Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tausta ja tarkoitus

Suurimmat esteet hoitoon haimasyövän ovat erittäin invasiivisia kapasiteetti ja kestävyys kemo- ja sädehoidon. Glykogeenisyntaasikinaasi 3β (GSK3p) säätelee useiden solureiteillä ja on sekaantunut erilaisia ​​sairauksia kuten syöpää. Täällä tutkimme patologinen rooli GSK3p invasiivisissa ja käsittely kestävät fenotyypin haimasyövän.

Methods

haimasyöpäsoluissa tutkittiin GSK3p ilmaisun, fosforylaatio ja aktiivisuus käyttämällä Western blotting ja

in vitro

kinaasimääritys. Vaikutukset GSK3p estoa syöpäsolujen selviytymistä, proliferaatiota, invasiivisia kyky ja alttius gemsitabiinin ja säteilyn tutkittiin hoidon jälkeen farmakologisen estäjän tai RNA-interferenssi. Vaikutukset GSK3p estoa syöpäsolujen ksenograftit tutkittiin.

Tulokset

Haimasyöpä solut osoittivat suurempi ekspressio ja aktiivisuus GSK3p kuin ei-neoplastiset solut, jotka oli liitetty muutoksiin sen ero fosforylaatioon . Esto GSK3p vähensi lisääntymistä ja selviytymisen syöpäsolujen, ne tiedostamaan gemsitabiiniannokseen ja ionisoivaa säteilyä, ja heikennettyjä kulkeutumista ja hyökkäystä. Nämä vaikutukset liittyivät pieneneminen sykliini D1 ilmentyminen ja Rb fosforylaatio. Esto GSK3p myös muuttanut solunosasijaintia Rac1 ja F-aktiini ja solujen -mikroarkkitehtuurin, kuten lamellipodioihin. Yhtenevä nämä muutokset olivat erityksen väheneminen matriisin metalloproteinaasi-2: n (MMP-2) ja väheni fosforylaatio fokaalisen adheesion kinaasin (FAK). Vaikutukset GSK3p eston kasvaimen invaasio, alttius gemsitabiinin, MMP-2: n ilmentymisen ja FAK fosforylaatio havaittiin tuumoriksenografteja.

Johtopäätös

kohdentaminen GSK3p edustaa tehokas strategia voittaa kaksi haastetta invaasiokyvyn ja hoidon vastustusta haimasyövän.

Citation: Kitano A, Shimasaki T, Chikano Y, Nakada M, Hirose M, Higashi T, et al. (2013) Poikkeava Glykogeenisyntaasikinaasi 3β osallistuu Haimasyöpä Cell Invasion ja kestävyys Therapy. PLoS ONE 8 (2): e55289. doi: 10,1371 /journal.pone.0055289

Editor: Sharmila Shankar, University of Kansas Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 22 elokuu 2012; Hyväksytty: 20 joulukuu 2012; Julkaistu: 08 helmikuu 2013

Copyright: © 2013 Kitano et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Apurahat-in-Aid tieteellisen tutkimuksen päässä Japanin opetus-, tiede-, urheilu, teknologia ja kulttuuri; Japanin Society for Promotion of Science (KK, TM); Japan Society for Technology (KK, TM); ulkopuolinen Collaborative Research Grant Kanazawa University Cancer Research Institute. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haimasyöpä on merkittävä terveysongelma johtuu yleisestä 5 vuoden pysyvyys on alle 10% [1]. Sille on tunnusomaista erittäin proliferatiivisen ja invasiivisia kapasiteetti kasvainsolujen ja vahva taipumus etäpesäkkeiden [2] – [4]. Aggressiivinen luonne haimasyövän vaikeuttaa varhaisen diagnoosin ja parantava kirurgisia toimenpiteitä ja tekee sen kestäväksi kemoterapiaa ja säteily [3], [4]. Yleisesti käytetty hoito on infuusiona gemsitabiini, mutta vähemmän kuin 20% potilaista reagoi tähän hoitoon [3], [4]. Uusia terapeuttisia strategioita, jotka parantavat vaikutukset gemsitabiinin ja vaimentavat invasiivisia ominaisuuksia haimasyövän soluja tarvitaan. Molecular kohde-terapiasta on tullut ja sisältää kohdistaminen kasvutekijän reseptorit, angiogeeninen tekijä /reseptori ja matriisin metalloproteinaasien, koska nämä ovat poikkeavasti ilmaistaan ​​haimasyövän [2] – [4]. Useat kliiniset kokeet haimasyövän jo kohdistettu nämä kasvutekijät, joko yksinään tai yhdessä gemsitabiinin, mutta useimmat ovat osoittaneet vain vähän tai ei lainkaan terapeuttista hyötyä [5]. Tunnistaminen romaani molekyylikohteista jotka voisivat parantaa terapeuttisia vaikutuksia gemsitabiinin ja säteily on näin ollen ensisijaisen tärkeää [6].

Glykogeenisyntaasikinaasi 3β (GSK3p) on seriini /treoniini proteiinikinaasi, joka säätelee useiden signalointireittien [ ,,,0],7]. Perustuu sen tunnettujen toimintojen ja osallistuminen ensisijainen sairauksista, GSK3p on liitetty terapeuttisena kohteena glukoosi-intoleranssi, hermoston sairaudet ja tulehdus [8]. Olemme aiemmin osoittaneet, että sääntelemättömään ilmentymiseen, aktiivisuus ja fosforylaatio GSK3p ovat eri ominaisuuksia maha-suolikanavan syöpien ja glioblastooma, ja että GSK3p ylläpitää eloonjäämisen ja leviämisen näiden tuumorisolujen. Rooli varten poikkeavalle GSK3p näissä kasvaintyypeissä tukee havainto, että farmakologinen esto sen aktiivisuuden vähentää selviytymistä ja leviämisen syöpäsolujen ja altistaa ne apoptoosin

in vitro

ja tuumoriksenografteissa [9] – [ ,,,0],12]. Vaikka sen rooli syövän keskustellaan yhä [13], kokonaistulokset toistaiseksi osoittavat, että poikkeava ilmentyminen ja aktiivisuus GSK3p on yleinen ja perusominaisuus on laaja syöpiä (tarkistetaan [14]).

Perustuen aiempien tutkimusten jotka osoittivat osallistuminen GSK3p NF-KB-välitteisen solujen eloonjäämistä [15], GSK3p todettiin tukemaan selviytymistä haimasyöpäsoluissa kautta tämän reitin [16], [17]. Vaikka GSK3p on keskeinen säätelijä solujen polarisaation ja muuttoliikkeen aikana fysiologisia prosesseja, kuten kudosten kehitystä ja haavojen paranemista [18], hyvin vähän tiedetään sen roolista migraation ja invaasion syöpäsoluja. Täällä tutkimme mahdolliset osallistumista GSK3p että invasiivisia luonteeltaan haimasyövän ja sen kestävyys gemsitabiinia ja ionisoivaa säteilyä, kaksi suurta esteitä tehokkaamman hoidon.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics Statement

Kirjallinen suostumus saatiin kaikilta potilailta haimasyöpä ennen leikkausta. Tutkimus hyväksyi Medical Ethics komitean Kanazawa University.

Eläinkokeet suoritettiin mukaisesti suuntaviivat hoito ja käyttö Laboratory Animals Kanazawa Medical University, ja kansallisen ohjeet eläinten käyttöä tutkimus Japanissa (https://www.lifescience.mext.go.jp/policies/pdf/an_material011.pdf). Protokolla hyväksyttiin valiokunnassa eläinkokeet Kanazawa Medical University.

Solulinjat ja kudosnäytteiden

Ihmisen alkion munuaissoluja (HEK-293) ja haimasyövän soluja (PANC-1, MIA PaCa-2, BxPC-3, Capan-1) saatiin American Type Culture Collection (ATCC). Nämä solulinjat tunnusomaista DNA-profilointi ATCC, ja kuljetettiin vähemmän kuin 6 kuukauden kuluttua elvytys. Ne pidettiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2 DMEM (HEK-293, PANC-1, MIA PaCa-2, Capan-1) ja RPMI 1640 (BxPC-3), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) ja antibiootteja (penisilliini G ja streptomysiiniä) (GIBCO). Solut kerättiin aikana eksponentiaalisen kasvuvaiheen varten RNA: n ja proteiinin.

Tutkimuksessa mukana 15 potilasta haimasyöpä, jotka tehtiin leikkaus laitoksella Surgical Oncology, Kanazawa University Hospital (taulukko S1). Kirurginen näytteet fiksattiin neutraaliksi puskuroidussa 10% formaliinilla, upotettiin parafiiniin ja jalostettujen histopatologista diagnoosia ja immunohistokemiallista tutkimukset.

Western-blottaus

Proteiini uutettiin viljellyistä soluista käyttäen lyysipuskuria (CelLytic -Mt, Sigma-Aldrich), joka sisältää seosta, jossa oli proteaasi ja fosfataasi-inhibiittorit (Sigma-Aldrich). Pitoisuudet proteiinia uutteet mitattiin Coomassie Protein Assay Reagents (Pierce). 30 ug: n näyte-proteiinin erotettiin natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS-PAGE) ja analysoitiin Western-blottauksella että kiinnostavia proteiineja ja niiden fosforylaatiota [9], [11], [12] käyttäen vastaavaa primaaristen vasta-aineiden (Taulukko S2). Sähköllä kalvoja (Amersham) blokattiin 5% naudan seerumin albumiinia ennen havaitsemista fosforyloidun proteiinin fraktioita. Proteiinin määrä kussakin näytteessä seurattiin ilmentymistä β-aktiini. Signaalit kehitettiin käyttämällä tehostettua kemiluminesenssin (ECL).

In vitro

-kinaasimääritys varten GSK3p Activity

nonradioisotopic

in vitro

kinaasimääritykseen (NRIKA) [19] havaitsemiseen käytettiin aktiivisuuden GSK3p peräisin soluista. NRIKA käyttää peräkkäinen yhdistelmä immuunisaostukset eristää GSK3p solun proteiinia näytteistä, joka on

in vitro

kinaasireaktiossa, joka käyttää rekombinanttia ihmisen β-kateniinin proteiini (substraatti) ja ei-radioisotooppisia adenosiinitrifosfaatti (ATP), jonka jälkeen immunoblottauksella havaita β-kateniinin phosporylated seriinin (S) 33, S37 ja /tai treoniini (T) 41 tähdettä (p-β-kateniinin

S33 /37 /T41) [19]. Negatiivisena kontrollina, hiiren monoklonaalinen vasta-aine on GSK3p korvattiin samalla määrällä ei-immuuni-hiiri-IgG: tä (Sigma-Aldrich) immunosaostusmenetelmiä vaiheessa. GSK3p aktiivisuus osoitetaan läsnäolo p-β-kateniinin

S33 /37 /T41 testissä reaktio ja poissaolollaan negatiivisen kontrollin reaktion. Määrä Immunopresipitoidun GSK3 # ja rekombinanttisen β-kateniinin proteiinin kinaasireaktiossa seurattiin immunoblottauksella.

immunohistokemia

Expression ja /tai fosforylaatio GSK3p, matriksin metalloproteinaasi (MMP) – 2 ja fokaalisen adheesion kinaasi (FAK) kasvaimen ja viereisen ei-neoplastisia kudoksia haimasyövän potilaat tutkittiin avidiini-biotiini-peroksidaasi-kompleksi menetelmä [11], [12]. Seuraavat deparaffinization, mikroaaltouuni antigeenin peittymisen ja esto epäspesifisten immuunireaktioiden, parafiini leikkeitä inkuboitiin vasta-aineen kanssa GSK3p, tyrosiini (Y) 216-fosforyloitua GSK3p: n (p-GSK3p

Y216), MMP-2, FAK, Y397-fosforyloitu tai Y861-fosforyloitu FAK (p-FAK

Y397, p-FAK

Y861) ja p-β-kateniinin

S33 /37 /T41, vastaavasti. Lähteet ja työ laimennoksia nämä vasta-aineet on esitetty taulukossa S2. Leikkeitä inkuboitiin sitten biotinyloidulla vuohen anti-kaniini-IgG tai hevosen anti-hiiri-IgG: tä (laimennettu 1:200, Vector). Immunoreaktiivisuus havaittiin käyttämällä ABComplex /HRP Kit (DakoCytomation). Jotta negatiivinen kontrolli, ensisijainen vasta korvattiin ei-immuuni kani tai hiiri-IgG (DakoCytomation). Yliekspressio tai korkeampi fosforylaation vastaavien molekyylien kasvaimet määriteltiin painokkaammin tai fosforylaation joko proteiinin tuumorisoluihin verrattuna ei-neoplastisia haiman kanavat samalla potilaalla.

Effects GSK3p esto Cell Survival ja leviämisen

Solut ympättiin 96-kuoppalevyille käsiteltiin dimetyylisulfoksidin (DMSO, Sigma-Aldrich) tai GSK3p estäjä (AR-A014418; Calbiochem) liuotettiin DMSO: hon on merkitty lopulliset pitoisuudet väliaineessa. Erityisesti, AR-A014418 ei inhiboi 26 läheisesti liittyviä kinaaseja, ja sitä pidetään erittäin spesifinen GSK3p [20]. Nimetyissä ajankohtina, suhteellinen määrä elinkelpoisia ja lisääntyvien solujen määritettiin käyttämällä WST-8 (4- [3- (4-jodifenyyli) -2- (4-nitrofenyyli) -2H-5-tetrazolio] -1,3 bentseeni disulfonaatti) iinianalyysikitissä (Cell laskenta kit-8, Wako) ja Cell Proliferation Elisa BrdU Kit (Roche), tässä järjestyksessä.

sirna (siRNA) erityinen ihmisen GSK3p (GSK3p Validoitu Stealth RNAi) ja negatiivinen kontrolli siRNA (Stealth RNAi Negative Control Low GC duplex) ostettiin Invitrogen. GSK3p-spesifinen siRNA tavoitteet sekvenssi 5′-GCUCCAGAUCAUGAGAAAGCUAGAU-3 ’. Solut transfektoitiin 10 nM joko siRNA käyttäen Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen). Vaikutus RNA häiriöitä GSK3p ilmentyminen määritettiin Western-blottauksella käyttämällä vasta-ainetta sekä GSK3α ja β (taulukko S2). Spesifisyys GSK3p-erityisiä siRNA vahvistettiin edellisessä tutkimuksessa [11], [12]. Jotta voidaan tutkia vaikutus GSK3p RNA-häirintää solun eloonjäämistä ja proliferaatiota, solut ympättiin 96-kuoppaisille levyille transfektoitiin 10 nM ohjaus- tai GSK3p-spesifisiä siRNA. 72 tuntia transfektion jälkeen, suhteellinen määrä elinkelpoisia ja lisääntyvien solujen määritettiin edellä kuvattuja menetelmiä.

vaikutukset GSK3p esto on herkkyys syöpäsolujen gemsitabiini ja Ionisoiva säteily

syöpäsolut ympättiin 96-kuoppaisille levyille (3-6 x 10

4 solua kuoppaa kohti) käsiteltiin kasvavia pitoisuuksia joko gemsitabiinin (eli Lily) tai AR-A014418. Hoidon jälkeen 72 tuntia, suhteellinen elävien solujen lukumäärä mitattiin WST-8 sen määrittämiseksi IC

50 (50% solujen eloonjäämistä inhiboiva konsentraatio) ja gemsitabiini ja AR-A014418 ja tuottaa isobologrammit. Sitten soluja käsiteltiin gemsitabiinin annos lähellä IC

50: n läsnä ollessa DMSO: ssa tai matalan annoksen (5 tai 10 uM) AR-A014418. Isobologrammimenetelmällä [21], käytettiin sen määrittämiseksi, onko vaikutus GSK3p: n inhibiittori on haimasyöpä solun alttius gemsitabiinin oli additiivinen, synergistinen tai antagonistinen.

vaikutus GSK3p: n inhibiittori on haimasyöpä solujen herkkyys säteilylle oli tutkittiin pesäkkeitä muodostavien solujen eloonjäämisen määritys. Kuhunkin kuoppaan 6-kuoppalevyille, 1000 haimasyöpä soluja ympättiin ja käsiteltiin peräkkäin joko DMSO: ssa tai matalan annoksen (5 tai 10 uM) AR-A014418 24 tuntia ja ionisoivan säteilyn annoksilla 0, 4 ja 8 Gy. Tällä 6 päivää säteilytyksen jälkeen, kokonaismäärä pesäkkeiden värjättiin 0,1% kristallivioletilla (Wako) teki kuhunkin kuoppaan. Keskimääräinen lukumäärä pesäkkeiden kolmessa erillisessä kokeessa laskettiin keskihajonnat.

Analyysit Cell Migration ja Invasion

Syöpä solumigraatioon ja invaasiota tutkittiin yksikerroksista perustuva haavan paranemista määritys ja transwell määritys. Konfluentteja yksikerroksiset haimasyövän soluja läsnä ollessa DMSO: ssa tai AR-A014418 annoksella 5 tai 10 uM oli naarmuuntunut, jossa on 20 ul:-mikropipetin kärki luoda solu-vapaa-alueelle (haava). Jokaisessa kunnossa, välisen raon pituus haavan reunat seurattiin kolmessa kiinteiden viitearvojen 6-24 tuntia, jonka CCD-kamera (AxioCam MRM, Zeiss) yhdistetty faasikontrastimikroskoopissa (Axiovert 40 CFL, Zeiss). Solumigraation kunakin ajankohtana laskettiin keskimääräinen etäisyys haava mitattiin kolme pistettä ja verrataan solujen käsitelty DMSO ja AR-A014418.

solumigraatioon ja invaasio tutkittiin Transvvell- joissa käytetään päällystämättömiä ja Matrigel-pinnoitettu 24 hyvin kaksinkertaisen kammion järjestelmä (BD BioCoat ™ matrigeelin ™ inkubaatiokammio, BD Bioscience). Syövän solut suspendoitiin seerumittomassa väliaineessa, joka sisälsi DMSO: ta tai AR-A014418 (5 tai 10 uM), ja 2 x 10

4 solut levitettiin ylempään kammioon pariksi alemman täytetty kammio, joka sisälsi 10% FBS: ää ( kuten kemoterapia-houkutin) ja DMSO tai AR-A014418 (5 tai 10 uM). 22 tunnin kuluttua mahdollistaa solujen siirtyä ja hyökätä, solujen alapuolelle kammion kiinnitettiin ja värjättiin Diff-Quick Kit (Symex). Kussakin määrityksessä kokonaismäärä solua suuritehoisia mikroskooppisen kentän alapuolelle päällystämättömän tai Matrigel pinnoitettu kammio laskettiin ja pisteytettiin muuttaa tai tunkeutuvat soluihin. Keskimääräinen solujen lukumäärä viidessä suuritehoisia mikroskooppikentäs- laskettiin keskihajonnat.

Solumorfologia ja Immunofluoresenssikoe Cytochemistry

Syöpäsolut kasvatettu cover slip hoidettiin joko DMSO tai AR- A014418 (5 tai 10 uM) 12 tunnin ajan ja sitten naarmuuntunut kuten edellä on kuvattu. Klo 12 tunnin jälkeen raapiminen, solut pitkin haavan reunoja havainnoitiin faasikontrastimikroskopiaan. Nämä solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä ja permeabilisoitiin 0,1% Triton-X (Sigma-Aldrich). Soluja inkuboitiin sarjaan hiiren monoklonaalisella vasta-aineella Rac1 (BD Bioscience, laimennettiin 1:200) 4 ° C: ssa yön yli ja Alexa Flour® 488-leimattua anti-hiiri-IgG: tä (Invitrogen, laimennettu 1:1,000) huoneenlämpötilassa 40 min pimeässä. Pesun jälkeen pois ylimääräinen vasta-aine, solut värjättiin filamenttisieni (F-) aktiini Alexa Flour® 546-leimattua phalloidin (Invitrogen, laimennettu 1:40) 20 minuutin ajan. Sitten solujen tumat vastavärjättiin Hoechst 33342 (Molecular Probes) ja niitä tarkkailtiin fluoresenssimikroskoopilla (Keyence) ekspressiota ja solunosasijaintia Rac1 ja F-aktiini.

Rac1 Activity

Proteiini uutettiin soluista käsiteltiin DMSO: ssa tai 10 uM AR-A014418 24 tuntia 25 mM Tris-HCl-puskuria (pH 7,5), joka sisälsi 150 mM NaCl, 5 mM MgCl

2, 1% NP-40, 1 mM ditiotreitolia ja 5% glyserolia. Aktiivinen Rac1 eristettiin proteiini näytteestä avattavasta menetelmää käyttäen GST-ihmisen PAK1-PBD (Thermo) ja hartsit (Glutathione Sepharose 4 Fast Flow, GE Healthcare). Osa Rac1 sidottu guanosiinitrifosfaatin (GTP) (Rac1-GTP, aktiivinen muoto) eluoitiin hartseista ja havaitaan Western blot -analyysillä käyttämällä kanin polyklonaalista vasta-ainetta Rac1 (laimennettu 1:1,000; Thermo). Erikseen, koko solun koettimena täydellisen Rac1 käyttäen samaa vasta-ainetta.

ilmentäminen ja eritys Matrix Metalloproteinase-2 (MMP-2) B

Expression of MMP-2: n mRNA tutkittiin kvantitatiivisen käänteistranskriptio-PCR: llä (qRT-PCR). Kokonais-RNA eristettiin soluista käyttämällä ISOGEN (Wako). Täydentävä DNA (cDNA) tuotettiin käyttämällä Reverse Transcription Kit (Promega). qRT-PCR suoritettiin käyttäen SYBR Esiseos Ex Taq

TMII (Takara Bio) ja vastaavat joukot sense- ja antisense-alukkeita monistamiseen MMP-2 ja β-aktiini (taulukko S2) [11].

MMP-2: n ilmentymisen analysoitiin gelatiinitsymografialla [22]. Syövän solut ympättiin 12-kuoppaisille levyille 48 tuntia ja käsiteltiin sitten DMSO: ssa tai AR-A01418 (10 tai 25 uM) 24 tunnin ajan seerumittomassa väliaineessa. Esikäsitelty väliaine tai käsitellyt solut inkuboitiin SDS-näytepuskuria 30 minuutin ajan 37 ° C: ssa. Näytteet erotettiin 10% SDS-PAGE, joka sisälsi 0,005% Alexa Fluor 680-leimattua gelatiinia. Elektroforeesin jälkeen geelit pestiin 2,5% Triton X-100: ssa 2 tunnin ajan ja sitten inkuboitiin substraatin puskurissa yön yli 37 ° C: ssa. Geeli skannattiin että LI-COR Odyssey IR kuvantamisjärjestelmä (Lincoln).

-tuumoriksenografti Study

valmis ihonalaista PANC-1 hiirissä kuvatulla [23]. Nämä hiiret jaettiin 4 ryhmään ja käsiteltiin intraperitoneaalisella injektiolla (kahdesti viikossa 10 viikkoa) DMSO: ta (liuotin), gemsitabiini (20 mg /kg kehon paino) ja AR-A014418 (2 mg /kg kehon painoa, mikä vastaa 10 uM viljelyväliaineessa määritetty ja optimoida myös aiemmissa tutkimuksissa [10], [12]), yksin tai yhdistelmänä, vastaavasti. Kaikki hiiret lopetettiin käsittelyn jälkeen ja ksenograftikasvaimissa poistettiin ja käsiteltiin histologista tutkimusta ja immunohistokemiaa MMP-2 ja FAK ja fosforylaation FAK kasvainsoluissa, kuten edellä on kuvattu.

Tilastollinen analyysi

Between-ryhmä tilastollinen merkitsevyys määritettiin käyttämällä Student

t

testiä. Vuonna -tuumoriksenografti tutkimuksessa kasvainten kummassakin hoitoryhmässä ilmaistiin keskiarvoina ± keskihajonta (SD). Tilastollinen merkitys eroja tietojen määritettiin Kruskal Wallis H-testi seurasi Mann-Whitneyn U-testi Bonferroni korjaus.

P

arvo 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Expression, fosforylaatio ja aktiivisuus GSK3p syöpäsoluissa

haimasyöpäsoluissa osoittivat korkeampia pohjapinta tasoilla GSK3p ja Y216-fosforyloidun aktiivinen muoto (p-GSK3p

Y216) ja alhaisempi S9-fosforyloituu inaktiivinen muoto (p-GSK3p

S9) verrattuna HEK 293-soluissa (kuvio. 1A ). Syöpäsolu johdettu GSK3p oli aktiivinen fosforylaatiota sen substraatin, β-kateniinin (Fig. 1 B). Nämä tulokset osoittavat, että haimasyövän ilmentävät aktiivinen GSK3p joka ei ole säännelty ero fosforylaation S9 ja Y216. Immunohistokemia sarjaportin osat osoittivat, että GSK3p ja p-GSK3p

Y216 olivat diffuusisti ilmaistuna ja colocalized kasvainsoluissa ja yli-ilmentyy invasiivista kasvainsolujen 8/15 (53%) haimasyövän potilailla (Fig. 1 C). Yliekspressio oli yleisempää potilailla, joilla on T3 /T4 primaarikasvaimen tai imusolmuke ja etäinen etäpesäke aikaan leikkauksen (taulukko S1).

(A) proteiini ote kustakin solulinjasta analysoitiin immunoblottaus varten ilmaus GSK3p ja sen fosforylaatio (p-GSK3p

S9, p-GSK3p

Y216). p-aktiinin ilmentymistä seurattiin latauskontrollina. (B) GSK3p aktiivisuus havaittiin NRIKA [19] vastaavissa soluissa. Kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät, GSK3p aktiivisuus osoitetaan läsnäolo p-β-kateniinin

S33 /37 /T41 testissä reaktiossa (T) ja poissaolollaan negatiivisen kontrollin reaktio (NC). Määrä Immunopresipitoidun GSK3 # ja läsnäolo substraatin (β-kateniinin) kinaasireaktiossa seurattiin immunoblottauksella. (C, D) Serial parafiinileikkeitä ensisijainen haimasyövän ja sen vieressä ei-kasvainkudoksessa (potilas nro 5 taulukossa S1) immunovärjättiin GSK3p: n ja p-GSK3p

Y216 (C), ja MMP-2: FAK, p-FAK

Y397 ja p-FAK

Y861 (D). Mittakaavapalkki kussakin paneelissa osoittaa 100-um pitkä.

Effects GSK3p estäjä Cell Survival ja Proliferation

olivatko GSK3p vaikuttaa syöpäsolun selviytymisen ja proliferaation. Tasot glykogeenisyntaasin (GS) fosforyloitiin Y641 (p-GS

S641) ja p-β-kateniinin

S33 /37 /T41 laski syöpäsolujen käsittelyn jälkeen AR-A014418 (Fig. S1A, B ), mikä osoittaa sen aktiivisuus GSK3p: aa vastaan ​​syöpäsoluja. GSK3p inhibitio vaimennetaan selviytymisen ja syöpäsolujen lisääntymistä (Fig. 2A, C). Ehtyminen GSK3p RNA interferenssin heikennetty solujen elinkelpoisuutta ja lisääntymistä kaikissa syöpäsolulinjoissa (Fig. 2B, D). Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia ​​aiempien tutkimusten [16], [17] viittaa siihen, että poikkeava GSK3p niiden vaikutuksista säilymisen ja leviämisen haiman syöpäsoluja.

(A) Suhteellinen elinkykyisten solujen nimetty ajankohtina olivat mitattuna WST-8 määritys vastaavat solut, kun läsnä on DMSO: n tai AR-A014418 ilmoitettuina pitoisuuksina. (B) Suhteellinen määrä elinkelpoisia soluja mitattiin vastaavat solut transfektion jälkeen epäspesifinen (NS) tai GSK3p-spesifisiä siRNA. (C, D) suhteellinen määrä lisääntyvien solujen määritettiin mittaamalla määrä BrdU. Lisääntyvät solut sijoitettiin 48 tunnin hoidon jälkeen DMSO: n tai AR-A014418 (10 uM, 20 uM) (C), tai transfektion jälkeen epäspesifinen (NS) tai GSK3p-spesifisiä siRNA (D). Arvot on esitetty (A-D) ovat keskiarvoja ± SD viidestä erillisestä kokeesta. *

p

0,05, tilastollisesti merkittävää eroa käsiteltyjen solujen DMSO tai AR-A014418 ja solujen välillä käsitelty epäspesifisiä ja GSK3p-erityisiä siRNA.

Effects GSK3p estäjä yhdistettynä gemsitabiini tai säteily syöpäsoluja vastaan ​​

edellä esitetyt tulokset johtivat meidät puuttumaan onko GSK3p esto voisi voimistaa gemsitabiinin ja ionisoivan säteilyn. Suuret annokset (25 tai 50 uM) AR-A014418 yksin oli terapeuttinen vaikutus syöpäsoluja vastaan ​​(Fig. 2A, C). Näin ollen, vaikutukset suhteellisen pieninä annoksina (5 tai 10 uM), testattiin yhdessä gemsitabiinin tai ionisoivan säteilyn. Ensin tutkimme annosriippuvaista vaikutusta AR-A014418 ja gemsitabiinin syövästä solujen eloonjäämistä ja määritettiin niiden IC

50-arvot (Fig. 2A, kuvio. S2). IC

50-arvot AR-A014418 oli samankaltainen PANC-1, MIA PaCa-2 ja BxPC-3-soluissa, kun taas ne, gemsitabiini vaihteli (taulukko S3). Me seuraavaksi tutkittiin, mikä vaikutus AR-A014418 herkkyyden syöpäsolujen gemsitabiinia. Kun soluja käsiteltiin nousevia annoksia (1 ng /ml 10 ug /ml) gemsitabiinin, yhdessä pienen AR-A014418 vähensi IC

50 gemsitabiinia (Fig. S2, taulukko S4). Isobologrammi analyysi [21], että tietojen mukaan pienen annoksen AR-A014418 yhdessä gemsitabiinin oli lisäainetta vastaan ​​PANC-1-soluissa ja yhteisvaikutukset vastaan ​​MIA PaCa-2-solut (Fig. 3A). Olemme vahvistaneet, että yhdistetty käsittely AR-A014418 merkittävästi parannettu vaikutus gemsitabiinin vastaan ​​syöpäsolun ksenograftien (Fig. 3C) jyrsijöillä ilman haitallisia vaikutuksia reagenssin.

(A) vaikutus AR-A014418 vaikutuksesta gemsitabiinin analysoitiin käyttämällä isobologram- [21] piirtämällä IC

50 yhdistelmähoitoa (Fig. S2, taulukko S4). (B) yhdistetty vaikutus ionisoivaa säteilyä ja AR-A014418 testattiin PANC-1 ja MIA PaCa-2-soluissa pesäkemuodostusta. *

p

0,05, tilastollisesti merkittävää eroa käsiteltyjen solujen DMSO tai AR-A014418. (C) yhdistetty vaikutus gemsitabiinin ja AR-A014418 testattiin PANC-1 -ksenografteja. Kateenkorvattomissa hiirissä, joissa PANC-1-ksenografti jaettiin neljään ryhmään, joiden käsittely vatsaonteloon (kahdesti viikossa) DMSO: ta (verrokki; 8 hiiret), gemsitabiini (GEM; 20 mg /kg kehon painoa, 9-hiiret) ja AR-A014418 ( AR; 2 mg /kg kehon painoa, 8 hiiret), yksin tai yhdistelmänä (GEM + AR, 9 hiiret). Tuolloin hoidon jälkeen 10 viikon ajan, kasvaimen tilavuus (cm

3) laskettiin käyttämällä kaavaa 0,5 × S

2 × L, jossa S on pienin kasvain halkaisija (cm) ja L on suurin (cm ) [10], [12]. Kasvaimen keskimääräinen tilavuus verrattiin 4 ryhmän väliin. *

p

0,05, tilastollisesti merkitsevää eroa datan.

The effect of AR-A014418 yhdistettynä ionisoivaa säteilyä testattiin syöpäsoluissa. Pesäkkeenmuodostusyksi- solujen eloonjäämistä määrityksessä, läsnä oli 10 uM AR-A014418 vähensi elinkelpoisuuden syöpäsolujen verrattuna hoitoon ionisoivalla säteilyllä yksin (Fig. 3B). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että yhdistetty hoito GSK3p estäjän herkistää syöpäsolut gemsitabiinia ja ionisoivaa säteilyä.

Molecular Alterations Associated kanssa GSK3p esto syöpäsoluissa

Ymmärtää mekanismia suojattavan osallistuminen GSK3p syövän solujen lisääntymisen ja kestävyys hoidon, tutkimme vaikutus GSK3p estoa ilmentyminen ja proteiinien fosforylaatio liittyvät solukierron säätelyssä ja proliferaatiota. Yhdenmukaisia ​​aiempien tutkimusten (tarkistetaan [2]), haiman syöpäsoluja osoitti fosforylaation RB-proteiinin (p-R b

S780, p-Rb

S807 /811; Fig. 4), mikä viittaa siihen, että sitoutuminen E2F transkriptiotekijä oli alentunut [24]. Hoito joko AR-A014418 tai GSK3p-erityisiä siRNA vähensi tasot Rb fosforylaation ja sykliini D1 ilmentyminen (kuvio. 4), mutta mitään johdonmukaista muutoksia löytynyt CDK4 tai CDK6 ilme.

(A) immuuniblottausanalyysi vertaa ilmentymisen Rb, CDK4, CDK6, ja sykliini D1, ja fosforylaatiota Rb S780 ja S807 /811 tähteet (p-Rb

S780, p-Rb

S807 /811) solujen välillä käsiteltiin DMSO: ssa ( DM) tai 10 uM AR-A014418 (AR) 24 tuntia. (B) muutokset tasot p-Rb

S780 ja p-Rb

S807 /811 ja RB ja sykliini D1 tarkasteltiin MIA PaCa-2 solut ilmoitettuina ajankohtina hoidon jälkeen 10 uM AR -A014418. (C) Expression of Rb, sykliini D1, GSK3α ja GSK3p-proteiineja ja tasot Rb-fosforylaation (p-Rb

S780) tutkittiin ja verrattiin samaan haimasyövän transfektoitujen solujen epäspesifisiä siRNA (NS) tai GSK3β- erityiset siRNA (S) (10 nM kutakin). (A-C) β-aktiinin ilmentymistä seurattiin latauskontrollina.

Effects GSK3p estoa syöpäsolu Migration ja Invasion

arpeutumisprosessit testi osoitti, että migraatio syöpäsolut väheni merkittävästi käsittelemällä 5 uM ja 10 uM AR-A014418 (Fig. 5A, kuviossa. S3). Mikä tärkeintä, nämä pitoisuudet olivat riittämättömiä estämään solujen lisääntymistä 24 tunnin käsittelyn jälkeen (kuvio. 2A). Vuonna transwell määrityksessä, 5 uM ja 10 uM AR-A014418 inhiboi kemotaktista migraatiota syöpäsolujen ja niiden hyökkäyksen soluväliaineen komponentin (Fig. 5B).

(A) ylempi paneelit esittävät aikakäyrän PANC- 1 soluvaelluksen haavan paranemista määritys läsnä ollessa DMSO: ssa tai AR-A014418 (AR). Alempi paneeli esittää suhteelliset leveydet haavat mitataan prosenttiosuutena alkuperäisestä raon ajanhetkellä nolla. *

p

0,05, tilastollisesti merkittävää eroa käsiteltyjen solujen DMSO tai AR-A014418. (B) siirto soluihin päällystämättömän siirtokuoppaan ja tunkeutuvat soluihin Matrigel päällystetyt siirtokuoppaan pisteytettiin PANC-1 ja MIA PaCa-2-solut käsiteltiin DMSO tai AR-A014418 (AR) 22 tuntia. Edustaja photomicroscopic havainnot jokaisessa määrityksessä esitetään alla sarakkeita. *

p

0,05, tilastollisesti merkittävää eroa käsiteltyjen solujen DMSO tai AR-A014418.

Muutokset Invasive Fenotyyppikuvaus syöpäsolujen jälkeen GSK3p esto

edellä esitetyt tulokset johtivat meidät oletuksen, että GSK3p on rooli syövän solujen vaeltamiseen ja invaasiota. Tämä voi johtua epiteeli–mesenkymaalitransitioon (EMT), fenotyyppi vastaa syövän invaasio ja metastaasi [25]. Tutkimme ilmaus EMT liittyvien molekyylien E-kadheriinin, N-kadheriinin ja vimentiinista syöpäsoluissa käsittelyn jälkeen AR-A04418 ja GSK3p-erityisiä siRNA. Ei johdonmukaisia ​​muutoksia havaittu ekspressiotasot näiden molekyylien (Fig. S1C, D), mikä tarkoittaa, että EMT ei todennäköisesti ole mekanismia, jolla GSK3p esto vaimentaa syöpäsolujen muuttoliikettä ja invaasiota. Mahdollinen selitys voi olla, että vahvistettu syöpä solulinjoja ovat jo hankkinut EMT fenotyyppi.

Seuraava keskittynyt solu- -mikroarkkitehtuuriin ja erityisesti lamellipodioihin että on tärkeä rooli solujen vaeltamiseen aikana fysiologisia prosesseja ja syövän solujen vaeltaminen ja hyökkäys [26]. Jäsen, Rho-GTPaasi perhe, Rac1, osallistuu lamellipodioihin muodostumiseen ja syövän etenemistä [27]. Haavojen parantumisen testi osoitti, että vaeltavien syöpäsolujen muodostavat lamellipodioihin paikalla Rac1 lokalisointi, jossa aktiinisäikeiden järjestäminen lamellin rakenne. Hoidon AR-A014418 laski lamellipodioihin muodostumista syöpäsolujen haavan reunalla ja johti diffuusi sytoplasman jakautumista Rac1 ja F-aktiini (kuvio. 6A).