Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kuvaamme uusien bioinformatiikan ja translationaalisen patologian lähestymistapa, geeni Signature Finder Algorithm (gSFA) tunnistaa biomarkkerit liittyy peräsuolen syövän (CRC) selviytymisen. Tässä vankan CRC markkereita valitaan ottamalla Ensemble menetelmällä. Käyttämällä aineisto 232 geeniekspressioprofiilien, gSFA havaitsee 16 erittäin merkittävä pieni geeni allekirjoitukset. Analyysi dikotomiat tuottaman allekirjoitukset johtaa joukko 133 näytettä vakaasti luokiteltu hyvää ennustetta ryhmässä ja 56 näytteiden huono ennuste ryhmässä, kun taas 43 pysyvät epäluotettavasti luokiteltu.

AKAP12

,

DCBLD2

,

NT5E

ja

SPON1

ovat erityisen edustettuina allekirjoituksia ja valittu validointi

in vivo

kaksi riippumatonta potilasta ikäluokat sisältää 140 kasvain kudosten ja 60 vastaaviin normaaleihin kudoksiin. Niiden ilme ja sääntelyyn ohjelmat tutkitaan

in vitro

. Osoitamme, että kytketyn ilmaus

NT5E

ja

DCBLD2

voimakkaasti stratifies potilaitamme kahdessa ryhmässä (joista yksi 100% eloonjääneitä viisi vuotta). Osoitamme, että

NT5E

on tavoite TNF-α signalointi

in vitro

; tuumorisuppressorigeenin PPARy toimii uutena

NT5E

antagonisti, joka positiivisesti ja samanaikaisesti säätelee

DCBLD2

on syöpäsolu yhteydessä-riippuvaisella tavalla.

Citation: Pagnotta SM, Laudanna C , Pancione M, Sabatino L, Votino C, Remo A, et al. (2013) Ensemble of Gene allekirjoituksista Tunnistaa uusien biomarkkereiden kolorektaalisyövässä Aktivoitu kautta PPARy ja TNFa Signaling. PLoS ONE 8 (8): e72638. doi: 10,1371 /journal.pone.0072638

Editor: Anthony W. I. Lo, Kiinan University of Hong Kong, Hongkong

vastaanotettu: 18 huhtikuu 2013; Hyväksytty: 11 heinäkuu 2013; Julkaistu: 19 elokuu 2013

Copyright: © 2013 Pagnotta et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Ministero dell’Università e della Ricerca alle avustus (PRIN2008-20085CH22F) ja Associazione Italiana per la lotta ai linfomi e leucemie. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syövän (CRC) on yksi yleisimmistä pahanlaatuisten kasvainten maailmanlaajuisesti ja yleinen syy sairastuvuuteen ja kuolleisuuteen. CRC selviytyminen liittyy läheisesti kliiniseen ja patologinen vaiheessa taudin diagnosointiin; Yli kolmannes CRC potilaista kuolee viiden vuoden kuluessa alustavan diagnoosin ja useimmat kuolemantapausriskin johdu maksametastaaseista [1].

Huolimatta viimeaikaisista käyttöön tehokkaammat terapeuttiset aineet, on olemassa vain muutamia validoitu prognostisia biomarkkerit arvioida aggressiivisuus taudin ja toistumisen todennäköisyys tai kuolema leikkauksen jälkeen. Viimeaikaiset tutkimukset ehdottavat pieni geeni allekirjoitukset tunnusmerkkejä kasvaimen vaiheen [1,2]. Ajan tasalla integroiva tutkimuksia löydettiin amplifikaatioita

ErbB2

ja

IGF2

ja geenien merkittävästi mutatoitunut CRC kuten

APC, TP53, Smad4, PIK3CA

ja

KRAS

mahdollisina terapeuttisina kohteina [3]. Siten tunnistaminen tarkka ennakoivan ja ennustetekijöitä markkereita yhdistettynä kasvavaan arsenaali terapeuttisten aineiden tarjoavat tehokkaampia hoitoja liittyvät potilaan molekyyliprofiilin minimoida hengenvaarallisia toksisuuksien [4].

kehittäneet uuden laskennallisen lähestymistapa , geeni Allekirjoitus Finder Algorithm (gSFA) tuottaa useita pieniä geenin sarjaa, joka osittaa osalta potilaiden eloonjäämisen. Strategiamme käyttää saatavuuden laajamittainen geeniekspression aineistoja on valita hakijat, jotka voidaan sitten validoitu riippumattomia kirjastoja kudoksiin. Olemme lähestyneet ongelmaa talteen sopivia ominaisuuksia maailmanlaajuinen geeniekspressiota, joka parhaiten korreloi kliinisen tiedon luomiseen ennustetekijöitä allekirjoituksia. Useimmat nykyiset menettelyt perustuvat asiantuntijatietoa valita muun tuhansien geenien, molekyylimarkkereiden joka voi liittyä ennusteen [5]. Äskettäin uusia menetelmiä, maadoitettu on tiedon louhinta, koneoppiminen [6] ja tilastollinen regressio [7] ”Signature oppimisen” on ehdotettu. Tämä on mielenkiintoinen aihe Laskennallisen biologian ja voidaan mallintaa ongelmana optimaalinen ominaisuuksien hallintaan [8]. Täällä hyväksyttiin optimality kriteerinä merkityksen log-rank-testi välillä eloonjäämiskäyrien ryhmien aiheuttama valittujen ominaisuuksien ja käyttää uusi menetelmä, joka yhdistää useita allekirjoituksia syntyy perus ahne algoritmi. Allekirjoitus geenit sitten paremmuusjärjestykseen sen perusteella, joidenkin pisteet mittareita, jotka mittaavat osuus geenin allekirjoitukset se kuuluu.

Lähtien julkinen aineisto on kaksisataakolmekymmentäkaksi CRC geeniekspressioprofiilien, algoritmimme valitaan, muun muassa, selviytyminen liittyvät biomarkkerit kuten

AKAP12, DCBLD2, NT5E

, ja uusia CRC-spesifisiä markkereita, kuten

SPON1

. Seuloimme ehdokas geenit kahden riippumattoman kohortteja 140 primaarisessa satunnaista CRC käyttämällä immunohistokemia kudossiruina (TMA). Vaihtelut geenien ilmentyminen tutkittiin myöhemmin käytettäessä

in vitro

solussa, joka vahvisti

in vivo

tietoja. Yhdessä meidän data tarjoaa uuden menetelmän tunnistaa uusia ja vankka biomarkkerit arvokkaana askel kohti parempaa prognoosi- kerrostuminen ja potilaiden hoitoon.

Materiaalit ja menetelmät

Microarray Tietoaineistot

Käytämme

gSFA

(kuvattu alla) julkisille aineistoja tunnistaa joukko biomarkkereita. Tiedot otetaan huomioon ovat ne kokoelmista raportoitu [9] ja saatavana GSE17536 ja GSE17537 aineisto Gene Expression Omnibus (GEO) (www.ncbi.nlm.nih.gov/geo). Molemmat aineistot ovat geeniekspressioprofilointi saadaan käyttämällä Affymetrix GeneChip- Human Genome U133 Plus 2.0 Array. GSE17536 laskee 177 näytteet 54613 geeni-antureista, kun taas GSE17537 on 55 näytteet saman antureista. 232 Raaka solu tiedostot on ladattu molemmista kokoelmista, sitten taustakorjausta, kvantiili- normalisointi ja yhteenvetoa sovellettiin.

kasvainnäytteestä

Analysoimme CRC näytteet kahdesta itsenäisestä potilaiden ikäluokat käsittää koesarjan ja validointi sarja (I ja II), tässä järjestyksessä. Kohortti I käsittää yhdeksänkymmentäkahdeksan CRC tapauksissa ja 60 pariksi normaalisti limakalvo poistettiin samana leikkauksen. Tämä aineisto sisältää sekä parafiiniin ja nestemäistä typpeä jäädytetyt yksilöitä, kuten on raportoitu [10,11]. Kohortti II koostuu 42 tapausta satunnaista CRC kerätään patologian osaston ja Oncology, Legnago Hospital Verona, Italia kaudella 2005-2007. Kasvaimet luokiteltiin ja porrastettu kriteerit TNM ja kasvaimen vaiheiden I-IV luokittelujärjestelmiä; keski-ikä potilailla oli 71,2 ± 18.21. Yhdelläkään potilaalla ei ollut suvussa suoliston toimintahäiriöitä tai CRC, olivat saaneet kemoterapiaa tai sädehoitoa ennen resektiota eikä ollut ottanut steroideihin kuulumattomien tulehduskipulääkkeiden säännöllisesti. Tavanomaisen leikkauksen jälkeen hoitoja tarjotaan kaikille potilaille, riippuen sairauden vakavuudesta. Kokonaispituus selviytymisen laskettiin alkaen ensimmäisestä leikkauksesta. Potilaita seurattiin keskimäärin 55 kuukauden ajan tai kunnes kuolema.

immunohistokemiallinen analyysi ja arviointi värjäys

immunohistokemiallinen analyysi, kudosleikkeiden poistettiin parafiini, hydratoitiin porrastettu alkoholia ja mikroaaltouuni hoitoa 20 min 750 W. Heat-epitooppisup- haku suoritettiin kuumentamalla TMA liukuu upotetaan haku puskurissa sitraattia (pH 6,0). Leikkeitä inkuboitiin 3% vetyperoksidia 20 minuuttia huoneen lämpötilassa ja sen jälkeen spesifiset vasta- aineet: AKAP12 (laimennus 1: 500; WH0009590M1, hiiri monoklonaalinen, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), Spondin1 (laimennus 1: 250; AB40797, kanin polyklonaalinen, Abcam, Cambridge, UK)); NT5E (laimennus 01:50; AB115289, kanin polyklonaalinen, Abcam, Cambridge, UK); ja DCBLD2 (laimennus 1: 100; AB115451, kanin polyklonaalinen, Abcam, Cambridge, UK) kaikki vasta-aineet, inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa. Sekundäärisiä vasta-aineita, jota seurasi streptavidiini-piparjuuren järjestelmä inkuboitiin 30 minuuttia kutakin, käyttämällä streptavidiini-biotiini-peroksidaasi-värjäykseen tarkoitettua reagenssipakkausta (LSAB + System HRP; Dako Cytomation, Glostrup, Tanska). Paljastettiin immuunireaktiivisuus inkuboimalla 3,3-diaminobentsidiiniä (DAB) -substraattia 5 minuuttia. Tämän jälkeen leikkeet vastavärjättiin hematoksyliinillä, de-sammutettua, ja kansi-liukastui. Ensisijainen aineet jätettiin pois negatiivisissa vertailuissa.

semikvantitatiivinen lähestymistapaa käytettiin arvioimaan immunoreaktiivisuus ottaen huomioon positiivisten solujen määrän ja värjäys jakelu värjäytyminen subsellulaarisessa (soluliman ja /tai kalvo). Kunkin näytteen koko pala mikro kudosta tarkasteltiin valomikroskoopilla 20x suurennuksella. Prosenttiosuus syöpäsolujen tunnistaa immunoreaktiivisuus kunkin merkin, arvioitiin kaikkien näytteiden TMA. Edustavalla (5 korkea teho kenttä), joka sisältää eniten syöpäsolujen käytettiin laskemalla kasvaimen soluihin per jakso. Fraktio (prosentuaalinen immunoreaktiivisia kasvainsolujen, kolmena kappaleena näytettä) ilmaistaan ​​positiivisten solujen määrän Fields (PCF), laskettiin sitten.

Ethics lausunto

Tutkimus suoritettiin periaatteiden Helsingin julistuksen ja hyväksynyt Institutional Review Board of ”FatebeneFratelli” sairaalan Beneventossa ja Legnago Hospital, Verona, Italia. Kaikki potilaat edellyttäen kirjallinen lupa varten otetaan näytteitä ja myöhempää analysointia.

Tilastollinen analyysi: geeni Allekirjoitus Finder Algorithm (gSFA) B

geenin valintamenettely työllistää tehokas kääre menetelmällä [8] perustuva on ilman valvontaa klusterointi, jossa häiriön järjestelmä tuottaa useita geenien, joissa on eri alkuehdot aloittaa geenin valintaan. Alkuehdot vastaavat siemeniin geenejä, joilla on joitakin ominaisuuksia, kuten on hyvä alkuperäisen hypoteesin. Tuloksena algoritmi määritellään

geneSignatureFinder

(gSFA) toteutetaan R-paketti saatavilla CRAN (https://cran.r-project.org/web/packages/geneSignatureFinder/index.html) käytettäessä avoimen lähdekoodin ladattavaksi. gSFA, joka on yleistys modifioidun Jyrkin laskeutuminen ehdottama Boutros et al. [6], sisältää neljä päävaihetta (kuva 1):

geeni Allekirjoitus Finder Algoritmi

koostuu 4 erillistä vaihetta: (1) löytää ehdokas siemenet geenit; (2) tuottaa allekirjoitusta alkaen kunkin siemenistä geenistä; (3) karsia allekirjoitukset tilastolliseen päättelyyn; (4) yhdistää allekirjoitukset geeni sijoitusta.

Vaihe 1:

Siemenet Finder

Ensimmäiseksi meidän algoritmin tarkoituksena oli valita joukko geenejä, jotka voivat olla luotettavan käynnistyksen siemen laajentaa allekirjoitus. Käytimme joukko geenejä mukaan kaksi ehtoa: (a) bimodaalis- ilmaisun tasoilla (b) kyky erottaa aineisto kahteen ryhmään sen perusteella, selviytymisen analyysin testi. Erityisesti kunkin geenin

i

katsoo sekvenssin g

i

= {

x

ij

,

i

= 1 …,

M

}, jossa

x

ij

on ilmentymistason geenin

i

vuonna näyte

j

. Bayes Information Criterion (BIC) [12] käytetään sitten tarkistaa kaksihuippuisuutta hypoteesi sekvenssin g

i

. Sekvenssi g

i

on ryhmitelty kaksi alaryhmissä S

1 ja S

2 käyttämällä

k

-median algoritmia (

k

= 2) ja etäisyys eloonjäämiskäyrien näytteiden S

1 ja S

2 lasketaan sitten. Seed geenit ovat ne ilmentämään kaksihuippuisuutta ja toisistaan ​​käyrien alle valitun merkitys kynnys (kaikissa kokeissa 0,05).

Vaihe 2:

Signature eteneminen

Koska joukko

K

siemen geenejä valittiin edellisessä vaiheessa, laajensimme aa pieni geeni allekirjoitus alkaen kunkin siemenistä geenistä. Ahne strategia hyväksytään valitsemalla ensi allekirjoitus geeni geeni maksimoida kasvu välisen etäisyyden eloonjäämiskäyrien kahdet S

1 ja S

2 saatu ryhmittelemällä kaksiulotteisen aineisto (joka sisältää n siemen geeni ja seuraava ehdokas allekirjoitus geeni). Algoritmi jatkaa lisäämällä geenejä kuhunkin allekirjoitus tällä tavoin, kunnes ei enää parantaa etäisyyttä eloonjäämiskäyrien saadaan.

Vaihe 3:

Allekirjoitus analyysi ja karsiminen

tärkeää indeksi

lasketaan kullekin geenin

K

allekirjoituksia, se on mitta siitä, kuinka paljon yhden geenin osaltaan parantaa etäisyys eloonjäämiskäyrien suhteen etäisyyden, joka perustuu kaikkien geenien allekirjoitus. Se määritellään 1 miinus suhde etäisyyksien eloonjäämiskäyristä saadaan, kun valitun geenin poistetaan allekirjoitus (yksityiskohdat oheisten tiedoston täydentävä gSFA menettely). Sitten jokainen allekirjoitus karsitaan geenit, jotka eivät merkittävästi lisää erottaminen kahtiajako syntyy allekirjoituksella.

Vaihe 4:

Gene Sijoitus

Vuodesta kokonaisuus geenin

K

allekirjoitukset, voimme saada erilaisia ​​tulokset valita ehdokkaan geenejä, jotka mahdollisesti liittyvät ennustetekijöiden ryhmiin. Me pisteet geenien perusteella allekirjoitusten lukumäärä, jossa ne esiintyvät ja niiden keskimääräinen merkitys indeksin.

Oheiset Materials Menetelmät S1 (Täydentävä gSFA menettely) sisältää kaikki yksityiskohdat algoritmin ja komennot kopioida koko analyysin R käyttäen gSFA paketti.

Tulokset

geeni Allekirjoitus Finder Algorithm (gSFA) paljastaa monta allekirjoitusta liittyy soluadheesiota ja soluväliaineen organisaatio

soveltanut gSFA on aineisto on kaksisataakolmekymmentäkaksi CRC näytettä ja tunnistettu 16 siemen-geenejä, jotka osoittavat merkittävää (

p

0,05 korjauksen jälkeen) univariate erottaminen eloonjäämiskäyrien hyvän ja huonon ennusteen ryhmät, ja ovat bimodaalinen samanaikaisesti (noin 1/3 koettimien osoittavat kaksihuippuisuutta). Kustakin siemen-geeneistä saadut allekirjoitukset, jotka on lueteltu taulukossa 1; vastaava selviytyminen käyrät kuviossa S1. Useimmissa tapauksissa,

p

-arvo ei ole laskettavissa kun otetaan huomioon, että

t

-arvo on yli koneen tarkkuuden. Vaikka valitun geenin osajoukot voi olla erilainen, eloonjäämiskäyrät usein olevan samanlaista (kuvio S1), joten kysyimme ero erottaminen aiheuttama kunkin allekirjoituksen. Me lasketaan etäisyys klusterointi saatu kunkin 16 allekirjoitusta ja saada dendrogrammi esitetään kuviossa 2a: havaitsemme, että eri geenistä allekirjoitus voi lopulta tuottaa samanlaisia ​​dikotomioiden. Tämä dendrogrammi voidaan saada vankka luokittelu näytteiden kahteen ryhmään sen mukaan, kuinka monta kertaa tietyn näyte kuuluu yksi ryhmistä. Erityisesti

vakaa hyvää ennustetta ryhmä

käsittää näytteitä, että vähintään 80% dikotomioiden lasku hyvää ennustetta ryhmä, analogisesti että

vakaa huono ennuste ryhmä

. Niinpä 133 ja 56 näytettä oli luokiteltu tallissa hyvä vai huono ennuste ryhmä, vastaavasti, kun taas 43 pysyi epäluotettavasti luokiteltu ja määritelty epävarma näytteitä. Vastaavat selviytyminen käyrät esitetään kuviossa 2b, log-rank-testi näiden kolmen käyrän välillä antaa

p

-arvo 10

-16. 1609 ilmentyvät eri geenit (kertainen muuttaa 1.5 ja korjataan

p

-arvo 0,05) kahden stabiilin ennustetekijöiden ryhmää syntyy klusteroinnin heatmap kuvion 2c. Näytteet jaettiin kahteen pääryhmään: ensimmäinen käsitti 113 ulos 133 (85%) on vakaasti luokitellaan hyvää ennustetta ryhmä; toinen 55 ulos 56 (98%) ja huonoon ennusteeseen ryhmä. Vastaavat selviytyminen käyrät esitetään kuviossa 2d, log-rank-testi kahden käyrän välinen antaa

p

= 6.6 · 10

-6. Siluetti Klusterin erottaminen on myös raportoitu oheisessa tiedostoon täydentävä gSFA menettelyä.

Seed Gene

t

-arvo

log (

p

-arvo)

Allekirjoitus

PCSK5 (205560_at) 76,572 -16PCSK5, AKAP12, NPR3, AGPAT5, GMFB, C6orf141, 1569202_x_at, KCNH8FST (226847_at) 75,757 -16FST, AKAP12, ULBP2, SLC25A43, EI24, 1563467_at, CLDN8POSTN ( 214981_at) 74,023 -16POSTN, AKAP12, AGPAT5, ATL3, SLC44A2SUSD5 (214954_at) 71,842 -16AKAP12, 241867_at, ADAMTS5, APLP2, PITPNC1, 1556983_a_atKIAA1462 (231841_s_at) 67.624-15.654KIAA1462, DCBLD2, ADIPOQ, FAM217B, C17orf48DCBLD2 (230175_s_at ) 66.71-15.477DCBLD2, AKAP12, GUSBP11, CDR2L, MGC16703, METTL4NPR3 (219054_at) 66.457-15.477NPR3, DZIP1, 243820_at, 238109_at, 236795_at, DNAJC4, FOXA1, EMID2AKAP12 (227530_at) 65.522-15.256AKAP12, ISM1, C11orf9, 244026_at, ARHGAP9, NOL3, AP2A1PAPPA (201981_at) 65.024-15.109PAPPA, NT5E, DUSP7, 230711_at, CD96, ABI2ETV1 (221911_at) 61.631-14.386ETV1, LONRF3, NGEF, RAB2A, U2AF2, CPOKIAA1462 (213316_at) 60.733-14.184KIAA1462, AKAP12, UGGT2 , 231989_s_atSRGAP2P1 (1568955_at) 58.417-13.674SRGAP2P1, AKAP12, SNX16, NT5ELOC100132891 (228438_at) 58.037-13.589LOC100132891, DCBLD2, ADIPOQ, SLFN5DCBLD2 (224911_s_at) 50.106-11.837DCBLD2, ADCY7, EHD2CTGF (209101_at) 46.099-10.949CTGF, FERMT1, AKAP12 , CDK1EFHA2 (238458_at) 42.166-10.076EFHA2, ST18, ACACBTable 1. allekirjoitukset kehitetty 16 siemen-geenejä.

CSV Lataa CSV

a. Dendrogrammi, että dikotomioiden syntyy kunkin 16 gSFA allekirjoituksia (taulukko 1 ja kuvio S1); b. Survival juoni 133 näytteiden vakaasti luokiteltu hyvää ennustetta ryhmä, 56 näytettä huono ennuste ryhmä ja 43 epävarmaa näytteiden (log-rank-testi antaa

p

10

– 16); c. heatmap DEGS kahden stabiilin ryhmien Punainen osoittaa ilmentynyt geenejä (ekspressiotasot yli mediaani) ja vihreä tarkoittaa ali-ilmentynyt geenejä (ekspressiotasot alla mediaani); d. eloonjäämiskäyristä näytteet kahteen klustereiden heatmap kuin c. (

p

= 6.6 · 10

-6).

Valaistaan ​​biologisia prosesseja ja toimintoja, jotka liittyvät näiden kahden klusterit tunnistimme 1394 ilmentyvät eri probesets vastaa 1024 eri geenit (DEGS), 87%, jotka sisältyvät luetteloon DEGS välisen stabiilin ennustetekijöiden ryhmiä. DEGS lista rikastettu useita Gene ontologia (GO) luokat. Meidän gSFA menettely on valittu, koska liittyy huono ennuste ryhmä, joukko näytteitä mesenkymaalisten piirteitä liittyy geenien mukana leviämisen ja soluadheesion. Erityisesti GO analyysi geenien säädellään ylöspäin köyhien ryhmä osoitti, että

Cell Adhesion

rikastettiin 123 DEGS (

p

10

-28),

soluväliaineen Organization

34 geenejä (

p

10

-15),

Response haavan tekemistä

95 DEGS (

p

10

-22),

Immuunivaste

91 geenejä (

p

10

-14). Lisäksi nämä DEGS rikastuttanut Kegg Pathways

ECM-reseptorin vuorovaikutus

(

p

10

-10) ja

Focal tarttuvuus

(

p

10

-8). Kun ladattu Ingenuity Pathway Analysis, lista DEGS tuottanut joukon rikastettua luokat, joiden

p

-arvo on selvitetty kuvassa S2a. Erityisesti muiden luokkien liittyvä kudosten kehittämiseen ja syövän olivat merkittävästi rikastettu; erityisesti niitä, jotka liittyvät peräsuolen syöpä oli rikastettu

p

10

-14.

Jotta ymmärtää keskeiset sääntelyviranomaisten mukana erottaminen kahdessa ennustetekijöiden ryhmien rikastuminen analyysi alkupään sääntelyviranomaisten suoritettiin. Mielenkiintoista, transformoiva kasvutekijä beeta 1 (TGFp 1) oli säädellään ylöspäin huono ennuste klusterin [13]. Lisäksi verkolle 20 säätävät kuviossa S2b voisi selittää käyttäytymistä 177 valitun geenin. Alkuun säätelijöinä verkon käsitti myös muita liukenevia kasvutekijät, kuten jäsenten fibroblastikasvutekijän (FGF) ja tuumorinekroositekijä (TNF) perheet. Valitut geenit ovat mukana lähinnä TGFp 1 signalointi, kuten 109 molekyylit (

p

10

-51) ovat sen selityksin tavoitteet IPA tietopohjaa. Reseptoriperäinen signalointi vastauksena näihin ligandeihin laukaisee aktivoitumisen solunsisäisten efektorimolekyylien, kuten pienet GTPaasi perheen RAS jäsenet SRC tyrosiini- -kinaasiperheen tai transkriptiotekijöiden mukaan lukien Smad, RUNX2, STAT3, NFKB, p53 ja β- kateniinin. Nämä effektorit on keskeinen rooli CRC etenemiseen ja metastaattinen invaasio edistää muodostumista kasvaimeen liittyvää mikroympäristön.

TMA validointi biomarkkereiden tunnistetaan ensemble allekirjoitukset

tunnistamiseen vankka biomarkkerit liittyvät CRC ennuste, joka voidaan validoitu kaksi kirjastojen kudosten, käytimme sijoitusta raportoitu kolmannessa vaiheessa gSFA ja tuloksena geenit on esitetty taulukossa S1, jossa

AKAP12, DCBLD2, NT5E

olivat yleisimpiä geenit valitaan algoritmin eri allekirjoitukset. Olemme myös validoitu SPON1 kuin yllättäen, se oli kaikkein differentiaalisesti ilmentyvien geenien kahden ryhmän; kuitenkin, sen rooli CRC ei ole käsitelty vielä. Me seulottiin immunohistokemiallinen (IHC) TMA meidän sarjan 140 CRC ja osajoukko 60 normaalin sovitettu paksusuolen näytteiden määrittämiseksi ennustetekijöitä potentiaalia valitun geenejä. Markkereita ”ilmentymiskuvio tallennettiin suhteessa positiivisia soluja: positiivinen värjäytyminen yli 25% kasvainsolujen määriteltiin korkean ilmentymisen. Kuva 3a raportoi edustaja kudoksen diat TMA leimattu vasta-aineita AKAP12, DCBLD2, NTE5 ja SPON1. Kuva 3b raportoi yleistä prosenttiosuudet havaitsemisen välillä kasvaimen ja normaalin näytteitä. Kuviossa S3 edelleen värjäytyminen DCBLD2 ja NT5E suuremmalla tarkkuudella havainnollistetaan.

a. ”Sarakkeet vasemmalta oikealle” osoittavat immunovärjäyty- kuvio normaalissa paksusuolen näytteiden ja CRC sydämiä negatiivisia ja positiivisia kunkin markkerin AKAP12, DCBLD2, NT5E, SPON1. Mustat nuolet osoittavat immunohistokemiallisella värjäyskuvion normaalissa tai pahanlaatuinen paksusuolen soluja. Valkoinen nuolet osoittavat Immunovärjäyksen jakelun strooman osastoon (endoteelin, säätelijä-T-solut ja makrofagit) ominaisia ​​NT5E ilmaisun kuvio. Suurennus 10X; b. Positiivisten tapausten havaitaan TMA validointi sarja käsittää kasvaimen yksilöt (TUM) ja alaryhmä vastaaviin normaaleihin paksusuolen limakalvo (NM). Virhe palkit ilmaisevat keskihajonta keskiarvosta (

p

0,05); c. Neljä edustaja jäädytetty CRC yksilöt (T) ja vastaaviin normaaleihin limakalvo (N) tunnistettiin samalla kohortin potilaiden ja analysoitiin immunoblottauksella. Molekyylipainomarkkerit ilmoitetaan kilodaltoneina. β-tubuliinia käytettiin latauskontrollina normalisoida kaistaintensiteettejä.

Normaalissa paksusuolen limakalvo, AKAP12 Immunovärjäys aina positiivinen, lokalisoitu sytosoliin ja jakautunut pääasiassa apikaalisella krypta, siis eriytetympää solut. CRC näytteitä, AKAP12 immunoreaktiivisuus säilyi 55%: n ja poissa noin 45%: ssa tapauksista.

DCBLD2 oli aina positiivinen on normaalia koolonin soluihin ja tasaisesti paikallistaa Baso sivuttainen solukalvojen. CRC näytteitä, Immunovärjäyksen havaittiin noin 52%: ssa tapauksista. Muutaman tuumorisektioiden, DCBLD2 immunopositivity myös lokalisoitu sytosolin osastoon.

NT5E immunopositivity pääasiassa havaittu stroomasoluissa (endoteelin tai säätelijä-T-solut) normaalin paksusuolen limakalvo, kun se oli heikosti positiivinen tai negatiivinen epiteeli- paksusuolen soluissa. Tämän mukaisesti havainnon, NT5E immunopositivity merkitty kasvainliitteisten strooman ja oli poissa pahanlaatuisia soluja noin 40% kasvain näytteistä. Mielenkiintoista on, että loput 60%, NT5E värjäystä merkitty myös pahanlaatuiset epiteelisolut, lisäksi strooman niitä.

SPON1 immunoreaktiivisuus oli positiivinen vain noin 20% normaalista paksusuolen näytteitä. Huomattavaa on, SPON1 havaittiin noin 70% CRC näytteistä, joissa on kalvo tai soluliman lokalisointi. Positiivisuus kasvaimiin korreloi merkitsevästi kollageeni IV ja vimentiinista ilmaisun, mikä viittaa rooli SPON1 uudelleenorganisoinnissa ja remontin kasvaimen soluväliaineen (ECM) (tuloksia ei ole esitetty).

Western Blot analyysi Ensisijainen CRC

vahvistavan IHC ilmaisun profiilia ja saada enemmän kvantitatiivista tietoa, kaksikymmentä satunnaisesti valitun CRC yksilöitä ja vastaaviin normaaleihin mucosas saman kohortin potilaista analysoitiin western blot käyttäen samaa käytetyt vasta IHC. Tämä analyysi myös vahvisti vasta-aineiden spesifisyys. Bändit saatu kvantitoitiin densitometrisesti jälkeen normalisoinnin p-tubuliinin Proteiinilisäyksen. AKAP12 ja DCBLD2 oli usein havaittu alhaisempi kasvaimen (T) kuin normaali täsmäsi kudoksista (N). Sen sijaan NT5E ja SPON1 ilme näytti huomattavasti korkeampi kasvaimissa kuin valvontaa. Kuva 3c raportoi vastaavat vyöhykkeet neljän edustavan näytteen, kvantisointi joista on raportoitu kuvassa S4a. Vaikka tarkoitetut tiedot ainoastaan ​​20 tapauksessa ne vahvistivat spesifisyys tulosten ja vahvistettu erot normaalin ja kasvaimen havaitsemista IHC on TMA.

Biomarkers Expression Profiles ja kliinis-patologisten parametrit

Teimme monivertailukoetta arvioitaessa IHC ilmaisun taajuuden kunkin biomarkkereiden ja kliinis-patologinen parametreja. Emme löytäneet yhdistyksen välillä AKAP12 tai SPON1 geeniekspressioprofiili ja potilaiden ikä, sukupuoli, kasvaimen vaiheesta, erilaistumisen tai histologian, läsnäolo solmukohtien ja maksametastaaseja. Sen sijaan menetys DCBLD2 korreloi pitkälle edennyt tauti (

p

= 0,021). Itse asiassa, 37,4% testatuista näytteistä alhainen DCBLD2 ilmentyminen oli useammin Stage IV-kasvaimissa verrattuna 15% DCBLD2 erittäin vahvasti ilmentävä niistä. Näin ollen vaikka tapauksissa liittynyt etäispesäkkeitä oli merkittävästi alhaisempi DCBLD2 ilmaisun kuin ilman maksametastaaseista (

p

= 5,71 · 10

-5). Erityisesti myös kasvaimen ilmentävät korkeita NT5E oli samanlainen herkkyys etäpesäkkeitä (

p

= 6,62 · 10

-4). Yhdistyksen välillä biomarkkereiden ja kliinis-patologinen parametrit meidän CRC aineisto on kuvattu taulukossa S2.

tutkia mikä valituista geeneistä oli myös itsenäinen ennustaja elossaololuku meidän CRC validointi sarja, me luokiteltu kasvaimet niin alhainen tai korkea ilmentävät kutakin biomarkkereiden tutkittavana. Kaplan-Meier selviytymisen analyysi paljasti, että menetys AKAP12 niukasti liittyy huono yleistä (OS) (

p

= 0,0758, kuva 4a). Merkillistä, matala kalvoon liittyvä ilmaus DCBLD2 ja yliekspressio NT5E kasvainsoluissa oli voimakkaasti yhteydessä lyhyempi elinaika (

p

= 5,97 · 10

-7and

p

= 1,01 · 10

-5 vastaavasti kuva 4c ja 4d). Ei merkittävää yhteyttä OS todettiin ottaen huomioon vain NT5E immunopositivity kasvaimen liittyvän-strooman (kuva S5). SPON1 yli-ilmentyminen ei korreloi potilaan ennusteeseen (tuloksia ei ole esitetty).

a. Eloonjäämiskäyrät meidän CRC validointi sarja, luokiteltu joilla on korkea (punainen käyrä) ja matalan (vihreä käyrä) AKAP12, DCBLD2 ja NT5E ilme.

p

-arvon nollahypoteesille yhtäläisen väestöstä eloonjäämiskäyrien tarjoaa log-rank-testi kunkin kaavion; b. Eloonjäämiskäyristä arvioitu yhdistämällä lauseke (

korkea

ja

alhainen

) kaikista 3 markkereita (AKAP12, DLBLC2, NTE5). Punainen käyrä edustaa yhdistelmä

korkea /high

; sininen käyrä edustaa yhdistelmä

korkea /matala

; musta käyrä edustaa yhdistelmä

pieni /suuri

; vihreä käyrä edustaa yhdistelmä

pieni /matala

.

Lopuksi arvioidaan, ovatko kaikki kolme ennakoivaa markkereita (AKAP12, DCBLD2, NT5E) voitaisiin käyttää vuorovaikutukset ja parantaa ennustetekijöiden tarkkuutta. Tapaukset luokiteltiin 4 ryhmiin niiden ekspressiotasot (kuvio 4d, 4e, 4f). Erityisesti 100% potilaista osoittaa yhdistelmän DCBLD2

korkea /NT5E

alhainen oli elossa 5 vuotta diagnoosin. Sitä vastoin vain 30%: lla potilaista, joiden kasvaimet ilmentävät yhdistelmä DCBLD2

pieni /NT5E

korkea olivat elossa. Tämä selviytymisen ero oli riippumaton adjuvanttihoitoa tai sairauden vaiheesta.

ilmentäminen valittujen biomarkkereiden CRC solulinjoissa

päästääkseen oivalluksia kandidaattigeeneihin, arvioimme niiden proteiinin ilmentymisen profiili kuusi edustaja ihmisen CRC solulinjat (kuvio S3b). AKAP12 proteiini havaittiin vain HCT116 ja DLD1 solut mukaan aikaisempien tutkimusten [14]. DCBLD2 ilmentyi hyvin alhaisilla tasoilla useimmissa solulinjoissa, kun taas NT5E oli hyvin ilmaistu HT29 ja HCT116 verrattuna muita solulinjoja. Lopuksi SPON1 havaittiin useimmissa solulinjojen, ja korkeimmat tasot DLD1.

Cross-talk välillä TNF-α ja PPARy signalointi säätelee NT5E ja DCBLD2

vuonna vivo

tulokset viittasivat siihen, että NT5E ja DCBLD2 ovat mukana kasvaimen invaasion ja metastaasin todennäköisesti läpi kasvaimen aiheuttamaa immunosuppressiivinen mekanismi. Niinpä keskittäneet huomiomme TNF-α, sytokiini, joka säätelee signalointiverkko osallisina tulehdussairauksien ja kasvaimen kehittymisen [15]. Kekseliäisyyttä Pathway Analyysi tiedustellessa korostamaan vaikutuksia TNF-α ja vuorovaikutuksessa sytokiineja. NFKB tullut tärkein solmukohta verkoston ylävirtaan sääntelyviranomaisten valitun DEGS ja puolestaan ​​ratkaisevana modulaattori geenien osallisena tulehdus- ja immuunivasteen (kuvio S6a) [16]. Näiden havaintojen perusteella etsittiin cis-vaikuttavan sääntelyn DNA elementit

NT5E

ja

DCBLD2

promoottorit (kuvio S6b) ja tunnistettu useita otaksuttu NFKB sivuston kaltaisia ​​elementtejä. Voit tarkistaa, onko

NT5E

, ja mahdollisesti

DCBLD2

voitaisiin säädellä tulehduksellinen cascade, käsittelimme HEK 293T-solut LPS, tehokas proinflammatoristen NFKB indusoija, ja saadaan merkittävä aika : sta riippuva induktio

NT5E

; Samoin, ektooppinen ilmentyminen p65 /RelA NFKB alayksikön aiheutti merkittävän induktion edelleen parantaa LPS hoitoon. Sen sijaan transfektio Super vaimentimen IκBα S32 /36 täysin poistanut LPS stimuloiva vaikutus

NT5E

(kuviot S6c ja S6d). b. b. a. b. c.