Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

mutaatio Wnt-signaalin antagonistien APC tai ak- siini aktivoituu β-kateniinin signalointi monissa syövissä, mukaan lukien suurin osa paksu- adenokarsinoomien. Fenotyyppi

APC

tai

ak- siini

mutaatio banaanikärpäsen

banaanikärpänen

on silmiinpistävän samanlainen kuin aiheuttama mutaatio segmentin polaarisuuden geeni,

alasti orvaskesi (NKD)

. NKD estää Wnt signalointia sitoutumalla Dishevelled (DSH /DVL) perhe telineen proteiineja, jotka viittaavat Wnt reseptorin aktivoitumisen ß-kateniinin kerääntyminen ja TCF-riippuvaisen transkription, mutta ihmisen

NKD

geenejä ei vielä ole suoraan osallisina syövässä.

Menetelmät /Principal havainnot

Tunnistamme ensimmäistä kertaa mutaatiot

NKD1

– toinen kahdesta ihmisen

NKD

homologeista – on osajoukko DNA mismatch korjaus-puutteellisia peräsuolen kasvaimia, jotka eivät ole tiedossa satamaan mutaatiot muissa Wnt-reitin geenit. Mutantti Nkd1 proteiinit ovat viallisia inhiboimaan Wnt signalointia; Lisäksi mutantti Nkd1 proteiinit vakauttaa β-kateniinin ja edistää solujen lisääntymistä, mikä johtuu osittain alentunut kyky kunkin mutantin Nkd1 proteiinia sitomaan ja horjuttaa DVL proteiineja.

Johtopäätökset /merkitys

meidän data nostaa hypoteesia, että erityistä

NKD1

mutaatiot edistävät Wnt-riippuvainen tuumorigeneesiä osajoukko DNA mismatch-korjauksen puutteesta peräsuolen adenokarsinoomia ja mahdollisesti muita Wnt-signaali ohjaa ihmisen syöpien.

Johdanto-osan: Guo J, Cagatay T, Zhou G, Chan CC, Blythe S, Suyama K, et al. (2009) Mutaatiot ihmisen

paljaalla orvaskeden

Homologi

NKD1

Löytyy peräsuolen syövän Alter Wnt /DVL /β-kateniinin Signaling. PLoS ONE 4 (11): e7982. doi: 10,1371 /journal.pone.0007982

Editor: Neil A. Hotchin, University of Birmingham, Iso-Britannia

vastaanotettu: 05 elokuu 2009; Hyväksytty: 19 lokakuu 2009; Julkaistu 24. marraskuuta 2009

Copyright: © 2009 Guo et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat amerikkalainen Cancer Society Institutional Research Grant (KW); National Institutes of Health (R01-GM65404 jotta K.W .; R01-CA60117 jotta S.N.T.); ja Mayo Clinic /Foundation (ja W. L.). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

aktivointi ”kanoninen” Wnt /β-kateniinin signalointi lähes kaikissa paksu- adenokarsinoomien (CRC) tekee Wnt koulutusjakson lupaava vielä käyttämättömiä terapeuttinen tavoite [1]. Vallitseva paradigman kanoninen Wnt signalointia pääteltiin osittain läpi tyylikäs kehityshäiriöitä tutkimukset banaanikärpäsen

banaanikärpänen

ja sammakkoeläinten

Xenopus laevis

: ei Wnt-signaali, joka on ”tuhoa monimutkainen” koostuu proteiinien APC, ak- siini, GSK3p ja CK1 fosforyloi β-kateniinin, joka johtaa p-kateniinin ubikitinaation ja proteasomaalisten hajoaminen [2]. Sitovat Wnt-ligandien Frizzled /LRP koreseptoreita aktivoi tukirakenne proteiini Dishevelled (DSH; Dvl1, Dvl2, Dvl3 nisäkkäiden), joka johtaa sitomisen ja hajoaminen ak- siini, joka mahdollistaa β-kateniinin kerääntyä, menevän tuman, ja sitoa TCF transkriptio tekijät säännellä kohdegeenien [2].

suurin osa (60-85%) ihmisen CRC näytteille aktivoitu kanoninen Wnt signalointia takia lyhennetty mutaatioista

APC

että vakauttaa β-kateniinin [3 ]. Vaihtoehtoisesti mutaatiot β-kateniinin

(CTNNB1) B että lohko fosforylaatio ja hajoamisen löytyy joitakin CRC että puuttuu

APC

mutaatio [4]. CRC näyttö ainakin kahdenlaisia ​​perimän epävakaisuuden: kromosomi epävakaus (CIN) liittyy mutantti APC ja p53 ja synnyttää aneuploidian, ja mikrosatelliitti-epävakaus (MSI) aiheuttama puutteellinen DNA mismatch korjaus (MMR) ja tuloksena mutaatioita yksinkertainen järjestyksessä toistoja (SSR) koko genomin [5], [6]. Mutaatio puolijohdereleiden koodauksessa tai liitoskohtaan alueiden keskeisten sääntelyn geenit voivat luoda piste mutantin tai typistettyjä proteiineja, jotka edistävät syövän etenemisen; todellakin, MMR puutos ja MSI ovat tyypillisiä kasvainten potilailla, joilla on perinnöllinen polypoottinen kolorektaalisyöpä oireyhtymä {HNPCC; alias Lynch oireyhtymä (OMIM 120435)} ja 13-17% satunnaista CRC [7].

APC

mutaatiot ovat yleisiä CIN-CRC [3], mutta Wnt-reitin geenimutaatio taajuuksia MSI-CRC on huonommin tunnettu, jossa mutaatiot ak- siini homologi

AXIN2

ja TCF -perhe transkriptiotekijä

TCF7L2

tunnistettu -25% ja ~35% MSI-CRC vastaavasti [8], [9].

APC

mutaatio on harvemmin MSI-CRC kuin CIN-CRC [10], [11], kun taas aktivoivat mutaatiot

CTNNB1

, vaikka yleisiä koko kirjon ihmisen syövän, ovat harvinainen MSI-CRC [11]. Nämä tiedot viittaavat siihen, että lisämekanismien aktivoida Wnt /β-kateniinin signalointi MSI-CRC.

Naked orvaskeden (NKD) proteiini perhe vaimentaa kanonisen Wnt signalointia sitomalla ja mahdollisesti epävakautta DSH /DVL proteiinit [12] – [ ,,,0],17].

Drosophila NKD

mutantteja kehittää tappava segmentointi vikoja hyvin samanlaisia ​​kuin vuonna

APC

tai

ak- siini

mutantit [12], [18], [19] (Fig. 1A ). Siksi arveltu, että muuttaminen

NKD

geenin vaikutus nisäkkäisiin voisi aktivoida Wnt signalointia ja aiheuttaa syöpää. Täällä tunnistaa uusia mutaatioita ihmisen

NKD1

geenin MSI-CRC jotka muuttavat Wnt signalointia ja vähentää NKD /DSH vuorovaikutusta. Tuloksemme viittaavat siihen, että tietty

NKD1

mutaatiot muuttavat Wnt /β-kateniinin signaloinnin vähemmistö MSI-CRC sekä mahdollisesti muissa β-kateniinin signaali kasvaimet, joissa mutaatiot tunnetussa Wnt sääntelyviranomaiset ovat harvinaisia .

(A) Villityypin,

ak- siini, APC

, ja

NKD Drosophila

kynsinauhat. Villityypin on vuorotellen denticle nauhat (nuoli) ja alastomia orvaskeden (nuolenkärki), jossa kukin mutantti, josta puuttuu denticle bändejä. (B)

NKD1

lokus 10 eksonia. Nkd1 kaavamaisen (oranssi) sisältää N-terminaalisen myristylaatio, EFX, 30AA (sininen), ja karboksiterminaalinen His-rikas motiiveja. Eksoni 10 sekvenssit noin poly (C) kirjoitusten (punainen) edellä natiivi (musta) ja mutantti (sininen) tähteet on esitetty. (C)

NKD1

elektroferogrammit osoittaa villityypin (WT) poly- (C)

7, solulinja TC7 C-poisto (6), solulinja RKO C-lisäys (C8), ja solulinja HCT15 kanssa G mutaatio (nuoli) 3 ’poly (C)

7. (D, E) α-Nkd1 blotit kokonaisten solu-uutteiden (D) ja Triton X-100 liukoisten ja liukenemattomien fraktioiden (E) solulinjojen kanssa osoitti

NKD1

mutaatio. Nuolet Nkd1 proteiineja. β-aktiini latautuu valvonta D. CCD841 on täyspitkät Nkd1, jossa vähäinen hajoamistuote at ~35 kDa havaittu myös transfektoitu

NKD1

(esim Fig. 1 E, 5C), kun taas SW480 jossa runsaammin, mutta villityypin Nkd1 on useita hajoamistuotteita.

Tulokset

NKD1

mutaatioita peräsuolen adenokarsinooma

tunnistettu kolme erilaista

NKD1

eksoni 10 koodausalueen mutaatioita 5/11 CRC solulinjoissa ja 2/40 satunnaista CRC kasvaimista MSI (taulukko 1), mutta ei

NKD1

koodausalueen tai liitoskohtaan mutaatioita 5/5 CRC solussa linjat ja 50/50 kasvaimia ilman MSI. Kaksi mutaatiota, joko deoksisytidiini (C) deleetio tai insertio, koska polymeraasi liukumista sisällä eksonin 10 poly (C)

7-suolikanavan, johtaa synteesi katkaistun proteiinien 345 tai 298 aminohappoa (aa) (kuvio . 1B, C). A (C)

7-vierekkäisen missensemutaatio (G A) muuntaa Arg-288, säilytetty Nkd2, Hänen (Fig. 1 B, C).

NKD1

mutaatiota ei havaittu 32/40 MSI-CRC kasvaimia, jotka satama mutaatiot muissa Wnt-reitin geenit kuten

APC

,

CTNNB1

,

AXIN2

ja

TCF7L2

, mutta löydettiin 2 jäljellä 8/40 kasvaimet ilman vaurioita näissä tunnetuissa Wnt-reitin geenit (p = 0,036, yksisuuntainen Fisherin testiä) (taulukko 1; ks Materiaalit ja menetelmät). Nämä tiedot osoittavat, molemminpuolisen poissulkemisen keskuudessa mutaatioita

NKD1

ja muut Wnt-reitin geenit meidän kohortissa MSI-CRC kasvain näytteissä, mikä viittaa siihen, että

NKD1

mutaatiot ovat patologinen merkitys.

sekä paksusuolen epiteelisolujen linja CCD841 ja CRC solulinjaa SW480, viimeksi mainittu C T mutaatio

APC

kodonin # 1338 [20], koodaavat villityypin Nkd1 (470 aa) 53,2 kDa kulkeutuvan ~ 50 kDa western blot (kuvio. 1D, E). Solulinjat Co115 ja TC7, kukin kanssa (C)

6 mutaatio, on ~39 kDa, joka vastaa 38,1 kDa Nkd1

C6, kun taas solulinja RKO, jossa (C)

8 mutaatio, on ~ 33 kDa: n vyöhyke, joka vastaa 33,4 kDa Nkd1

C8; kaikki kolme solulinjat typistetyn Nkd1 myös vähemmän runsas täyspitkä Nkd1, mikä viittaa siihen, että villityypin

NKD1

lokuksen ei tapahdu menettämisestä heterotsygoottisuuden (Fig. 1 D). Western blot kanssa Nkd1 vasta emme pysty erottamaan villityypin peräisin mutantti Nkd1 in solulinjassa HCT15, joka satamat

NKD1

R288H

(Fig. 1 D).

NKD proteiinit ovat kalvoon liittyvä, nisäkkään Nkds nojalla N-terminaalista my- [14], [21], [22]. Katkaistu Nkd1 proteiineilla on alentunut affiniteetti kalvoihin verrattuna täyspitkän Nkd1 kuten päätellä Triton X-100 liukoisuus: 95% NKD

C6- tai NKD

C8 mutantti-solulinjoja on TX-100 liukoinen, kun taas 0-26% täyspitkän Nkd1 kaikista solulinjoista on TX-100 liukeneva (Fig. 1 E).

Mutant Nkd1 proteiinit ovat viallisia inhiboimaan Wnt /DVL signalointi

hiiri Nkd1 voi estävät akselin päällekkäisyys aiheuttama kohdunulkoinen Wnt signalointia

Xenopuksen

alkioita [16]. Kuten on esitetty kuviossa. 2A, 90%

Xenopuksen

alkioiden pistetään

XWnt8

mRNA kehitetty osittaisen-to-täydellinen akselin päällekkäisyyttä; sopusoinnussa Nkd1 aktiivisuus kuin Wnt antagonisti, villin tyypin ihmisen

NKD1

mRNA co-injektio vähensi akseli päällekkäisyyttä taajuus 42%, jossa on vain 3% valmis päällekkäisyyksiä. Sen sijaan, co-injektio kunkin mutantin ihmisen

NKD1

johti akselin päällekkäisyyttä taajuuksia samanlainen kuin havaittiin

XWnt8

injektiolla (Fig. 2A). Kuten solulinjoilla, misexpressed Nkd1

C6 ja Nkd1

C8 oli runsaammin kuin villityypin Nkd1 tai Nkd1

R288H Western blot (ei esitetty). Kanssa

Xenopus

tulokset, villityypin Nkd1, mutta yksikään kolmesta mutanttien, tukahdutti DVL-indusoidun aktivoitumisen TCF-reportteri TOPflash HEK-293-solut (Fig. 2B). Expression of mutantti Nkd1 yksin hieman lisääntynyt tyvi TOPflash aktiivisuuden ja ei vaikuttanut endogeenisen

Xenopus

akselin muodostuminen (ei esitetty), mikä osoittaa, että vaikutus Nkd1, kuten että

NKD

kärpäsen riippuu Wnt signalointia [23].

(A)%

Xenopuksen

alkioiden osoitetun akselin fenotyyppi injektion jälkeen

XWnt8

+/- villityypin tai mutantti

NKD1

. (N) = # alkioita pistetään. Paneelit suorassa näyttää edustavan sivusuunnassa (L) ja selkä (D) näkemyksiä alkioiden pisteytetään yhdellä akselilla (valkoinen), lyhyt A /P-akselin (vaaleanharmaa), osittainen akselin päällekkäisyyksiä (tummanharmaa), ja täysi akseli päällekkäisyyttä (musta) mukaan Materiaalit ja menetelmät. Alkioiden yhden akselin vasemmassa paneelien huomata runko (valkoinen nuoli) ja sementin rauhanen (musta nuoli). Arrowheads nimettävä kukin akseli alkioiden kanssa akselin päällekkäisyys (oikea paneeli). Alkiot osittaisella akselin päällekkäisyyttä ovat päällekkäisiä runko kudos mutta yhden sementtiä rauhanen, kun taas alkioiden täysi akseli päällekkäisyyttä on kahdennettu runko kudosten ja sementtiä rauhaset. (B) Normalized TOPflash lusiferaasiaktiivisuutta (RLU) HEK-293-solut transfektoitu toimittaja +/- Dvl2 +/- merkitty Nkd1 rakentaa.

NKD1

mutaatiot vakauttaa β-kateniinin ja edistää soluproliferaatiota

yhdenmukainen

NKD1

mutaatioita aktivoimalla Wnt signalointia CRC, soluliman ja ydinvoiman tasot β-kateniinin ovat suuremmat Co115 soluissa kuin CCD841 soluissa (Fig. 3A). Näin ollen ydin- β-kateniinin oli näkyvästi Co115 soluissa, mutta ei CCD841 soluissa (Fig. 3B, C). HEK-293T-solut transfektoitiin Nkd1

C6, Nkd1

C8, tai Nkd1

R288H oli korkeampi sytosolin β-kateniinin kuin solut, jotka on transfektoitu villin tyypin Nkd1 tai kontrolli (Fig. 3d), mikä osoittaa, että kukin mutantti Nkd1 proteiinia voidaan stabiloida β-kateniinin.

(A) Western blot sytosolin ja tumauutteiden solujen villityypin (CCD841) tai mutantti (Co115)

NKD1

. GAPDH ja HDAC2 koetettiin tavaraluetteloina valvontaa. (B-B ’, C-C ”) β-kateniinin (punainen) ja DNA (sininen) jakauma CCD841 soluja (B-B’) ja Co115 (C-C”) soluja. Nuolet ytimiä. Sulautunut kuvat B ”ja C”. (D) Western blot sytosolin uutteiden HEK-293-solut transfektoitiin

lacZ

ohjaus (-), villityypin Nkd1 (WT), tai merkitä mutantti Nkd1 rakentaa, ja tutkittiin ja β-kateniinin, Nkd1, ja lastaus valvonta GAPDH. Huomaa, että jokainen mutantti Nkd1, mutta ei villityypin Nkd1 lisää β-kateniinin tasoilla. (E) Suhteellinen solujen lukumäärän funktiona vuorokautta infektoimalla retroviruksia CCD841 solujen tyhjän vektorin kontrolli, villityypin Nkd1, tai merkitä Nkd1 mutantti (p = 0,016, 0,012 ja 0,0091 C6, C8, ja R288H mutantteja verrattuna kontrolli) (F) Suhteellinen solujen lukumäärän funktiona vuorokautta retrovirusinfektiolla ja Co115 solujen valvontaa tai villityypin Nkd1 (p = 0,022). α-Nkd1 western blotit solujen uutteiden GAPDH tai β-aktiini latauskontrollina, esitetään alla jokaisen tontin E ja F.

Koska kanoninen Wnt signalointia edistää solujen lisääntymistä [2], me analysoitiin kertyminen solujen tasaisesti ilmentävät vertailukelpoisia joko villityypin tai mutantti-Nkd1. Retroviruksen ekspressio kunkin mutantin Nkd1 proteiinin CCD841 soluissa lisääntynyt solujen määrä verrattuna villityypin Nkd1 tai tyhjän vektorin kontrolli (Fig. 3E). Toisaalta, ekspressio villityypin Nkd1 in Co115 soluissa vähentää solujen määrä (Fig. 3F). Nämä tiedot osoittavat, että

NKD1

mutaatiot voivat edistää β-kateniinin stabilointi ja paksusuolen solujen lisääntymistä.

Altered solunosasijaintia ja DVL rinnakkaispaikantumisen typistetyn Nkd1

Emme voineet havaita endogeeninen Nkd1 solulinjoissa immunosolukemiallisella, joten tutkia tarkemmin suhdetta Nkd1 lokalisointi ja toiminnan tarkastelimme lokalisoinnin merkittyjen proteiinien HEK-293-soluissa. Nkd1 paikantuu pilkukkaan, pääasiassa sytoplasminen jakautuminen samanlainen

Drosophila

NKD

GFP kun ilmaistaan ​​lentää sylkirauhasten (Fig. 4A, F). Sen sijaan, Nkd1

C6 ja Nkd1

C8 jakaa diffuusisti sytoplasmassa (Fig. 4B ja ei näytetty), mikä on yhdenmukaista niiden paremman pesuainetta liukoisuus suhteessa Nkd1 (Fig. 1 E), kun taas Nkd1

R288H aggregaatteja, kuten villityypin Nkd1 (ei esitetty).

(A, B) HEK-293-solut, jotka ilmentävät HA /Flag-merkityn Nkd1 (A) tai Nkd1

C8 (B) värjättiin α-HA (vihreä ). Nkd1 kerääntyy puncta (nuolet), kun taas Nkd1

C8 diffuusisti jaetaan sytoplasmassa. Nkd1

C6 jaetaan kuvio samanlainen Nkd1

C8 (ei esitetty). (C, D) Solut, jotka koekspressoivat Dvl3 ja villityypin (C) tai C8 (D) Nkd1

GFP konstrukteja. Nkd1-GFP (vihreä, C) esittää lähellä täydellistä rinnakkaispaikantumisen (nuolet) kanssa Dvl3 (punainen, C ’), kun taas Nkd1

C8-GFP (D) kerääntyy sytoplasman aggregaattien ympäröi Dvl3 (nuolet). Sulautunut kuvat ovat C ”, D”, DNA on sininen A-D. Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin soluissa, ilmensi Nkd1

C8-GFP: n ja Dvl1 tai Dvl2, ja solut, jotka ekspressoivat Nkd1

C6-GFP ja Dvl1, Dvl2 tai Dvl3 (ei esitetty). (E) Sylkirauhasen villityypin kolmannen kehitysvaiheen

Drosophila

toukka värjättiin α-DSH (punainen) osoittaa diffuusia ja punktuaalista värjäystä. (F-F ”)

A8-Gal4 /AMK-NKD

GFP

sylkirauhasten värjättiin α-DSH ja kuvattavan GFP (F) ja DSH (F ’; yhdistettiin vuonna F”). Fly NKD

GFP relocalizes DSH kohteeseen perinuclear aggregaatteja (nuolet) kuin havaitut Nkd1

GFP /Dvl3 C.

DVL proteiineja paikallistaa dynaamisia, soluliman ja solukalvon liittyvä aggregaatteja, joita on ehdotettu täydentää Wnt /β-kateniinin signalointi [24]. Yhdenmukainen

in vitro

NKD /DSH yhdistys, ilmaus Nkd1

GFP HEK-293-solut tai lentää NKD

GFP sylkirauhasten johti solunsisäisen aggregaatteja colocalized NKD ja DSH /DVL ( Fig. 4C-C ”, F-F”, ja jota ei ole esitetty). Sen sijaan kukin DVL yhteistyössä syntetisoitiin kukin katkaistu Nkd1

GFP (C6 tai C8) muodostaa aggregaatteja, mutta rinnakkaispaikantumisen oli sen sijaan havaittiin yhteensä rajapintoja, jossa DVL aggregaatit tyypillisesti ympäröivän katkaistu Nkd1 aggregaatteja (Fig. 4D-D ”eikä esitetty). Vaikka merkitys näiden lokalisoinneissa nähden suhteessa Wnt signalointi on epäselvä, katkaistu Nkd1 proteiinit tunnistettu CRC osoitti alentunut kyky colocalize kanssa DVL proteiineihin verrattuna täyspitkän Nkd1.

Mutant Nkd1 proteiinit ovat virheellisinä sitovat DVL proteiinien

Seuraavaksi tutkimme biokemiallinen mekanismi virheellisten Wnt-signaalin esto mutantti Nkd1 proteiineja. NKD EFX motiivi sitoutuu perus /PDZ alueella DSH /DVL proteiinit [14]. Yllättäen, kukin Nkd1 mutantti, huolimatta ehjä EFX motiivi, sidottu kunkin DVL-proteiinin vähemmän kuin villityypin Nkd1 hiivan kaksi-hybridi (Y2H) määritys (Fig. 5A). Nkd1 typistäminen (C)

7-suolikanavan (Nkd1

1-286) vähensi myös DVL sitovia (Kuva. 5A), mikä osoittaa, että alennettu DVL sitoutuminen ei johtunut kehyksenvaihdon aiheuttama ainutlaatuinen C-päät on kaksi katkaistun mutantteja. Kukin katkaistu Nkd1 proteiini säilyttää lähellä sen C-päähän 30AA amfipaattisen α-kierteisen motiivi, joka on erittäin konservoitunut (28/30 aa) Nkd2 [14]. Vuonna lentää NKD, joka on samalla tavoin sijoitettu 30AA motiivi on kriittinen toiminto ja ydinvoiman lokalisointi [25], mutta rooli 30AA motiivin selkärankaisten NKD proteiineihin ei tunneta. Poistaminen 30AA motiivin Nkd1

1-286 palautettu DVL sitovia, kun taas edelleen poistaminen EFX motiivin eliminoitu DVL sitova (Kuva. 5A). Nämä tiedot viittaavat siihen, että yksi toiminto selkärankaisen NKD 30AA motiivi on vastustaa Nkd1-EFX /DVL vuorovaikutus, joka itse on ilmeisesti vastustaa edelleen C-terminaalinen sekvenssi, joka on poistettu meidän MSI-CRC kasvaimia.

( A) Y2H välillä Nkd1-syötit ja DVL-saalis analysoitiin kasvua kolminkertainen keskeyttämisen (3D + 3AT) tai kahden haarukan (2D) media. Pylväsdiagrammit oikealla osoittavat ONPG yksiköitä määrällisistä Y2H määritys. Western blot osoittaa, että Nkd1 mutanttiproteiinit ovat vertailukelpoisia runsaasti (ei esitetty). (B) GST-pulldown määritys

in vitro

käännettynä

35 [S] -merkittyjä Dvl1-3 kunkin GST-Nkd1 proteiinia. Pylväsdiagrammi on kvantitatiivinen bändi intensiteetti. Coomassie-värjätty geeli osoittaa kunkin GST-fuusioproteiinin, jossa nuolenpää osoittaa täyspitkän proteiineja. (C) Western blotit Flag-IP HEK-293-solu-uutteiden kanssa yhtä suuret määrät kutakin HA /Flag-merkityn Nkd1, ja sitten koetettiin α-HA (ylempi) ja α-Dvl3 (keskellä). β-aktiini latautuu ohjaus (alempi). Huomaa, että vähemmän Dvl3 on IP’d mukaan Nkd1

C6 tai Nkd1

C8 verrattuna täyspitkän Nkd1. Ei co-IP ei havaittu villityypin tai mutantti Nkd1s ja Dvl1 tai Dvl2, muistuttaa vakaita yhteistyön IP välillä

Drosophila

NKD ja DSH [13].

Me vahvisti Y2H tulokset GST-pulldown ja coimmunoprecipitation kokeiluja. Kuten on esitetty kuviossa. 5B, kukin DVL proteiini osoitti vähentyneestä sitoutumisesta GST-Nkd1

C6 ja GST-Nkd1

C8 verrattuna villityypin GST-Nkd1, kun GST-Nkd1

R288H oli vähentynyt yhdistysten kanssa Dvl1 ja Dvl2, mutta vain vähäisemmässä määrin Dvl3, samanlainen kuin nähdä Y2H. Kun ilmaistaan ​​HEK-293-solut, Nkd1

C6 ja Nkd1

C8 kertynyt korkeammalle tasolle kuin Nkd1 ja Nkd1

R288H (ei esitetty); normalisoimalla tulo lysaatit jotta yhtä suuria määriä villityypin Nkd1 ja kukin mutantti Nkd1 proteiini immunosaostettiin, havaitsimme kaksijakoinen väheneminen määrän Dvl3 yhteistyössä immunosaostettiin Nkd1

C6 tai Nkd1

C8 verrattuna ja Nkd1 tai Nkd1

R288H (Fig. 5C). Siten

NKD1

mutaatiot vähentävät Nkd1 /DVL yhdistysten

in vitro

ja

in vivo

.

Mutant Nkd1s ovat viallisia pyritään muuttamaan DVL tasolla

Dvls voidaan ubikitinoitu ja hajottaa proteasomin, ja sitoutuminen NKD tai muiden DVL sitovien proteiinien johtaa DVL liikevaihtoon [17], [26] – [28].

NKD1

mutaatiot saattavat vaarantaa siten kykyä Nkd1 horjuttaa Dvls. Ilmaisemalla

Drosophila

NKD

GFP eri tasoilla viereisissä soluissa kolmannen muodonvaihdosvaiheen

Drosophila

sylkirauhasten, me jatkuvasti havaittu käänteinen suhde tasojen NKD

GFP ja dsh (Fig. 6A-A ”). Koska

dsh

transkriptio ei tiedetä säänneltävä

Drosophila

, NKD

GFP on todennäköisesti epävakautta DSH, koska havaittiin, kun Nkd1 yliekspressoitui viljellyissä nisäkässoluissa [17]. Seuraavaksi kotransfektoidaan villin tyypin tai kukin mutantti Nkd1 kanssa Dvl1, Dvl2 tai Dvl3 HEK-293-soluihin ja tutkittiin tasot kunkin DVL proteiinin Western blot. Kuten on esitetty kuviossa. 6B, Dvl1 ja Dvl2, ja vähäisemmässä määrin Dvl3, olivat vähemmän runsas kun koekspressoidaan villiin Nkd1 kuin silloin, kun ilmaistaan ​​yksin. Kumpikaan tyhjä vektori tai koekspressoitiin GFP vaikuttaa tasot kunkin DVL (ei esitetty). Sen sijaan, määrä Dvl1 havaittavissa koekspressoimalla kunkin mutantin Nkd1 oli samanlainen kuin Dvl1 vain transfektoitiin kontrolli (Fig. 6B). Dvl2 tasot osittain vähennetään kunkin mutantin Nkd1, kun taas Dvl3 tasot alenivat vähemmän ilmentämällä joko katkaistun Nkd1 kuin villityypin Nkd1. Samanlainen käänteinen suhde NKD

GFP ja DSH tasot

Drosophila

sylkirauhasten (Fig. 6A-A ”), fine pistemäinen Dvl1 immunoreaktiivisuus soluissa, joilla on korkea Nkd1

GFP ilmestyi alennettu verrattuna vierekkäisten solujen alhaisempi Nkd1

GFP (Fig. 6C, C ’). Yhdessä meidän tiedot tukevat hypoteesia, että tietty muutos on Nkd1 kyvystä edistää DVL vaihtuvuus saattaa aktivoida Wnt /β-kateniinin signaloinnin aikana CRC syövän etenemiseen.

(A-A ”)

71B-Gal4 /UAS-NKD

GFP

kolmannen kehitysvaiheen

Drosophila

sylkirauhasten värjättiin α-DSH ja kuvattavan GFP (A) ja DSH (A ’) jakaumat (yhdistetyn kuvan A ”). Kvantitointi DSH pikselin intensiteetti (valkoinen laatikko A) paljastaa vähensi värjäytymistä solussa ilmentävät enemmän (oikea, vihreä tähti) NKD

GFP kuin viereisissä ilmentävän solun vähemmän NKD

GFP. (B) Western-blotit HEK-293-solut transfektoitiin ilmoitetuilla Flag /HA-merkitty Nkd1 ja Dvl1, Dvl2 tai Dvl3 konstruktioita tutkittiin α-HA, α-Dvl1-3, ja α-βtubulin latauskontrollina. Kukin Dvl1-3 blotteja kuormitettiin saman verran uutetta, mikä vahvistettiin tutkimalla kunkin blotilla α-βtubulin. (C) HEK-293-soluista, jotka ilmensivät samanaikaisesti Nkd1

GFP ja Dvl1, värjättiin α-Dvl1, ja kuvaamisen GFP (vihreä), Dvl1 (punainen), ja DNA: n (sininen), jotka osoittavat hienoa pistemäinen Dvl1 jakelu soluissa, jotka ilmentävät Pienemmästä poissa Nkd1

GFP (valkoinen nuoli). Viereisissä soluissa, jotka ilmentävät Nkd1

GFP, Dvl1 on relocalized on Nkd1

GFP /Dvl1 aggregaatteja (keltainen nuoli), menetys hieno pistekeratopatiaa Dvl1 värjäytymistä (nuolenpäät). (D, E) mallit NKD toiminnon

Drosophila

(D) ja

NKD1

-mutant CRC (E). Double linjat: ylempi = solukalvon; alempi = tumakalvoa. (D) Fly Wg (Wnt) sitoutuu Fz /Arrow (LRP5: stä /6) reseptoreihin, joka estää APC /ak- siini /CK1 /GSK3p kompleksi, joka edistää hajoamista Arm (β-kateniinin). Arm komplekseja Pan (TCF) aktivoi kohdegeenien lukien

NKD

. NKD edistää DSH liikevaihdon osittain estää signalointi, ja se työllistää ydinvoima tuonti tekijä Imp-α3 menevän tuman ja edelleen estävät signalointia tuntematon mekanismien [31]. (E) In

NKD1

-mutant CRC, mutantti Nkd1 proteiini ei enää sitoo ja edistää DVL vaihtuvuus, vakauttaa β-kateniinin ja aktivoimalla TCF-riippuvaista kohdegeenien transkription.

keskustelu

mutaatio tuumorisuppressorigeenin

APC

nostaa Wnt /β-kateniinin signaloinnin enemmistön 1000000 uusia tapauksia CRC diagnosoitu vuosittain maailmassa [3], [29 ]. Oletimme, että mutaatiot muissa Wnt antagonisteilla nostaa signaloinnin osajoukko CRC, erityisesti MSI-CRC ilman mutaatioita tunnetuissa Wnt sääntelyviranomaisten. Raportoimme kolme syöpään liittyvän ihmisen

NKD1

mutaatioita, jotka muuttavat Wnt /β-kateniinin signalointi ja häiritä Nkd1 /DVL sitova. Perustuen taajuus

NKD1

mutaatio (5%) tunnistettu meidän kohortissa MSI-CRC, arvioimme, että

NKD1

mutaatioita esiintyy jopa ~ 1% vasta diagnosoiduista CRC, tai ~10,000 tapausta vuodessa.

Koska MSI kasvaimet ovat alttiita mutaatio koko genomin, herää kysymys, onko

NKD1

mutaatioita ajaa kasvaimen etenemisen tai ovat vain ”sivullinen” mutaatioita. Kansallinen Cancer Institute työpajan [30] ehdotti viisi kriteeriä erottaa bona fide kohde- geenejä sivustakatsoja mutaatiot, mukaan lukien a) korkea mutaatio taajuus, b) bialleelisen inaktivoituminen, c) rooli kasvun vaimennin koulutusjakson, d) inaktivoituminen saman kasvun hidastuminen väylän tuumoreihin MSI mutaation kautta samassa geenissä tai toisessa geenissä saman reitin, ja e) toiminnallinen vaimentimen tutkimukset, vaikka ovatko nämä kriteerit arvioitaessa harvinaisia ​​tai uusia kuljettajan mutaatioita on kyseenalaistettu {esim [6]}. Työmme osoittaa, että

NKD1

mutaatioita täytettävä neljä viidestä kriteerien – a, c, d, ja e. Kun taajuus

NKD1

mutaatio oli suhteellisen alhainen verrattuna tunnetun Wnt-reitin geenit, keskinäinen yksinoikeus keskuudessa mutaatioita

NKD1

ja muita Wnt-reitin geenit oli tilastollisesti merkittävä tuumorin näytteissä. Puuttuminen

NKD1

mutaatioiden meidän näytteessä kasvainten ilman MSI voisi johtua harvinaisista erityisten Nkd1 katkaisu kasvaimissa ehjä MMR, tai johtuen meidän pieni otoskoko. Kuitenkin muita geenejä Wnt signalointireitillä kuten

APC

usein mutatoitunut, poistettu tai metyloitavaa kasvaimissa ehjillä MMR. Bialleelisen inaktivointi

NKD1

ei havaittu, mutta kun läsnä villityypin Nkd1 kasvainsolulinjoissa, samoin kuin kyky mutantin Nkd1 vakauttaa β-kateniinin, viittaa siihen, että

NKD1

mutaatioita saattaa toimia vallitsevana (katso alla). Lopuksi NKD proteiinien perhe estää kanoninen Wnt signalointia, ja tämä aktiivisuus on puutteellinen kaikissa kolmessa mutantti Nkd1 proteiineja, mikä viittaa siihen, että Nkd1 mutaatiot muuttavat Wnt /β-kateniinin signalointi

in vivo

.

Me osoittavat lisäksi, että NKD voivat rajoittaa DSH /DVL runsaus sekä nisäkkäiden soluviljelmissä ja lentää järjestelmien kanssa lentää NKD lisäksi ottaa tunneta, mutta olennaista ydin- toimintoja [25], [31] (Fig. 6D). Ehdotamme, että mutantti-ihmisen Nkd1 proteiineja, joilla kullakin on alentunut kyky sitoa ja rajoittaa runsaasti Dvls, lisätä Wnt-riippuvaista DVL aktiivisuutta, mikä vaimentaa β-kateniinin hajoamiseen ja lisätä TCF-riippuvaisen transkription kohdegeenien jotka edistävät proliferaatiota (kuvio . 6E). Kuitenkin estää suora Nkd1 /DVL yhdistys ei ilmeisesti riitä edistämään neoplasia, kuten poistetaan DVL-sitova

Nkd1

EFX motiivi ei sulatettu mutanttihiirien altis syöpä eikä voimisti taajuus

APC

mutaatio perustuva suoliston adenoomia [32]. Samoin hiiret kuljettaa N-terminaalista Typistävä

Nkd1

ja /tai

Nkd2

mutaatiot eivät kehittyneet spontaaneja kasvaimia [33]. Koska NKD on olennainen takaisinkytkentäpiireihin kärpäsiä ja selkärankaisten [12], [34], me aikaisemmin arveltu, että nisäkkäillä puute NKD aktiivisuutta voidaan kompensoida tarpeeton palautejärjestelmät, kun taas kärpäset tällaista korvausta on mahdollista puuttumisen vuoksi geenit koodaavat solunulkoisia Wnt signalointia antagonistit [33].

ei-satunnainen pariksi erilaisten

APC

mutaatioita kasvaimissa {esim, proteiini katkaisu lähellä mutaatio klusterin alue (MCR) kanssa alleelinen poisto tai metylaatio} yhdistettynä toiminnan tutkimuksessa mutantti APC proteiinien [35], [36], on ehdottanut, että solu on säilytettävä jonkinlainen kyky säädellä Wnt /β-kateniinin signaloinnin aikana syövän etenemiseen – niin sanottu ”juuri oikea” hypoteesi [ ,,,0],37]. Huomioiminen tunnetun roolit Wnt /β-kateniinin signalointia kolorektaalisyöpää etenemisen tarjoaa joitakin perustelut tätä hypoteesia: alkuvaiheessa, lisääntynyt signalointi edistää kantasolu- uudistumista ja muuttaa migraatio crypt epiteelisolujen [38], kun taas myöhemmin se toimii kytkimenä säännellä epiteelin ja mesenkymaaliset siirtymiä aikana ja metastaasit [39]. Täten kasvaimen etenemistä saattavat vaatia ohimenevä ylös- tai alaspäin säätely kohdegeenin ilmentymisen riippuen mutaatiostatuksesta kuormituksen ja paikalliset ympäristöolosuhteet. Kun otetaan huomioon, että villityyppinen Nkd1 proteiinin jatkuu

NKD1

-mutant testatuissa solulinjoissa, oletamme, että mutantti Nkd1 proteiineja – joista kukin säilyttää useita funktionaalisia motiiveja (N-terminaalinen myristylaatio, EFX, ja 30 aa kuviot ) – aktivoi Wnt signalointia

in vivo

, ehkä analogisia, millä tavoin APC proteiinit typistetty lähellä MCR aktivoida Wnt signalointia [36].

huolimatta merkittävää näyttöä siitä, että epänormaali Wnt /β- kateniinin signalointi aiheuttaa syöpää, rooli DSH /DVL proteiinien neoplasia epäselviä. Wnt signalointi voi edistää DSH /DVL kertymistä [40], ja DVL yli-ilmentyminen voi jäljitellä aktivoitumisen Wnt /β-kateniinin signalointi akselilla [41], mikä viittaa siihen, että DVL yliaktiivisuus, kuten β-kateniinin stabilointi mutaatiosta johtuen, voi olla ensisijainen syy kohonneen Wnt signalointia syöpä. Todellakin, DVL vahvistusta ja yli-ilmentyminen on havaittu neoplasia {esim. keuhkosyöpä [42]}, mutta DVL kertyminen syöpä saattaa myös olla toissijaisena seurauksena pelkkää Wnt ligandin perustuva autoaktivaatiota signaloinnin [43]. Koska ratkaiseva roolit DSH /Dvls in ”ei-kanoninen” Wnt väyliä, jotka määräävät tasomaiset-solu-polariteetin ja soluvaelluksen selkärankaisten [44],

NKD1

mutaatioita saattaa myös muuttaa DVL aktiivisuutta ei-kanoninen Wnt polkuja, jotka ohjaavat solun polariteetti tai muuttoliikkeen aikana syövän etenemisen. Tulevaisuuden kokeita keskittyy ymmärtämään miten mutantti Nkd1 proteiinit muuttaa Wnt signalointia syövän etenemisen

in vivo

.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

Tämä tutkimus tehtiin periaatteiden mukaisesti ilmaistu Helsingin julistus. Tutkimuksen hyväksyi Institutional Review Board of Mayo Clinic sairaaloissa. Kaikki potilaat edellyttäen kirjallinen lupa varten otetaan näytteitä ja myöhempää analysointia. Sammakko kasvatuksessa, koeputkihedelmöitys, ja alkio kulttuuri ja lavastus suoritettiin standardimenetelmien mukaisesti ja kaikki eläimet käsiteltiin tiukasti mukaisesti eläinten hyvä käytäntö määrittelemän American Association for Laboratory Animal Science, ja

Xenopus