Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

heparaanisulfaattiproteoglykaanit (HSPGs) ovat valvonnan elementtejä Wnt signalointia, jotka sitoutuvat solun ulkopuolelle ja Wnt-ligandien ja säädellä niiden kyky olla vuorovaikutuksessa signaalitransduktion reseptoreihin solun pinnalla . Sulf-1 ja sulf-2 ovat uusia solunulkoinen sulfataaseja jotka toimivat sisäisen glukosamiini-6-sulfaatti (6S) Räätälöinti HSPGs ja siten moduloida HSPG vuorovaikutusta eri molekyylejä, kuten Wnt ligandit. Kehittyvät todisteet osoittavat, että on tärkeää uudelleen Wnt signalointia useissa syöpiä, kuten haiman adenokarsinooma.

Periaate Havainnot

Molemmat sulf proteiinit yläreguloituja ihmisen haiman adenokarsinooma kasvaimia ja oli ilmentyy laajasti ihmisen haiman adenokarsinooma solulinjat. Humaani ekstrasellulaarisen sulfataaseja sulf-1 ja sulf-2 tehostetun Wnt signalointia on rekonstruoitu järjestelmässä. Kolme neljästä haiman adenokarsinooma tutkituissa solulinjoissa näytteillä autokriinisella Wnt signalointia, että solunulkoinen Wnt ligandit aloitettava alavirran Wnt signalointia. Altistuminen näistä haiman adenokarsinooma solujen katalyyttisesti inaktiivinen muoto sulf-2 tai siRNA-välitteisen hiljentäminen endogeenisen sulf-2 esti sekä Wnt signalointia ja solujen kasvua. Sulf-2 hiljentäminen kahdessa näistä riviä, johti merkittävästi vähentänyt kasvainten synnyssä immuunipuutteisilla hiirillä.

Johtopäätökset /merkitys

Olemme tunnistaneet Sulfs potentiaattoreina autocrine Wnt signalointia haiman syöpäsoluissa ja ovat osoittivat niiden vaikutus kasvuun ja tuumorigeenisyystesti näiden solujen. Koska Sulfs ovat solunulkoisia entsyymejä, ne olisivat houkuttelevia kohteita terapiassa haimasyövän. Tuloksemme vastoin vallitseva näkemys kirjallisuudessa että Sulfs ovat alipaineensäätöventtiileillä tumorigeneesin.

Citation: Nawroth R, van Zanten A, Cervantes S, McManus M, Hebrok M, Rosen SD (2007) Solunulkoisilla sulfataaseja, Elements of Wnt-signalointireitin, positiivisesti säädellä kasvu ja tuumorigeenisyystesti of Human haimasyöpäsoluissa. PLoS ONE 2 (4): e392. doi: 10,1371 /journal.pone.0000392

Academic Editor: Mikhail Blagosklonny, Ordway Research Institute, Inc., Yhdysvallat

vastaanotettu 18 maaliskuuta 2007; Hyväksytty: 28 maaliskuu 2007; Julkaistu: 25 huhtikuu 2007

Copyright © 2007 Nawroth et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimus tukivat Susan Komen Breast Cancer Foundation Grant PDF0402844 (RN ja SDR), Saksan tutkimussäätiö Grant NA439 /1-1 (RN), Ministerio de Educación, Cultura y Deporte Espanjan hallituksen (SC) ja National Institute of Health Avustukset GM57411 (SDR), CA122025 (SDR), HL075602 (SDR) ja CA112537 (MH). Valmistelu lentiviruksien oli tukeman Sandler lentivirustartunnat Core Facility UCSF. Sponsoreita ei ollut roolia suunnitteluun ja tutkimuksen tekeminen, keräämiseen, analysointiin ja tietojen tulkinta, ja valmisteluun, tarkastelun tai hyväksyntä käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

haiman adenokarsinooma on yleisin haimasyövän ja yksi tappavan syöpäsairauksia on 5 vuoden eloonjäämisaste 3% ja keskimääräinen eloonjäämisaika on alle 6 kuukautta [1]. Viime aikoina on kiinnostusta rooli alkion signalointireittien syövässä. Huomattavaa näyttöä on osoittanut, että nämä reitit ovat edelleen toimivaksi rajoitettu määrä solujen aikuisen ja että säätelyhäiriö näistä reiteistä edistää muodostumista ja pysyvyyttä kasvaimien [2], [3]. Tässä suhteessa on aktivoida Notch, Hedgehog ja Wnt väyliä ovat herättäneet viime aikoina kiinnostus syöpää ruoansulatuskanavasta, mukaan lukien haiman adenokarsinooma [2], [4], [5].

häiriöstä Wnt signaloinnin haiman adenokarsinooma on painopiste tässä tutkimuksessa. Wnts käsittävät suuren perheen eritettyjen proteiinien, jotka säätelevät solujen kasvua, apoptoosin, liikkuvuuteen ja erilaistumisen alkion kehityksen aikana [3]. Lyhyesti, aktivointi kanoninen Wnt-reitin aloitetaan sitomalla Wnt-ligandien signaalitransduktion reseptoreihin solun pinnalla, mikä johtaa kertyminen ei-fosforyloitua β-kateniinin sytoplasmassa. Sen jälkeen translokaatio tumaan, β-kateniinin muodostaa kompleksin jäseniä TCF /LEF perheen transkriptiotekijöiden, ja aktivoi kohdegeenien [3].

Wnt signalointi ensimmäisen osallisena syövän analysoimalla rintarauhasen kasvaimien synnyn aiheuttama hiiren nisäkasvainviruksen (MMTV) [6]. Suuri osa kasvainten johtui aktivointi Wnt1 ilmaisun insertoimalla MMTV aihioviruksen osaksi

wnt1

geeni. Kasvaimen kehittymisen ajatellaan perustuvan autokriini Wnt muuntamiseen polku, jossa Wnt ligandin ilmentymistä maitorauhasen epiteelisolujen tarjoaa kasvun ärsyke samat solut. Äskettäin autokriininen Wnt signalointia osoitettiin rintasyövän, munasarjasyövän ja myeloomasolulinjat, [7], [8]. Tämä mekanismi, jossa solunulkoinen Wnt ligandit ovat keskeinen ärsyke solujen lisääntymisen, toiminta eroaa yleisesti todettu ihmisen paksusuolen syövän ja useiden muiden syöpämuotojen, jossa konstitutiivisen aktivaation Wnt signalointi on seurausta mutaatioita alavirran sytoplasman elementtejä, kuten

APC, CTNN1

(koodaa β-kateniinin) tai

AXIN2

[3].

Nämä ominaisuus mutaatioita loppupään Wnt molekyylejä ovat hyvin harvinaisia ​​haiman adenokarsinooma [9 ]. Silti poikkeava aktivaatio Wnt signalointi on merkittävä piirre ihmisen haiman adenokarsinooma, koska paljasti ydinvoiman lokalisoinnin β-kateniinin huomattava osa (30-65%) kasvaimia [9], [10]. Yhdenmukainen histokemiallista todisteita, biokemiallinen analyysi on vakiintunut selvästi korkeus koko β-kateniinin voimistuva tumaanohjaussignaali kaksi kolmasosaa haiman adenokarsinooman [9]. Lisäksi mekaaniset tutkimukset kanssa haiman adenokarsinooma solulinjojen, esto Wnt signaloinnin vähensivät solujen lisääntymisen ja eloonjäämisen in vitro [11].

alue ajankohtaisia ​​ovat solunulkoinen säätelyelementtejä että Wnt signalointireitin. Näistä erittyy Wnt-antagonistit, kuten Frizzled liittyvät proteiinit (SFRP), Wnt estävä tekijä (WIF) ja Dickkopf perhe (DKK) [12]. Downregulation tahansa näiden antagonistien aloittaa Wnt aktivointia ja edistää useiden syövän muotoja [12]. Luokka solunulkoisten proteiinien positiivisesti Wnt aktiivisuus ovat heparaanisulfaattiproteoglykaanit (HSPGs). Glypicans Esimerkiksi tarvitaan Wnt signalointia kehitystä Drosophila ja selkärankaisten [13]. HSPGs tarvitaan myös esimerkkejä Wnt kasvain muodostumisen [14], [15]. Lukemattomia toiminnot HSPGs kasvun ja solujen erilaistumista [16] välittyvät niiden kyky sitoutua monipuolinen ohjelmistoon kasvutekijöiden ja morfogeeneille. Binding riippuu sulfatointi kuvio glukosamiini (N-, 3-O, ja 6-O asentoa) ja uronihapon (2-O-asento) sisällä liitteenä heparaanisulfaatista ketjuja. [16]. 6-O-sulfaatio (6S) glukosamiini on erityisen tärkeää, että sitova monia tärkeitä ligandien HPSGs, mukaan lukien Wnts [17] – [19]. Hiljattain arvostettu säätelevä mekanismi signalointia näiden ligandien on postitse synteettinen ”muokkaus” on 6S mallia HSPGs toiminnan kautta luokan solunulkoisen sulfataaseja tunnetaan Sulfs [20].

QSulf-1 , ensimmäinen jäsen sulf perheen kuvattava, löydettiin analyysi lihasten kehityksen viiriäisen alkion [20]. Tätä seurasi kuvauksen sen ortologeja rotalla [21], hiiren ja ihmisen [22] ja löytö tälle läheistä sukua homologin, sulf-2 [22]. Sulfs ovat neutraaleja pH-optimi endosulfatases että poistaa 6-O-sulfaatti sisäisestä glukosamiinijäännöksiä erittäin sulfatoidut aliverkkotunnuksissa hepariini /HSPGs [18], [19], [22], [23]. Alkuperäinen tutkimuksissa QSulf-1 paljasti positiivinen rooli Wnt signalointia lihas erittelyä viiriäisen alkion [20]. Tämä toiminta riippuu kyvystä QSulf-1 vähentää vuorovaikutuksen Wnt-ligandien kanssa HSPGs. Kirjoittajat ehdotti kahden valtion mallia, jossa HS ketjut muodostavat suuren affiniteetin HS-Wnt kompleksi, joka sitoo Wnt alkaen vuorovaikutuksessa sen signaalitransduktion reseptoreihin. Affiniteetti Wnt HS on heikentynyt, kun QSulf-1 muuttaa 6S malli HS ketjujen mahdollistaa aloittamisen Wnt signalointia [19].

sulf riippuva edistäminen Wnt signalointia havaittu myös muissa kehityshäiriöitä tapahtumia [24]. In vitro viittaavat siihen, että Sulfs voi edistää muita signaalinvälitysreittien lukien angiogeneesi ja BMP signalointi [23], [25]. Tärkeää on,

sulf

null hiiret osoittavat alentunut ruumiin massa [26], [27]. Tämä fenotyyppi on sopusoinnussa positiivinen sääntelyn roolit Sulfs normaalin kehityksen.

Havainto, että kanoninen Wnt signalointia aktivoidaan haiman adenokarsinooma (katso edellä) on kiinnittänyt huomiota mahdolliseen osallistumista Sulfs tässä syöpä . Tässä tutkimuksessa osoitamme, säätelyä sekä sulf proteiinien haiman adenokarsinooma kasvaimia. Ihmisen haiman adenokarsinooma syöpäsolulinjassa asetamme rooli sulf-2 edistämisessä autokriinisella Wnt signalointia, in vitro solujen kasvua ja kasvainten muodostumiseen. Tämä positiivinen vaikutus on sulf että Wnt kasvain kasvu on silmiinpistävä vastakohta useita raportteja, joissa täytäntöön ilmaus Sulfs antagonisoi muita signaalinvälitysreittien (esim FGF-2, ja HGF) tuumorisoluissa ja tukahduttaa solujen kasvua [28] – [34].

tulokset

sulf-1 ja sulf-2 yläreguloituja ihmisen haimasyövän

Mining julkisten DNA-siru aineistot ja kvantitatiivinen PCR tutkimus vahvistaa, että

SULF1

transkriptit yläreguloituja ihmisen haimasyövän (taulukko 1). Jälkimmäinen Tutkimuksessa havaittiin, että keskimääräinen taso

SULF1

mRNA oli 22,5 kertaa suurempi syöpäkudoksessa (n = 31) kuin normaalissa haimassa (n = 19) [31].

In situ

-hybridisaatio lokalisoitu ilmaus

SULF1

putkimaisiin rakenteisiin, todennäköisesti edustavat invasiivisen karsinooman.

Voit selvittää sulf ekspressoitiin haiman adenokarsinooma kirurgisista näytteistä olemme värjätyt leikkeet seitsemän arkistoitu tapauksissa sulf-1 ja sulf-2-vasta-aineita ja IgG-kontrolli (kuvio 1 A ja B). Hyvänlaatuinen interlobular kanavat samalla kudosleikkeiden kuin invasiivisen karsinooman toimi sisäisenä kontrollina. Vuonna 7/7 tapauksissa pahanlaatuisia epiteelisolujen yleensä osoittivat kohtalaisesta vahvaa värjäytymistä sulf-1 (kuvio 1 B). For sulf-2, 4/7 tapaukset osoittivat vahvaa värjäytymistä näiden solujen, 2/7 tapauksista oli kohtalainen värjäytyminen ja 1 tapauksessa oli negatiivinen. Useimmat hyvänlaatuinen kanavat eivät osoittaneet värjäytymistä tai vain pieniä värjäystä varten sulf-1 (≈54%) tai sulf-2 (≈88%). Focal värjäys sulf-1 tai sulf-2 nähtiin vähemmistö hyvänlaatuinen kanavat. Diffuusi heikko värjäys fibroblastien sekä Sulfs havaittiin joillakin strooman, yleensä yhdessä tulehdussolujen. Ei ollut mitään värjäytymistä IgG ohjaus.

V: edustaja leikesarjojen haiman adenokarsinooma värjättiin sulf-1, sulf-2 ja kontrolli-lgG. Hyvänlaatuisia kanavat verrattiin alueille invasiivisen kohdunkaulan samassa osiossa. B: kvantitatiivinen taulukkomuodossa sulf immunohistokemiaa tulokset haiman adenokarsinooma tapauksissa (0 = ei ole tai jälkeä värjäystä, 1 = kohtuullinen värjäys, 2 = voimakas värjäytyminen, ND = ei määritetty). C: RNA eristettiin 24 adenokarsinoomasolulinjaan linjat, cDNA valmistettiin ja alistettiin PCR alukkeilla

SULF1

ja

SULF2

ja β-

ACTIN

kuin latauskontrollina . D: Immunoblotit tehtiin solulysaateista ja väliaine (CM) käyttäen vasta-aineita sulf-1 (ylempi paneeli) ja sulf-2 (keskellä ja alempi paneeli). Vain sulf-2-proteiinin havaittiin CM.

Seuraavaksi määritetään ilmentymisen Sulfs ihmisen haiman adenokarsinooma solulinjoja käyttämällä RT-PCR kartoittaa paneelin 24 solulinjoissa. Nämä olivat peräisin joko primaarinen tai metastaattinen haiman adenokarsinoomat [5].

SULF1

transkriptit havaittiin RT-PCR 12/24 ja

SULF2

transkriptien 21/24 näiden linjojen (kuvio 1 C). Tutkia ilmaisu proteiinitasolla, tutkimme 4 näistä solulinjoista, joista 3 oli positiivisia sekä

sulf

selostukset (CFPAC-1, HS766T, L3.6sl) ja 1, joka oli positiivinen vain

SULF2

(BxPC-3). Suoritimme immunobloteissa pesu- lysaatit ja kunnostetun alustan (CM) on johdettu näistä soluista (kuvio 1 D). Sulf-1-proteiini havaittiin vain yhdessä solulinjassa (HS766T solut), kun taas sulf-2-proteiinia oli läsnä kaikissa 4. pesuainetta lysaatit, molekyylipaino tärkeimmistä lajeista oli 130 kDa, mikä vastaa käsittelemättömän muodossa sekä proteiinit [22]. Sulf-2-proteiinia vapautui CM kaikki 4 solulinjoissa. Sen sijaan, sulf-1 ei havaittu HS766T CM. Kuten aikaisemmin on havaittu useita rintasyövän solulinjat [25], sulf-2-proteiinia ei havaittu CM jalostettua 75 kDa: n komponenttia.

sulf-1 ja sulf-2 edistää Wnt signalointia

QSulf-1: n on osoitettu edistävän aktivointia Wnt signalointireittien vastauksena eksogeenisen Wnt-ligandien [20]. Päätimme tutkia, mitä vaikutuksia ihmisen Sulfs on Wnt signalointia samanlaisessa saatettua järjestelmä [20]. Olemme yli-ilmennetään Sulfs HEK 293T ja yhteistyö viljeltiin nämä solut fibroblastien että ilmaista joko Wnt1 tai Wnt4. Wnt signalointi aktiivisuus mitattiin TCF-lusiferaasireportterisysteemillä (TOPflash /FOPflash), standardi mittausmenetelmää β-kateniinin-riippuvaisen transkription aktivaation [20]. Expression kunkin sulf täydennetty Wnt signalointia vastauksena joko Wnt ligandiin, kun taas valetransfektoiduista HEK 293T-solut eivät reagoineet (täydentävä kuva, kuva. S1). Siten sekä HSulfs, kuten QSulf-1 [20], voivat edistää Wnt signalointia.

Expression of SFRP-2 estää Wnt signalointia haiman adenokarsinooma solulinjoissa

Aikaisempi tutkimus on vahvistanut aktiivinen Wnt signalointia sisällä sarja haiman adenokarsinooma solulinjat, mukaan lukien 4 riviä edellä [M. Pasca di Magliano ja M. Hebrok, julkaisemattomia havaintoja]. Sen ratkaisemiseksi, onko Wnt signalointia näillä 4 riviä oli autokriiniset luonteeltaan, käytimme erittyy Frizzled liittyvä proteiini-2 (SFRP-2) kuin ekstrasellulaarisen Wnt antagonisti [35], [36]. Olemme transfektoitiin lyhytaikaisesti solulinjaa cDNA SFRP-2 tai tyhjällä vektorilla (ctrl) ja mitataan Wnt aktiivisuus TCF-lusiferaasireportteri- määrityksessä. SFRP-2: n ilmentymisen pienentynyt Wnt signalointia ≈60% 3 linjat, mutta ei ollut vaikutusta CFPAC-1-soluja (kuvio 2). Nämä tulokset vahvistaa, että BxPC-3, HS766T ja L3.6sl soluilla autokriini Wnt-signalointireitin.

osoitti haiman adenokarsinooman solulinjoja transfektoitiin SFRP-2-cDNA (SFRP-2) tai kontrollivektorin ( ctrl) ja TOP /FOPflash toimittaja järjestelmässä. Wnt aktiivisuus määritettiin lusiferaasiaktiivisuus. Esitetyt arvot ovat keskiarvoja ± SD: n 3 riippumaton määritys. Erot SFRP ja valvonta olivat merkittäviä Student t-testi p-arvojen 0,002 varten BxPC-3, HS766T ja L3.6sl.

Katalyyttisesti aktiivinen ihmisen sulfataasi proteiini estää Wnt signalointia ja solujen kasvua

vieressä kysytään endogeenisten Sulfs näissä solulinjoissa osallistuivat suoraan Wnt signalointia. Kun yli-ilmennetään Sulfs, ei ollut vaikutusta Wnt signalointia (tuloksia ei ole esitetty). Koska kaikki nämä solut ilmaisivat merkittäviä tasoja Sulfs, me seuraavaksi kysyttiin, voisiko olla olemassa estäviä vaikutuksia, jos ilmaistaan ​​katalyyttisesti aktiivinen muotoja näiden proteiinien. Olemme aiemmin osoittaneet, että mutaatio kahden kysteiinin Sulfataasin domain kunkin sulf eliminoitu sulfataasiaktiivisuus [22]. Olemme transfektoitu cDNA, joka koodaa ei-aktiivinen sulf-1 (S1ΔCC), sulf-2 (S2ΔCC) tai tyhjän vektorin (ctrl) kuhunkin 4 solulinjojen ja mitataan jälleen Wnt toimintaa. Kuten kuviossa 3A on esitetty, ilmentyminen joko inaktiivisia sulf esti Wnt aktiivisuus ≈50% kaikissa mutta CFPAC-1-soluja. 3 vastaa riviä olivat samoja, että esillä autokriininen Wnt signalointia (kuvio 2). Se seikka, että joko inaktiivisia sulf kohdistuu vastaavia vaikutuksia näihin haimasyövän solulinjoissa ehdottaa toiminnallisia redundanssin kahdella entsyymillä.

: Neljä haiman adenokarsinooma solulinjoja kuten transfektoitiin ohimenevästi koodaavat cDNA: t joko katalyyttisesti inaktiivinen muoto sulf-1 ( ”S1ΔCC”) tai katalyyttisesti inaktiivinen muoto sulf-2 ( ”S2ΔCC”) tai tyhjällä vektorilla ( ”vertailu”). Mutantit tehtiin korvaamalla kaksi vierekkäistä kysteiiniä alaniineilla. Wnt signalointi määritettiin käyttämällä TOP /FOPflash reportteri-järjestelmän. Esitetyt arvot ovat keskiarvoja ± SD: n 4 riippumaton määritys ja erot mutantin ja kontrollisolut olivat tilastollisesti merkitseviä p-arvoja 0,02 BxPC-3, HS766T ja L3.6sl soluja (Studentin t-testi). B: haiman adenokarsinooma solulinjoja viljeltiin kasvualustassa, jotka ovat peräisin kustakin seuraavista: vanhempien HEK-293-soluja ( ”kontrolli”), HEK 293T-solut, jotka ekspressoivat stabiilisti villityypin sulf-2 (merkitty ”sulf-2”), tai ilmentävät katalyyttisesti inaktiivinen muoto sulf-2 ( ”S2ΔCC”). Villityypin sulf-2-proteiinia ja mutantti oli läsnä vakioitu väliaine kahden tuottavien solujen suunnilleen yhtäläinen. Wnt signalointi määritettiin ennen kanssa TCF-lusiferaasireportterilla määritys. Esitetyt arvot ovat keskiarvoja ± SD: n 3 riippumaton määritys ja erot sulf-2 mutantti ja ohjaus olivat tilastollisesti merkittäviä BxPC-3 (p = 0,002), HS766T (p = 0,01) ja L3.6sl (p = 9 x 10

-6) (Studentin t-testi). C: haiman adenokarsinooma solulinjoja viljeltiin transwell-järjestelmän yli syöttölaite kerrosta, joka koostuu: pelkästään väliaineen ( ”Medium”); vanhempien HEK 293T-solut ( ”HEK 293T”); HEK 293T-soluissa stabiilisti tuottavien villityypin sulf-2 ( ”sulf-2”); tai katalyyttisesti inaktiivinen muoto sulf-2 ( ”S2ΔCC”). Solujen kasvua seurattiin hemasytometriä laskenta ja 4 päivää. Esitetyt arvot ovat keskiarvoja ± SD: n 3 riippumaton määritys.

vieressä kysyttiin eksogeeninen katalyyttisesti inaktiivinen sulf proteiini myös häiritä Wnt signalointia. Lähteenä sulf-2-proteiinia, käytettiin HEK 293T-soluja, jotka oli stabiilisti transfektoitu joko ihmisen villityypin sulf-2 (S2) tai katalyyttisesti inaktivoitu sulf-2 (S2ΔCC) [25]. Käytimme myös vanhempien HEK 293T-solut (293T) kontrolleina. Vakaa transfektantit erittynyt aktiivinen ja passiivinen Sulfs samalla tasolla (tuloksia ei ole esitetty). Olemme inkuboitiin haiman adenokarsinooma soluja 16 tuntia CM näistä soluista tai ohjaus keskipitkän ja verrattiin Wnt signalointia. Altistuminen aktiivinen sulf-2-proteiinia (S2ΔCC) esti Wnt signaloinnin samaan 3 solulinjoja, jotka olivat herkkiä transfektion S2ΔCC cDNA: n (kuvio 3B), kun taas CFPAC solut eivät osoittaneet vaikutusta. Lisääminen väliaineen, esikäsitellään aktiivinen sulf-2-proteiinia, ei edistää Wnt signalointia perustasoon.

Seuraavaksi voimme perustaa yhdessä viljelemisen järjestelmän vaikutusten tutkimiseksi yhdistelmä-sulf proteiinin solun kasvuun saman solulinjoissa. Haiman syöpäsoluja ympättiin alhaisen tiheyden transwell suodattimilla edellä syöttölaite kerrosta, joka koostui vanhempien HEK 293T-solut tai HEK 293T ilmentävät aktiivinen tai passiivinen sulf-2. Solulaskennat tarkkailtiin seuraavien päivien aikana. Tulokset samansuuntainen estävä vaikutus huomaamistamme Wnt signalointia. Näin ollen, verrattuna kont- väliaineessa, S2ΔCC CM esti kasvua BxPC-3, HS766T ja L3.6sl soluja (kuvio 3C), mutta ei ollut vaikutusta CFPAC-1-soluja. Sen sijaan aktiivisen sulf-2 ei ole edistää tai estää solujen kasvua tahansa linjojen.

Lentivirusvektorikonstruktit shRNA hiljentäminen sulf-2 haiman adenokarsinooma soluissa vähentää Wnt signaloinnin, solun proliferaation ja solujen eloonjäämistä

tutkimiseksi edelleen roolin sulf-2 in Wnt signalointia ja solujen kasvua, käytimme shRNA menetelmää vaientaa ilmentymisen sulf-2 näissä soluissa. Meillä työskentelee kolme shRNA rakentaa: kaksi riippumatonta konstruktioita kohdistaminen sulf-2 (1413 ja 1143) sekä kontrollina (ctrl). Näitä rakenteita käytettiin eri vektori taustat, jossa läsnä ollessa tai puuttuessa GFP antoi meille mahdollisuuden seurata ekspression shRNAs (katso materiaalit ja menetelmät). Transdusoidut solut lajitellaan GFP: n ilmentymisen ja tämän jälkeen analysoitiin sulf-2: n ilmentymisen. 1143 ja 1413 konstruktioita (pLV-1143, pLV-1413) tuotti 80% ja 90% vähennykset sulf-2-proteiinia, vastaavasti, L3.6sl soluissa suhteessa kontrolliin shRNA (pLV-ctrl) (kuvio 4A). Ei ollut vähentäminen proteiinin pLV-ctrl käsitellyissä soluissa verrattuna käsittelemättömiin soluihin (tietoja ei ole esitetty). PLV-1413-rakenne tuotti samanlaisen väheneminen BxPC3 soluissa kahdessa eri vektori taustat (pLV ja pSico).

inaktivointi Wnt signalointi johtaa alentuneet aktivoitu β-kateniinin (N-terminaalisesti ei-fosforyloitu) tumassa [3]. Siksi eristetty ydin- osa sulf-2 vaiennetaan ja ohjaus soluja (BxPC-3 ja L3.6sl) ja analysoitiin tasot aktivoitua β-kateniinin. Oli ≈80% laskua β-kateniinin sulf-2 vaimennettu BxPC-3-soluja, ja ≈30%: n vähennys L3.6sl soluissa (kuvio 4B). Olemme myös määrällisesti Wnt aktiivisuus käyttämällä TCF-lusiferaasireportterisysteemillä. Yhdenmukainen β-kateniinin tulos, tämä määritys vahvisti, että Wnt signalointia oleellisesti estyy sulf-2 vaimennettu solujen suhteessa hallita käsiteltyjä soluja sekä BxPC-3 ja L3.6sl soluja (kuvio 4C). Jälleen BxPC-3-solut osoittivat vahvempaa esto (52% kanssa pLV-1413) kuin L3.6sl soluja (35% inhibitio pLV-1413 tai pLV-1143).

V: Solut transdusoitu ehdollinen (pSico) tai nonconditional lentivirukselle (pLVTHM) koodaa joko sulf-2 erityistä (1413, 1143) tai kontrolli (ctrl) shRNAs. Solut hajotettiin ja yhtä suuret määrät proteiineja suoritettiin SDS-PAGE. Siinä tapauksessa, että pSico solut lyysattiin 10 päivää sen jälkeen, kun cre transfektion. Sulf-2-proteiinin tasot määritettiin suorittamalla immunoblot ja sama lysaatit tutkittiin anti aktiini-vasta-latauskontrollina. B: 100 ug kokonaisproteiinia ydin- osa soluista levitettiin SDS-PAGE ja määriä aktiivista beta-kateniinin havaittiin käyttämällä vasta-ainetta ei-fosforyloitua beeta-kateniinia. Kuormituksen valvonta, samalla lysaatit analysoitiin anti histoni vasta-aine. C: Vanhempien, pLV-ctrl, pLV-1413 ja pLV-1143 transdusoidut solut transfektoitiin FOP /TOPflash toimittaja järjestelmään ja lusiferaasin aktiivisuutta havaittiin 48 tuntia myöhemmin. Esitetyt arvot ovat keskiarvoja ± SD: n 3 riippumaton määritys ja erot ctrl ja sulf-2 vaiennetaan solut olivat tilastollisesti merkitseviä (BxPC-3, p = 0,002 ja (L3.6sl, p = 0,013 ja 0,017 kahden hiljentäminen vektorit) .

määrittää vaikutukset sulf-2 hiljentäminen soluproliferaatioon mittaamalla sisällyttämällä 5-bromideoksiuridiinin (BrdU) soluihin. oli 25-30% vähennys läpikäyvien solujen S- vaihe L3.6sl, BxPC3, ja HS766T soluja, ja vain 5%: n vähennys CFPAC-1-soluja (kuvio 5A). Lisäksi, teimme apoptoosin määrityksiä mittaamalla anneksiini V-värjäys. sulf-2 vaimennettu BxPC-3-solut osoittivat apoptoosin lisääntyminen 33%, kun taas L3.6sl solut osoittivat kasvaa 65% ja 79% ja kaksi riippumatonta shRNAs (kuvio 5B).

V: Ilmoitetut solut transdusoitiin ohjaus (pLV-ctrl ) tai sulf-2 shRNA (pLV-1413, pLV-1143). soluja inkuboitiin sitten BrdU yhden tunnin ajan ja BrdU havaittiin virtaussytometrialla analysointia. Esitetyt arvot ovat keskiarvoja +/- SD: n 2 riippumatonta koetta. Erot BrdU oton välillä ctrl ja sulf-2 vaiennetaan solut olivat tilastollisesti merkittäviä BxPC-3 (p 0,005), L3.6sl (p 0,007) ja HS766T (p 0,001). B: BxPC-3 ja L3.6sl haiman solut transdusoitiin ohjaus (pLV-ctrl) tai sulf-2 shRNA (pLV-1413, pLV-1143) otettiin talteen ja inkuboitiin PE-konjugoidulla anneksiini V: Sen jälkeen solut altistettiin virtaussytometria-analyysi. Erot välillä ctrl ja sulf-2 vaiennetaan solut olivat tilastollisesti merkitseviä p-arvot 0,0001 BxPC-3 ja p 0,004 varten L3.6sl. C ja D: L3.6sl solut transdusoitiin joko pLV-1413, pLV-1143 tai pLV-ctrl ja sekoitetaan populaatiot siRNA ja ei-siRNA ilmentäviä soluja viljeltiin yh-. Suhteet transdusoitujen ei-transdusoidut solut mitattiin ajan mittaan GFP: n ilmentymisen. BxPC-3-soluja transdusoitiin joko pSico-ctrl tai pSico-1413 ja transfektoitiin väliaikaisesti cre-rekombinaasin aktivoida ilmentymistä shRNA. Saatu sekoitettu solujen populaatiot aktivoidulla (GFP-) ja inaktivoitu (GFP +) shRNA ilmentyminen oli co-viljeltiin. Suhteet GFP + ja GFP- soluihin, käyttäen virtaussytometriaa analysoitiin ajan funktiona. GFP: n ilmentämistä ei ollut mitään vaikutusta solujen kasvuun kontrollipopulaatiossa.

tutkia solujen kasvua ajan myötä sulf-2 vaimennettu soluja, vertasimme solujen kasvua, joka sulf-2 on vaiennettu ei-transdusoituja emosoluilta sekaviljelmässä. Samanaikaisesti co-viljelmät, vertasimme kasvua ohjaus shRNA-transdusoidut solut vanhempien ei-transdusoituja soluja. Jotta molemmat sulf-2 erityisiä shRNAs, ei-vaiennettu vanhempien L3.6sl solujen asteittain ohitti vaimennettu solut ajan viljelmässä. Tulokset olivat samankaltaisia ​​kanssa BxPC-3-soluissa (kuvio 5D). Sen sijaan ei ollut muuttunut suhde ohjaus transdusoimattomien solujen vanhempien soluihin ajan myötä (kuvio 5C).

vaiennettu sulf-2 estää kasvaimen kasvua in vivo

Määritä vaikutukset sulf-2 hiljentäminen on osoitettu aiheuttavan kasvaimia L3.6sl ja BxPC-3-solujen

in vivo

vertasimme kasvainten kasvua, jotka muodostivat immuunipuutteisilla hiirillä tai ilman vaiennettu sulf-2. Nude-hiirten (CD-1) injektoitiin ihonalaisesti joko pLV-ctrl tai pLV-1413 transdusoidut solut 1 viikon kuluttua transduktion. Tuumorikoko seurattiin kerran ulkopuolisilla tunnustelu. Lopussa kokeen, eläimet uhrattiin ja tuumorit punnittiin. Kuten kuviossa 6 on esitetty, kasvaimet, jotka ovat peräisin sulf-2 vaimennettu soluja (L3.6sl tai BxPC-3), kasvoivat selvästi hitaammin kuin ne, jotka on johdettu ohjaus solut (kuvio 6B). Korjattu kasvaimia vaiennetaan soluja vastaavasti pienentää painoa ilman päällekkäisyyttä näissä kahdessa ryhmässä joko solulinja (kuvio 6C).

L3.6sl ja BxPC-3-soluja transdusoitiin joko pLV-1413 tai pLV -ctrl ja injektoidaan subkutaanisesti nude-hiiriin 5 x 10

6 per sivusto. V: L3.6sl johdettu kasvainten talteen hiirillä 17 päivä kasvun B: Kasvaimen koko seurattiin ajan mittaan ja arvot edustavat keskiarvoa (+/- SEM) 4 hiirtä varten L3.6sl solujen ja 6 (pLV-ctrl) tai 5 (pLV-1413) hiirille BxPC-3-soluissa. C: Eläimet tapettiin ja kasvaimen paino tutkittiin. Ero kasvaimen paino näiden kahden ryhmän välillä oli merkittävä L3.6sl solujen p-arvo on 0,01 ja BxPC-3-solut, joissa on p-arvo 0,029 (Studentin t-testi).

keskustelu

vallitseva näkemys kirjallisuudessa on ollut, että Sulfs ovat alipaineensäätöventtiileillä kasvaimen solujen kasvua. Useat raportit osoittivat, että yli-ilmentyminen sulf-1 [28] – [34] tai sulf-2 [32] kasvainsolulinjoissa inhiboi kasvutekijän signalointi vasteena useista tekijöistä, mukaan lukien FGF-2, HB-EGF, ja HGF. Lisäksi tuumorigeenisyyden sulf yli-ilmentäviä soluja immuunivasteeltaan hiirissä väheni [31], [32], [34]. Kielteisiä vaikutuksia Sulfs on FGF-2 signalointi ovat yhdenmukaisia ​​tunnetun vaatimuksen 6S siitä HSPGs että FGF-2 signalointikompleksiin [37]. Nämä solulinjan havainnot ovat johtaneet siihen ehdotukseen, että alas-säätely Sulfs voisi tarjota kasvainsolujen kasvua etu tiettyjä asetuksia. Tämä malli voi olla voimassaoloa merkittävästä osajoukon (kaksi kolmasosaa) munasarjasyövän tapauksista [28] ja vähäinen osajoukko (29%) Maksasolusyövän tapauksista [30], jossa

SULF1

ilmentyminen säädeltiin vähentävästi suhteessa että normaalissa kudoksessa. Kuitenkin malli on ongelmallista suurehko subsets useiden syöpien, jotka osoittavat nousua

sulf

ilme. Näin ollen, esimerkiksi,

SULF1

esiintyminen lisääntyy merkittävästi osajoukkoja rintasyövän [38], haimasyöpä [31], [39] (taulukko 1) keuhkoadenokarsinooma [40] ja maksasyövän [30], kun taas

SULF2

ylössäädellään multippelia myeloomaa [32], rintasyöpä ja keskushermoston syöpien [41].

ymmärtää merkityksen ilmen- tymisen lisääntymisen

sulf

ilmentyminen syövän, me päätti keskittyä haiman adenokarsinooman vuoksi selkeä näyttö, jonka mukaan tämän syövän kanonisen Wnt signalointia, signalointireitin tiedetään positiivisesti säätelee Sulfs kehityksen aikana (katso edellä). Yhdenmukainen transkripti ekspressiotietojen (taulukko 1), huomasimme, että molemmat Sulfs voimakkaasti ilmaistiin proteiinin tasolla pahanlaatuisia epiteelisolujen haiman adenokarsinooma. Helpottaakseen tutkimuksen näiden entsyymien haimasyövän, tutkimme

sulf

ilmaisun suuressa paneelissa haiman adenokarsinooma solulinjojen ja saaneet laajaa ilmaisua, erityisesti

SULF2

. Valitsimme 4 linjat tutkimusta, jotka kaikki ilmaistu sulf-2-proteiinia ja joista ilmoitetaan sekä Sulfs. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että proliferaation ja eloonjäämisen 3 näistä (BxPC-3, HS766T ja L3.6sl) riippuvat käytössä Wnt signalointia [M. Pasca di Magliano ja M. Hebrok, julkaisemattomia havaintoja]. Olemme osoittaneet, että Wnt signalointia inhiboitui merkittävästi yli-ilmentämällä yhdistelmä-DNA-SFRP-2 näissä solulinjoissa. Lisäksi yliekspressio katalyyttisesti inaktiivinen sulf-2 samansuuntaisia ​​johti merkittävään inhibitioon Wnt aktiivisuuden, ja kun solut on altistettu inaktiivisiksi sulf-2-proteiinin viljelyn aikana esti sekä Wnt signaloinnin ja kasvua. Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia ​​Wnt-ligandin riippuvainen näiden solujen kasvua ( ”autokriinisen Wnt signalointi”), joka on moduloitu ekstrasellulaarisen Sulfs. On todennäköistä, että CFPAC-1-solulinjassa, joka oli tulenkestävät kaikki nämä hoidot, kuljettaa aktivoiva mutaatio alavirran elementit Wnt-signalointireitin, joka ohittaisi tarpeen solunulkoisen Wnt-ligandien ja Sulfs. On huomattava, että Sulfs ovat ylimääräinen esimerkki solunulkoisen tekijä, joka moduloi Wnt signalointia.