Krooninen sairaus

tiivistelmä

Keuhkosyöpä on johtava syy syöpäkuolemista maailmanlaajuisesti. Kliinisesti hoito ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) voidaan parantaa varhaisen havaitsemisen ja riskin seulonta keskuudessa väestöstä. Vastatakseen tähän tarpeeseen, tässä kuvaamme soveltamisesta laaja peptidin tason fraktioinnin yhdistettynä etiketti ilmainen määrällisiä proteomiikka löytämisen mahdollisten seerumin biomarkkereita keuhkosyöpää, ja käyttö Tissue mikrosiruanalyysi (TMA) ja Multiple reaktion seuranta (MRM) määritykset seuraaville ylös vahvistusten todentamisessa vaiheessa. Käyttämällä näitä state-of-art, tällä hetkellä saatavilla kliinistä proteomic lähestymistapoja, tietojenkeruuvaiheessa me luotettavasti tunnistettu 647 seerumin proteiineihin, ja 101 proteiinit osoittivat tilastollisesti merkittävää yhteyttä NSCLC meidän 18 löytö näytteitä. Tämä seerumi proteomic aineisto pystyimme erottaa ero malleja ja epänormaalia biologisia prosesseja keuhkosyövän verta. Näiden proteiinien, Alpha-1B-glykoproteiini (A1BG) ja leusiinirikkaita alfa-2-glykoproteiini (LRG1), kaksi plasma glykoproteiineja aiemmin tuntemattoman funktion valittiin esimerkkeinä joille TMA ja MRM tarkastusta tehtiin suuren otoksen Settiin noin 100 potilasta. Olemme paljasti, että A1BG ja LRG1 oli yli-ilmentynyt sekä veren ja kasvaimen osia, joihin voidaan viitata erottaa keuhkosyöpäpotilaita terveistä tapauksissa.

Citation: Liu Y, Luo X, Hu H, Wang R, Sun Y, Zeng R, et ai. (2012) Integrative Proteomiikka ja Tissue Microarray Profilointi Merkitään välistä assosiaatiota yliekspressoidaan Seerumin proteiinit ja ei-pienisoluinen keuhkosyöpä. PLoS ONE 7 (12): e51748. doi: 10,1371 /journal.pone.0051748

Editor: Giuseppe Viglietto, University Magna Graecia, Italia

vastaanotettu: 25 kesäkuu 2012; Hyväksytty: 5. marraskuuta 2012 Julkaistu: 19 joulukuu 2012

Copyright: © 2012 Liu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Hanke tukivat avustuksia tiede ja teknologia (2010CB912100, 2011CB910200), National Natural Science Foundation of China (91029301, 30821065, 81101760, 81172218, 81101761), Science and Technology komission Shanghai kunta (09JC1416302), kiinalainen Academy of Science Project (KSCX2-YW-R-106, KSCX1-YW-02), Fudanin yliopiston (09FQ78) ja Fudanin yliopiston Cancer Hospital (YJ200804, YJ200701). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on yleisin syöpä maailmassa, kannalta sekä ilmaantuvuutta ja kuolleisuutta. Ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) osuus 80-85% keuhkosyöpää kokonaispituudeltaan 5 vuoden pysyvyys on alle 14% [1]. Tarkemmin sanoen 5 vuoden pysyvyys on tuskin 3% ja 7% vaiheessa III B, ja on alle 1% vaiheessa IV sairaus [2]. Kuitenkin potilaat diagnosoidaan varhaisessa vaiheessa ja leikkaukseen kokemusta 86% kaiken kaikkiaan 5 vuoden pysyvyys [3]. Siksi diagnoosi tarvitaan tunnistaa varhaisessa vaiheessa keuhkosyöpään koska se voidaan kovettaa kirurgisesti. Useita mahdollisia proteiini allekirjoituksia kuten syöpä -antigeeni, CYFRA21-1, plasman kallikreiinin B1 ja neuroni enolaasin on löydetty ja kliinisesti käytetty biomarkkerina ehdokkaita keuhkosyöpään. Kuitenkin, mikään niistä osoitti riittävän herkkyyden, spesifisyyden tai toistettavuus [4]. Siksi biomarkkerit varhaisen diagnoosin keuhkosyöpään kiireellisesti.

Molecular biomarkkereita varhainen havaitseminen keuhkosyövän voi olla monenlaisia. Histologinen biomarkkerit ovat ensiarvoisen tärkeitä, koska ne voidaan suoraan liittyvät patologiset muutokset, riski supistuminen, läsnäolo tai taudin vaiheesta. Niiden uskotaan olevan potentiaalia erottaa eri molekyyli- tautimekanismien NSCLC. Toisaalta, seerumin biomarkkereita keuhkosyöpä ovat entistä houkuttelevamman, koska veri on helposti saatavilla ja sen ajatellaan hankkia proteiineja erittyy, irtoa tai muutoin vapautuu kudoksista, joiden kautta veri kiertää. Jopa jotkut kohtalainen runsaasti plasman proteiineihin voisi olla indikaattorit erityinen elin asemasta ja on raportoitu vaihdella vastauksena tietyntyyppisten sairauksien [5].

Tällä hetkellä tauti perustuva proteomiikkaa perustuva massaspektrometria on otettu käyttöön löytö sekä histologisia ja serologiset biomarkkereita. Tärkeydestä huolimatta seerumin biomarkkereiden löytö, yksi suurimmista teknisistä haasteista on se, että veri proteomiin on erittäin monimutkainen, ulottuen pitoisuusalueella vähintään kymmenen kertaluokkaa. On odotettavissa, että tehokkaat ehtyminen menetelmiä ja moniulotteinen fraktiointi järjestelmien voisi olla hyödyllistä erottaa vähäisessä määrin proteiineihin ja laajentaa havaitsemisrajasta [6]. Tässä käytimme laajaa fraktiointi peptidin tasolla profilointi albumiiniin köyhdytettyä seerumi Proteome, ainutlaatuinen integroitu moniulotteinen nestekromatografia (IMDL) kehitetty meidän lab [7]. Toinen tekniikka este on se, kuinka nopeasti ja tehokkaasti vertailla proteiini tasoilla koko kudoksia tai plasmanäytteistä. Yleensä nämä näytteet eivät ole yhteensopivia in vivo vakaan isotooppileimaukseen strategia MS-kvantifiointi. Peräkkäin, in vitro -merkintä strategioita, kuten iTRAQ [8] ja akryyliamidi isotooppien [9] ovat nousemassa vaihtoehtoja. Kuitenkin nämä tekniikat ovat rajoitukset, jotka liittyvät kustannukset, yleensä pienempiä proteomia peitto merkintöjä valikoivuus, sovellettavuutta ja erot merkintöjen tehokkuutta. Tässä tutkimuksessa olemme siis hyödyntää yksinkertaista ja vankka label-vapaa kvantifiointi (LFQ) strategia spektrin laskennan tietojenkeruuvaiheessa. Lisäksi tarvitaan yhä enemmän toistettavissa MS-analyysiä on johtanut kehitystä useiden reaktionseuraamista (MRM) tekniikka. Tätä tekniikkaa voidaan käyttää mittaamaan proteiinin pitoisuudet kliinisissä plasmanäytteiden integroituna syntetisoitu peptidi standardien ja absoluuttisia analyysi (AQUA). Parempi valikoivuus, herkkyys ja dynaaminen alue voidaan saavuttaa MRM, jotka ovat ratkaisevia kliinisiä validointi [10].

Tämän tutkimuksen tarkoituksena on ensinnäkin käyttää haulikko proteomiikka suoraan erottaa ero seerumin proteomiin kuvioita liittyy NSCLC sairaudet, ymmärtää säännöllisen seerumin proteiineihin mitattuna niiden biologista merkitystä, kuten molekyylien toimintaa, ja perustaa tietokanta seerumin indikaattoreiden NSCLC. Toiseksi, vahvistaa meidän löytö vaivaa, valitsimme kaksi uutta biomarkkereiden ehdokasta -A1BG ja LRG1-, jonka avulla perinteisen tarkastuksen lähestymistapoja, kuten perinteiset western blotting ja /tai kudosten microarray (TMA), sekä MRM mittauksia suuremmissa näytteessä ikäluokat.

Methods

etiikka ja keräämällä seeruminäytteitä

Verinäytteet vasta diagnosoiduista potilaista saatiin ennen hoitoa laitoksella Torakaaliikirurgia Shanghai Cancer Hospital. Mukaanottokriteereihin aiheista koostui diagnosoitu NSCLC, ei kaukainen etäpesäke tai muiden kirurgisten vasta. Kirjallisessa ilmoitti suostumukset toimittivat kaikki henkilöt mukana tässä tutkimuksessa. Anonyymi näytteitä potilaista valittiin satunnaisesti. Tämä tutkimus on hyväksynyt Institutional Review Board Fudanin yliopiston Shanghai Cancer Center.

Seerumi kerättiin ja käsiteltiin käyttäen samaa standardoitua protokollaa. Lyhyesti, verinäytteet jätettiin hyytyä huoneenlämpötilassa 30 minuuttia, sentrifugoitiin 3000 g: ssa 20 min (4 ° C), ja supernatantit kerättiin, tehty alikvootteja, ja varastoidaan -80 ° C: ssa kunnes analysoitiin. Välinen aika käsittelyyn ja jäädyttäminen oli enintään 2 h kunkin näytteen. Mikään näytteistä sulatettiin yli kaksi kertaa ennen analyysiä.

Lipidien poistaminen ja albumiini ehtyminen seeruminäytteistä

Lipidien poistaminen ja albumiini ehtyminen tietojenkeruuvaiheessa muutettiin mukaan aiemmin raportoitu protokollat ​​[11] , [12]. Lyhyesti, kunkin näytteen, 50 ui raakaa seerumia laimennettiin 250 ui puskuria (100 mM NaCl, 10 mM HEPES, pH 7,4), ja sentrifugoitiin 10000 g: ssa 30 minuutin ajan 0,22 um: n suodattimen (Millipore) poistamaan lipidejä. Seuraavaksi 260 ui lipidit seerumi saostettiin 180 ui ennalta jäähdytettyyn etanoliin (Sigma), inkuboitiin yhden tunnin ajan 4 ° C: ssa varovaisesti sekoittaen, ja sentrifugoitiin 16000 g: ssa 45 minuuttia. Albumiini-poistettu pelletit kerättiin, lyofilisoitiin ja suspendoitiin uudelleen 100 ul: aan lyysipuskuria, joka sisälsi 8 ​​M ureaa, 4% CHAPS, 40 mM Tris-emästä, 65 mM DTT ja proteaasi-inhibiittoriseosta (Roche, Ltd.).

in-liuosta proteiinin ruuansulatuksen

Protein seoksia inkuboitiin 10 mM ditiotreitolia (DTT) 37 ° C: ssa 2,5 h, ja carbamidomethylated 20 mM jodiasetamidilla (IAA) 45 min ajan huoneenlämpötilassa pimeässä. Alkyloitua proteiini liuokset saostettiin viidellä tilavuudella ennalta kylmällä asetonilla /etanoli (01:01, v /v), jossa oli 0,1% etikkahappoa -20 ° C: ssa 12 h [13]. Proteiini suspendoitiin uudestaan ​​50 mM ammoniumkloridia (pH 8,3), ja inkuboitiin trypsiinin kanssa (25:1, Promega) 20 tuntia 37 ° C: ssa. Digestoidut peptidit lyofilisoitiin ja varastoitiin -80 ° C: ssa massaspektrometria-analyysi.

Online kaksiulotteinen MS /MS-analyysi Integrated moniulotteinen nestekromatografialla

laaja fraktiointi seerumin peptidit suoritettiin meidän Integroitu moniulotteinen nestekromatografialla (IMDL) järjestelmä, kuten aiemmin on kuvattu [7]. Pohjimmiltaan, bi-phase integroitu pylvästä saavuttamiseksi on-line kaksiulotteinen HPLC erotus. Tämä integroitu kolonni sisälsi voimakasta kationinvaihtohartsia sarakkeen (SCX, 320 um id, 50 mm pituus, sarake Technology Inc., CA) ja käänteisfaasi (RP) kromatografiapylvääseen (150-um id, 100 mm: n pituus, sarake Technology Inc.). Peptidi seos ensiksi pistetään Surveyor autosampler (ThermoFinnigan, San Jose, CA), ja sitten fraktioitiin 11 pH vaiheet (pH 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 7,0, 8,0, 8,5), käyttäen sarja pH puskureita (konfiguroida 5 mM sitruunahappo säätää NH

4OH). Eri pH-puskureita levitettiin integroituun pylväästä käyttäen loop-injektion 100 ui 3 ul /min, ennen kuin on-line RP-HPLC-gradientilla. RP-HPLC-liuottimet käytettiin 0,1% muurahaishappoa (v /v) vesiliuosta (A) ja 0,1% muurahaishappoa (v /v) asetonitriiliä (B), jossa gradientilla 2-40% liikkuva faasi B: 115 minuuttia 2 ui /min jälkeen split. Massaspektrometriin käytettiin lineaarista ioniloukku LTQ (Thermo). Jännite 3,0 kV levitettiin ESI neula, ja normalisoitu törmäysenergia oli 35,0. Ionien lukumäärä tallennettu ioniloukku säädeltiin automaattinen vahvistuksen säätö. Spektrit hankittu data riippuva -tilassa, jossa on mahdollisuus, että 10 voimakkaimman ionien kunkin MS-spektri MS /MS-analyysiä. Dynaaminen poissulkemisominaisuutta vahvistettiin seuraavasti; toistomäärässä 3, toista kesto 0,5 min, ja poissulkemisen kestoa 1,5 min.

Protein tunnistaminen

BIOWORKS ™ 3.2 ohjelmistopaketti käytettiin tuottamaan huippu luettelot kaikista hankitun MS /MS-spektrit ( oletusparametrit), jotka sitten automaattisesti vastaavuushaku inhimillisen International Protein indeksi proteiinisekvenssitietokannassa (versio 3.22, joka sisältää 57867 proteiinit), käyttäen SEQUEST versiota 2.7 (University of Washington, lisensoitu Thermo Finnigan) etsimistä ohjelmassa. Voidaan arvioida jatkamalla virheellisten tunnistusten (vääriä positiivisia), kaikki suodatettu spektrit tehtiin tietokantaan hakuja vastaan ​​komposiitti tietokanta, joka sisältää ihmisen proteiinisekvenssien sekä eteenpäin (oikea) ja reverse (virheellinen) suunta [14]. Kaikki tietokannan haut, trypsiiniä nimettiin proteaasin, ja vain yksi jäi pilkkominen annettiin. Maksimaalinen massan toleranssi oli asetettu 3 Da esiastetta ioni ja 1,0 Da fragmentti-ionit. Carbamidomethylation (57,0125 Da) etsittiin kiinteänä muutos on kysteiini, ja hapetus (15,99492 Da) asetettiin muuttuja muutos on metioniini. Kotitekoinen ohjelmisto Buildsummary käytettiin poistaa tarpeeton data aikaisemmin määritelty [15].

Proteiinit tunnistettiin tiukat kriteerit. Erityisesti käytimme konservatiivinen naiivi kohde-houkutuslinnut strategia, joka arvioi proteiini tunnistaminen vääriä löytö määrä (FDR) analogisesti peptidi-spektri ottelu (PSM) FDR eli lähentämällä odotettu määrä vääriä positiivisia proteiinin tunnistus useissa houkutuslintujen proteiinin tunnistaminen [16]. Kynnysarvot Xcorr ennakkotietojen mukaan PSM FDR pienempi kuin 1% ja lopullinen proteiini FDR pienempi kuin 5% oli sovellettu. Kaikki hyväksytty SEQUEST tuloksen on oltava ΔCn pisteet vähintään 0,1 riippumatta varaustila [17].

Label ilmaiseksi kvantifiointiin spektrin laskenta ja tilastot

Yksinkertainen etiketti vapaa kvantifiointiin lähestymistapaa käyttäen spektrin laskenta käytettiin profiloida seerumin proteomista välillä NSCLC ja valvonta tapauksissa [18]. Peptidi-sekvenssi ottelut annetaan jokaiselle proteiini konserniin lasketaan yhteen ja otetaan perusteella suhteellisen kvantifioinnin [13], [17]. Tapaukset kunkin kohortin käsiteltiin NSCLC koskevassa biologisessa rinnakkaista. Laskimme suhteellisen rikastamiseen tekijä, R

e, määritellään R

e = (n

f /n) /(N

f /N) priorisoida ilmentynyt ja alle ilmaistaan ​​proteiinit [19 ]. Tässä yhtälössä n

f on määrä peptidin osumia proteiinin yhdessä näytteessä, n on kokonaismäärä peptidin osumien tässä näytteessä, N

f on koko osuu määrä tämän proteiinin kaikissa näytteissä ja N on kokonaismäärä peptidin osumia kaikista proteiineista kaikissa näytteissä. Pohjalta R

e, toteutimme ANOVA ja opiskelija T testi käyttämällä permutaatio testi 200000 kertaa Pomelo II [20]. Vastaanottimen Operating Characteristic (ROC) analyysi suoritettiin PROC paketin R [21]. Vuonna ROC analyysi biomarkkereiden paneelin, käytimme logistinen regressiomalli arvioida tuloksista paneeli, johon sisältyi ehdokkaat haluamme sisällyttää paneeliin (eli käyttämällä lohko tulo muuttujien) yhdessä todennäköisyydet. Tämä mallinnus suoritettiin SPSS (v13.0). Ennustettu todennäköisyydet tapahtumaa, joka (kuten syöpä tai normaali) sisällytettiin ennustajina vuonna ROC-käyrä; ja alapuolinen alue ROC-käyrän (AUC) laskettiin arvioida teho paneelin [22]. Hierarkkinen klusterointi analyysi (HCA) ja Pääkomponenttianalyysi (PCA) suoritettiin R ohjelmisto (https://www.r-project.org/) käyttäen kvantiili- normalisoidut arvot logaritminen transformoitujen spektrin laskee, eli transformoimalla log

2 (spektrin määrä +1) kunkin seerumin proteiinin jokaisessa näytteessä.

Tissue mikrosiruanalyysi (TMA) B

immunohistokemiallinen (IHC) värjäys suoritettiin käyttäen kudossiruina ostettiin Shanghai outdo Biotech Co .. lyhyesti, formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut leikkeet 90 pienisoluista keuhkosyöpää, joka koostuu 44 keuhkon adenokarsinooma (AD), 38 levyepiteelisyöpä (SCC), ja 8 tapauksissa muihin alatyyppeihin, poistettiin parafiini ja rehydratoitiin. Endogeeninen peroksidaasi pysäytettiin 3% H

2O

2 (v /v). Sen jälkeen, kun antigeeni haku ja esto, leikkeitä inkuboitiin kaniinin polyklonaalista anti-A1BG (1:100, elinikä Biosiences), kanin polyklonaalinen anti-USP1 (01:25, Abgent), hiiren monoklonaalinen anti-Mucin5B (01:25, Millipore) ja hiiren monoklonaalinen anti-LRG1 (Laimennus 1:200, Abonva) 4 ° C: ssa yön yli. Jälkeen huuhtele PBST ratkaisu, leikkeitä inkuboitiin peräkkäin biotinyloidun sekundaarisen vasta-aineen ja ABC-reagenssia (Vectastain), jota seuraa käsittely DAB-liuoksella (Shanghai Sangon Biological Engineering Service Co.). Lopuksi leikkeet vastavärjättiin hematoksyliinillä QS (Vectastain). Niistä 90 tapauksissa vain yksi viipale katosi käsittelyn aikana, jolloin 89 NSCLC osissa voimassa niiden pariksi ei-kasvain valvontaa.

IHC diat tarkistettiin kaksi patologit (XL, ja HC), sokaissut kaikki ennusteeseen viittaavia tietoja. Tulokset laskettiin keskiarvo niiden riippumattomien arviointien ja tekee arvioimalla prosenttiosuus (P) solujen havaita karakteristisia värjäytymistä (vuodesta havaita taso tai 0% ja homogeeninen värjäys tai 100%) ja arvioimalla intensiteetti (I) värjäystä (0, no visuaalista värjäystä, 1, heikkoa värjäytymistä, 2, kohtalainen värjäytyminen tai 3, voimakas värjäytyminen). Prosenttiosuus määritettiin osuus kaikkien positiivisten solujen, ilman intuitiivinen tuomiot solutyyppejä. Prosenttiosuus arvot sitten luhistettiin P pisteet 0-9, joka vastaa vaihtelee 0-5%, 5-15%, 15-25%, 25-35% ja 85-100% lopullisesti. Kuten ehdotimme aiemmassa tutkimuksessa [13], suhteellinen proteiinin ilmentymistä histologista tasolla pisteytettiin kertomalla P pistemäärä intensiteetti arvo I eli ns nopeasti pistemäärä (Q) (Q = P × I; minimi = 0 ja maksimi = 27).

Western blotting

Me tehdään western blot-analyysi 12 satunnaisesti valittua kolmoset normaalia, AD ja SCC seerumit. Proteiininäytteet erotettiin 12% polyakryyliamidigeelillä ja siirrettiin PVDF-kalvolle (Pall Inc.). Kanin polyklonaalista A1BG (elinikä Biosiences) laimennettiin kuin valmistajan ohjeiden ja käytetty koetin blot. Immunodection toteutettiin käyttäen ECL plus reagenssit (Amersham Biosciences) ja altistettiin röntgenfilmille (Kodak). Kun lopulliset WB kuva saadaan, kuvan ohjelmisto nimeltään Multi Gauge (v3.0, FUJI FILM CO.) Käytettiin poimia proteiinin ilmentyminen tietojen IOD arvo.

LC-MRM mittaus

Neljä isotooppinen peptidien osoitetaan A1BG ja LRG1 (kaksi kutakin proteiinia) syntetisoitiin käyttämällä standardia Fmoc-kemiaa yhdistetty puhdasta, raskas [

13C

6] leusiini (Sigma-Aldrich). Tunnisteeton [

12C] muotoja kunkin peptidin syntetisoitiin myös (GL Biochem, Kiina). Kaikki synteettiset peptidit puhdistettiin 95% puhtaus, ja määrä on raportoitu toimittajalta.

Peptidit pilkottu 0,1 ui raakaa seerumi (70 NSCLC näytettä ja 30 ikä verrokit, katso taulukko S1) on liuotetaan uudestaan 0,1% muurahaishappoa, johon oli lisätty sisäistä standardia peptidejä, ja erotettiin käänteisfaasi mikro korkean suorituskyvyn nestekromatografialla 1200 HPLC järjestelmä, yhdistettynä 6410 QQQ massaspektrometrillä (Agilent Technologies). Erottaminen suoritettiin liikkuvan faasin virtausnopeudella 1,5 ul /min puskurilla A (0,1% muurahaishappoa) ja puskuri B (90% asetonitriiliä 0,1% muurahaishappoa), yhtä C18 trap-pylvästä (300 pm x 5 mm, Agilent Technologies ), jota seurasi analyyttinen C18-kolonnia (150 pm x 100 mm, Column Technology Inc., CA). Binary kaltevuus koostui 3-17% B 2,5 min, 17-23% B 25 min, 23-40% B 5 min, 40-100% B 5 min ja 100% B 2,5 min. Tiedot hankittiin joiden kapillaarinen jännitteellä 4000 V, kuivaus kaasun 300 ° C 3,0 l /min, ja sumutinta kaasu 18 psi. Fragmenttori jännite ja törmäys energia (CE) optimoitiin infuusio kunkin peptidin. Vuonna MRM kokeissa työkierrosajat ei ylittänyt 1,2 sekuntia ja vähintään 20 datapistettä kerättiin kohti huippu.

Absolute kvantifiointiin A1BG ja LRG1 seerumin

MRM data-analyysi suoritettiin käyttäen Masshunter laadullinen ohjelmistot (Agilent). [

12C] /[

13C] piikin ala kirjattiin käsin tarkastus tiukkojen keraeluoituvan käyttäytymistä, kun kaikki [

13C] siirtymiä referenssinä. Sillä A1BG ja LRG1, varmennukset niiden runsaus eri ikäluokat saavutettiin kaikkien siirtyminen parit, mutta vain paras siirtymiä, jotka tunsivat parhaiten lineaarisuus vaste käytettiin absoluuttisia. Määritys lineaarisuus leimasi laimentamalla tryptiselle sulattaa yhden seeruminäytteessä joka hyväksyttiin valolla peptidien tuottaa erilaisia ​​endogeenisiä analyyttikonsentraatioiden ulottuen 3

7 ja 3

8-kertainen pitoisuusalue (menetelmä muokattu Michael et al., [23]) ja LRG1 ja A1BG viite peptidejä vastaavasti. Määrä [

12C] peptidin mitattiin pitoisuuden piste, jossa ala suhteet [

12C] /[

13C] olivat lähimpänä 1 (1.029 varten A1BG ja 0,922 varten LRG1). Pinta-alojen suhteet laskemisessa käytettiin endogeenisen pitoisuuksia kohde- proteiinien seerumista, jonka kaava on asennettu lineaarisuus käyrä. Inter-määritys variaatiokerroin (CV) arvioitiin viisi erotettu käsittely ja MRM replikoituu sekoitettua näytettä, ja toteamisraja (LOD) määriteltiin pitoisuudet jossa S /N analyytin on yhtä suuri kuin 3 [24 ]. Määritysraja (LOQ) oli empiirisesti määritettiin pienimpänä analyytin pitoisuutta, joka voi pitää hyväksyttävänä lineaarisuus (Pearson korrelaatio, R 0,99) ja voidaan mitata 20% CV [23].

Tulokset

Korkealaatuinen tietokanta NSCLC liittyy seerumin proteiineihin

Pre-terapia seerumit 13 pienisoluista keuhkosyöpää (8 ADs ja 5 SCC) ja 5 terveillä verrokeilla prosessoitiin IMDL-MS /MS-analyysi ( Kuvio 1). Purkaa monimutkaisuus seerumin Proteome, me lievittää aiemman sademäärä tapa poistaa ihmisen seerumialbumiinia ja hyödyntää kaksiulotteinen HPLC fraktiointi. Ehtyminen prosessi oli nopea ja edullinen, ja oli varsin toistettavissa ja tehokkaita, kuten on osoitettu kuvassa S1. Uusi sarja puskureita yhdentoista eri pH-arvoja käytettiin IMDL, ottaen huomioon monimutkaisuus ihmisen seerumin prote- (kuvio 1, keskimmäinen paneeli). Verrattuna perinteiseen yksiulotteinen RP-LC erottaminen, proteomia kattavuus on parannettu, kun otetaan huomioon, että enemmän kuin kolme kertaa niin paljon proteiineja tunnistettiin IMDL samoissa PSM FDR kriteerit (tietoja ei esitetty).

Vasen paneeli seeruminäytteet keräys ja ehtyminen poistaa ihmisen seerumialbumiini (HSA); Lähi-paneeli, IMDL fraktioimalla joka erottaa seerumin peptidit niiden pl: (2.5~8.5) ja hydrofobisuus, joiden esimerkki HPLC-MS /MS analyysi osoitti kullekin pH vaiheen eluutio; Oikea paneeli, määrä NSCLC potilaiden määrä ja ikä-haun terveillä verrokeilla tarkastuksessa vaiheessa Western blottauksella, TMA ja MRM mittaus. SCX, vahva kationinvaihtaja, RP käänteisfaasikromatografialla. AD: Adenokarsinooma; SCC: Okasolusyöpä; NSCLC: Ei-pienisoluinen keuhkosyöpä.

Kun osalta kasvavaan huoleen luottamus kysymys Veriproteiinien tunnistettu [25], käytimme tiukat kriteerit, naiivi kohde-houkutuslintuna FDR proteiineihin taso saada seerumin proteomiin [16]. Yhdessä 629804 peptidi osumia 4456 ainutlaatuista peptidien määräämällä 647 proteiineja tunnistettiin seerumista (proteiini FDR 4,6%) ja osaksi etiketti vapaa kvantifiointiin. Sitten havaittu XCorr jakautuminen peptidin tunnistamisen seerumissa proteomiin. Kuten kuva S2 osoitettu, kaikki spektreissä oli XCorr suurempi kuin 2,25, ja hallitsi tunnistaminen huomattavasti korkeammat pisteet sekä maksun 2+ ja maksu 3+ ioneja. Edelleen varmistua suorituskykyä kohde-houkutuslintujen strategia ja sen johdettu FDR, toinen laajalti käytetty proteiinin tunnistaminen työnkulun, Trans-proteomiikan Pipeline (TPP) [26], sovellettiin myös kaikki raaka spektri lähtöisin yksi terve seeruminäytteestä. Kaikki PSMS kanssa PeptideProphet ≥0.75 säilytettiin ja ne liitetään proteiineihin. Lisäksi 89,7% proteiineja meidän tunnistamistulokselle oli ProteinProphet ≥0.9, ja noin 65,1% proteiineista oli ProteinProphet vastasi 1. Sen sijaan, jos säilytetään syötti tunnisteen TPP, seerumin proteiinit ProteinProphet ≥0.9 oli FDR korkeampi kuin 10,7 %. Nämä ehdotti melko korkea luottamus meidän seerumin proteomiin.

profilointia ja biologisten merkkiaineiden seulonta NSCLC seerumin Proteome

ensi arviolta dynamiikan etiketin vapaa profilointia. Merkittävä korrelaatio proteiinin spektrin määrää ja niiden tiedossa vastaavia pitoisuuksia [27], [28] saatiin (taulukko S2). Siten meidän proteomic lähestymistapa antoi mahdollisuuksia tunnistus- ja suhteellisen kvantifioinnin seerumin proteiineihin yli kuusi kertaluokkaa (niinkin alhainen kuin useat nanogrammaa millilitrassa).

Muodosta NSCLC liittyy seerumin Proteome aloitimme suorittamista hierarkkinen klusterointi analyysi (HCA) ja pääkomponenttianalyysi (PCA) kokonaispainosta proteomiin käsitellä tätä, jos merkittävä seerumin proteiinit säännelty takia NSCLC esiintyminen. HCA ja PCA molemmat suoritettiin spektrin laskenta tiedot kaikista 647 seerumin proteiineihin (ks menetelmä). HCA ymmärtää, että NSCLC ja normaalihenkilöihin sisällytettiin kaksi suuret ryppäät (kuvio 2A). Samoin PCA analyysissä, NSCLC seerumit voidaan erottaa 5 terveillä vain yhden pääkomponenttina, ja vaihtelu syövän ryhmässä oli paljon enemmän normaalissa ryhmässä (kuvio 2B). Koska MS-analyysi valvonnan tapauksista asetettu sattumanvaraisesti jaksotusta ajojen 13 NSCLC seerumit, pre-analyyttiset tekijät tulisi olla epävarmaa ja vähäisempiä kuin syöpä fenotyyppi. Vaikka suhteelliset asemat jokaisen NSCLC tapauksessa HCA ja PCA eivät olleet samat, havaitsimme kohtalainen eroavaisuuksia AD ja SCC potilaita. Vastata jos erottaminen kohortteja oli lähtöisin vain yksi tai kaksi olennaisesti muuttunut runsaasti proteiineja, myös käytetty PCA kaikkien proteiinin identiteettejä (katso punaiset nuolet kuvassa 2B). Tämä ”bi-juoni” ehdotti, että suurehko proteiineja, pikemminkin kuin pieni määrä proteiineja, osaltaan erottamiseen.

(A) Hierarkkinen klusterointi analyysi ja (B) Pääkomponenttianalyysi kaikkien 647 proteiinit määrällisesti poikki 18 seeruminäytteessä. Päät punaiset nuolet (B) edustavat PCA tulokset kunkin proteiinin.

Koska tunnistettu seerumin proteiini voi pitää mahdollisuuksia rajata tai ennustaa NSCLC, permutoituina ANOVA ja opiskelija T koe välillä ikäluokat käytettiin. Kaikkiaan 101 proteiineista suodatettuna merkittävästi erilaiseen proteiinien (p 0,01, katso yksityiskohdat taulukossa S3) ja niiden suhteellinen rikastamiseen kuvio lämpökarttana oli kuvassa 3A. Niistä 101 proteiinit suodatetaan, yli 25% aiemmin merkitty NSCLC biomarkkereiden ehdokkaita. Tämä merkittävä johdonmukaisuus voimakkaasti validoitu meidän kokeellisen lähestymistavan tietojenkeruuvaiheessa. Huomattavaa on, että suurin osa aiempien tutkimusten perustuivat 2D geeli ja raportoitu vähemmän ero proteiineja kuin tuloksemme [29], [30], [31]. Myös meidän 101 proteiini asetettu onnistuneesti kattaa merkittävän suhde ehdokkaita raportoitu edellisestä vaivalloisen työn [32], joka yhdisti laaja moniulotteisia nestekromatografia ja kaksiulotteinen ero geelielektroforeesia kutakin kromatografiaa murto. Nämä todisteet osoittivat, että online IMDL fraktiointi ei ollut vain mukava, mutta myös suhteellisen herkkä seulontaan mahdollisten veren biomarkkereita. Lisäksi raportoitu NSCLC ehdokas markkereita, löysimme suurehko huomionarvoista proteiineja läheisesti muiden syöpien, kuten alfa-1 B-glykoproteiinin [33], täydennyksessä C1q -aliosa aliyksikössä [34], fibrinogeeni alfa /gamma-ketjun [35], [36] , Fibuliini-1 [37], verihiutaleiden tekijä 4 ja sen muunnelma [38]. Silti oli useita proteiineja, jotka tunsivat erittäin hyvät tilastot, mutta puuttui aiemmin esitetyn näytön yhdistää ne syöpää aseman, kuten proteiini AMBP (vaihtoehtoinen nimi, alfa-1-mikroglobuliini), Multivesikulaaristen kehon alayksikkö 12B ja V-tyypin protoni ATPaasi 116 kDa alayksikön. Mielenkiintoinen proteiineja, jotka liittyvät suoraan Syöpätilassa (joko NSCLC tai muu syöpä ihmisen) kirjallisuuden kaivostoiminnan lueteltiin taulukossa 1.

(A) Hierarkkinen klusterointi heatmap 101 muutu merkittävästi proteiineihin. Expression arvot näkyvät värillisinä korkeampia arvoja edustaa keltainen ja alemmalla edustaa sinistä. (B) Gene ontologia biologisia prosesseja merkittävästi rikastettu 101 proteiinia asetettu. Gene symboleja sininen tai punainen ympyrät (voitaisiin viitata taulukossa S3) osoittavat vastaavia proteiineja myötä- tai säädellään ylöspäin NSCLC seerumeista.

Biologiset prosessit rikastunut ero seerumissa proteomiin NSCLC

vieressä pyrittiin luonnehtimaan 101 proteiinit yhteydessä niiden biologisia toimintoja. Vertaamalla GO biologinen prosessi selityksin Bingo, löysimme useita prosesseja merkittävästi rikastettu (säädä p 0,05 jälkeen BH korjauksen, kuvio 3B). Erityisesti prosessit akuutin vaiheen vasteita (p = 5.26E-10) ja solujen kationin homeostaasin (p = 1.31E-6) verenkiertojärjestelmän näyttivät olevan säädellään ylöspäin syöpä seerumeista. Liittyviä prosesseja komplementin aktivaation (p = 1.28E-7), solukuoleman (p = 1.15E-2) ja apoptoosia (p = 1.27E-3) on myös merkittävästi säädellä. Lisäksi löydettiin useita proteiinin toimintaa ei ole aiemmin tunnettu oleskella keuhkosyöpä, kuten proteaasi-inhibiittorin ja G-proteiini-kytketyn reseptorin sitoutumisaktiivisuus, jonka asiaankuuluvat proteiinit olivat enimmäkseen alassäädetty (p = 1.56E-11 ja 3.24E -6). Yhdessä nämä havainnot sekaantumaan NSCLC paitsi akuutissa vaiheessa vastauksista ja koskemattomuutta, mutta myös erityisiä signaalin transductions ja kuoleman prosesseja.

TMA ja pisteytys validoida histologinen ilmaisua A1BG, USP1 ja musiinia 5B NSCLC kudoksissa

Osoittaakseen, että jotkin, elleivät kaikki, proteiinit kohteita ovat todellakin liittyy NSCLC riski, että tarkastus vaiheessa käytimme eri validointi lähestymistapoja. Koska korkea vastaavuutta on aiemmin havaittu TMA mittauksen ja RT-PCR [39] tai proteomic profilointi [40], kysyimme, onko TMA voisi mahdollistaa nopean, tiukka ja puolikvantitatiivinen arvio histologisten biomarkkereita. Tässä osassa lisäksi alfa-1 B-glykoproteiinin (A1BG) ja leusiinirikkaita alfa-2-glykoproteiini (LRG1), jotka ovat keskitason runsaus seerumissa, päätimme alhainen runsas seerumin proteiini ubikitiinipromoottori karboksiterminaalisille hydrolaasi 1 ( USP1), joka havaittiin NSCLC seerumista. Lisäksi, koska solulinja lysaatin voisi olla biologisesti enemmän lähellä kudosnäyte, me valittu ehdokas limaa 5B että havaitut NSCLC solutasolla mukaan aineisto edellisessä tutkimuksessa [17]. Meidän TMA kohti näitä neljää proteiinit tarjotaan homogeeninen ja synkronisen profilointi 90 pariksi NSCLC kohdat. Kaikki testatut proteiinit osoitettiin korkeampi ekspressiotaso NSCLC kasvainleikkeissä (kuvio 4A). Tiiviisti käsiksi ero tasoa välillä NSCLC ja niiden vieressä ei-tuumorisektioiden, IHC värjäyksen intensiteetti (I, 0-3) ja prosenttiosuus (P, 0-9) positiivisten värjättyjen solujen jaettiin (kuva 4B ja kuva S3) . Useimmat tuumorisektioiden karakterisoitiin suurempi intensiteetti (I≥2) ja lisää positiivisten solujen (P 60%).