Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää antituumorivaikutuksen ja mahdollisia mekanismeja i.p. hypertermia yhdessä α-galaktosyyliseramidin (α-GalCer) hoitoon munasarjasyöpä. Tässä tutkimuksessa, immunologiseen toimivaltainen kasvainmuodoista perustettiin käyttäen hiiren munasarjasyövän solulinjoissa ja käsiteltiin i.p. hypertermia yhdistyvät α-GalCer. Th1 /Th2-sytokiinien ilmentymisen profiilit seerumissa, NK-solun sytotoksisuuden ja fagosytoosia toimintaa dendriittisolujen (DC: t) analysoitiin. Analysoimme myös CD8

+ /IFN-γ

+ kasvaimen spesifisten sytotoksisten T-solujen, sekä kasvaimen kasvun perusteella väheneminen lymfosyyttien alapopulaatio. Terapeuttinen vaikutus näihin munasarjakasvaimia seurattiin ei-invasiivisia luminescent kuvantamisjärjestelmä. Intraperitoneaalitestissä hypertermia indusoi merkittävän proinflammatoristen sytokiinien ilmentymisen, ja jatkuva vaste NK ja DC: iden aiheuttama α-GalCer hoitoon. Yhdistelmä hoito paransi sytotoksinen T-lymfosyytti (CTL) immuunivasteen kahden hiiren munasarjasyövän malleja. Tämä uusi hoitomuoto yhdistämällä hypertermian ja glykolipidin tarjoaa voimakas kasvaimen vastainen immuunivaste ja paremman selviytymisen. Lopuksi, vatsaonteloon hypertermian parannettu pro-inflammatoristen sytokiinien eritystä ja fagosytoosiaktiivisuutta DC: iden stimuloitiin α-GalCer. Myöhempi CTL indusoiman immuunivasteen α-GalCer vahvistui entisestään yhdistämällä i.p. lämmönnousua. Sekä synnynnäisen ja adaptiivisen vapaudet olivat mukana, ja tuloksena on ylivoimainen terapeuttinen vaikutus hoidettaessa munasarjasyöpää.

Citation: Wu C-C, Chuang Y-T, Hsu Y-T, Huang J-T, Wu T-C, Hung C-F, et ai. (2013) intraperitoneaalitestissä Hypertermia yhdistäminen α-galaktosyyliseramidin että munasarjasyövän. PLoS ONE 8 (7): e69336. doi: 10,1371 /journal.pone.0069336

Editor: Moriya Tsuji, Aaron Diamond AIDS Research Center Rockefeller University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 15 helmikuu 2013; Hyväksytty: 7. kesäkuuta 2013. Julkaistu: 23 heinäkuu 2013

Copyright: © 2013 Wu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat apurahan Taiwan National Science Council (NSC 98-2314-B-195-008-MY3). Rahoittaja ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Vaikka munasarjasyövän osuus on vain 3% kaikista naisten kasvaimista, se on kaikkein vaarallisin gynecologic maligniteetti maailmanlaajuisesti [1]. Koska puuttuminen erityisiä oireita tai merkkejä ja puute luotettava seulonta yksityiskohtaiset alussa tauti, munasarjasyöpä on useimmiten diagnosoitu edennyt pitkälle [2] – [4]. Tällä hetkellä standardi etukäteen hoitoa epiteelin munasarjasyövän koostuu maksimaalisen sytoreduktiivisen leikkausta seuraa adjuvanttihoitoa platina-taksaanin yhdistelmä hoito. Vaikka vastaus hinnat ovat noin 70-80%, suurin osa näistä potilaista lopulta uusiutumisen. Vaikka yhä useammat kemoterapeuttisten saatavilla uusiutuva sairaus, kurssi munasarjasyöpä on yleensä ominaista toistuvat remissiojaksoista ja uusiutumisen, ja useimmissa tapauksissa tauti lopulta vastustuskykyiseksi kaikille kemoterapia-aineiden ja tulla parantumaton [5]. Perustuu biologinen käyttäytyminen ja leviäminen rakenteessa munasarjasyöpäsoluja useita i.p. hoitomuotoja on kannattanut saavuttamaan paremman tautien torjunnan [6]. Joukossa, i.p. hypertermia, varsinkin yhdistettynä kemoterapia, on osoitettu parantavan terapeuttista tehoa joko optimaalisesti tai osa-optimaalisesti rajatusta munasarjasyöpä [7], [8]. On raportoitu, että korkea lämpötila voi aiheuttaa suora lämpö sytotoksisuutta ja myös tuoda ”terminen kemoterapia-herkistymistä” [9]. On yleisesti uskotaan, että herkistymistä tulokset kasvoivat kudosperfuusio ja kudoksen tunkeutumisen sytotoksisten aineiden. Vaikka perusmekanismit hypertermia on yleisesti hyväksytty, soveltaminen terapeuttisen hypertermia yhdessä kemoterapian kanssa potilaille on paljon monimutkaisempi [10]. Hypertermistä kemoterapiaa (42-43 ° C) on tiedetty liittyvän suurempi sytotoksisuus syöpäsoluja. On kuitenkin olemassa joitakin haittoja, jotka rajoittavat sen käyttöä hoidettaessa munasarjasyöpä, kuten mahdollinen huono-paranemista suoliston anastomosis, riski kemoterapeuttisen aineenvaihduntatuotteiden saastumisen kirurgiselle henkilökunnalle kehon nestettä tai hengittämällä haihduttamalla kemoterapeuttisten aineiden [11]. Lisäksi ei voida soveltaa toistuvasti ilman etsintä vatsaonteloon.

hypertermia itse on osoitettu saavan aikaan useita solu- ja molekyylitason vaikutuksia, erityisesti saamaan aikaan kompleksin immunologinen muutokset vastaanottavassa [12], [ ,,,0],13]. Erityisesti, hypertermia pystyy ajan säätelemään lämpösokkiproteiini kasvainsoluissa, ja jotka liittyvät antigeenin esittelyyn, rajat esitys ja kasvaimen immuniteetin [14]. Kaikki nämä tiedot antavat perusteet yhteydessä parantamaan kasvaimen vastainen vaikutus hypertermian yhdistämällä immuunijärjestelmää moduloivia aineita.

glykolipidin, kuten α-galaktosyyliseramidin (KRN7000, α-GalCer, glykosfingolipidikertymäsairaus) on osoitettu estää kasvaimen kasvua ja pidentää elinaikaa muutamalla hiiren kasvainmuodoista aktivoimalla synnynnäisen ja adaptiivisen immuunivasteen [15], [16]. Useat kliiniset kokeet ovat myös dokumentoitu sen turvallisuudesta ja biologisia vaikutuksia potilailla, joilla on kiinteitä kasvaimia kautta parenteraalisesti [17], [18]. Tämä yhdiste itsessään ei ole sytotoksinen aine, mutta voidaan esittää NKT-solujen CD1d [19], [20]. α-GalCer aktivoiduilla NKT-solut raportoitiin erittämään suuria määriä sytokiineja, mukaan lukien IFN-γ: n ja IL-4, ja siten aktivoimaan muiden efektorien solut, kuten NK-solujen, T-solujen, B-solujen, DC ja makrofagit [16]. Annon α-GalCer osaksi eläimet voivat myös indusoida muiden sytokiinien tuotantoa, kuten IL-2, IL-6, IL-12, ja GM-CSF, joka voi vahvistaa immuunijärjestelmää [21].

Oletimme, että hypertermia ei ole ainoastaan ​​sytotoksinen, vaan myös mahdollisuus paljastaa immunogeenisyyttä kasvainsolujen, ohjata immuunivaste yli mikroympäristön sekä Th1 /Th2-reittejä. Olemme ehdottaneet, että lisäys α-GalCer voi aktivoituvat NKT-solujen samoin kuin kypsymistä DC. Hoidon jälkeen α-GalCer, vahva sytokiinikaskadin myöhemmin esiin, se lisäisi rajat talk välillä synnynnäisen ja adaptiivisen kasvainten vastaisen immuunivasteen.

Tässä tutkimuksessa käytimme eri hiiren munasarjasyövän soluja malleja testata hypoteeseja ja tutkia antituumorivaikutuksen ja taustalla olevien mekanismien ip hypertermia yhdistettynä α-GalCer hoidossa munasarjasyöpä.

Materiaalit ja menetelmät

Hiiri ja Cell Line

C57BL /6-hiirten ja BC3F1 (C57BL /6 x C3H F1) hiiret hankittiin BioLASCO, Taiwan. Eläimiä hoidettiin spesifisissä patogeenivapaissa olosuhteissa. Hiiren munasarjasyövän solulinja MOSEC-luc (C57BL /6-alkuperää ja valmistettu ilmentyminen tulikärpäsen lusiferaasi), ID8-luc (peräisin MOSEC-luc VEGF yli-ilmentyminen), ja HM-1 (BC3F1 alkuperä) viljeltiin RPMI1640-elatusalustassa (Gibco), jota oli täydennetty 10% FBS: ää (Biological Industrial, Israel), 100 U /ml penisilliiniä (Gibco) ja 100 pg /ml streptomysiiniä (Gibco), kostutetussa ilmakehässä, 5% CO

2/95% ilmaa 37 ° C.

Ethics lausunto

Kaikki kokeet seurasi suuntaviivoja suhteen koe-eläinten hyvinvoinnin ja oli sallittua IUAUC Mackay Memorial Hospital (MMH-AS-97030).

intraperitoneaalitestissä hypertermia ja α-GalCer hoito

Voit suorittaa ip hypertermia, tutkiva laparotomiassa tehtiin sen jälkeen, kun hiiret nukutettiin Zoletil (VIRBAC, Ranska) ja rompunin (Bayer Vital GmbH, Leverkusen) ensin. Vatsaonteloon jokainen hiiri jatkuvasti täynnä 45 ° C: ssa 1 x PBS: llä. Lämmitetty PBS täytetään korvata jäähdyttää PBS jonka taajuus 20~30 sekuntia /sykli kaikkiaan 10 minuuttia. Yhdistetyssä hoitoryhmässä, 2 ug α-GalCer (Enzo Life Science, USA) lisättiin vatsaonteloon heti valmistumisen jälkeen hypertermian. Vatsaontelo avattiin myös 10 minuuttia hiirten kontrolliryhmä. Hiiriä pidetään lämpimänä alle lämmittimen valot kunnes ne toipuivat nukutuksesta.

Multiplex Serum Sytokiini Detection

laskimoverta kerättiin pyrstö kunkin hiiren inkuboitiin 37 ° C: ssa 30 min, sitten sentrifugoidaan 1500 x g 10 min. Supernatantti seerumi siirrettiin toiseen puhtaaseen putkeen ja säilytettiin -20 ° C: ssa ennen analyysiä. Konsentraatio IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, INF-α, ja TNF-α seerumissa kunkin hiiren havaittiin BD sytometria Bead Array kit (BD biotieteiden), kuten on kuvattu valmistaja.

Ensisijainen Cell eristäminen ja NK /NKT kennojen tunnistus

eristämisen valkosolujen (WBC), ääreisveren kerättiin häntälaskimosta hiirillä. RBC veressä poistettiin ACK lyysipuskuria (Invitrogen) ja WBC: t suspendoitiin uudelleen RPMI 1640 ennen analyysiä. Eristämiseksi solujen vatsaonteloon, hiiret tapettiin CO

2 eutanasiaa. Soluja vatsaonteloon kerättiin vatsakalvon huuhtelu 3% BSA kylmää 1 x PBS: ää. Solut toipunut huuhtelulla pestiin ja suspendoitiin uudelleen RPMI 1640-väliaine. Sitten solut värjättiin FITC-anti-CD3: n ja PE-anti-NK1.1-vasta-ainetta, kuten valmistuksessa on kuvattu (eBioscience). Populaatiot NK ja NKT-solujen havaittiin virtaussytometrialla. (Calibur, BD Bioscience). Tulokset analysoitiin FACS ilmaista ohjelmistoa.

Detection of Cancer solukuoleman

Yksi miljoonaa ID8-luc solua injektoitiin intraperitoneaalisesti kuhunkin C57BL /6 hiiri koeryhmässä. Kolme päivää myöhemmin, i.p. hypertermia annettiin kasvainta kantavissa hiirissä, kuten on kuvattu aikaisemmin. Ei intervention suoritettiin kontrolliryhmän hiirten, lukuun ottamatta avautumisen /sulkeutumisen vatsaonteloon. Yksi päivä myöhemmin hiiret tapettiin CO

2 eutanasiaa. Solut sisällä vatsaonteloon olivat huuhdeltiin ja värjättiin anneksiini V-APC ja propidiumjodidilla (PI, BD biotieteiden), ja sen jälkeen niille analyysi virtaussytometrialla.

sytotoksisuus peritoneaalisille efektibokseille solujen

kaksikymmentä tuhansia ID8-luc-soluja siirrostettiin jokaiseen kuoppaan pyöreäpohjaisella 96-kuoppaisille levyille kohdesoluina. Ne Levyt suljettiin parafiini ja laittaa nesteen pinnalle 42 ° C vesihauteessa ja inkuboitiin 20 minuuttia. Huuhdeltiin soluja (peräisin kontrolliryhmä tai α-GalCer-käsitellyn ryhmän hiiret) efektoreina solut sitten lisätään ID8-luc solu, joka sisältää hyvin efektorit /kohde (E /T) suhde 05:01 ja 10:01 , ja viljeltiin 37 ° C: ssa yön yli. Kun oli lisätty lusiferiiniä (Etu), määrä selvisi ID8-luc-solujen esitettiin intensiteetti kemoluminesenssin havaita IVIS kuvantamisjärjestelmä. (Xenogen).

dendriittisolujen -fagosytoosikoe

in vitro

Kaksi mikrogrammaa α-GalCer olivat i.p. injektoidaan C57BL /6-hiiristä ja jätettiin yön yli. Hiiret ja ilman α-GalCer hoito lopetettiin ja pernat siirrettiin RPMI 1640-väliaine. Pernasoluja eristettiin Smashing pernat 100 um solun siivilä 6 cm malja sisältää 5 ml RPMI1640. Keskeytetty solut pestiin ja RBC poistettiin ACK lyysipuskuria (Invitrogen). DC: iden näissä pernasoluja puhdistettiin anti-CD11 c magneettiset helmet (MACS, Saksa). Sillä -fagosytoosikoe, ID8-luc solut värjättiin 25 uM CFSE (Sigma), ja sitten annettiin lämpökäsittely kuten aiemmin on kuvattu. Puhdistettu DC: iden kontrolliryhmässä tai α-GalCer-käsitellyn ryhmän hiiret yhteistyössä viljeltiin 1 x 10

5 joko lämmitetään tai ei-lämmitetty CFSE-värjättiin ID8-luc-solut 6 tunnin ajan. DC olivat merkinnät värjäämällä APC-anti-CD11 c-vasta-aine (eBioscience). Prosenttiosuus CFSE-positiivisten DC analysoitiin virtaussytometrialla kanssa gating on CD11 c-positiivisten solujen.

dendriittisolujen -fagosytoosikoe

in vivo

Miljoona CFSE-värjätty (25 uM) ID8-luc soluja ip injektoidaan C57BL /6-hiiristä. Seuraavalla päivää, kaikki hiiret jaettiin 4 ryhmään, ja i.p. hypertermian ja /tai 2 ug a-GalCer. Hiiret saivat laparotomiaa vain (ilman lääkehoitoa) asetettiin kontrolliryhmään. Sen jälkeen, kun 24 tunnin kuluttua vatsaonteloon solut huuhdeltiin ja värjättiin PE-anti-hiiri-CD11 ja APC-anti-hiiri-CD11 c-vasta-aineita (eBioscience). Prosenttiosuus CFSE-positiivinen DC analysoitiin virtaussytometrialla gating CD11 b

+ /CD11 c

+ positiiviset solut.

Tumor Specific CD8

+ T Cell Immunoassay

miljoona HM-1-soluja ip ruiskutetaan B6C3F1 hiirillä ja 3 x 10

5 ID8-luc solua injektoitiin intraperitoneaalisesti C57BL /6-hiiristä. Kolme päivää myöhemmin hiiret nukutettiin ja käsiteltiin i.p. tai ilman α-GalCer. Yhden tai kolmen viikon kuluttua hiiret tapettiin eristämiseksi pernasolut. Pernasoluja (1 x 10

7) viljeltiin kanssa tai ilman sitä 1 x 10

5 syngenetic syöpäsolujen (jotka oli injektoitu vatsaonteloon hiirien) 1 ug: Golgi-tulpan (BD Pharmingen ) 24-kuoppaisilla levyillä. Seuraavana päivänä solut värjättiin APC-konjugoidun monoklonaalisen rotan anti-hiiri CD8a (eBioscience) 20 minuuttia, ja kiinnitettiin Cytofix /Cytoperm kit (BD Pharmingen), mitä seurasi värjäys FITC-konjugoidulla rotan anti-hiiri-interferoni -γ (eBioscience) kuten valmistuksessa on kuvattu. CD8 /interferoni-γ-positiivisten solujen analysoitiin virtaussytometrialla.

Ei-invasiiviset Tumor Growth mittaus

Yksi miljoonaa MOSEC-luc-soluja i.p. injektoidaan C57BL /6-hiiristä. Viikon kuluttua i.p. hypertermia suoritettiin tai ilman α-GalCer hoitoa. Kasvaimen kasvua MOSEC-luc-soluja hiirissä havaittiin ei-invasiivisen kemoluminesenssin kuvantamisjärjestelmä (IVIS, Xenogen).

kuluminen Lymfosyyttien Alaryhmät

Yksi miljoonaa MOSEC-luc-soluja i.p. injektoidaan C57BL /6-hiiristä. Viisi päivää myöhemmin hiiret jaettiin 4 ryhmään, ja sai i.p. injektio joko 100 ug anti-hiiri-CD4 (klooni GK1,5), anti-hiiri-CD8 (klooni TIB210) tai rotan IgG: tä ohjaus (Millipore) vasta-aineiden 2 päivän välein. Kaikki hiirille annettiin i.p. hypertermia yhdistettynä 2 ug α-GalCer viikon kuluttua kasvaimen istuttamisen jälkeen. Kasvaimen kasvu mitattiin noninvasiivinen IVIS kuvantamisjärjestelmä kuten aikaisemmin on kuvattu.

Tilastot

Kaikki tulokset edustivat keskiarvo ± SE (standardivirhe) ainakin kahdesta toisistaan ​​riippumattomasta kokeesta. Vertailut eri datapisteiden suoritettiin käyttäen ANOVA testin tai opiskelijan T testi. Selviytyminen edusti Kaplan-Meier käyrä ja verrattiin käyttämällä pitkän rank analyysi.

Tulokset

intraperitoneaalitestissä Hypertermia Enhanced eritystä proinflammatoristen sytokiinien indusoima α-GalCer

avain anti-kasvain vaikutuksia α-GalCer ajatellaan olevan moduloimalla loppupään immuuni kaskadeista stimuloimalla Th1 /Th2-sytokiinien tuotantoa NKT-solujen. Paitsi IL-5, i.p. lämmönnousua entisestään eritystä näiden kuuden sytokiinien aluksi esiin i.p. a-GalCer hoitoon. Ensin tutkittiin, lisäämällä i.p. hypertermia pystyy vaikuttamaan Näiden sytokiinien ilmentyminen stimuloi α-GalCer asennus. Kuvio 1 osoittaa, että i.p. hypertermia yksin ei muuttanut Th1 /Th2 sytokiinit, kun taas i.p. a-GalCer annon laukaisi eritystä useiden sytokiinien, joka saavutti korkeimman tason eri ajankohtina. Tasot IL-2 (p = 0,0003, α-GalCer

vs.

kontrolli), IL-4 (p = 0,0012, α-GalCer

vs.

kontrolli), IL-6 (p 0,0001, α-GalCer

verrattuna

ohjaus), ja kudos nekroottinen alfan (TNF-α) (p = 0,0007, α-GalCer

verrattuna

valvonta) oli huipussaan 6 tuntia, kun taas IL 5 ja IL-13 oli korkeimmillaan 12 tuntia (p = 0,0013, α-GalCer

verrattuna

ohjaus IL-5; p 0,0001, α-GalCer

verrattuna

ohjaus IL-13) . Kesti jopa 24 tuntia IFN-γto saavuttaa huippunsa tasolle (p 0,0001, α-GalCer

verrattuna

ohjaus). Paitsi IL-5, i.p. lämmönnousua entisestään eritystä näistä viidestä sytokiinien aluksi esiin i.p. α-GalCer hoitoon (p = 0,0056, IL-2; p = 0,0041, IL-4, p 0,0001 IL-6, p = 0,0058, IFN-γ ja p = 0,018 TNF-α). Tämä hoitomuoto myös parannettu eritystä IL-13 (p 0,0001, hypertermia ja α-GalCer versus α-GalCer yksinään), joka saavutti aikaisemmin 6 tuntia hoidon jälkeen. Nämä tulokset osoittivat, että α-GalCer saattaa aiheuttaa vahvempi kasvaimen vastaisen immuunivasteen pääasiassa tehostamalla Th1 /Th2 sytokiinien ilmentymistä yhdistämällä i.p. hypertermia.

C57BL /6-hiiret jaettiin 4 ryhmään, joissa 5 hiirtä kussakin ryhmässä ja käsiteltiin i.p. hypertermia vain 43 ° C: ssa 10 min, i.p. lisättiin 2 ug α-GalCer, ja yhdistämällä molemmat. Kontrolliryhmän hiiret suoritetaan vain valmisteleva laparotomiaa 10 min. Hiiren seerumia kerättiin 6, 12, ja 24 tuntia käsittelyn jälkeen. IL-2, IL-4, IL-5, interferoni-γ: n, TNF-α, IL-6 ja IL-13 konsentraatiot seerumissa havaittiin multiplex CBA kit. Jotkut sytokiinien kohoamiseen α-GalCer ja saavutti 6 tuntia hoidon jälkeen (IL-2, p = 0,0003, α-GalCer yksin

verrattuna

ohjaus), (IL-4, p = 0,0012, α -GalCer yksin

vs.

ohjaus), (IL-6, p 0,0001, α-GalCer

vs.

ohjaus), (TNF-α, p = 0,0007, α-GalCer

versus

valvonta); Jotkut oli korkeimmillaan 12 tunnin käsittelyn jälkeen (IL-5, p = 0,0013, α-GalCer

verrattuna

ohjaus) (IL-13, p 0,0001, α-GalCer

verrattuna

valvonta); yksi oli korkeimmillaan 24 tunnin käsittelyn jälkeen (INF-γ, p 0,0001, α-GalCer

verrattuna

ohjaus). Paitsi IL-5, Th1 /Th2-sytokiinien tasot olivat korkeampia yhdistettiin hoitoryhmässä kuin a-GalCer yksin ryhmä (IL-2, p = 0,0056, IL-4, p = 0,0041, TNF-α, p = 0,018; INF -γ, p = 0,0058). Huipputaso IL-13 saavutettiin aikaisemmin yhdistetyssä hoitoryhmässä ja sen taso oli paljon korkeampi kuin α-GalCer yksinään (p 0,0001). Nämä tulokset ymmärtää, että α-GalCer hoito voi laukaista immuunivastetta Th1 /Th2 reitillä ja hypertermia saattavat voimistaa tätä vaikutusta. (# P 0,05; * p 0,01; ** p 0,001; *** p 0,0001).

α-GalCer hoito näytteillä Synergistinen sytotoksinen vaikutus Lämmitetty munasarjasyöpäsoluja

on osoitettu, että tärkein antituumorivaikutuksia aiheuttamien α-GalCer ovat vapauttamalla tiettyjen sytokiinien, mikä parantaa niiden toimintaa NK tai T-soluja. Sen tutkimiseksi, α-GalCer hoito vaikuttaa aktiivisuuteen NK-solujen, me seurataan NK solupopulaation eri ajankohtina sen jälkeen i.p. a-GalCer hoitoon. Ääreisverenkierrossa, NK-solupopulaatio ei muuttunut merkittävästi sisällä ensimmäisen 24 tunnin ajan. Kuitenkin prosenttiosuus NK-solujen lisääntynyt dramaattisesti 72 tunnin käsittelyn jälkeen (kuvio 2A; p 0,001, 72 h

verrattuna

muut aikapisteissä). Sisällä vatsaonteloon, NK-solujen määrä lisääntyi 3 tunnin kuluttua α-GalCer hallinto, ja lisäämällä i.p. hypertermia ei vaikuttanut välein (kuvio 2B).

(A) 2 ug α-GalCer oli ip ruiskutettiin 5 C57BL /6-hiiristä ja häntälaskimoon verta kerättiin 0,5, 1, 3, 6 , 24, ja 72 tuntia käsittelyn jälkeen. Osuus vaihtelu NK-solujen perifeerisen veren analysoitiin virtaussytometrialla fluoresoivilla CD3 ja NK1.1-vasta-aine värjäys. Tulokset osoittivat, että α-GalCer merkittävästi palvelukseen NK-solujen populaatio perifeerisessä veressä 72 tuntia hoidon jälkeen. (P 0,001, 72 h

verrattuna

muut ajankohtana) (B) C57BL /6-hiiret jaettiin 4 ryhmään ja käsiteltiin intraperitoneaalisesti hypertermian 43 ° C: ssa, 2 ug α-GalCer, tai yhdistelmä. Kontrolliryhmän hiirille annettiin vain avattiin vatsan 10 minuuttia. Intraperitoneaalitestissä solut kerättiin vatsakalvon huuhtelu 3 tuntia hoidon jälkeen. Vaihtelua osuudet vatsaonteloon NK-solut analysoitiin virtaussytometrialla fluoresoivilla CD3 ja NK1.1-vasta-aine värjäys. Tulokset osoittivat, i.p. a-GalCer annon lisääntynyt paikallinen NK-solujen osuus muutamassa tunnissa. Yhdistelmä hypertermia ei vaaranna tätä vaikutusta. (P = 0,0007, α-GalCer

verrattuna

valvonta; p = 0,0009, α-GalCer

versus

lämmönnousua, ei merkittäviä erilaiset α-GalCer yksin ja yhdistetty hoito) (C) ID8 kasvain -pitoista C57BL /6-hiiriä käsiteltiin intraperitoneaalitestissä hypertermia 43 ° C: ssa 10 min. Yksi päivä käsittelyn jälkeen, intraperitoneaalitestissä solut huuhdeltiin ja värjättiin anneksiini V ja PI. Syöpäsoluja saatiin erotettua ja apoptoottisten indeksi analysoitiin virtaussytometrialla. Osuus apoptoottisten syöpäsolujen nostettiin jälkeen intraperitoneaalitestissä hypertermia. (P = 0,0084, hypertermia

verrattuna

ohjaus) (D) 2 x 10

4 ID8-luc-solut ympättiin 96 kuopan pyöreää painiketta levyt ja kuumennettiin 42 ° C: ssa vesihauteessa 20 minuuttia . Eri suhteet intraperitoneaalitestissä huuhdeltiin solut hiiristä, i.p. injektoitiin tai ilman α-GalCer lisättiin sitten kaivoon efektoreina solujen ja co-viljeltiin yön yli, jossa on lämmitetty tai lämmittämätön ID8-luc-soluja kohdesoluina. Ei-lämmitetty ID8-luc-soluja viljeltiin yhdessä huuhdeltiin soluja ilman käsittelemällä α-GalCer käytettiin kontrollina. Sytotoksisuus edustaa intensiteetti chemoluminence oli havaittu IVIS kuvantamisjärjestelmä. Tulokset osoittivat, että yhdessä viljelemisen lämmitetty syöpäsolujen kanssa intraperitoneaalitestissä huuhtelu solujen α-GalCer hoidetuissa hiirissä indusoi korkein sytotoksisuuden syöpäsolun in vitro. (At E /T-suhde = 5:01, p 0,0001, lämpö plus α-GalCer

verrattuna

valvonta; p = 0,0162, lämpö plus α-GalCer

versus

lämpöä; p = 0,0004 , lämpö plus α-GalCer

verrattuna

a-GalCer). (# P 0,05; ** p 0,001; *** p 0,0001).

Hypertermia on raportoitu aiheuttavan kuoleman syöpäsoluja. In ID8 kasvainta kantavissa hiirissä, enemmän apoptoottisia ID8 soluja (ip) havaittiin hiirissä, joita käsiteltiin kuume kuin kontrollihiirissä (kuvio 2C; p = 0,0084, hypertermia

vs.

kontrolli).

ex-vivo

yhteisviljelmässä, todettiin myös, että lämmitetty ID8 solut olivat herkempiä vatsakalvon huuhdeltiin saadut solut α-GalCer-käsiteltyihin hiiriin (kuvio 2D; p = 0,0004, lämmitetty

versus

Lämmittämättömän ID8 solujen E /T-suhde 05:01). Nämä tulokset merkitsi, että i.p. anto α-GalCer voisi palkata lisää NK-soluja, mikä lisää syöpäsolujen tappaminen, ja hypertermia indusoi lisäksi sytotoksinen vaikutus syöpäsoluja.

Hoito yhdistäminen i.p. Hypertermia α-GalCer luoman synergistinen vaikutus on DC ”Fagosyyttiset Toiminta

in vitro ja in vivo

Yksi anti-kasvain toimintaa NKT-solujen liittyy aktivaatio DC: iden. Päätehtävä DC anti-kasvain immuniteetin on ajautua kasvainsolut ja esillä olevan kasvaimen antigeenejä asiaa efektoreiden soluja, kuten sytotoksiset T-solut. Tutkimme lisäksi tuloksena vaikutukset α-GalCer hypertermia- on phagocytic toiminnasta DC. Perustuen yhdessä viljelemisen syöpäsolujen kanssa DC eristetty perna, on havaittu, että kuumennetaan syöpäsolut olivat alttiimpia DC ”fagosytoosin (kuvio 3A; p = 0,005, hypertermia

verrattuna

ohjaus). Lisäksi DC eristetty α-GalCer-käsitellyistä hiiristä osoittivat merkittävästi korkeampia toimintaa fagosytoosin (p = 0,0037, α-GalCer

vs.

kontrolli). Operaattorin yhdessä, co-kulttuuri lämmitetyn syöpäsolujen kanssa DC saatu α-GalCer hoidetuissa hiirissä osoittivat paljon fagosytoosin (p = 0,0002, yhdistelmähoito

verrattuna

valvonta; p = 0,0008, yhdistelmähoito

versus

hypertermia; p = 0,005, yhdistelmähoito

versus

α-GalCer). Nämä tulokset osoittivat, että α-GalCer käsittely plus hypertermia johtaa synergistinen vaikutus DC: ”fagosytoosin

in vitro.

Ottaen huomioon, että yhdistetty hoito annettiin kohdistaa intraperitoneaalitestissä syöpäsoluja, olemme analysoineet fagosyyttisten toimintaa sisäisessä -peritoneal DC saatu vatsakalvon huuhtelu. Laskemalla CFSE-värjätty CD11

+ /CD11 c

+ DC, on huomattava, että α-GalCer tehosti fagosytoottiseksi toimintaa i.p. DC (p = 0,0289, α-GalCer

versus

Control) ja hypertermia plus α-GalCer entisestään tätä vaikutusta (p = .0.038 yhdistettynä

versus

α-GalCer yksin). Nämä tulokset osoittavat selvästi, että α-GalCer käsittely plus hypertermia johtaa myös synergistinen vaikutus DC: ”fagosytoosin sisällä vatsaonteloon.

(A) C57BL /6-hiiret olivat ensin i.p. injektoitiin 2 ug α-GalCer. 18 tunnin kuluttua hiiret tapettiin, ja DC-soluja puhdistettiin pernoista anti-CD11 c magneettisia helmiä. Sillä dendriittisolujen -fagosytoosikoe, ID8 solut värjätään ensin CFSE: llä ja kuumennettiin 42 ° C: ssa vesihauteessa 20 minuuttia. DC: iden välillä α-GalCer stimuloitiin (tai ei-stimuloitu) hiiret olivat viljeltiin yhdessä lämmitetty tai lämmittämätön ID8 solut 6 tunnin ajan suhteessa 05:01. Osuus DC: iden fagosytoosiaktiivisuutta oli edustettuna CFSE positiivinen aidatulla CD11 c ilmentävien solujen analysoitiin virtaussytometrialla. Tulokset osoittivat, että molemmat

in vitro

lämpökäsittely syöpäsolujen ja

in vivo

stimulaatio DC by α-GalCer voisivat tehostaa fagosytoosiaktiivisuutta dendriittisolujen (p = 0,005, lämpö

versus

valvonta; p = 0,0037, α-GalCer

verrattuna

ohjaus). Synergistinen vaikutus syntyi yhdistetyssä hoidossa (p = 0,0002, yhdistelmähoito

verrattuna

valvonta; p = 0,0008 yhdistelmähoito

versus

lämpöä; p = 0,005, yhdistelmähoito

versus

α-GalCer). (B) C57BL /6-hiiret olivat i.p. injektoitiin 1 x 10

6 CFSE-värjättyä ID8 soluissa. Seuraavana päivänä hiiret jaettiin neljään ryhmään, joissa käsittely i.p. hypertermian ja /tai α-GalCer kuten aiemmin on kuvattu. Yksi päivä myöhemmin, intraperitoneaalitestissä solut kerättiin läpi i.p. huuhtelu ja osuus CFSE-positiivisten CD11

+ /CD11 c

+ solujen osoittaa phagocytic toimintaa DC analysoitiin virtaussytometrialla. On osoitettu, että α-GalCer hoito voisi parantaa fagosytoosin DC

in vivo

(p = 0,0289, α-GalCer

verrattuna

ohjaus). Tämä vaikutus parantaa entisestään lisää lämmönnousua (p = 0,038, yhdistelmähoito

versus

α-GalCer). (# P 0,05; * p 0,01; ** p 0,001).

Yhdistelmä intraperitoneaalitestissä Hypertermia ja α-GalCer herättänyt kasvain sytotoksisten CD8

+ T Cell Immuunivasteen

Koska α-GalCer hoito voidaan tehostaa fagosytoottiseksi toimintaa DC: iden ja kuumotusta voi edelleen vahvistaa tätä vaikutusta, seuraava kysymys olisi, onko yhdistelmä ip hypertermia ja α-GalCer kohtelu voi aiheuttaa kasvaimen-spesifisten sytotoksisten T-solujen vasteen. Arvioida läsnä soluvälitteisen immuunivasteen syöpäsoluja vastaan, kaksi eri hiiren munasarjasyövän soluja, HM-1 ja ID8-luc, käytettiin immuno- kompetentteihin kasvainmalleissa. Seitsemän päivää käsittelyn jälkeen, käsittelyä HM-1-hiirissä, joissa α-GalCer yksin pelkästään lisää pieni määrä kasvaimeen CD8

+ T-solujen sisällä pernasoluja (p = 0,0033, α-GalCer yksin

versus

ohjaus). Kuitenkin olemme huomanneet merkittävän määrän kasvu kasvaimeen CD8

+ T-solujen HM-1-hiirissä, käsiteltiin i.p. hypertermia plus α-GalCer (p 0,0001, yhdistelmähoito

verrattuna

valvonta; p 0,0001, yhdistelmähoito

versus

lämmönnousua; p = 0,0026, yhdistelmähoito

versus

α -GalCer yksin, kuvio 4A). In ID8-luc malli, kasvain- CD8

+ T-solujen immuunivastetta voitiin havaita käsitellyssä ryhmässä α-GalCer yksinään (p 0,0001, α-GalCer yksin

vs.

kontrolli). Kuitenkin tämä vaikutus todettiin olevan merkittävämpi ryhmässä hoidettiin monimuotoiset hoitoa (p 0,0001, yhdistelmähoito

verrattuna

muita ryhmiä). Tehostaminen kasvaimen spesifisen CTL-vasteen väheni 21 päivän kuluttua hoidon (data ei näytä). Tämä voi johtua liikakasvua kasvainsolujen esti kasvaimen vastainen immuunivaste vain yhden kerran hoidon. Teoreettisesti olisi paljon tehokkaampaa, jos lämmönnousua voidaan suorittaa toistuvasti, tai kasvaimen kasvun voi lopulta voittaa kasvaimen vastaisen immuunivasteen tämä nopea kasvava kasvain malli. Nämä tulokset osoittivat, että i.p. hypertermia voidaan edelleen parantaa sytotoksista kasvaimen CD8

+ T-solujen indusoiman immuunivasteen α-GalCer hoitoon.

(A) 1 x 10

6 HM-1-soluja ip ruiskutetaan B6C3F1 hiiriä ja (B) 3 x 10

5 ID8-luc soluja ip injektoidaan C57BL /6-hiiristä. Hiiret jaettiin neljään ryhmään (käsittelemätön kontrolli, hypertermia vain, α-GalCer yksin ja yhdistettynä hypertermia- ja α-GalCer), jossa on viisi hiirtä ryhmää kohti ja käsiteltiin kuten edellä on kuvattu. Jälkeen 7 päivää, pernasoluja eristettiin ja stimuloitu yön yli ID8 solujen tai HM-1-soluja. Pernasoluja kustakin ryhmästä ilman uudelleen stimuloitiin ID8 solujen tai HM-1-soluja on myös viljeltiin yön yli kontrollina. Prosenttiosuus syövän spesifistä CTL: ää edustettuina CD8

+ /IFN-γ

+ havaittiin virtaussytometrialla gating 2 x 10

5 lymfosyyttejä. On osoitettu, että 7 päivää hoidon jälkeen, i.p. α-GalCer käsittely hieman lisäsi kasvaimen erityisiä CTL (p = 0,0033, ohjaus

versus

α-GalCer HM-1; p 0,0001, α-GalCer

verrattuna

ohjaus ID8 ). Hypertermia plus α-GalCer näytteillä vahvin vaikutus aktivoinnissa spesifistä CTL (p = 0,0026, yhdistelmähoito

versus

α-GalCer HM-1; p 0,0001, yhdistelmähoito

versus

α-GalCer for ID8). (* P 0,01; *** p 0,001).

intraperitoneaalitestissä Hypertermia Enhanced terapeuttisia vaikutuksia α-GalCer

in vivo

on ilmeistä, että ip hypertermia tehostetaan sekä synnynnäisen ja adaptiivisen anti-kasvain immuunivasteiden aiheuttama α-GalCer hoitoon. Me validoitu onko monimuotoiset hoito voi johtaa parempaan terapeuttiseen vaikutukseen

in vivo

. In MOSEC-luc kasvain C57BL /6-hiiriä i.p. hypertermia ja α-GalCer esillä vahvempi kasvaimen kasvun estämiseen (kuvio 5A; p 0,05, yhdistetty hoito

versus

α-GalCer yksin). Ja tämä käsittely myös pidensi elinaikaa kasvaimen kantavien hiirten (kuvio 5B; p = 0,0018, yhdistetty hoito

vs.

kontrolli).