGAAAAC) käytettiin; Hiiren

DLC2

geeni, forward-aluketta (5′-GATGAGAAACACAGCCAGCA) ja reverse (5′-GTTGGGTATCTGGACGCACT) käytettiin; Sillä

DLC3

, forward-aluketta (5′-TCCACAGGCAGCCATGCCAG) ja käänteinen aluke (5′-TCTTGCTCAAGATCCTGGGCC) käytettiin. PCR ehto oli seuraava: denaturaatio 95 ° C: ssa 15 minuutin ajan, jota seurasi 25 sykliä (

DLC1

ja

DLC2

) tai 27 kierrosta (

DLC3

) denaturoinnista 30 sekuntia, pariutuminen 55 ° C: ssa 30 sek ajan pidennys 72 ° C: ssa 30 sek ja lopullinen pidennys 72 ° C: ssa 10 min. PCR tuotteet erotettiin 1,2% agaroosigeelissä.

metaboliahäkkiä kokeilu

Hiiriä asutettiin yksittäin metabolisen häkeissä 12:12 tunnin pimeä-valon sykli ja syötettiin

mainos libitum

. Veden ja ruoan kulutus sekä virtsan ja ulosteiden lähtö mitattiin 2 päivää.

Diethylnitrosamine (DEN) hiirten

hepatokarsinogeneesin oli seuraavanlainen. 15 päivän ikäisiä urospuolisia

DLC2

homotsygoottinen hiirten ja villityypin hiiriin ruiskutettiin intraperitoneaalisesti 25 mg /kg DEN steriiliin PBS: ään. 35 viikon iässä, hiiret tapettiin ja niiden maksat otettiin talteen ja tutkittiin. Maksat kiinnitettiin sitten 4% formaldehydiä PBS, upotettiin parafiiniin ja leikattiin 4 um osiot histologista tutkimusta varten.

valmistaminen hiiren alkion fibroblasteja (MEF) ja perustamalla solulinjojen

Raskaana hiiret lopetettiin 13,5 päivää myöhässä yhdynnästä (DPC). Alkiot leikeltiin kohtu, ja extra-alkion kalvot ja sisäelimet poistettiin. Alkiot leikattiin pieniksi paloiksi, ja liotettiin 30 minuutin ajan 4 ml: ssa 0,25% trypsiiniä-EDTA huoneen lämpötilassa. Trypsinisaatiolla inaktivoitiin α-Modified Eagle Medium (aMEM), jota oli täydennetty 10% lämmöllä inaktivoitua FBS: ää, 50 U penisilliiniä ml: aa kohti, ja 50 ug streptomysiiniä millilitrassa. Solut lietettiin pipetoimalla ja läpi siivilä. Standard menetelmiä käytettiin luomaan kuolemattomaksi fibroblastisolulinjat [21]. Lyhyesti, solut siirrostettiin joka 3 päivä DMEM, jota oli täydennetty 10% vasikan seerumia ja antibiootteja tiheydellä 10

6 solua per 10 cm malja. Media muutettiin myöhemmästä päivänä. Vakaa kuolemattomia solulinjoja perustettiin jälkeen 30-50 kohtia.

mittaus solukoko

suhteelliset koot

DLC2

+ /+

ja

DLC2

– /-

solut määritettiin virtaussytometrialla. Lyhyesti, solut BrdU-leimattu FITC BrdU Flow Kit (BD Pharmingen ™, NJ, USA). G1 solupopulaatio oli aidatulla ja eteenpäin valonsironnan (FSC) 5000 G1-soluja määritettiin. FSC käytettiin määrittämään solujen suhteellisen koon.

induktio adiposyyttien erilaistumiseen

induktioon adiposyyttien erilaistumisen, MEF-solut käytettiin kahden kohtia. Induktio adiposyyttien erilaistumisen suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [19]. Soluja viljeltiin 6-kuoppalevyille ja kasvatetaan konfluenssiin. Kaksi päivää myöhemmin, väliaine korvattiin tavallisella erilaistumisen induktion keskipitkän (α-MEM, joka sisälsi 0,5 mM isobutyylimetyyliksantiinin, 1 uM deksametasonia, 5 ug insuliinia per ml, 10% FBS, 50 U penisilliiniä ml: aa kohti, ja 50 ug streptomysiiniä kohden ml, ja elatusaine uusittiin joka toinen päivä. solut indusoitiin 8 päivää ennen analyysiä.

solut kiinnitettiin 10% formaliinilla, huuhdottiin kahdesti fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS), ja värjättiin öljy-Red O värjäytymistä (0,5% öljy-Red O isopropyylialkoholissa liuokseen tislattua vettä [60:40]) 30 minuutin ajan 37 ° C: ssa ja pestiin sitten tislatulla vedellä kolme kertaa. adipogeneesi Oil-Red-O- stained MEF kvantifioitiin mittaamalla valon absorbanssi 510 nM uuttamisen jälkeen isopropyylialkoholiin.

Rhotekin sitoutumismääritys

Solut hajotettiin 500 ul: aan lyysipuskuria, joka sisälsi 50 mM Tris (pH 7,4 ), 10 mM MgCI2, 500 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,1% SDS: ää, 0,5% natriumdeoksikolaattia, 10 ug /ml aprotiniinia, 10 ug /ml leupeptiiniä ja 1 mM PMSF: ää. Lysaatit kirkastettiin sentrifugoimalla 12000 x g: ssä 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa, ja 500 ug kutakin lysaattia inkuboitiin 45 ug GST-RBD (GST-fuusioproteiini, joka sisältää RhoA sitovan domeenin Rhotekin) sitoutunut glutationi-Sepharose -helmiä (Amersham Pharmacia) 1 h. Sitoutumisen jälkeen näytteet pestiin lyysipuskurilla kolme kertaa. Sitoutuneet proteiinit fraktioitiin 12% SDS /PAGE ja immunoblotattu polyklonaalisella vasta-aineella RhoA (Santa Cruz Biotechnology). Kokosolulysaattia analysoitiin myös anti-RhoA-vasta latauskontrollina. Vaikuttavien aineiden pitoisuus RhoA määritettiin normalisoinnin jälkeen kokonaismäärään RhoA läsnä solulysaateista.

immunofluoresenssi

Soluja kasvatettiin peitinlaseja ja huuhdeltiin PBS: ssä, kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä PBS: ssä 15 minuuttia huoneen lämpötilassa, läpäiseviksi 0,5% Triton X-100 PBS: ssä 5 minuutin ajan ja blokattiin 5% naudan seerumin albumiinia PBS: ssä. PBS-pesun jälkeen soluja inkuboitiin sitten paksilliini vasta-aineella (Sigma), jota seurasi FITC-konjugoitu sekundaarinen vasta-aine huoneenlämpötilassa. F-actins värjättiin tetrametyylirodamiini B-isotiosyanaatti-leimattu phalloidin (Sigma) 20 min huoneen lämpötilassa, ja tumat värjättiin DAPI. Solut asennettu Vectashield mikroskooppipreparaatin haalistumista estävää liuosta (Vector Laboratories).

Tulokset

Generation of DLC2-hiirillä

tutkimiseksi funktio DLC2

in vivo

ja rooli DLC2 vuonna hepatokarsinogeneesin, tuottamaamme DLC2-deficent hiirillä. Häiriöt hiiren DLC2-geeni saatiin aikaan homologisella rekombinaatiolla alkion kantasoluja (ES-solut). Kun rekombinaatio, eksonin 5, suurin eksonin

DLC2

geeni, korvattiin neomysiiniresistenssigeeni on kohdistettu vektorin (kuva 1a). Kaksi kohdennettuja ES klooneja käytettiin luomaan DLC2-puutoshiirissä (kuva 1b ja 1c).

DLC2

– /-

hiiret eivät ilmaista

DLC2

mRNA havaittuna RT-PCR valittuihin kudoksiin, sydän, maksa ja luustolihasten (kuva 1d).

DLC2-hiirillä oli anatomisesti normaalit, mutta pienempi ja oli vähemmän rasva rasvaa

Toisin kuin

DLC1

– /-

hiiret, joka kuoli alkutekijöissään,

DLC2

– /-

hiirillä voisi selviytyä aikuisuuteen. Tämä viittaa siihen, että DLC2 on tarpeeton alkionkehityksen. Anatominen analyysi osoitti, että

DLC2

– /-

hiirillä oli normaali (30 viikon ikäisiä), mutta

DLC2

– /-

hiiret olivat pienempiä ja kevyempiä paino (p = 0,01) (kuvio 2a) ja oli vähemmän rasvakudoksessa kuin villityypin hiirissä (p = 0,02) (kuvio 2b 2c). Halusimme sulkea pois sitä mahdollisuutta, että

DLC2

– /-

hiiret voi syödä vähemmän ruokaa kuin

DLC2

+ /+

hiirillä ja tämä saattaa edistää niiden pienemmän kehon kokoon. Siksi suoritettiin metaboliahäkkiä kokeessa tutkimaan, oliko eroja ruoan ja veden kulutusta. Emme kuitenkaan voi havaita merkittäviä eroja ruoan ja veden saanti välillä

DLC2

– /-

hiiret ja

DLC2

+ /+

hiirillä (kuva 3).

(a) paino. (B) paino lisäkiveksen rasvatyynyt. (A) ja (b), keskiarvot ± keskivirhe ja p-arvot on esitetty. P-arvot laskettiin parittomia Studentin t-testiä. (C) edustavien näytteiden lisäkiveksen rasvatyynyt.

(a) elintarvikkeiden saanti, (b) veden saanti, (c) ulosteet lähtö ja (d) virtsaneritystä 24 tunnissa. Keskiarvot ± keskivirheet ja p-arvot näkyvät. P-arvot laskettiin parittomia Studentin t-testillä.

ehtyminen DLC2 ei vaikuttanut solukoko ja adipogeneesi vuonna MEF

p190B RhoGAP puutosta hiiren alkioiden olivat pienempiä kuin luonnossa tyyppi alkioiden ja fibroblasteissa, jotka ovat peräisin p190B RhoGAP puutosta alkiot olivat pienempiä kuin ne, jotka on johdettu villin tyypin alkioiden [18]. Lisäksi, fibroblastit, jotka on saatu p190B RhoGAP puutosta alkiot olivat viallisia adipogeneesi [19]. Siksi tutkittiin, fibroblasteja johdettu

DLC2

– /-

hiiri alkiot olivat pienempiä ja puutteellinen adipogeneesi.

Kuten osoitettu virtaussytometrialla, koko solujen johdettujen alkaen

DLC2

– /-

hiiri alkioita ei ollut merkittävästi erilainen kuin

DLC2

+ /+

hiiri alkioiden (kuva 4a ja 4b). Koska Sordella et ai. [18] osoitti, että AKT polku oli alavirtaan kohteena RhoA, ja tämä johti lopulta laski solukoko fibroblastit, jotka on saatu p190B RhoGAP puutosta alkiot, tutkimme AKT-reitin soluissa, jotka ovat peräisin

DLC2

– /-

ja

DLC2

+ /+

hiiri alkioita. Emme havainneet mitään eroa niiden välillä tämän reitin (kuvio 4c). Osoitimme aikaisemmin, että DLC2 oli RhoGAP; yli-ilmentymisen DLC2 alassäädetty Rho aktiivisuuden hepatoomasolulinjassa linjojen ja johti eston aktiini stressisäikeiden muodostumiseen [2]. Kuitenkin ylössäätöä Rho aktiivisuuden

DLC2

– /-

soluissa ei havaittu (kuvio 4d) ja siellä oli joitakin pieniä, mutta ei merkittävää eroa muodostumiseen aktiini stressin kuituja tai paikallisessa tarttumisessa välillä

DLC2

– /-

ja

DLC2

+ /+

soluja (kuvio 4e). Nämä viittaavat siihen, että saattaa olla muita toiminnallisesti vastaavia proteiineja, jotka voivat kompensoida toimintaa DLC2.

(a) vertailu koot DLC2 + /+ (n = 6) ja DLC2 – /- (n = 6) solut virtaussytometrialla. Eteenpäin valonsironnan (FSC) G1-vaiheen-soluissa määritettynä virtaussytometrialla käytettiin mittaamaan solujen suhteellisen kokoja. Keskiarvot ± keskivirheet ja p-arvot näkyvät. P-arvot laskettiin parittomia Studentin t-testiä. (B) edustavien näytteiden virtaussytometrialla tuloksia. (C) Western blot -analyysi insuliinia saaneilla DLC2 + /+ ja DLC2 – /- soluja. (D) RhoA aktiivisuus DLC2 + /+ ja DLC2 – /- soluja, kuten havaitaan Rhotekin sitoutumismäärityksessä. (E) Aktiinisytoskeletonin ja polttoväli kiinnikkeistä DLC2 + /+ ja DLC2 – /- MEF-solut havaittiin immunofluoresenssivärjäyksen aktiini rasitukseen liittyviä säikeitä (punainen) ja paksilliinin (vihreä), vastaavasti.

sitten tutki adipogeneesi fibroblasteissa johdettu

DLC2

– /-

ja

DLC2

+ /+

hiiri alkioita. Kun

DLC2

– /-

ja

DLC2

+ /+

solut indusoitiin standardin adiposyyttien erilaistumisen induktion välineellä sekä

DLC2

– /

– ja

DLC2

+ /+

solut toimivaltaisia ​​erilaistumaan adiposyyteiksi ja ei merkittävästi eroa rasvantuotantoa määrällisesti (kuva 5).

(a) induktio adipogeneesin suoritettiin DLC2 – /- (n = 6) ja DLC2 + /+ (n = 6), MEF. Induktion jälkeen, MEF värjättiin Oil-Red O, ja tahra uutettiin sitten ja absorbanssi 510 nm: ssä mitattiin. Keskiarvot ± keskivirheet ja p-arvot näkyvät. P-arvot laskettiin parittomia Studentin t-testiä. (B) edustavien näytteiden Öljy-Red O-värjättyä MEF.

ehtyminen DLC2 ei altistaa muodostumista maksakasvaimien eikä pahentaa DEN aiheuttama hepatokarsinogeneesin

Me emme noudata mitään kasvainten muodostumista maksa aikuisen

DLC2

– /-

hiirillä jopa ikä 18 kuukautta. Vastatakseen roolia DLC2 kemiallisissa aiheuttama hepatokarsinogeneesin, käsittelimme 15 päivän vuotias mies

DLC2

– /-

ja

DLC2

+ /+

hiirten DEN . Kun hiiret saavutti 35 viikkoa ikäisiä, ne leikeltiin ja niiden maksat tutkittiin kasvaimen muodostumisen. Havaitsimme, että maksan kasvaimia kehittyi kaikissa hiirissä, joita käsiteltiin DEN. Lisäksi kasvainten määrä muodostuu ja maksimaalinen kasvaimen halkaisijat olivat samanlaisia ​​sekä

DLC2

– /-

ja

DLC2

+ /+

hiirissä (p = 0,79 ja 0,51, vastaavasti) (kuvio 6). Nämä havainnot viittaavat siihen, että DLC2 puute ei pahentaa kemiallisia hepatokarsinogeneesin.

(a) määrä kasvaimia muodostetun maksanvärisillä jälkeen DEN hoidon. (B) koko kasvaimen jota edustaa suurin halkaisija (mm). (A) ja (b), keskiarvot ± keskivirhe ja p-arvot on esitetty. P-arvot laskettiin parittomia Studentin t-testiä. (C) edustaja maksa näytteitä käsiteltiin DEN. Valkoinen nuolet osoittavat kasvaimia. (D) edustaja H & E-värjätyt leikkeet maksan käsitellyt näytteet DEN.

DLC1

ja

DLC3

mRNA: n ekspression DLC2-köyhdytettyä kudosten

Semi-kvantitatiivinen PCR suoritettiin valittu kudoksiin kuten maksa, luuston lihaksia ja sydämissä

DLC2

– /-

ja

DLC2

+ /+

hiiriä 3 kuukauden ikäisten tarkkailla tahansa geeni annostus korvaus muiden DLC jäsenet meidän

DLC2

– /-

hiirillä. Tuloksemme osoittivat merkittävää lisäystä joko DLC1 tai DLC3 näissä kudoksissa

DLC2

– /-

hiirissä (Täydennyskuvio S1). Kokeet suoritettiin itsenäisesti kolmesti.

Keskustelu

Kerrottiin, että DLC1 puutosta alkioita oli hermostoputken vikoja ja kuoli varhain midgestation [17]. Ehdottivat Durkin et al. [17], tämä voi johtua siitä, että ensisijainen toimintahäiriön muiden elinten, kuten sydäntautien. Ryhmämme osoittivat äskettäin, että DLC1 säätelee negatiivisesti Rho /ROCK [22]. Myös suhteellisen korkea ROCK ilmentymistä havaittiin aiemmin kehittyvissä sydämissä alkioiden 7,0-9,0 DPC [23] ja 9,5-11,5 DPC [24]. Tämä viittaa siihen, että DLC1 puute voi häiritä normaalia toimintaa ROCK proteiinien alkion sydämen ja johtaa alkion kuolemaan. Kuitenkin havaittu fenotyypit viittaavat siihen, että DLC1 on kriittinen rooli alkupuolella hiiren kehitystä.

Tässä tutkimuksessa osoitimme, että DLC2 puute ei aiheuta havaittavaa kehityshäiriöitä vikoja, ja DLC2-hiirissä voisi selviytyä aikuisuuteen. Tämä viittaa siihen, että toiminnot DLC2 alkion kehitykseen voidaan kompensoida sen homologi, DLC1, mutta ei päinvastoin. On tavallista, että paralogista geenit korvaavat toiminnot ryhmän jäsenten. Esimerkiksi jäsenet hiiren Hox paralogista ryhmä 3, Hoxa3, Hoxb3 ja Hoxd3, synergistisesti vuorovaikutuksessa säännellä alkion kehityksen annoksesta riippuvalla tavalla [25], [26]. Vaikka DLC2 puute ei johtanut alkion kuolleisuutta, DLC2-hiirillä olivat pienempiä ja oli vähemmän rasvakudos. Kun on osoitettu, että fibroblastit johdettu 190B RhoGAP puutosta alkiot olivat pienempiä [18] ja olivat vähemmän tehokkaita adipogeneesi [19], tutkimme DLC2-puutoshiirissä tähän suuntaan. Emme kuitenkaan havaittu mitään merkittäviä eroja solukoko ja adipogeneesi välillä saaduissa fibroblasteissa

DLC2

– /-

ja

DLC2

+ /+

hiirillä. Myös metaboliahäkkiä kokeilu ei havaittu mitään merkittävää eroa

DLC2

– /-

ja

DLC2

+ /+

hiirillä. Tässä yhteydessä ei voitu sulkea pois sitä mahdollisuutta, että metaboliahäkkiä kokeilu ei ehkä ole riittävän herkkä havaitsemaan pieni ero määrää ravinnon, joka saattaa aiheuttaa havaitun fenotyypin painon. Lisäksi emme voi sulkea pois sitä, että

DLC2

– /-

hiiret voivat olla aktiivisempia ja kuluttaa enemmän kaloreita kuin

DLC2

+ /+

hiirillä.

on osoitettu, että DLC2 lokalisoitu mitokondrioissa ja saattaa olla rooli lipidien kuljetukseen [7]. Lisäksi on ehdotettu, että START domain sisältävän proteiinia, tähti, on olennainen osa steroidi hormonin tuotanto translokaatio kolesterolin ulomman kalvon sisäkalvon mitokondriot steroidien solussa [27]. Koska DLC2 on START verkkotunnuksen sisältävä proteiini ja pystyy paikallistaa mitokondrioissa, se on kiinnostavaa tutkia fysiologista toimintaa DLC2 suhteessa lipidiaineenvaihdunnan sekä steroidi hormoni biosynteesin.

DLC2 oli osoitettu olevan ali-ilmentynyt HCC [1], [2], [28] ja on tuumorisuppressorigeeni toimintoja kuten solujen proliferaatio, Ras aiheuttama pesäkkeiden muodostumisen ja ankkurista riippumaton kasvu [1], [2]. Yksi päätavoitteista on tuottaa DLC2 puutosta hiirillä oli tutkia tuumorisuppressori roolia DLC2 in vivo. Olemme havainneet, että DLC2 puute ei altistaa muodostumista HCC eikä pahentaa DEN-indusoidun hepatokarsinogeneesin. Jälleen tuumorisuppressorigeenin toiminta DLC2 toiminto voidaan kompensoida DLC1. Koska DLC1-hiirillä kuolee alkiovaiheessa, olisi mielenkiintoista nähdä, jos hepatosyyttispesifinen erityinen puute DLC1 voi altistaa sellaiset hiiret kehittämiseen HCC sekä hahmotella roolia DLC2 puute kehittämisessä HCC näissä hiirissä. On osoitettu, että menetys p53 nopeuttaa hepatokarsinogeneesin transgeenisissä hiirissä, jotka yli-ilmentävät c-myc [29]. Olisi informatiivinen rajat DLC2-hiirissä muiden hiirten kasvainten synnyssä, kuten p53 ja /tai transgeenisissä hiirissä yli-ilmentävät onkogeenien, kuten c-myc: n ja TGF-alfan [30]. Vaihtoehtoisesti äskettäin kehitetty järjestelmä Zender et al. voitaisiin hyödyntää tutkia tuumorisuppressori roolia DLC2 vuonna hepatokarsinogeneesin [31]. Tässä järjestelmässä p53-puutosta maksan progenitorisolujen voisi olla tartunnan yhdistelmällä ekotrooppisille retrovirusten kuljettaa c-myc, RAS, AKT ja DLC2. Näin voimme tutkia tarkemmin, ovatko DLC2 on kasvaimia estävä toiminto in vivo.

DLC2 kuuluu jäsenenä DLC proteiinit. Se koodaa RhoGAP verkkotunnuksen korkea sekvenssihomologia DLC perheenjäsenten, DLC1 ja DLC3. Aiemmissa tutkimuksissa osoitimme, että DLC2 tai DLC1 kykeni estämään RhoA aktiivisuutta, joka johti alas aktiinin stressisäikeiden muodostumista. Lisäksi tutkimuksessa Kawai et al osoitti, että DLC3 voisi myös estää RhoA aktiivisuutta sen RhoGAP domain. Ektooppinen ilmentyminen DLC3 HeLa-soluissa laski numerot aktiini rasitukseen liittyviä säikeitä [32]. Tulokset viittaavat siihen, että toiminnallinen roolit DLC1, DLC2 ja DLC3 solulinjoissa ja niiden alavirran efektorien ovat melko samanlaisia. Hiirimallissa, DLC1 ehtyminen oli alkion tappava kun meidän DLC2 hiirten voisi selviytyä aikuisuuteen. Tämä viittaa siihen, että toiminnot DLC2 alkion kehitykseen voidaan kompensoida DLC1 tai DLC3. Kuitenkin meidän semikvantitatiivinen RT-PCR tulos, ei ollut merkittävää kasvua joko DLC1 tai DLC3 että maksa, sydämet ja luuston lihaksia DLC2 hiirten. Tulos viittaa siihen, että fysiologinen taso DLC1 tai DLC3 ilmentyminen voi olla riittävä korvaus DLC2 toimintoja. On mielenkiintoista tuottaa DLC3 hiirten tutkia sen merkitystä sikiön kehityksen tutkia sen toimintaa voidaan kompensoida muilla DLC jäsentä. Lisäksi hiirten tulokset osoittavat, että DLC jäsenet voisi olla erilaiset fysiologiset roolit kehittämiseen. Sen lisäksi, että yhteinen alavirtavaikuttajainhibiittorit (RhoA), saattaa olla muita erilaisia ​​molekyylikohteista on säädetty erikseen tietyn DLC jäsen.

lisäksi tutkimalla tuumorisuppressori roolia DLC2 vuonna HCC, The DLC2-hiirissä voi olla hyötyä tutkimalla muita syöpätyyppejä, kuten downregulation DLC2 havaittiin myös keuhko-, munasarja-, munuais-, rinta-, kohtu-, maha-, paksusuoli- ja peräsuolen syöpiä [33].

tukeminen Information

Kuva S1.

Expression taso DLC1 ja DLC3 in DLC2 – /- ja DLC2 + /+ hiirillä. Semi-kvantitatiivisen PCR: suoritetaan maksa, luuston lihaksia ja sydäntä DLC2 – /- ja DLC2 + /+ hiirillä 3 kuukauden iässä ei havaittu merkittävää eroa mRNA: n ilmentymisen tasoa DLC1 ja DLC3. β-aktiini geeniä käytettiin normalisointi.

doi: 10,1371 /journal.pone.0006566.s001

(0,39 MB TIF) B