Krooninen sairaus

tiivistelmä

peräsuolen syöpä on yksi yleisimmistä syövistä kehittyneissä maissa ja on seurausta sekä ympäristö- ja geneettisen tekijät. Monet geneettisten vaurioiden havaittu peräsuolen syöpä muuttaa ilmentymistä homeobox geenejä, jotka koodaavat homeodomain transkriptiotekijöitä.

MEIS1

homeobox geeni tiedetään mukana useissa hematologisissa maligniteettien ja kiinteitä kasvaimia ja viimeaikaiset tiedot osoittavat, että ilmaus

MEIS1

transkriptio on muuttunut peräsuolen syöpä. Tästä huolimatta potentiaalia yhteydessä tiedetään vähän roolista geenin suolistossa. Me testattiin hiiren maha-suolikanavan kudoksen näytteiden N-pään Meis1 vasta-aine, paljastaa ilmentymisen aikaisemmin kuvatut kaksi isoformeja, samoin kuin kaksi uutta Meis1 tuotteita. 32 kD Meis1 tuote ilmaistu ytimet ei-epiteelisolujen mahassa ja paksusuolen, kun taas 27 kD: n tuote on ilmaistu sytoplasmassa epiteelisolujen proksimaalisessa paksusuolessa. Tuloksemme viittaavat siihen, että 27 kD ja 32 kD Meis1 proteiinit ovat molemmat muotoja Meis1d proteiinin, homeodomeenin-vähemmän isoformi jonka transkripti on aiemmin tunnistettu cDNA näytöissä. Sekä

MEIS1D

transkriptio ja proteiini ilmennettiin ihmisen paksusuolen limakalvolla. Ilmentäminen MEIS1D proteiinin vaimentua 83% (10/12) ensisijaisen peräsuolen syövän näytteitä verrattiin vastaaviin normaaleihin limakalvo, mikä osoittaa, että MEIS1D on biomarkkereiden peräsuolen kasvaimien syntyyn. Vähentynyt ilmentyminen MEIS1D paksusuolen kasvaimissa myös, että tämä konservoitunut homeodomain-vähemmän isoformi voi toimia tuumorisuppressorina ihmisen peräsuolen syövän.

Citation: Crist RC, Roth JJ, Waldman SA, Buchberg AM (2011) konservoitunut Tissue-Specific homeodomain-Less isoformin MEIS1 Is vaimentua sisään peräsuolen syövän. PLoS ONE 6 (8): e23665. doi: 10,1371 /journal.pone.0023665

Editor: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 20, 2011; Hyväksytty: 22 heinäkuu 2011; Julkaistu: 17 elokuu 2011

Copyright: © 2011 Crist et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Institutes of Health [T32-CA09678 RCC, T32-CA09683 jotta JJR] ja National Cancer Institute. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista tämän käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä vastaa noin 10% sekä syövän diagnoosit ja kuolleisuutta Yhdysvalloissa (www.cancer.org). Kuolleisuus on vähentynyt kahden edellisen vuosikymmenen aikana johtuu pääasiassa korkeampi noudattamista suositellaan kolonoskopia näytökset sekä parantunut tehokkuus hoitovaihtoehtoja [1]; kuitenkin, peräsuolen syöpä on edelleen toiseksi korkein kuolleisuus ilmaantuvuus Yhdysvalloissa, perään vain keuhkosyöpään. Kuten monet syöpiin, peräsuolen syöpä on sekä ympäristö- ja geneettiset tekijät [2], [3], [4]. Sekä satunnaista ja perinnölliset muodot taudin liittyy kertyminen useiden geneettisten vaurioiden [5], [6], mikä voi johtaa alentuneisiin apoptoosin [7], menetys solusyklin säätelyssä [8], ja konstitutiivisen aktivaation

WNT

signalointireitin [9]. Säätelijöinä loppupään transkription aktivaation, transkriptiotekijät usein väärin säädellystä kolorektaalisyövässä [10], [11].

Homeobox koodaavat proteiineja DNA sitovia alueita kutsutaan homeodomains. Nämä homeodomain proteiinit toimivat transkriptiotekijöitä sitovia promoottorialueet ja aktivoimalla transkription [12].

HOX

geeni perheenjäsenet ovat prototyyppiseen homeobox geenejä.

HOX

geenit osallistuvat alkion segmentointia ja kuviointi sekä kehittämään lukuisia elinjärjestelmien, kuten maha-suolikanavan [12]. Developmental geenit ovat usein ektooppisesti ilmaistaan ​​aikana syövän synnyn [13] ja useita

HOX

geenejä on yhdistetty peräsuolen syöpä.

HOXB6

,

HOXB8

,

HOXC8

,

HOXC9

, ja

HOXD13

yliekspressoituvat molemmissa peräsuolen syövän solulinjoja ja ensisijainen paksusuolen kasvaimet [14], [15], [16].

HOXB13

kuitenkin normaalisti ilmaistaan ​​paksusuolen limakalvolla, mutta on vaimentua kasvainkudoksessa [10]. Vapautuminen ei-

HOX

homeobox geenit on havaittu myös peräsuolen karsinoomat.

CDX1

ja

CDX2

ovat vaimentua aikana peräsuolen syövän synnyn [17], [18], kun taas poikkeava

PROX1

ilmentymistä paksusuolessa johtaa lisääntyneeseen dysplasia [19].

homeodomain transkriptiotekijöiden usein sitoutuvat promoottorialueille joko homodimeerisissä tai heterodimeerinen kompleksit [20]. Tämä dimeroituminen tarjoaa lisääntyneen spesifisyys transkription aktivaation [21]. MEIS1 homeodomain proteiini on tunnettu sitomiskumppanin useiden muiden homeodomain proteiineja, kuten HOXA7, HOXA9, ja PBX1 [22].

MEIS1

on rooli normaalia kehitystä hematopoieettisperäisiä ja yli-ilmennetään osajoukko akuutin myeloidileukemiat [23]. Lisääntynyt

MEIS1

ilme on havaittu myös varhaishermosolukasvaimesta ja ilmentymistason

MEIS1

transkriptio on prognostinen indikaattori rintasyövässä [24]. Downregulation yhteensä

MEIS1

transkripti havaittiin peräsuolen adenoomien, mikä viittaa rooli

MEIS1

suolen kasvainten synnyssä [25].

Koska yhteyksiä homeobox geenien ja peräsuolen syöpä, tutkimme tila Meis1 paksusuolessa. Tässä tutkimuksessa kuvaamme kaksi uutta Meis1 tuotteita ilmaistaan ​​hiiren maha-suolikanavan. Nämä kaksi proteiinia ilmennetään eri solutyypeissä ja subsellulaaristen. Molemmat proteiinit on käännetty

Meis1d

transkriptio, homeodomeenin-vähemmän silmukointimuunnosta

Meis1

.

MEIS1D

, ihmisen homologi

Meis1d

, tunnistettiin normaalissa ihmisen koolonin kudosta sekä mRNA: ta ja proteiinia tasolla. Lisäksi huomaamme downregulation

MEIS1D

ilmentymistä ihmisen kolorektaalisyövissä. Nämä tiedot viittaavat siihen, että

MEIS1D

on uusi vaimennin ja peräsuolen kasvaimen kehittymisen ja mahdollinen terapeuttinen kohde paksusuolen syöpä.

Materiaalit ja menetelmät

Mouse pesäkkeitä

C57BL /6J (B6) hiiret saatiin Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Hiiret ylläpidetään AALAC akkreditoimaton TJU eläin laitokseen. Tutkimus toteutettiin tiukasti mukaisesti suosituksia Opas hoito ja käyttö Laboratory Animals of National Institutes of Health. Protokolla, 343C, hyväksyttiin Institutional Animal Care ja käyttö komitean Thomas Jefferson University, luvan numero A3085-01.

Retrovirusinfektio

HCT116-solut saatiin American Type Culture Collection (Cat. No. CCL-247), jossa identiteetti solulinja vahvistettiin STR-analyysi. MSCV-

Meis1d

ja MSCV-

Neo

transfektoitiin Phoenix-soluihin käyttäen Profection kalsiumfosfaatti kit (Promega, Madison, WI). Soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa 24 tunnin ajan tuottaa viruksen media. Viral media lisättiin HCT116-solut kuuden kuoppalevyille ja sentrifugoitiin 1800 rpm: llä 45 minuutin ajan. Sitten soluja inkuboitiin 32 ° C: ssa 3 tuntia, viruksen väliaine poistettiin, ja uusi virus median lisättiin. Soluja sentrifugoitiin jälleen 1800 rpm 45 minuutin ajan ja inkuboitiin 32 ° C: ssa 3 tuntia. Viral elatusaine korvattiin DMEM: llä, ja solut siirrettiin 37 ° C: ssa 48-72 tunnin ajan, jotta käännös siirretyn sekvenssin.

Western blot-analyysi

B6-hiiriin 120 päivän iässä lopetettiin CO

2 tukehtumisen seuraa niskanmurrolla. Kudosten ja solujen näytteet pestiin 1 x PBS: ssä ja homogenisoitiin lyysipuskurissa (50 mM Tris-HCl, pH 7,4; 150 mM NaCl; 2 mM EDTA; 10% glyseroli; 1% Triton-X-100), proteaasi-inhibiittorit (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Proteiini kvantifioitiin käyttämällä Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). 20 ug kutakin näytettä erotettiin SDS-PAGE: lla (10% akryyliamidi) ja siirrettiin nitroselluloosamembraaneille. Membraanit blokattiin 5% rasvatonta kuivamaitoa 1 x TBST: ssä (20 mM Tris-HCl, pH 7,4; 150 mM NaCl; 0,05% Tween 20). Ensisijainen vasta-aineita käytettiin yön yli 4 ° C: Meis1-N; Meis1d-C; GAPDH (Abcam, Cambridge, MA); aktiini, histoni H1, ja sytokeratiinin 18 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Piparjuuriperoksidaasi-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (Vector Laboratories, Berlingame, CA) käytettiin yhdellä 1:2500 laimennus 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Proteiinit saatiin näkyviin käyttäen SuperSignal kemiluminesenssisubstraatilla (Thermo Scientific, Rockford, IL).

Solunosafraktiointi

kudosten ja solujen näytteet pestiin 1 x PBS: ssä ja homogenisoitiin lyysipuskurissa (10 mM Tris- pH 7,4; 5 mM MgCl

2; 1 mM DTT; 1 mM PMSF) proteaasinestäjien kanssa (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Lysaatit sitten seulan 25½g neulan ja sentrifugoitiin 600 x g: llä 4 ° C: ssa 10 min. Supernatantti merkitty sytoplasminen osa. Pelletti suspendoitiin uudelleen hajotuspuskuriin ja merkitty tumafraktios-.

epiteelisolujen eristäminen

proksimaalinen ja distaalinen paksusuolen näytteet leikattiin 1 mm leveää. Näytteitä inkuboitiin 1 x PBS: 0,15% DTT 30 minuuttia huoneenlämpötilassa sekoittaen jatkuvasti by sekoita bar poistaa limaa. Limakalvon nauhat ja sekoitussauvalla pestiin 1 x PBS: ssä ja sitten inkuboitiin 1 x PBS, 1 mM EDTA, pH 7,2 60 minuutin sekoittamisen huoneen lämpötilassa poistamiseksi epiteelisoluihin. EDTA-liuosta otettiin talteen ja sentrifugoitiin 470 x g: ssä 5 min. Jäljellä kudosta inkuboitiin EDTA-liuosta jäännöksen poistamiseksi epiteelisoluihin ja sitten homogenisoitiin lyysipuskurissa kuten edellä on kuvattu. Epiteeli- Pelletti suspendoitiin uudelleen RPMI 1640 ja inkuboitiin kollagenaasi (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 50 yksikköä /ml 30 min ajan 37 ° C: ssa, vorteksoimalla kevyesti viiden minuutin välein. Näytteet sentrifugoitiin 200 x g: ssä 5 min. Pelletti suspendoitiin uudelleen 1 x PBS: llä, sentrifugoitiin uudelleen ja suspendoitiin uudelleen RPMI. RPMI Solususpensio päällekkäin 50% Percoll /PBS seoksen. Percoll-gradientti sentrifugoitiin 470 x g 20 minuutin ajan. Epiteelisolujen otettiin gradientin päälle, laimennettiin RPMI, ja sentrifugoitiin 830 x g: ssä 5 min. Solupelletti suspendoitiin uudelleen RPMI: hin ja sentrifugoitiin uudelleen 470 x g 5 min. Lopullinen Solupelletti homogenisoitiin western blot lyysipuskuria käyttäen 25½g neulaa.

RT-PCR

Tissue homogenisoitiin 1 ml TRI Reagent Solution (Ambion, Inc., Austin, TX) ja sentrifugoitiin 12000 x g: ssä 15 minuutin ajan 4 ° C: ssa. 200 ui kloroformia lisättiin. Näytteitä sekoitettiin 15 sekunnin ajan, inkuboitiin huoneen lämpötilassa 3 minuutin ajan, ja sentrifugoitiin 12000 x g 20 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Pintakerros sekoitettiin 500 ui 2-propanolia, inkuboitiin huoneen lämpötilassa 10 minuutin ajan, ja sentrifugoitiin 12000 x g 20 minuutin ajan 4 ° C: ssa. RNA-pelletti pestiin 75% etanolilla ja sentrifugoitiin 7500 x g: ssä 5 min. Tämän jälkeen RNA kuivattiin ilmassa ja suspendoitiin uudelleen DEPC-käsiteltyyn veteen. SuperScript II Reverse Transcriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA) käytettiin tuottamaan cDNA: ta. Kaikki Meis1 transkriptien monistettiin hiiren näytteissä, kun taas MEIS1D-spesifisiä alukkeita käytettiin ihmisestä otetuista näytteistä.

immunohistokemia

Kudokset fiksattiin Formalde-Fresh 10% puskuroituun formaliiniin liuosta (Fisher Scientific) yön yli 4 ° C: ssa ja varastoidaan 70% EtOH. Kiinteä kudokset upotettiin parafiiniin ja kudoksissa leikattiin ja asetettiin lasilevyille, joita KCC translaatiotutkimuksen Core Facility. Kudokset poistettiin parafiini käyttäen sitraatti- puskuria, pH 6,0 (Vector Laboratories, Berlingame, CA) ja värjättiin Meis1-N-vasta-ainetta yli yön 4 ° C: ssa. Anti-kani sekundääristä vasta-ainetta (Vector Laboratories, Burlingame, CA) käytettiin yhdellä 1:200 laimennus 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa, jota seuraa ABC Linker Kit (Vector Laboratories, Berlingame, CA) 30 minuutin ajan 37 ° C: ssa. Näytteet kehitettiin käyttämällä DAB-Peroxidase Substrate Kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Värjäys tehtiin näkyväksi Nikon Eclipse E600 mikroskoopilla joko 4 x tai 20 x suurennus.

Ethics

Potilaat suostumuksensa käyttämällä kirjallista kirurginen suostumuslomakkeen jossa todetaan jäte leikkauksesta käytettäisiin tutkimustarkoituksiin. Kaikki näytteet saatiin Thomas Jefferson University Hospital. Thomas Jefferson University Institutional Review Board (IRB) vapautettu tämän tutkimuksessa tarkastelun koska ne katsotaan, että tutkimuksessa ei ole ihmiskoe ja luopua tarvetta suostumuksen johtuu siitä, että näytteet sai koodattiin poistamiseksi tunnistamiseen.

tulokset

Kaksi novel Meis1 isoformeja on läsnä hiiren ruoansulatuskanavassa

Vaikka downregulation

MEIS1

ihmisen peräsuolen syöpä on viime aikoina havaittu, rooli geenin ruoansulatuskanavan (GI) homeostaasiin ja kasvaimen kehittymisen ymmärretään huonosti. Ekspression määrittämiseksi hiiren Meis1 isomuotojen ruoansulatuskanavasta, western blot suoritettiin C57BL /6J (B6) GI lysaatit käyttäen polyklonaalista vasta-ainetta suunnattu N-päähän Meis1 (Meis1-N). Tuotteet 43 kD ja 51 kD havaittiin useimmissa näytteissä (kuvio 1a). Nämä molekyylipainot vastaavat tunnetun koot aikaisemmin kuvatut kaksi isoformit, Meis1a ja Meis1b, vastaavasti. Kaksi lisävyöhykettä havaittiin joissakin näytteissä a ~32 kD proteiinin läsnä mahassa ja paksusuolen ja ~27 kD proteiini, joka ilmentyy proksimaalisessa paksusuolessa ja umpisuoli (kuva 1a). ~27 KD tuote on sama kuin ennustettu paino Meis1d, toinen Meis1 isoformi. Otteen varten

Meis1d

aiemmin havaitut ruuduilla hiiren cDNA [26], [27]. Isoentsyymi puuttuu kaikki eksonin 8, mikä johtaa ennenaikaisen lopetuskodonin eksonissa 9 ja teoreettinen katkaistun proteiinin tuotteen (kuvio 1 c, d). Olemassaolo

in vivo

proteiinia tuote, mutta ei ole koskaan vahvistettu.

A) Western blot-analyysi B6 ruoansulatuskanavan lysaatit käyttäen Meis1-N-aine. GAPDH: ta käytettiin latauskontrollina. PSI, MSI, ja DSI osoittavat lysaatit proksimaalisesta, keskimmäinen ja distaalinen ohutsuoli, vastaavasti. PC ja DC osoittavat lysaatit proksimaalisesta ja distaalisesta kaksoispisteet. B) monistaminen

Meis1

isoformien B6 proksimaalisesta paksusuolen ksi käyttäen RT-PCR. Kaaviot C) selostukset ja D) tuotteet Meis1a, Meis1b, ja Meis1d isoformit sisältyvät. Sijainnit kaksi Meinox domeenit (M1 ja M2) ja homeodomeenin (HD) on merkitty.

Meis1d, katkaistun Meis1 isoformin, ilmaistaan ​​hiiren umpisuoli ja proksimaalinen paksusuolen

Jos 27 kD Meis1 tuote on Meis1d, niin

Meis1d

transkriptio pitäisi olla havaittavissa proksimaalisessa paksusuolessa. Sen määrittämiseksi,

Meis1d

transkripti on läsnä,

Meis1

silmukointivarianteista monistettiin B6 proksimaalisesta paksusuolen cDNA näytteitä RT-PCR. Alukkeet suunniteltiin monistamaan poikki eksonin 8, erottaa

Meis1d myynnissä maassa täyspitkä isoformit,

Meis1a

ja

Meis1b

. PCR-reaktio monistetut tuotteet on noin 758 ja 904 emäsparin pituinen, ennustettu koko tuotteiden

Meis1d

ja

Meis1a /b

selostukset (kuva 1b). Kokoero kaksi tuotetta vastaa pituudeltaan tunnettuun eksonin 8 (146 bp), mikä viittaa siihen, että pienemmät tuote puuttuu, että eksoni. Uuttaminen ja sekvensointi pienempi PCR-tuote on vahvistettu, ettei eksonin 8 PCR-tuotetta (tuloksia ei ole esitetty), mikä osoittaa, että läsnä on

Meis1d

transkripti hiiren proksimaalisessa paksusuolessa.

Removal eksonista 8 alkaen

Meis1d

transkriptio aiheuttaa lukukehyksen eksonissa 9. tuloksena tästä kehyksenvaihdon on tuotannon katkaistun proteiinituotteen viisi novel aminohappojen C-päässä (kuvio 1 d). Koska nämä tähteet eivät ole läsnä täyspitkä Meis1 isoformit, mukautetun vasta-aine on kohdistettu ainutlaatuinen epitooppi (Meis1d-C) muodostettiin. Sen määrittämiseksi, mukautetun vasta-aine tunnistaa ~27 kD Meis1 tuote, paksusuoli lysaatit B6 hiiriin koetettiin Meis1d-C ja Meis1-N-vasta-aineita. Proksimaalinen paksusuolen ja distaalisen paksusuolen lysaatit käytettiin positiiviset ja negatiiviset kontrollit, vastaavasti. Kuten odotettua, Meis1-N-vasta-aineen poimi aiemmin tunnistettu ~27 kD: n vyöhyke proksimaalisessa paksusuolessa, mutta ei distaalisen paksusuolen (kuvio 2a). Sama ekspressiokuvio havaittiin näytteissä koettimena Meis1d-C-vasta-aine, mikä osoittaa, että Meis1d-C-vasta-aine havaitsee ~27 kD Meis1 tuotteen osoittaa, että tuote on Meis1d (kuvio 2a). Määrittämään spatiaalisen ekspressiokuvion Meis1d proteiinin, lysaatit paneelista B6 elinten koettimena Meis1d-C-vasta-aine. Meis1d ilmentyminen rajoittui umpisuoli ja proksimaalinen paksusuolen (kuva 2b, c).

A) Western blot-analyysi B6 läheisten ja etäisten paksusuolen lysaatit kanssa Meis1-N ja Meis1d-C-vasta-aineita. Kannat Meis1, Meis1b, ja kaksi uutta Meis1 tuotteet on merkitty. B) ja C) Lysaatit paneelin B6 elinten koettimena Meis1d-C-vasta-aine. GAPDH: ta käytettiin latauskontrollina.

käännösten jälkeinen muutos Meis1d korreloi solunosasijaintia

homeodomain vähemmän isoformeja muista homeodomain proteiinien on osoitettu toimivan kahden mekanismin kautta. Homeodomain-vähemmän proteiinit voivat sitoa täyspitkä isoformit sytoplasmassa kautta hallitseva negatiivinen vuorovaikutusta. Homeodomain vähemmän isoformit voivat myös toimia ydin- sitovia kumppaneita muille transkriptiotekijät, muuttavat aktivaation alavirran kohdegeenien. Siksi solunosasijaintia Meis1d voi ilmoittaa toiminnallista roolia isoformin paksusuolessa. Voit selvittää solunosasijaintia Meis1d, B6 proksimaalisessa paksusuolessa lysaatit erotettiin ydin- ja sytoplasman jakeet ja tutkittiin Meis1-N-aine. Kuten odotettua, täyspitkät Meis1 oli läsnä tumafraktios- (kuvio 3a). 32 kD Meis1 tuote oli myös läsnä tumassa. 27 kD: n Meis1d proteiinia, kuitenkin, havaittiin ainoastaan ​​sytoplasman osa (kuva 3a). Nämä lokalisointi tiedot osoittavat, että Meis1d ei toimi transkriptiotekijän tai ionikomplekseja täyspitkä Meis1 ulkopuolella tumaan, mikä viittaa siihen, että isoformi on uusia sytoplasminen toimintoja.

A) B6 proksimaalinen paksusuolen näytteet erotettiin ydin- ja sytoplasmisen jakeet ja koetettiin Meis1-N-vasta-ainetta. Histoni H1 käytettiin vahvistamaan subsellulaarifraktiointikokeet. B) Western blot-analyysi B6 proksimaalinen paksusuolen ja HCT116-solut, jotka ilmentävät Meis1d ORF käyttäen Meis1-N-vasta-ainetta. C) HCT116-solut retroviraalisesti infektoitiin Meis1d ORF tai tyhjän MSCV vektorin. Solut otettiin 72 tuntia infektion jälkeen, fraktioitiin, ja koettimena Meis1-N-vasta-ainetta. Kannat Meis1a, ydin- Meis1d (Meis1d

32), ja sytoplasman Meis1d (Meis1d

27) on merkitty tarvittaessa.

vaikutusten tutkimiseen

Meis1d

ilme

in vitro

, avoin lukukehys (ORF)

Meis1d

oli retroviraalisesti tartunnan osaksi HCT116 koolonisyöpäsolulinja. Western blot-analyysi solulysaateista paljasti, että läsnä on 32 kD: n proteiinia, joka havaittiin, että Meis1-N-vasta-aine, mutta ei Meis1d-C-vasta-ainetta (kuvio 3b). Tämä

in vitro

Meis1d tuote on -5 kD suurempi kuin odotettua 27 kD proteiinia ennusti Meis1d otteen ja havaittiin

in vivo

(kuva 3b). Kuitenkin molekyylipaino vastaa uuden 32 kDa: n Meis1 isoformi aiemmin havaittu B6 mahan ja paksusuolen lysaatit (kuva 1a). Molekyylipaino

in vitro

Meis1d vahvistettiin sekä hiiren 3T3 ja apinan Cos-1-solut, mikä osoittaa, että lisääntynyt koko ei ole solulinja erityisiä (tuloksia ei ole esitetty). Translaation jälkeinen muuttaminen

in vitro

Meis1d tuote voi olla syy kohonneeseen molekyylipaino, sekä kyvyttömyys Meis1d-C-vasta-aineen havaitsemiseksi proteiinia.

Toisin kuin 27 kD Meis1d tuote, 32 kD Meis1 isoformi on tumassa proksimaalisen paksusuolessa. Sen määrittämiseksi, onko

in vitro

Meis1d myös tumassa, HCT116-solut, jotka ilmentävät Meis1d fraktioitiin. 32 kD

in vitro

Meis1d tuote oli läsnä ydin- lysaateissa, pääpiirteittäin

in vivo

solunosasijaintia romaanin 32 kD isoformin (kuvio 3c). Nämä tiedot viittaavat siihen, että sekä 27 kD: n ja 32 kD: n Meis1 isoformit havaittiin hiiren maha-suolikanavan on käännetty

Meis1d

transkriptio. Sytoplasmisen muoto (Meis1d

27) on ennustettu molekyylipaino Meis1d, kun taas ydinvoiman muodossa (Meis1d

32) on suurempi, todennäköisesti johtuu posttranslational muutokseen.

Nuclear ja sytoplasman Meis1d ovat toisensa poissulkevia paksusuolessa

kaksoispiste koostuu yksikerroksinen epiteelisolujen kattaa lamina propriassa ja useiden lihasten kerroksia. Paksusuolen syöpä on peräisin kantasoluista sijaitsee epiteelikerroksen [28]. Sen määrittämiseksi, onko joko Meis1d

27 tai Meis1d

32 ilmaistaan ​​paksusuolen epiteelin, epiteelisolut eristettiin B6 proksimaalisen ja distaalisen paksusuolen näytteitä. Lysaatit eristetyistä epiteelisolujen ja lamina propria /lihas kerrokset koetettiin Meis1-N-aine. Meis1d

27-proteiinia ekspressoitiin ainoastaan ​​epiteelisoluissa proksimaalisen paksusuolen (kuvio 4a). Meis1d

32, kuitenkin, on ilmaistu lamina propriassa /lihaksen kerrokset sekä proksimaalisen ja distaalisen paksusuolen (kuvio 4a). Täyspitkä Meis1 isoformit, Meis1a ja Meis1b, oli myös läsnä vain lamina propria /lihas näytteet (kuvio 4a). Nämä tiedot osoittavat, että ydin- ja sytoplasman muodot Meis1d eivät ole läsnä samassa solussa väestön hiiren paksusuolen. Lisäksi Meis1d

27 ilmaistaan ​​paksusuolen epiteelisoluissa puuttuessa täyspitkä Meis1. Edelleen vahvistaa epiteelisolujen ilmentymisen Meis1d

27, B6 paksusuolen näytteet värjättiin Meis1-N-vasta-ainetta. Vahva sytoplasminen värjäytyminen havaittiin epiteelin proksimaalinen paksusuolen, mutta ei distaalisen paksusuolen (kuvio 4b). Tämä ekspressiomalli on yhteenveto ilmentymisen Meis1d

27, jälleen viittaa siihen, että Meis1d

27 on läsnä epiteelisoluissa proksimaalisen paksusuolessa.

A) B6 proksimaalisten ja distaalisten paksusuolen näytteet erotettiin epiteelin ja ei-epiteelin jakeet. Ei-epiteelisolujen jakeet koostuvat lamina proprian ja lihasten kerrokset paksusuolen. Fraktiot ja kokosolulysaateista sekä paksusuolen segmenttien koettimena Meis1-N-vasta-ainetta. Cos-1-solut, jotka ekspressoivat Meis1d käytettiin vertaamaan

in vitro

ja

in vivo

molekyylipainot Meis1d

32. B) B6 proksimaalisten ja distaalisten paksusuolen näytteet värjättiin Meis1-N-aine. Värjäys tehtiin näkyväksi 20-kertaisella suurennuksella.

ilmentäminen MEIS1D proteiini vaimentua ihmisen paksusuolen ja peräsuolen syöpiä

Meis1 on erittäin hyvin säilynyt eukaryooteissa ja poisto eksonin 8 ihmisen MEIS1 mRNA olisi koodata ennustetun proteiinituotteen kanssa 99% homologia hiiren Meis1d. Perustuen evoluution suojelusta Meis1, yritimme luonnehtia ilmentymisen MEIS1D ihmisen paksusuolen. Western blot suoritettiin ihmisen paksusuolen lysaatit käyttäen Meis1-N-aine. Bändi ennustettu koko MEIS1D

27 havaittiin ihmisen paksusuolen näytteissä (kuvio 5b). Vahvistaa ilmentymisen MEIS1D transkriptin, RT-PCR suoritettiin ihmisen koolonin cDNA: n (kuvio 5a). 758 emäsparin kaistan monistettiin, mikä osoittaa, että

MEIS1D

mRNA transkriboidaan ihmisen paksusuolen.

A) RT-PCR-monistus

MEIS1D

transkriptio ihmisen paksusuolen cDNA. B) Western blot -analyysi lysaatit ihmisen paksusuolen ja peräsuolen kasvaimista (T) ja vastaaviin normaaleihin limakalvo (N) käyttäen Meis1-N-vasta-ainetta. GAPDH: ta käytettiin latauskontrollina. Näytteet edustavat kaikki neljä osa ihmisen paksusuolen: nouseva, poikittainen, laskeva, ja sigmasuolen.

Expression of täyspitkä MEIS1 tiedetään väärin säädellystä useita kiinteitä kasvaimia [29], [30]. Voit selvittää tilan MEIS1 kolorektaalisyövässä, western blotit suoritettiin vastaaviin normaaleihin paksusuolen ja ensisijainen peräsuolen kasvain lysaatit käyttäen Meis1-N-aine. MEIS1A ja MEIS1B ilmaistiin sekä kasvaimen ja normaali näytteitä, kun taas MEIS1D

32 ei ollut läsnä joko joukko näytteitä (tuloksia ei ole esitetty). Kuitenkin 83% (10/12) normaalin paksusuolen limakalvon näytteet ilmaisivat havaittavaa MEIS1D

27-proteiinin (kuvio 5b). Ilmentyminen vähentää tai täysin menetetty kaikki vastaavat kasvaimen näytteet näistä potilaista (kuvio 5b). Loput kaksi potilasta ilmaistuna havaitsemattomia tasoja MEIS1D

27 sekä normaali limakalvo ja kasvainkudoksen (kuvio 5b). Nämä

in vivo

tiedot osoittavat, että MEIS1D

27 ilmentyminen säädeltiin vähentävästi aikana suoliston tuumorigeneesin.

Keskustelu

vaihtoehtoinen silmukointi tiedetään tuottavan kaksi

Meis1

isoformit,

Meis1a

ja

Meis1b

, sekä hiirillä että ihmisillä. Sekä Meis1a ja Meis1b proteiinit ovat koko pituudeltaan, jotka sisältävät kaksi Meinox meenit, jotka osallistuvat proteiini-proteiini-vuorovaikutusten ja DNA: ta sitovien homeodomain (kuvio 2d). Proteiini tuotteita Näiden silmukointivarianttien eroavat C-pää, koska silmukoimalla ulos eksonin 12 pois

Meis1b

koodaus sekvensoinnilla (kuvio 2c, d). On näyttöä siitä, että kahta samanlaista isoformia voi aktivoida transkriptio eri osa geenien [31]. Näytöt cDNA-kirjastojen osoittavat, että suuri määrä muita vaihtoehtoisesti silmukoituja transkriptit tuotetaan

Meis1

lokukseen [26], [27], [32]. Toisin kuin

Meis1a

ja

Meis1b

kuitenkin proteiineja muut

Meis1

selostukset ei ole havaittu

in vivo

. Siksi on epäselvää, ovatko nämä selostukset ovat toiminnallisesti merkitykselliset tai yksinkertaisesti esineitä syntyy väärä vaihtoehtoisen silmukoinnin.

Tässä artikkelissa olemme kuvanneet kaksi proteiinituotteiden

Meis1d

silmukointivariantti, isomuotoa aikaisemmin tunnistettu cDNA näytöissä.

Meis1d

transkriptin puuttuu eksoni 8, tuloksena on ennustettu 27 kDa: n proteiinia, josta puuttuu homeodomeenin (kuvio 2c, d). Tämä 27 kD: n tuote havaittiin sytoplasmassa proksimaalisen paksusuolen epiteelisolujen (kuviot 3a, 4a). Toinen, 32 kD Meis1d tuote esiintyy tumissa ei-epiteelisolujen mahalaukun ja paksusuolen (kuviot 3a, 4a). Sytoplasmisen ja ydin- muotoja Meis1d on nimetty Meis1d

27 ja Meis1d

32, vastaavasti. Mitä suurempi molekyylipaino ja ydinvoiman lokalisoinnin Meis1d

32-proteiinin toisteta transfektoitujen solujen

Meis1d

ORF (kuva 3b). Expression of MEIS1D

27 ihmisen paksusuolen näytteissä havaittiin myös, osoittavat evoluution säilyttäminen tämän uuden isoformin (kuva 5).

Meis1d

on vasta kolmas

Meis1

isoformin, jolle käännettynä proteiinituotteen on vahvistettu ja on myös ensimmäinen homeodomeenin-vähemmän Meis1 tuote kummassakaan hiirillä tai ihmisen kudoksia.

homeodomain vähemmän isoformien on kuvattu monia homeobox-geenien, mukaan lukien useat jäsenet HOX-perheen. Vain muutama näistä isoformien, kuitenkin, on tunnistettu TALE superperheen geenien ryhmä, johon kuuluvat Meis1. Menetys homeodomeenin estää suoran sitoutumisen DNA kohdesekvenssien ja normaali transkription aktivaation. Homeodomain vähemmän isoformeja TALE transkriptiotekijöiden, kuitenkin, on aiemmin osoitettu vielä transkription säätelemiseksi kahden erillisen mekanismeja. Katkaistun isoformit voivat olla vallitsevia negatiivisia vaikutuksia, metalleja sitovia täyspitkät proteiinit sytoplasmassa ja estää transkription aktivoitumisen loppupään tavoitteet [33], [34]. Homeodomain-vähemmän proteiinit voivat myös olla vuorovaikutuksessa epäsuorasti DNA sitomalla muut transkriptiotekijät muodostaa heterodimeerejä. Läsnäolo katkaistun proteiinien muuttaa DNA-sitoutumiskohta proteiinin kompleksin aktivointi erillistä osajoukon loppupään tavoitteet [35].

Koska homeodomain vähemmän isoformeja liittyvien geenien on erilaiset mekanismit sytoplasmassa ja tumassa, solunsisäisen lokalisoinneissa Meis1d ja mahdolliset sidoskumppanien voi ehdottaa solujen toiminnan. Esillä olevassa tutkimuksessa, Meis1d havaittiin joko tumassa tai sytoplasmassa riippuen solutyypistä. Meis1d

27 ilmaistaan ​​sytoplasmassa proksimaalisen paksusuolen epiteelisolujen (kuviot 3, 4). Täyspitkä isoformeja on läsnä ydin- osa proksimaalinen paksusuolen lysaateista, mikä osoittaa, että Meis1d

27 ei sitoa muita Meis1 isoformien sytoplasmassa (kuviot 3, 4). Edelleen todisteet osoittavat, että Meis1d

27 ei ilmenny samaan soluissa Meis1a tai Meis1b estäen kaikenlaiset vallitsevan negatiivisen vuorovaikutuksen (kuva 4). Sytoplasmisen muoto Meis1d voi vielä sido muita tuntemattomia transkriptiotekijöitä ja estää ydinaseiden lokalisointi. Isoformivyöhykkeet voi olla myös uusi homeodomain riippumaton toiminto liity transkription aktivaation.

Mahdollinen tehtävä Meis1d

27 on epäselvä, koska tiedot eivät sovi myöskään tiedossa mekanismi homeodomain vähemmän TALE proteiineja. Proteiini ei voida toimii dominantti negatiivinen, koska sitä ei ole ilmaistu samoissa soluissa kuin muut Meis1 isoformeja. Meis1d

27 ei myöskään voida aktivoimalla alavirtaan transkription tuman sisällä, koska proteiini on lokalisoitu sytoplasmaan. Ydin- muoto Meis1d kuitenkin voi silti sovi joko näiden mekanismien lamina propriassa tai lihasten ympäröivään paksusuolessa. Ydin- lokalisointi Meis1d

32 tarkoittaa proteiini voitiin toimii sitovan partnerin muille transkriptiotekijät. Meis1d

32 säilyttää yhä motiivit tarvitaan PBX vuorovaikutuksen ja homodimerisaation [36]. Nämä tiedot viittaavat siihen, että katkaistu isoformi voisi silti toimia kofaktorina näiden muiden homeodomain proteiineja. Meis1d

32-proteiinia voidaan myös toimii hallitseva negatiivinen isoformin tuman sisällä estäen assosiaation täyspitkän Meis1 proteiineja ja promoottori alueille DNA. Edelleen leikkelyn lamina proprian ja taustalla lihas kerros on tarpeen selvittää, onko Meis1d

32 ja mahdolliset toisiinsa sitoutuvat ilmentyvät samassa solujen populaation. Tunnistaminen toiminnallisten roolien sekä Meis1d

32 ja Meis1d

27 auttavat selittämään merkitystä

Meis1

silmukoinnin suoliston toimintaa ja homeostaasiin.

puutteesta huolimatta määritetyn funktion