Krooninen sairaus

tiivistelmä

suuri haaste onkologit ja farmakologian on kehittää vähemmän myrkyllisiä lääkkeitä, jotka parantavat selviytymistä keuhkosyöpäpotilaita. Frondoside A on triterpenoidi glykosidi eristetään meren kurkkua,

Cucumaria frondosa

ja sen osoitettiin olevan erittäin turvallinen yhdiste. Olemme tutkineet vaikutus Frondoside A selviytymisen, muuttoliikettä ja invaasio

in vitro

, ja kasvaimen kasvua, etäpesäke ja angiogeneesiä

in vivo

yksinään ja yhdistelmänä sisplatiinin. Frondoside aiheuttama pitoisuudesta riippuvainen väheneminen elinkelpoisuuden LNM35, A549, NCI-H460-Luc2, MDA-MB-435, MCF-7, ja HepG2 yli 24 tuntia läpi kaspaasi 3/7 riippuvainen solukuolemareittiin. IC50 pitoisuudet (tuottaa puolet maksimaalisesta esto) 24 h olivat välillä 1,7 ja 2,5 uM Frondoside A. Lisäksi Frondoside indusoi ajasta ja pitoisuudesta riippuva esto solumigraation, invaasio ja angiogeneesi

in vitro

. Frondoside A (0,01 ja 1 mg /kg /päivä i.p. varten 25 päivää) laski merkittävästi kasvua, angiogeneesin ja imusolmuke etäpesäke LNM35 ksenograftien kateenkorvattomissa hiirissä, ilman selvää toksisia sivuvaikutuksia. Frondoside A (0,1-0,5 uM) myös merkittävästi estänyt pohjapinta ja bFGF: n indusoimaa angiogeneesiä CAM angiogeneesimääritys. Lisäksi Frondoside parannettu inhibitioon keuhkoissa kasvaimen kasvun aiheuttama kemoterapeuttisen aineen sisplatiinin. Nämä havainnot tunnistaa Frondoside A lupaava uusi terapeuttinen aine keuhkosyöpään.

Citation: Attoub S, Arafat K, Gélaude A, Al Sultan MA, Bracke M, Collin P, et ai. (2013) Frondoside tukahduttava Vaikutukset Keuhkosyöpä Survival, Tumor Growth, Angiogeneesi, Invasion, ja Metastasis. PLoS ONE 8 (1): e53087. doi: 10,1371 /journal.pone.0053087

Editor: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 13 kesäkuu 2012; Hyväksytty: 27 marraskuu 2012; Julkaistu: 8. tammikuuta 2013

Copyright: © 2013 Attoub et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ sai taloudellista tukea FMHS avustuksen määrä NP /08/27 (SA), Arabiemiirikuntien yliopiston avustusta sopimuksen no. 01-04-8-11 /09 (SA), Terry Fox Fund for Cancer Research (SA ja TA), The UAEU-NRF 09/10 lupanumeroon 21MO72 (SA), ja Maine Technology Institute, Gardiner, Maine, USA, ja National Cancer Institute, RAPID Program (PC). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Peter Collin on johtaja, laboratorio johtaja, työntekijän ja kalusto-haltijan Coastside Bio resurssit, Maine, USA Corporation. Thomas Adrian ja Peter Collin ovat keksijät yhdysvaltalaisen patentin kuvataan Frondoside A ja muut meren kurkkua glykosidit putatiivisiksi syöpälääkkeet, ja voivat hyötyä taloudellisesti jos Frondoside tulee lääke ihmisen syövissä. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Keuhkosyöpä on yleisin syöpä on yksi korkeimmista kuolleisuus maailma. Kohdennettu hoitojen valituille potilasalaryhmissä muodostavat huomattavaa edistystä hoidossa keuhkosyövän. Huolimatta näistä edistysaskeleista, ristiriitoja säilyvät, potilaat kuolevat, ja hoito on edelleen heikko [1]. Luonnolliset yhdisteet ovat nousemassa uuden sukupolven syöpälääkkeiden rajoitetun myrkyllisyys syöpäpotilailla [2], [3]. Ne voivat olla arvokkaita kasvaimissa vastustuskykyisiä klassista kemoterapian avulla tai resistenttejä tyrosiinikinaasiestäjiksi kuten gefitinibi

Sea kurkut on arvostettu satoja vuosia Kiinan ruokavalion ruoka herkku sekä lääkkeenä erilaisia ​​sairauksia. Yhdysvalloissa ja Kanadassa, meri kurkkua kudokset kuivataan, jauhettiin ja kapseloitu kuten Nutraceuticals over-the-counter ruokavalion terveyteen täydentää, ensisijaisesti suunnattu tulehdustiloja ihmisillä ja lemmikkieläimiä [4]. Frondoside A on triterpenoidi glykosidi eristetään Atlantin kurkkua,

Cucumaria frondosa

. (Katso [5] kemiallinen rakenne). Viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että pieninä pitoisuuksina Frondoside estää kasvun ja indusoi apoptoosia ihmisen haiman, leukemian ja rintasyövän solujen kautta kaspaasin aktivaation [6] – [8].

kemoterapeuttisten aineiden käytössä keuhkosyövän ovat edelleen epätyydyttävä johtuen liittyvän yhteistyön sivusuunnassa myrkyllisyys ja lääkkeen aiheuttama vastus [9] – [11], jotka saavat meidän tutkimus vaikutuksista Frondoside A ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä selviytymisen, muuttoliike ja invaasio

in vitro

, ja kasvaimen kasvua, etäpesäke ja angiogeneesiä

in vivo

yksinään ja yhdistelmänä sisplatiinin.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja reagenssit

ihmisen keuhkosyöpä solut LNM35 (NSCLC) [12], A549- ja NCI-H460-Luc2 (Caliper LifeSciences, USA) ylläpidettiin RPMI 1640 (Invitrogen, Paisley, UK), ihmisen melanooma MDA-MB-435, ihmisen maitorauhasen adenokarsinoomasoluja MCF-7, ja ihmisen hepatoomasolut HepG2 pidettiin DMEM (Invitrogen, Paisley, UK). Kaikki alustat on täydennetty antibiooteilla (penisilliini 50 U /ml; streptomysiiniä 50 ug /ml) (Invitrogen, Cergy Pontoise, Ranska) ja 10% naudan sikiön seerumia (FBS, Biowest, Nouaille, Ranska). EndoGRO ™ ihmisen napalaskimon endoteelisoluja (HUVEC) (Millipore, Temecula, CA) pidettiin EndoGRO ™

-MV-VEGF Complete Media Kit (Millipore, Temecula, CA). Sisplatiini ostettiin Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, Ranska). Frondoside A puhdistettiin

Cucumaria frondosa

, korjattu lähellä Stonington, Maine ja puhtaus (99,9%) varmistettiin NMR aikaisemmin kuvatulla [13], [14].

Cellular elinkelpoisuuden

solut ympättiin tiheydellä 5000 solua /kuoppa 96-kuoppaisille levyille. 24 tunnin kuluttua soluja käsiteltiin vielä 24 h: n eri konsentraatioilla Frondoside A (0,01-5 uM), kolmena kappaleena. Ohjaus viljelmiä käsiteltiin 0,1% DMSO: ta. Vaikutus Frondoside A solujen elinkelpoisuus määritettiin käyttämällä CellTiter-Glo Luminescent solunelinkykyisyysmääritys (Promega Corporation, Madison, USA), joka perustuu määrällisesti ATP, joka viestittää läsnäolo metabolisesti aktiivisia soluja. Luminoiva signaali mitattiin käyttäen GLOMAX Luminometer järjestelmään. Tulokset esitettiin suhteessa elinkelpoisuus (%) vertaamalla käsitellyn ryhmän kanssa käsittelemättömiä soluja, elinkelpoisuutta, jonka oletetaan olevan 100%.

kaspaasi 3/7 aktiviteetti

LNM35 soluja ympättiin tiheydellä 5000 solua /kuoppa 96-kuoppalevylle ja käsiteltiin Frondoside A (1-2,5 uM) 2 ja 24 h, kolmena kappaleena. Kaspaasi 3/7 aktiivisuus mitattiin käyttämällä luminoivaa kaspaasi-Glo 3/7 iinianalyysikitissä noudattamalla valmistajan ohjeita (Promega Corporation, Madison, USA). Kaspaasi-reagenssia lisättiin ja levyä sekoitettiin käyttäen tasoravistelijalla ja inkuboitiin 2,5 tuntia huoneenlämpötilassa. Luminenssi mitattiin käyttämällä GLOMAX Luminometer järjestelmä.

Haavan paranemista motiliteetin määritys

LNM35 soluja kasvatetaan kuuden hyvin kudosviljelymaljoille konfluenssiin asti. Viljelmiä inkuboitiin 10 min Moscona puskurilla. Kaapia tehtiin läpi yksisolukerroksena muovisella pipetin kärki 1 mm halkaisijaltaan. Sen jälkeen maljat pestiin kahdesti ja inkuboitiin 37 ° C: ssa tuoreessa RPMI, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia läsnä ollessa tai poissa ollessa ei-toksisia pitoisuuksia Frondoside A (0,1-0,5 uM). Alareunassa puolella kuhunkin maljaan kahden mielivaltaisen paikoissa, jotka on merkitty, missä leveys haava mitattiin käännettyä mikroskooppia (tavoite x 4) (Olympus 1X71, Japani). Liikkuvuutta ilmaistiin keskiarvona ± SEM ja mittausten ero ajanhetkellä nolla ja 6, 24 ja 30 h ajan tarkastelujaksolla.

Matrigel invaasiomääritys

invasiivisuuden keuhkosyöpä solut LNM35 käsiteltiin Frondoside A (0,1-1 pM), testattiin käyttämällä BD Matrigel Invasion jaosto (8 um: n huokoskoko, BD Biosciences, Le Pont de Claix, Ranska) valmistajan protokollan. PI3 estäjä LY294002 (20 uM) käytettiin positiivisena estäjä solujen invaasion. Lyhyesti, solut (1 x 10

5 solua 0,5 ml: aan väliainetta ja ilmoitettu pitoisuus Frondoside A) ympättiin yläkammiot järjestelmän, pohja kuopat järjestelmän täytettiin RPMI, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön naudan seerumia chemo-houkutin, ja inkuboitiin sitten 37 ° C: ssa 24 tuntia. Ei-tunkeutuva solut poistettiin yläpinnan suodattimen pumpulipuikolla. Solut, jotka ovat siirtyneet kautta matrigeelin kiinnitettiin 4% formaldehydiä, värjättiin DAPI ja laskettiin 25 satunnaisessa aloilla mikroskoopilla. Määritys suoritettiin kahtena ja toistettiin kolme kertaa kvantitatiivista analyysiä.

rakkokalvon (CAM) angiogeneesimääritys

Tämä määritys suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [15], jossa on joitakin muutoksia. Lyhyesti, hedelmöitettyjä munia inkuboitiin 3 päivää 37, 8 ° C: ssa kosteuden ollessa 48%. Päivänä 4, albumiini poistettiin irrottaa kuori kehittyvän CAM ja ikkuna tehtiin munankuoren, paljastaen CAM, ja peitetään hengitys kalvon (suprasorb F®). Munat palautettiin inkubaattoriin päivään 10, ennen soveltamista testiyhdisteiden. Testiyhdistettä ja ohjaus yhdistettä (DMEM ilman 10% FBS: ää) liuotettiin DMEM ilman 10% FBS kaadettiin erillistä steriiliä levyt (12 mm halkaisija), joka annettiin kuivua steriileissä olosuhteissa. Liuos, jossa kortisoniasetaattia (125 ug /levy) kaadettiin kaikki levyt estämään tulehdusreaktion. Testi levyjä tutkittiin ihmisen rekombinantti-bFGF (Peprotech) toimi kontrollina angiogeneesin stimulaation. Jokaisena CAM, sisältävän levyn ohjaus yhdistettä ja levyn sisältävän testiyhdisteen pantiin etäisyydellä 1 cm. Ikkunat peitettiin ja munia inkuboitiin vasta 14. päivänä, ennen arviointia angiogeneesiä. Näin ollen, munat tulvii 10% puskuroituun formaliiniin ja munat pidettiin huoneen lämpötilassa vähintään 20 minuutin ajan. CAM-alue levyjen mukana, laitettiin petrimaljaan, jossa oli 10% puskuroituun formaliiniin. Muovipidikkeisiin poistettiin ja vaihe-kontrastin kuvia alueen muovikiekkojen otettiin. Verisuonten indeksi mitattiin kuten aiemmin on kuvattu [16]. Vascular risteyksiä laatikossa sisältää kolme ympyröitä (6, 8 ja 10 mm halkaisijaltaan niin keskus keskellä levyä) laskettiin. Angiogeeninen index =

(tc) /C

, jossa

t

määrä risteyksiä kattamalla alueella testi levy ja

c

määrä risteyksiä kattama alue säätökiekko samassa muna. Mann-Whitneyn U-testiä käytettiin tilastolliseen analyysiin (p 0,05).

Vascular putken muodostumiseen määrityksessä

Arvio

in vitro

kapillaarisen muodostumiseen käytetty Matrigel (Becton Dickinson, Le Pont de Claix, Ranska). Matrigel on okasolusyöpä tyvikalvon matriisin, joka koostuu pääasiassa kollageeni IV, laminiini, entaktiini, ja heparaanisulfaattiproteoglykaanit. Matrigel-matriisi sulatettiin, sekoitettiin varovasti homogeeniseksi käyttäen jäähdytettiin pipetit, ja laimennettiin v /v kanssa EndoGRO ™

-MV-VEGF Complete Media Kit väliaineessa (Millipore, Temecula, CA, USA). Matrigel, 50 ul /kuoppa, johon on lisätty angiogeenisten peptidien ja muiden efektorien käytettiin kaivot päällystettiin 96-kuoppaisille levyille. Sitten levyä inkuboitiin yhden tunnin ajan 37 ° C: ssa, jotta matriisin jähmettämiseksi ennen hoitoa. HUVEC-soluja (tiheydellä noin 4 x 10

4 solua /kuoppa ja osoitettu pitoisuus Frondoside A) maljattiin kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin 8 tuntia 37 ° C: ssa 0,1 ml: ssa EndoGRO ™

-MV -VEGF Complete Media Kit keskitason (Millipore, Temecula, CA, USA). Sitten solut valokuvattiin käyttäen käänteisen faasikontrastimikroskoop- valomikroskooppia. Putkimainen verkko kasvualue verrattiin kontrolli- ja estäjä käsiteltyjen matrigeeliä matriisi. -Putken muodostumiseen kvantifioitiin laskemalla putken kaltaisia ​​rakenteita on muodostettu kuhunkin kuoppaan. Vaikutus Frondoside A elinkelpoisuus HUVEC määritettiin käyttämällä CellTiter-Glo Luminescent solunelinkykyisyysmääritys (Promega Corporation, Madison, USA), kuten aiemmin on kuvattu, että syöpäsoluja.

Kasvaimen kasvu ja etäpesäkkeiden määrityksessä

eläinkokeet suoritettiin pöytäkirjan mukaisesti hyväksymän eläimen eettinen komitea ja Institutional animal Care lääketieteellisen tiedekunnan Health Sciences /UAE yliopistossa. Kuusi viikkoa vanhoja kateenkorvattomiin NMRI naispuolinen nude-hiiriin (nu /nu, Charles River, Saksa) pidettiin suodatettua ilmaa laminaarivirtausmittaria kaapit ja käsitellään aseptisesti. Menettelyt, joissa käytetään eläimiä ja niiden hoito tehtiin mukaisesti Institutional ohjeita, jotka noudattavat lääketieteellisen tiedekunnan Health Sciences, kansallisia ja kansainvälisiä lakeja ja politiikkaa (ETY neuvoston direktiivi 86/609, OJ L 358, 1 12. joulukuuta 1987 ja NIH opas Hoito ja käyttö Laboratory Animals, NIH-julkaisu nro 85-23, 1985). LNM35 soluja (1 x 10

6 solua 200 ul PBS) ruiskutettiin ihonalaisesti sivusuunnassa kylkeen nude-hiirissä. Viikon kuluttua inokulaation jolloin kasvaimet olivat saavuttaneet tilavuus on noin 150 mm

3, eläimet (kuusi kussakin ryhmässä) käsiteltiin ensimmäisen protokollan 25 päivää Frondoside A (0,01 ja 1 mg /kg /vrk, ip ) tai kantaja-liuosta (kontrolli), jotta voidaan määrittää vaikutus Frondoside yksin kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden. Toinen protokolla, eläimiä käsiteltiin vain 10 päivää, jolla on pienin annos Frondoside A (0,01 mg /kg /vrk, ip), sisplatiinia (1 mg /kg /vrk, ip), tai yhdistetty Frondoside A ja sisplatiinihoitoon . Kontrollieläimet käsiteltiin kantaja-liuosta. Kasvain mitat ja eläinten painot mitattiin 3 päivän välein. Kasvaimen tilavuus (V) laskettiin käyttäen kaavaa: V = 0,4 x a × b

2, jossa ”a” on pituus ja ”b” leveys kasvain. Lopettamisen jälkeen kasvaimet ja kainalon imusolmukkeisiin leikattiin ja punnittiin.

Immuno-histokemiallinen määritys CD31 /verihiutaleiden-endoteelisolujen adheesiomolekyyli 1 (PECAM-1) varten mikroverisuonitiheys

Vaikutus of Frondoside A angiogeneesiin arvioitiin käyttämällä CD31 immuno-värjäystä. Kasvaimen kudokset jäädytettiin nopeasti isopentaanissa on -130 ° C: ssa ja säilytettiin -70 ° C: ssa, kunnes se jatkokäsiteltiin. Kahdeksan um jääleikkeille kiinnitettiin asetonilla ja inkuboitiin yön kanssa CD31-vasta-aineen (klooni MEC13.3, 1:100) (BD Pharmingen, San Jose, CA, USA). Objektilasit pestiin sitten kolme kertaa PBS: ssä ja inkuboitiin sekundäärisen vasta-aineen leimattu rodamiinilla (vuohen anti-rotta-1:100) yhden tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Valtaama alue CD31-positiivisten pienten verisuonten ja koko kudoksen ala lohkolle vertailtiin käsiteltyjen ja kontrolli hiirillä. Kaikki analyysit suoritettiin sokkotavalla.

Tulokset ilmaistiin keskiarvoina ± S.E.M. lukumäärästä kokeita. Ero kokeellisia ja ohjaus arvot arvioitiin ANOVA seurasi Dunnettin post-hoc monivertailutestillä. Kasvaimen kasvu ja etäpesäkkeiden tutkimukset analysoitiin käyttämällä paritonta Studentin t-testiä. P 0,05 osoita merkitsevää eroa.

Tulokset

vaikutus Frondoside A solujen elinkelpoisuuden

Kuten kuvassa. 1, Frondoside a pitoisuus (0,01-5 uM) aiheutti pitoisuudesta riippuvainen vähentää solujen elinkelpoisuuden LNM35, A549, NCI-H460-Luc2, MDA-MB-435, MCF-7, ja HepG2-soluissa yli 24 tuntia. IC50-pitoisuudet (jotka tuottavat puolimaksimaalisen inhibition) 24 h olivat välillä 1,7 ja 2,5 uM Frondoside A kaikissa solulinjoissa.

Eksponentiaalisesti kasvavat LNM35 (A), A549 (B), NCI-H460 -Luc2 (C), MDA-MB-435 (D), MCF-7 (E), ja HepG2 (F) soluja käsiteltiin ajoneuvon (0,1% DMSO) ja osoitetut konsentraatiot Frondoside A. Elävät solut analysoitiin on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Kaikki kokeet toistettiin vähintään kolme kertaa.

Sarakkeet

, keskiarvo;

baareja

, S.E.M. ** Merkittävästi erilainen P 0,01, *** Merkittävästi erilaiset P 0,001.

Frondoside indusoi kaspaasi 3/7 aktivointi

kaspaasi-3/7-aktiivisuus on olennaista apoptoottisen solukuoleman polkuja. Suhteellista aktiivisuutta kaspaasien 3/7 analysoitiin LNM35 soluissa käsiteltiin 2 ja 24 h Frondoside A (1-2,5 uM), ja normalisoitiin solujen määrä kuoppaa kohti. Kuten on esitetty kuviossa. 2, kaspaasi 3/7 aktiivisuus lisääntyi 2,5-ja 10,8-kertaisesti LNM35 soluissa käsiteltiin 24 h Frondoside A1 ja 2,5 uM. Samanlainen vaikutus havaittiin hoidon jälkeen Frondoside A (1-2,5 uM), 2 tuntia (dataa ei näytetty).

analysoitiin LNM35 soluissa, joita käsiteltiin 24 h Frondoside A (1-2,5 uM), normalisoitu että elävien solujen lukumäärä kuoppaa kohti ja ilmaistuna kertainen induktio verrattuna kontrolliryhmään. * Merkittävästi erilainen P 0,05.

vaikutus Frondoside A LNM35 ksenografteissa

Vahvista farmakologinen merkitystä meidän

in vitro

tiedot, syövän vastaista aktiivisuutta of Frondoside A tutkittiin

in vivo

kateenkorvattomissa hiirissä ympätty LNM35 keuhko- syöpäsoluja. Kasvu LNM35 ihmisen tuumoriksenografteja seurattiin joka kolmas tai neljäs päivä 25 peräkkäisen päivän kuluttua päivittäisen i.p. injektio 0,01 mg: n ja 1 mg /kg Frondoside A. Käsittely pienin annos Frondoside A (0,01 mg /kg /vrk) vähensi tilavuus LNM35 ksenograftien 41% (Fig. 3A). Samanlainen ero havaittiin myös kasvaimen painon kokeen lopussa (2,1 +/- 0,3 g versus 4,5 +/- 0,8 g;

P 0,05

, Fig. 3C). Hoito korkeimmalla annoksella (100 kertaa enemmän) Frondoside A (1 mg /kg /vrk) noin 43,9% tuumorin tilavuudesta LNM35 ksenograftien (Fig. 3B). Lähes samanlainen ero havaittiin kasvaimen painon kokeen lopussa (3 +/- 0,5 g versus 4,5 +/- 0,8 g; Fig. 3d). Tämä koe osoitti selvästi, että pienin annos Frondoside A (0,01 mg /kg /päivä) on optimaalinen kasvaimen kasvun inhibitiota. Ei ollut ilmeisiä haittavaikutuksia Frondoside Hoito eläinten käyttäytymisen tai kehon painoa joko kokeessa (Kuva. 3E ja 3F). Lisäksi, ei ollut näkyviä poikkeavuuksia ruumiinavauksessa, tai mitä tahansa muita ilmeisiä merkkejä toksisuudesta, kuten aiemmin on kuvattu meidän tiimiin [7].

A) B) Kasvaimen tilavuus LNM35 ksenograftien istutettiin ihonalaisesti nude-hiirissä ja käsiteltiin Frondoside A (0,01 ja 1 mg /kg, vatsaonteloon injektioita, vastaavasti) tai kontrolli kantaja-liuosta yksin, yhteensä 25 päivää. Data pistettä edustavat keskiarvoa ± SEM 6 hiirtä ryhmää kohti. C) D) Kasvaimen paino saadaan samasta ohjaus ja käsitelty paljaisiin hiiriin. Data pistettä edustavat keskiarvoa ± SEM 6 hiirtä ryhmää kohti.

Sarakkeet

, keskiarvo;

baareja

, S.E.M. E) F) Paino näiden hiirten. Data pistettä edustavat keskiarvoa ± SEM 6 hiirtä ryhmää kohti. * Merkittävästi erilainen P 0,05.

Angiogeneesin estäminen Frondoside A, ksenosiirrettyjä kasvaimia ja CAM-määritys

in vivo

ja kapillaarisesti kaltaisia ​​rakenteita

vuonna vitro

Angiogeneesi on houkutteleva kohde syövän hoidossa ei vain koska se toimittaa happea ja ravinteita eloonjäämisen kasvainsolujen mutta tarjoaa myös reitin metastaattisen leviämisen näitä syöpäsoluja. Ensimmäinen, me osoitamme, että lisääntyvissä alueilla kehällä kasvain, mikroverisuonitiheys (mitattuna CD31-värjäys), oli merkitsevästi pienempi Frondoside A (0,01 mg /kg /päivä) (Fig. 4, oikea paneeli) verrattuna kontrolli-käsiteltyjen kasvainten (Fig. 4, vasen paneeli). Seuraavaksi käytimme CAM analyysissä käytetään koordinoinnista ja integroinnista monisoluisten vastausten kehityksen aikana kanan alkion vahvistamaan tätä potentiaalia antiangiogeeniset vaikutus Frondoside A. Kuten kuvassa. 5 ja 6, bFGF (2 ug /ml), stimuloitu 15% uusi alus muodostumisen angiogeenisen indeksin tilastollisesti erilaisia ​​verrattuna kontrolliryhmään DMEM väliaineessa. Frondoside A (100 ja 500 nM) esti pohjapinta angiogeneesiä pitoisuudesta riippuvaisella tavalla vastaavasti 7% ja 12%: n inhibition angiogeeninen indeksi verrattuna kontrolliin (Fig. 5 ja 6). Muodostuu uusia verisuonia bFGF: n indusoimien myös tukahduttaa täydellisesti Frondoside A (500 nM) (Fig. 5 ja 6). Lopuksi arvioida, antiangiogeeniset vaikutus Frondoside A käsittää suoran vuorovaikutuksen yhdisteen kanssa endoteelisolujen teimme vertailevia tutkimuksia muodostumista kapillaarimaisen rakenteet

in vitro

, käyttäen HUVEC maljattiin Matrigel päällystettyihin levyihin. Kuten on esitetty kuviossa. 7A, ihmisen endoteelisolujen on kyky muodostaa kapillaarisen rakenteita, kylvetään ja viljellään päälle Matrigel alustan. Ohjaus solut liikkuvat sen ensimmäisestä yhtenäistä mallia hajallaan solukerrosten ja liittää muodostamaan verkoston soluklusterien kytketty pitkä, monisoluisista johtavia prosesseja muodostumiseen putken kaltaisia ​​rakenteita. Lisäksi ei-myrkyllisiä pitoisuuksia Frondoside A (0,01-1 uM) johti merkittävään inhibitioon spontaani angiogeeninen fenotyyppi (Fig. 7A ja 7B). Frondoside inhiboivan tämän spontaanin angiogeeninen fenotyyppi tapahtui ilman merkittävää vähentämistä solujen elinkelpoisuuden (Fig. 7C). Yhdessä nämä tiedot vahvistavat voimakas anti-angiogeeninen potentiaali Frondoside A.

Immuno-histokemiallisella keuhkojen ksenograftikasvaimissa CD31 (mikroverisuonitiheys).

CAM käsiteltiin ohjaus (seerumittomassa väliaineessa), 100 nM Frondoside A, 500 nM Frondoside A, 2 ug /ml bFGF: ää, 2 ug /ml bFGF: ää + 500 nM Frondoside A ja vaskularisaation testin levyjen valokuvattiin.

harkko

osoittavat angiogeenisen indeksin (%) CAM: n tutkitun 2 ug /ml bFGF: ää, 100 nM Frondoside A, 500 nM Frondoside A, 2 ug /ml bFGF: ää + 500 nM Frondoside A. Data edustaa keskiarvoa ± SD (Mann-Whitney U-testi, *: p 0,05, ***: p 0,01). Kussakin kokeessa kuusi munaa testattiin per ehto.

A) kuviot indusoiman angiogeneesin ihmisen napalaskimon endoteelisoluja (HUVEC) viljeltiin Matrigelillä matriisin 96-kuoppalevyille puuttuessa tai läsnä ollessa Frondoside A. B) kvantifiointi putkimaisen morfogeneesin indusoiman HUVEC-soluja viljeltiin ilman tai läsnä Frondoside A. Tube muodostuminen määritettiin putken pituus kaltaisia ​​rakenteita, jotka sisältävät kytketty soluja. Tiedot ovat keskiarvo ± SEM kolmesta erillisestä kokeesta. Asteriskit osoittavat, että merkittävästi erilaiset arvot saatiin, kun läsnä on ilmoitettua estäjien vs. vastaava valvonta stimulaatiota. *** Merkittävästi erilainen P 0,001. C) HUVEC-soluja käsiteltiin vehikkelillä (0,1% DMSO) ja osoitetut konsentraatiot Frondoside A. Elävät solut testattiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Kaikki kokeet toistettiin vähintään kolme kertaa.

Sarakkeet

, keskiarvo;

baareja

, SEM

Frondoside myös heikentää keuhkosyöpäsolua muuttoliikettä ja invaasiota

in vitro

ja etäpesäkkeiden

in vivo

Syöpä etenemistä liittyy kumoamisesta terveillä jotka rajoittavat solujen vaeltamiseen ja invaasio, joka lopulta johtaa etäpesäkkeitä. Keuhkosyöpä potilailla on suuri riski toistumista muodossa etäpesäkkeitä. Etäpesäke alkaa soluvaelluksen primaarikasvaimen, mikä johtaa paikalliseen kudosinvaasio ja tuloa imunesteen tai verisuoniin. Kyky Frondoside A vähentää solumigraatiota tutkittiin käyttämällä klassisia

in vitro

haavan paranemisen malli. Frondoside alennettu solujen kulkeutumista LNM35 solujen pitoisuudesta ja ajasta riippuvaisella tavalla (Kuva. 8A). Samoin Frondoside heikentynyt hyökkäyksen LNM35 solujen Matrigel invaasiomääritys (Fig. 8B). Frondoside inhiboivan vaikutuksen solumigraatiota ja matrigeeliä hyökkäys tapahtui ilman merkittävää vähentämistä solujen elinkykyä (Fig. 1A).

A) Haavat käyttöön LNM35 konfluentteja mono-kerrosta viljelty läsnä ollessa tai puuttuessa (kontrolli) ja Frondoside A (0,1-0,5 uM). Keskimääräinen etäisyys, että solut kulkivat reunasta kaavittu alueen 6, 24, ja 30 h 37 ° C: ssa mitattiin sokkona, käyttämällä käännettyä mikroskooppia (4 x suurennuksilla). Tiedot ovat keskiarvoja ± SEM Kahden itsenäisen kokeen. B) LNM35 soluja inkuboitiin 24 h: n läsnä tai poissa ollessa Frondoside A (0,01-1 uM) ja LY294002 (20 uM). Solut, jotka tunkeutunut osaksi matrigeelin pisteytettiin kuvatulla Materiaalit ja menetelmät.

Sarakkeet

, keskiarvo; baareja, S.E.M. Imusolmukkeiden etäpesäkkeiden painon vahvistettu ihmisen keuhkosyöpä ksenografteja käsiteltiin Frondoside 0,01 mg /kg (C) ja 1 mg /kg (D) joka päivä 25 päivää.

Sarakkeet

, keskiarvo;

baareja

, S.E.M. * Merkittävästi erilainen P 0,05, ** Merkittävästi erilaiset P 0,01, *** Merkittävästi erilaiset P 0,001.

Seuraavaksi arvioimme metastaattisen käyttäytymistä ihmisen keuhkojen solulinja LNM35 tutkimalla kainalon imusolmukkeisiin. Histologinen tarkastelu imusolmukkeiden LNM35 kantavien hiirten paljasti LNM35 solujen kaikki imusolmukkeet sekä ohjaus- ja Frondoside Käsitelty hiirissä (tuloksia ei ole esitetty). Kontrolliryhmässä hoidetussa ryhmässä keskimääräinen imusolmukkeiden paino oli 548,5 +/- 112,8 mg verrattuna 256 +/- 43,3 ja 268,8 +/- 55,7 mg potilailla, joita hoidettiin Frondoside 0,01 mg ja 1 mg /kg /vrk, vastaavasti (Fig. 8C ja 8D).

Frondoside parantaa syövän vastaista aktiivisuutta sisplatiinin

Kuten kuviossa. 9A, päivittäinen anto Frondoside A nude-hiiriin vähensi kasvua LNM35 ihmisen tuumoriksenografteja 40,3% päivänä 10. estäminen LNM35 -tuumoriksenografti kasvua Frondoside A verrattavissa tuottamien DNA: ta vaurioittavien syöpälääke sisplatiini (46,9% ). Yhdistetty hoito Frondoside A sisplatiinin johti merkittävä voimistumisen (67,6%;

P 0,05

) Sisplatiini terapeuttisen vaikutuksen (kuvio. 9A). Ei ollut ilmeisiä sivuvaikutuksia kombinaatio eläinten käyttäytymisen tai kehon paino (Fig. 9B).

A) Frondoside lisää sisplatiinin tehoa vastaan ​​NSCLC LNM35 soluja kasvaa ksenograftit. B) vaikutus Frondoside A ja sisplatiinia yksin tai yhdistettynä painoon. * Merkittävästi erilainen P 0,05.

Keskustelu

Huolimatta edistysaskeleet molekyylibiologian keuhkosyöpään, parantunut diagnoosi, ja jopa optimaalinen tavoite hoitoja, nykyinen protokollia Keuhkosyövän syöpä ovat vielä riitä tuottamaan silmiinpistävää kliinisiä etuja ja parantamiseen keuhkosyöpäpotilaiden pysyy onnistu. Nykyinen täsmähoitoihin huumeiden kehittää resistenssin ja ne ovat erittäin kalliita ja ei ole saatavilla useimmissa keuhkosyöpäpotilaita maailmassa. Monet lääkkeet ovat suhteellisen alhainen aktiivisuus; harvat potilaat kovettunut, lyhyt, mahdollisesti kasvaa selviytymisen [17]. Historia syöpälääkkeet, kuten paklitakseli, osoittaa, että vaikutusmekanismi on tunnistettu useita vuosia kliinisen teho on osoitettu. Vaikka ei tiedä lääkkeen toimintamekanismi, uskomme, että

in vitro

sekä vahva

in vivo

syöpälääkkeen vaikutuksia Frondoside a tulee kääntää klinikalla uuteen voimakas anti keuhkosyöpä agentti.

Tässä tutkimuksessa olemme tutkineet vaikutus Frondoside A keuhkosyöpään solujen etenemisen. Osoitimme, että Frondoside aiheutti pitoisuus-reagoiva (0,01-5 uM) pienenee elinkelpoisuus LNM35, A549, ja NCI-H460-Luc2 soluissa yli 24 tuntia kautta kaspaasi 3/7 riippuvaista solukuolemareittiin. IC50 pitoisuudet (tuottaa puolet maksimaalisesta esto) 24 h olivat välillä 1,7 ja 2,5 uM Frondoside A. Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia ​​aiemmin julkaistu tulokset alhainen pitoisuus Frondoside estää niiden kasvun ihmisen haimasyövän soluja ja indusoi apoptoosia kaspaasi 9 /3/7 lisääntynyt Bax, vähentynyt bcl-2 ja MCL-1, ja pidätti solukierron ja säädelty p21 [8], indusoi apoptoosin ihmisen leukemiasolujen kautta kaspaasin aktivaatio [6], ja merkittävästi vähentää elinkelpoisuus estrogeenireseptori (ER) -negatiivinen MDA-MB-231-rintasyöpäsolujen indusoimalla apoptoosin kautta Caspase9-Caspase3 /7 sisäisen reaktiotien [7]. On myös osoitettu, että Frondanol A5, epäpuhdas uute

Cucumaria frondosa

ihoa, josta Frondoside A on alun perin peräisin, johtuvan kasvun inhibitio S ja G2-M-vaiheeseen lasku Cdc25c ja lisätä p21

WAF1 /CIP1 merkittäviä apoptoosiin liittyviä H2AX fosforylaatiota ja kaspaasi-2 pilkkominen on paksusuolensyöpä johdettuja HCT116-soluissa [4]. Toinen paperi osoitti myös, että Frondanol-A5P, polaarista sakka sub-osa Frondanol-A5, esti lisääntymistä ja indusoi G2 /M vaiheessa solukierron pysähtymisen kahdessa haimasyövän soluja vähentynyt ilmentyminen sykliini A, sykliini B, ja cdc25c [ ,,,0],18]. Tämä syövänvastainen vaikutus Frondoside A ei ole kudosspesifinen, ja tässä yhteydessä olemme osoittaneet, että Frondoside indusoi konsentraatiosta riippuvaisen vähentää solujen elinkelpoisuus melanooman MDA-MB-435, rinta MCF-7, ja hepatooma HepG2-soluissa.

vaikutusten arvioimiseksi Frondoside A keuhkojen kasvainten kehittymiseen

in vivo

, LNM35 ksenograftit tehtiin immunologiseen tukahdutetaan hiirillä. Olemme osoittaneet, että intraperitoneaalisesti Frondoside aiheutti voimakkaan taantumisen vakiintuneiden kasvainten. Maksimi inhibitio saatiin alhaisella annostasolla 0,01 mg /kg /päivä 25 päivää. 100 kertaa suurempi annos antaa samanlaisia ​​vaikutuksia osoittaa, että annoksen nostaminen ei paranna syövän tehoa Frondoside A. syöpä estävä vaikutus Frondoside A on ollut havaittu aikaisemmin AsPC-1 haima- ja MDA-MB-231 vierassiirrännäiset kateenkorvattomissa hiirillä [7], [8]. Tämä kasvaimen vastainen vaikutus Frondoside A voi olla osittain sen immuno-stimuloiva vaikutus [13] ja /tai anti-angiogeenisen vaikutuksen. Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet ensimmäistä kertaa, että Frondoside A on voimakas anti-angiogeeninen aine. Se vähentää mikroverisuonitiheys (mitattuna CD31 värjäys) on ksenosiirrettyjä kasvaimen käsitelty Frondoside A ja myös merkittävästi kääntää pohjapinta ja bFGF: n indusoimaa angiogeneesiä CAM angiogeneesimääritys. Samoin Frondoside Täysin tukahdutetaan kapillaarirakenteella muodostumista Matrigelillä pohjamaa ihmisen endoteelisolujen.

Angiogeneesi on houkutteleva kohde syövän hoidossa ei vain koska se toimittaa happea ja ravinteita eloonjäämisen kasvainsolujen mutta tarjoaa myös reitin metastaattisen leviämisen näitä syöpäsoluja.