Krooninen sairaus

tiivistelmä

Cancer liittyy fibroblastien (valuuttalisiin) ovat vastuussa kasvaimen kasvua, angiogeneesiä, hyökkäystä, ja etäpesäkkeitä. Matrix (MMP) -9 erittää syöpään stroomasta asuttaman valuuttalisiin on edellytys syövän angiogeneesi ja metastaasi. Omega-3-monityydyttymättömiä rasvahappoja (omega-3-PUFA), on raportoitu olevan anti-kasvain vaikutuksia monentyyppisiä maligniteetteja. Fat-1 hiirillä, joka voi muuntaa omega-6 omega-3 PUFA riippumaton ruokavalio, ovat hyödyllisiä tutkimaan toiminnot endogeenisen omega-3 PUFA. Vaikutuksen tutkimiseksi omega-3-PUFA on tuumorigeneesiin, TC-1-soluja, hiiren epiteelisolulinja kuolemattomiksi ihmisen papilloomaviruksen (HPV) onkogeenien, injektoitiin ihonalaisesti rasva-1, tai villityypin hiirissä. Kasvaimen kasvua ja angiogeneesiä TC-1 kasvaimen merkittävästi tukahdutettiin rasva-1 verrattuna villin tyypin hiiriin. cDNA microarray kasvainten Rasvasta-1 ja villityypin hiirillä että MMP-9 on vaimentua rasvaa-1 hiirissä. Immunohistokemiallinen tutkimus osoitti immunoreaktiivisuus MMP-9 kasvaimen strooman fibroblasteissa oli hajanaisesti positiivinen villityypin taas polttovälin rasvaa-1 hiirissä. MMP-9 ilmentyi ensisijainen viljellyissä fibroblasteissa eristettyjen rasva-1 ja villityypin hiirillä, mutta ei ollut ilmaistu TC-1-soluissa. Co-kulttuuri fibroblastien TC-1-soluja parannettu ilmaisu ja proteinaasi MMP-9, vaikka proteaasi MMP-9 rasva-1-johdettu fibroblastit oli pienempi kuin villityypin fibroblasteissa. Tuloksemme viittaavat siihen, että omega-3 PUFA tukahduttaa MMP-9 induktio ja kasvaimen angiogeneesiä. Nämä havainnot voivat tarjota käsityksen mekanismeja, joiden omega-3 PUFA käyttää antituumorivaikutuksia moduloimalla kasvain mikroympäristön.

Citation: Taguchi A, Kawana K, Tomio K, Yamashita A, Isobe Y, Nagasaka K, et al. (2014) Matrix (MMP) -9 in Cancer-Associated fibroblastit (valuuttalisiin) on tukahdutti Omega-3 monityydyttymättömiä rasvahappoja

In vitro

ja

In Vivo

. PLoS ONE 9 (2): e89605. doi: 10,1371 /journal.pone.0089605

Editor: Zhongjun Zhou, The University of Hong Kong, Hongkong

vastaanotettu: 10 lokakuu 2013; Hyväksytty: 22 tammikuu 2014; Julkaistu: 27 helmikuu 2014

Copyright: © 2014 Taguchi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus rahoittivat Tokyo IGAKUKAI (KK), Japan Science and Technology Agency alustavia tutkimus alkion Science and Technology (PRESTO) (MA), opetus-, kulttuuri-, urheilu-, tiede-, and Technology of Japan (MA). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kasvaimen mikroympäris- koostuu mikrovaskulaaristen endoteelisolujen vieressä normaali epiteelisolujen ja syöpään liittyvän fibroblasteissa (valuuttalisiin), ja on raportoitu olevan tärkeä säätelijä kasvaimien syntyyn [1], [2]. Yleisin solupopulaation löytyy kasvaimen mikroympäristössä, valuuttalisiin ovat vastuussa proteiinien synteesiin osallistuvien remodeling soluväliaineen (ECM), ja eritystä kasvutekijöiden ja sytokiinien, jotka säätelevät kasvainsolujen proliferaatiota ja invaasiota [3 ], [4]. Hiiren munasarjasyövän ksenograftimalleissa, p53 /NF-KB-reitin valuuttalisiin merkittävästi lisääntynyt in vivo kasvaimen kasvu [5]. Paksusuolen syöpä, Zhu Y et al. raportti, että IL-1β lisääntynyt paksusuolen syövän solujen lisääntymistä ja invaasiota jopa säätelevä COX-2 signalointi valuuttalisiin [6].

Matrix-metalloproteinaasit (MMP: t), syntetisoidaan proentsyymien ja aktivoidaan tyypillisesti proteolyyttisellä poistamalla propeptidi [7]. MMP raportoidaan vaikuttaa kasvaimen etenemistä helpottamalla tapahtumien ratkaisevaa uudissuonittumisen ja perustamiseen etäpesäkkeiden lukien lisääntymistä, eloonjääntiä ja migraatio endoteelin, kasvain ja stroomasolujen [8], [9]. MMP-2 ja MMP-9 ovat osallisina edellytyksinä angiogeneesiä ja etäpesäke carcinogenesic prosessissa. MMP-2 ilmentyy eri syöpäsolulinjoissa [10]. Sen sijaan, MMP-9 on hyvin vähän tai ei ilmentymistä näissä syöpäsoluissa. Sen sijaan, MMP-9 on hyvin tiedetään erittyvän syövän strooman fibroblastien ja endoteelisolujen [11], [12]. MMP-9 on perheen jäsen sinkkiä sisältävien endoproteinases, joka osallistuu hajoamisen soluväliaineen (ECM) ja verisuonten remodeling [13].

dokosaheksaeenihappoa (DHA, 22:6n-3) ja eikosapentaeenihappo (EPA, 20:5n-3) ovat edustavia välittäjiä omega-3 monityydyttymättömiä rasvahappoja (omega-3 PUFA) ja aiheuttavat tulehdusta estäviä akuuteissa ja kroonisissa patologinen tulehdusreaktioita vastustamalla tulehdus [14]. Omega-3 PUFA myös raportoitu olevan syöpälääkkeen vaikutuksia perustuu in vitro ja in vivo tutkimukset [15] – [17]. Useita mekanismeja on ehdotettu selittämään syövän vaikutukset omega-3-PUFA:. Omega-3-PUFA: t muuttavat syöpäsolujen kasvua moduloimalla solujen replikaation, häiritsemällä komponenttien solusyklin tai lisäämällä solukuoleman kautta kuolion tai apoptoosin [18], [19]. Omega-3-PUFA: t tiedetään myös käyttää anti-angiogeeninen vaikutukset estämällä tuotantoa monien angiogeenisten välittäjäaineiden, kuten: verisuonen endoteelin kasvutekijä (VEGF), verihiutaleista johdettu kasvutekijä (PDGF), ja prostaglandiini E2 (PGE2) [20] – [24].

lisäravinteena on perinteinen lähestymistapa muuttaa kudoksen ravinteiden koostumus eläinkokeissa ravitsemus. Ruokinta eläimiä ruokavaliot, jotka muuttavat erityisiä ravitsemuksellisia ja ei-ravitsemukselliset komponentit voivat auttaa erottamaan koeryhmään; kuitenkin, se voi olla erittäin vaikea säätää ruokavalioita, jotka ovat samat kaikissa vaan yksi tai pieni mutta kontrolloitua komponenttien lukumäärä. Kang et ai. Äskettäin suunniteltu siirtogeeninen hiiri, joka kantaa rasva-1-geenin roundworm

Caenorhabditis elegans

[25]. Tämä geeni koodaa omega-3-rasvahappo-desaturaasi, joka katalysoi omega-6 omega-3-PUFA: ja joka on poissa useimmissa eläimissä, mukaan lukien nisäkkäät. On huomattava ero kudoksen omega-6 /omega-3-PUFA suhde villityypin ja rasva-1 transgeenisten hiirten [26]. Fat-1 hiirissä, joka tyypillisesti on tasapainoinen suhde omega-6 omega-3 PUFA niiden kudosten ja elinten riippumaton ruokavalio, mahdollistavat tarkkaan kontrolloituja tutkimuksia voidaan suorittaa ilman mahdollisten sekoittavien tekijöiden ruokavalion. Tämä tekee niistä hyödyllinen malli tutkia biologisten ominaisuuksien endogeenisen omega-3-PUFA: t [25]. Useat raportit käyttäen rasva-1-hiiret ovat osoittaneet syövän vaikutukset omega-3-PUFA: t [27] – [30]. Näissä tutkimuksissa, omega-3 PUFA kohdistama syöpälääkkeen vaikutuksia tukahduttamalla tulehdusreaktioita ja PGE2 eritys syöpäsoluja. Tähän mennessä on olemassa muutamia tutkimuksia, jotka tutkimaan osallistumisen omega-3 PUFA biologiassa valuuttalisiin.

Tässä tutkimuksessa olemme arveltu, että omega-3 PUFA voi muuttaa kasvain mikroympäristöihin vaikuttamalla CAF aktiivisuutta. Tutkia tämän hypoteesin, fibroblasteja, jotka ovat peräisin rasva-1 ja villityypin hiiriä arvioitiin sekä in vitro että in vivo olosuhteissa, jotka sallivat vuorovaikutuksen TC-1 syöpäsoluja. TC-1-soluja, jotka ovat peräisin epiteelin C56BL /6-hiiret ja kuolemattomiksi ihmisen papilloomaviruksen (HPV) tyyppi 16 E6 ja E7 onkoproteiineja. Niitä käytetään yleisesti in vitro ja in vivo hiirimalleissa HPV: syöpä [31]. Täällä, tutkimme osallistumista omega-3 PUFA TC-1 kasvainten synnyssä vertaamalla rasva-1 ja villityypin hiirillä. Meidän erityinen painopiste mukana tutkimuksessa kasvaimeen liittyvien fibroblasteissa. Nämä mallit ovat käyttökelpoisia tutkimuksessa valuuttalisiin koska syöpäsolut ovat peräisin villityypin hiiren epiteelin, kun syövän strooman komponentteja, kuten valuuttalisiin, peräisin rasvasta-1 (omega-3 PUFA:-rikas), tai villityypin (normaali PUFA:) hiirillä.

Materiaalit ja menetelmät

Eläimet ja ruokavalio

Fat-1-hiiret luotu C57BL /6 taustalla kuvatulla [26] ja sen jälkeen takaisinristeytettiin (vähintään neljä kertaa) päälle C57BL /6 taustalla. Eläimiä ruokittiin erikoisruokavaliota (AIN-76A + 10% safloriöljy, CLEA Japan, Inc.), joka sisälsi 10,3% koko rasvaa rasvahappokoostumus C16:0 (7,6%), C18:0 (2,7%), C18 :1n-9 (14,1%), C18:2n-6 (73,2%), C18: 3n-3 (0,3%), C20:4n-6 ( 0,1%), C20:5n-3 ( 0,1 %), C22: 6n-3 ( 0,1%), korkea n-6 ja alhainen n-3-rasvahapot, kunnes haluttu ikään (6-8 viikkoa) kokeisiin. Estämään lipidien hapettumista ruokavaliossa, kaikki elintarvikkeet säilytettiin jääkaapissa antioksidantteja (iätön; Mitsubishi Gas Chemical Inc.), ja valmis vasta kahden päivän välein. Eläinkokeet hyväksyi Tokion yliopiston Animal komitean.

Kasvaimen kasvu määritys hiirillä

TC-1-solut ovat peräisin ensisijainen keuhkojen epiteelisolujen välillä C56BL6 /hiirillä ja ikuisti käyttäen HPV 16 E6 /E7 plus c-Has-ras (ystävällinen lahjoitus tri TC Wu, Johns-Hopkins University, Baltimore MD USA) [32]. TC-1-soluja viljeltiin DMEM: ssä (Gibco, NY, USA), joka sisälsi 10% FBS: ää, 100 U /ml penisilliiniä, 0,1 mg /ml streptomysiiniä ja 0,25 ug /ml amfoterisiini B: Kahdeksan viikkoa vanhoja naaraspuolisia hiiriä injisoitiin 5 x 10

6 hiiren TC-1-soluja suspendoitiin 100 ul: aan DMEM: ä. Tuumorin tilavuus, joka perustuu mittaharppimittauksilla, laskettiin 7 ja 14 päivää injektion jälkeen seuraavalla kaavalla: (tuumorin tilavuus) = 1/2 x (lyhin halkaisija)

2 x (suurin läpimitta). Hiiret tapettiin 14 päivää ymppäyksen jälkeen, kasvaimet leikattiin irti ja säilytettiin -80 ° C: ssa tulevia analyysejä.

cDNA microarray

Kokonais-RNA TC-1 kasvaimet (edellä) uutettiin käyttäen RNeasy MINIKIT (QIAGEN, Hilden, Saksa). CDNA-microarray-analyysi, 0,5 ug yhdistettyä kokonais-RNA: ta monistettiin ja merkitty käyttäen amino Allyyli MessageAmpTM II mRNA Amplification Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kukin näyte mRNA leimattu Cy3 ja viite mRNA leimattu Cy5: llä oli cohybridized että GeneTM Mouse Oligo siru 24 k (Toray Industries Inc., Tokio, Japani) 37 ° C: ssa 16 tuntia. Hybridisaation jälkeen kukin DNA-siru pestiin ja kuivattiin. Hybridisaatiosignaaleista johdettu Cy3 ja Cy5 skannattiin Scan Array Express (PerkinElmer, Waltham, MA, USA). Skannattu kuva analysoitiin GenePix Pro (MDS Analytical Technologies, Sunnyvale, CA, USA). Kaikki analysoidut tiedot olivat skaalataan maailmanlaajuinen normalisointi. GEO-hakunumero on GSE54079.

immunohistokemia

Parafiinisektioista (4 pm) TC-1 kasvaimet poistettiin vaha ksyleenillä ja rehydratoitiin kautta lajitellut etanolia vedessä. Antigeenejä haettiin keittämällä 10 mM sitraattipuskurilla (pH 6,0) 30 minuutin ajan. Jäähdytetty leikkeitä inkuboitiin DAKO REAL Peroxidase-Salpaamisliuos (DAKO, Carpinteria, CA, USA) 10 minuutin sammuttamiseksi endogeeninen peroksidaasi. Estää epäspesifisen sitoutumisen, leikkeitä inkuboitiin DAKO Protein lukitus liuosta (DAKO) 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Sitten leikkeitä inkuboitiin kaniinin polyklonaalista vasta-ainetta hiiren MMP-9 (PAB12714, Abnova, 1:100 laimennus) on DAKO REAL-vasta-aineen liuotinta (DAKO), yön yli 4 ° C: ssa. Levyjä inkuboitiin 1 tunti huoneenlämpötilassa peroksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita, pestiin, inkuboitiin DAB, vastavärjätään hematoksyliinillä, kuivattu läpi etanolissa ja ksyleeni, ja asennettu. Arvioimaan tuumorin pienten suonten muodostuminen, kasvain leikkeet värjättiin CD-31 käyttäen rotan monoklonaalinen vasta-aine hiiren CD-31 (ab56299, Abcam, Tokio, Japani, 1:100 laimennos).

RT-kvantitatiivista PCR: ää ( RT-qPCR) B

Kokonais-RNA uutettiin TC-1 kasvaimia ja viljeltiin fibroblastien käyttäen RNeasy MINIKIT (QIAGEN, Hilden, Saksa), jota seurasi käänteistranskriptio. cDNA monistettiin 40 syklillä Light Cycler 480 (Roche, Basel, Sveitsi) käyttäen Universal Probe Master Mix ja seuraavia alukkeita ja Universal Probe kirjasto (UPL) koettimia (Roche). Alukeparit ja yleinen koettimet, jotka vastaavat kutakin aluketta, joita on käytetty monistuksissa olivat seuraavat: hiiren β-aktiini, 5’ATTGAAACATCAGCCAAGACC-3 ’ja 5′-CCGAATCTCACGGACTAGTGT-3′ probe88; hiiren MMP-9, 5’-ACGACATAGACGGCATCCA-3 ’ja 5′-GCTGTGGTTCAGTTGTGGTG-3’ probe19. MMP-9 on normalisoitu käyttäen β-aktiini-mRNA: n sisäisenä standardina. Ekspressiotasoja laskettiin vertaileva Ct menetelmää käyttäen β-aktiini kuin endogeeninen viitteenä geeni.

Ensisijainen fibroblastiviljelmässä ja rinnakkaisviljelemällä TC-1-soluja

Keuhkot eristettiin rasva-1 siirtogeenisiä ja villityypin hiirien ja pestään suolaliuoksella poistamiseksi verisoluja. Eristäminen ja viljely keuhkojen fibroblasteja suoritettiin käyttäen aikaisemmin kuvattuja menetelmiä [33]. Keuhkojen kudokset jauhettiin pieniksi paloiksi ja inkuboitiin DMEM: ssä (Gibco, NY, USA), joka sisälsi tyypin I kollagenaasilla (0,25%, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) ja deoxynuclease I (15 U /ml; TaKaRa, Tokio, Japani) 120 minuutin ajan 37 ° C: ssa. Saatu dispergoitu solut erotettiin suodattamalla nylon solun- (70 um, BD, Franklin Lakes, NJ, USA). Fibroblastien suodos kerättiin, asetettiin 10 cm: n maljoille DMEM, joka sisälsi 10% FBS: ää, 100 U /ml penisilliiniä, 0,1 mg /ml streptomysiiniä ja 0,25 mg /l amfoterisiini B, ja inkuboitiin 7-10 päivää. Fibroblasteja puhdistettiin muista solupopulaation differentiaalisella tarttuvuus ja serial passage.

Confluent fibroblastit ja TC-1-solut trypsinoitiin ja suspendoitiin uudelleen DMEM, joka sisälsi 10% FBS: ää, 100 U /ml penisilliiniä, 0,1 mg /ml streptomysiiniä, ja 0,25 g /ml amfoterisiini B ja 1 x 10

5 solua /ml soluja kunkin solutyypin maljattiin yhdessä 12 kuoppaviljelylevyillä. Co-viljelmiä inkuboitiin 37 ° C: ssa 5% CO 2: ssa kosteutetussa ilmakehässä 24 tunnin ajan. Homotyyppisessä viljelmät toimivat kontrolleina.

gelatiinitsymografialla

gelatiinitsymografialla analyysit suoritettiin käyttäen gelatiinitsymografialla kit (Cosmobio, Sapporo, Japani) mukaan valmistajan instuctions. Soluviljelmän supernatantit kerättiin ja sentrifugoitiin 1500 rpm 5 minuuttia. Solujen supernatantti sekoitettiin 2 x näytepuskuria ja elektroforeesi käyttämällä esivalettuja geelejä (10% polyakryyliamidia, 0,1% gelatiinia), 4 ° C: ssa 1 tunnin ajan. Subsequentnzymatic reaktiot suoritettiin 37 ° C: ssa yön yli. Gelatinaasi toimintaa visualisoitiin käyttäen spesifistä värjäytymistä ratkaisuja ja väri poistettiin etikkahappo-metanoli-dH

2O (01:03:06). Sillä puolikvantitatiivinen analyysien gelatiinitsymografialla nauhat analysoitiin kuva-analyysi-ohjelmisto (ImageJ).

Tilastollinen

Data esitetään keskiarvoina ± SEM. Tilastolliset analyysit tehtiin Studentin

t

-testi tai Wilcoxonin analyysin avulla JMP-ohjelmisto. Arvo P 0,05 pidettiin merkittävänä. Kuviossa legendoja, Tähdet osoittavat ne vertailuja tilastollista merkitsevyyttä (p 0,05).

Tulokset

Kasvaimen kasvu ja angiogeneesi TC-1 kasvaimia vaimennetaan rasvaa-1 hiirissä

vaikutuksen tutkimiseksi omega-3 PUFA kohdunkaulan syövän kasvainten synnyssä, me pistetään TC-1-solut subkutaanisesti rasva-1 ja pentue-mate villityypin C57 /BL6-hiirissä. TC-1 kasvaimen muodostumisen hinnat ja kasvaimen kasvua arvioitiin hiirten lukumäärä, jotka muodostavat kasvaimia ja kolmen ulottuvuuden kasvainten kokoja, vastaavasti. Ei ollut eroa kasvainmuodostusta hinnat välillä rasva-1 ja villityypin hiirillä. TC-1 kasvainten koot piirrettiin 14 päivää rasvaa-1 ja villityypin kontrolleihin (Fig. 1). Kasvaimen kasvu oli johdonmukaisesti vähemmän rasvaa-1 hiirissä verrattuna villityypin hiiriin kaikkina ajankohtina. Rasvaa-1-hiiret, kasvaimen koko on 14 päivää injektion jälkeen oli merkitsevästi pienempi kuin villityypin kontrolleihin (Fig. 1). Vaikka solujen kasvua TC-1-solujen riippuu HPV16 E6 /E7 ilmentyminen, E6 ja E7 ilmentyminen TC-1 kasvaimia ei vaimentua rasvaa-1 hiirissä (Fig. S1).

5 x 10

6 hiiren TC-1-soluja suspendoitiin 100 ul: aan DMEM: ää injektoitiin sc kuhunkin 10 rasva-1 ja villityypin hiirillä. Tuumorin tilavuus, joka perustuu mittaharppimittauksilla, laskettiin 7 ja 14 päivää injektion jälkeen seuraavalla kaavalla: (tuumorin tilavuus) = 1/2 x (lyhin halkaisija)

2 x (suurin läpimitta). Keskiarvot kanssa keskihajonnat on esitetty. Tähdellä osoittaa ne vertailut (rasva-1 vs. villityypin hiiret) kanssa tilastollista merkitsevyyttä (p 0,05).

määritellä tarkemmin mekanismeja Erojen taustalla kasvaimen kasvua tässä mallissa, etenkin mahdollisen roolin isännästä peräisin syöpään liittyvän peruskudoskomponentit lukien valuuttalisiin, me seuraavaksi tutkittava, onko omega-3 PUFA modifioitu angiogeneesiä TC-1 kasvain. Arvioimme puolittain määrällisesti kasvain mikroverisuonitiheys TC-1 kasvaimia peräisin rasvasta-1 ja villityypin hiirillä laskemalla CD31-positiivisten pienten verisuonten immunohistokemiallista määritystä (Fig. 2A ja 2B). CD31 immunovärjäystä TC-1 kasvaimia, jotka ovat peräisin rasva-1 ja villin tyypin hiirissä (Fig. 2A) osoitti hypovascularity rasvaa-1-johdettu TC-1 kasvaimissa verrattuna villityypin johdettu kasvaimia. Määrä CD31-positiivisia mikrosuonten per suuritehoisia kentän rasva-1 hiirillä oli merkitsevästi pienempi kuin villityypin hiirillä (Kuva. 2B). Nämä in vivo tulokset osoittivat, että TC-1 kasvaimen kasvua ja angiogeneesiä olivat ainakin tukahdutettiin rasva-1 hiirissä verrattuna villityypin kollegansa vaikka oli vaikea tarkasti arvioida TC-1 solujen kasvua rasva-1 hiirissä.

CD31 immunovärjäykseen TC-1 kasvain on peräisin villityypin (WT) hiiret (A) ja rasva-1 (B). Palkit osoittavat 200 pm. (C) pienten suonten tiheyksiä TC-1 kasvaimet ilmaistaan ​​edustava määrä merkitty alusten 4 aloilla (n = 5). Keskiarvot kanssa keskihajonnat on esitetty. Tähdellä osoittaa ne vertailut (rasva-1 vs. villityypin hiiret) kanssa tilastollista merkitsevyyttä (p 0,05).

MMP-9 on vaimentua rasvaa-1 hiirissä johdettuja TC-1 kasvaimia

Tutkitaan mahdolliset erot geeniekspressioprofiilien TC-1 kasvaimia kasvaa ihon rasvan-1 ja villityypin hiirillä, TC-1 tuumorikudoksista saatu rasva-1 ja villityypin hiiret analysoitiin cDNA microarray. Koska omega-3-PUFA: t raportoidaan vaikuttaa solujen lisääntymistä ja tulehdusta, Taulukossa 1 luetellaan suhteessa geeni-ilmentymisen tasoa edustavien geenejä, jotka liittyvät tuumorin kasvua ja tulehdusta (taulukko 1). Lukuun ottamatta EGF, ekspressiotasoja lähes kaikkien inflammatoristen sytokiinien /kemokiinien ja kasvutekijöiden TC-1 kasvainten rasva-1-hiiret olivat korkeammat kuin, kasvaimia villityypin kontrolleihin. Tämä viittaa siihen, että tulehdusta ja anti-solujen kasvua vaikutukset omega-3 PUFA eivät todennäköisesti ole keskeinen niiden anti-kasvain toimintaa, ainakin tässä mallissa. Tutkimme seuraavaksi ilmentymistä MMP näissä TC-1 kasvainten edelleen osoite peruskudosta liittyvät angiogeneesin kasvaimen mikroympäristöihin (taulukko 1). cDNA microarray osoitettu, että MMP-2 ja -9 tukahdutettiin rasvaa-1-hiiriä johdettu TC-1 kasvain, kun taas muiden MMP: iden oli yleensä voimistuvan verrattuna kontrolleihin. Vahvista nämä vaikutukset RNA-tasolla, RT-qPCR MMP-9 suoritettiin. MMP-9 RNA-tasot rasvaa-1 hiiret olivat noin 60% pienempi kuin villityypin kontrolleihin (Kuva. 3A). TC-1 kasvaimen immunohistokemia vahvistivat nämä tulokset proteiinitasolla. MMP-9 immunoreaktiivisuus villityypin hiiren johdettuja TC-1 kasvainten oli selvästi voimakkaampaa kuin rasva-1 hiiren johdettuja kasvaimia (Fig. 3B). Suuritehoiset histokemiallinen analyysi MMP-9 immnoreactivity TC-1-soluja (Fig. 3B, insertit) paljasti vähäinen ilmaisu, kun taas strooman komponentteja, mukaan lukien valuuttalisiin ja endoteelisolujen oli vahvasti positiivinen ainoastaan ​​villityypin johdettu TC-1 kasvainten . Nämä tiedot osoittivat, että tuotanto MMP-9 valuuttalisiin ja endoteelisoluissa tukahtui selvästi rasva-1-hiirissä.

Kokonais-RNA uutettiin TC-1 kasvaimia, jota seuraa käänteistranskriptio. MMP-9 mRNA-tasot mitattiin qRT-PCR. Expression MMP-9 normalisoitiin p-aktiini sisäisenä standardina (n = 4 kussakin ryhmässä). Tähdellä osoittaa ne vertailut (rasva-1 vs. villityypin (WT) hiiret) kanssa tilastollista merkitsevyyttä (p 0,05). MMP-9 immunovärjäykseen TC-1 kasvainten johdettu villityypin (WT) ja rasva-1 hiirissä. Palkit ilmaisevat 200 mikrometriä pienitehoisia kenttiä, 50 pm suuritehoisissa aloilla.

MMP-9 ilmaisun ja gelatinaasiaktiivisuutta tukahdutettiin viljellyissä ensisijainen fibroblasteissa Rasvasta-1 hiirissä

Voit jäljitellä syövän strooman microenvironment in vitro, yhteisrahoittaisimme viljellyistä fibroblasteista eristettiin rasva-1 ja villityypin hiiret TC-1-soluissa. Käytimme keuhkokudokset rasvasta-1 ja villityypin hiirten lähteet fibroblastien, ja ero tarttuvuus menetelmät niiden eristämistä. Kaikki fibroblasteja siirrostettiin 3-4 kertaa ennen käyttöä kokeissa. Baseline MMP-9 ekspressiotasot ensisijainen fibroblasteista rasva-1 hiiret olivat noin 60% pienempiä kuin villityypin johdettuja fibroblasteja (Fig. 4A). Viljelysupernatantit kunkin ensisijaisen fibroblastien alatyypin kerättiin ja altistettiin polyakryyliamidigeelielektroforeesi tutkimaan eroja MMP gelatinaasin toimintaa (Fig. 4B). Käyttämällä tätä menetelmää, MMP-2 havaittiin, mutta MMP-9 ei ollut rasva-1 ja villityypin fibroblasti

(A) Ensisijainen fibroblasteista eristettiin hiiren keuhkoista viljeltiin. Kokonais-RNA fibroblastien käänteistranskriptoitiin ja MMP-9 mRNA-tasot mitattiin qRT-PCR: llä. Expression MMP-9 normalisoitiin p-aktiini sisäisenä standardina. Tiedot ovat edustaja kolmen erillisen kokeen. Aineisto analysoitiin käyttämällä Studentin

t

-testi. Tähdellä osoittaa ne vertailut (rasva-1 vs. villityypin (WT) hiiret) kanssa tilastollista merkitsevyyttä (p 0,05). (B) gelatiinitsymografialla: supernatantit ensisijainen fibroblastiviljelmät kerättiin ja erotettiin elektroforeettisesti. Gelatinaasi toimintaa visualisoitiin normaaleja värjäystekniikoita.

Seuraavaksi, nämä ensisijainen fibroblastit olivat viljeltiin yhdessä TC-1-soluja tutkia fibroblastien aktivoitumista, kun in vitro altistumisen syöpäsolujen

11. Fibroblastit ja TC-1-soluja viljeltiin yh- 24 tuntia ja MMP-9 transkription mitattiin RT-qPCR. Fibroblasteista rasva-1 ja villin tyypin hiirten lisääntynyt osoittivat MMP-9 ilmaisun altistuessaan TC-1-soluissa (kuvio. 5A). Fibroblasteissa, jotka ovat peräisin rasva-1-hiiret, missä määrin MMP-9: induktio oli pienempi kuin fibroblasteissa villityypin hiirillä (Kuvio 5A). MMP-9: ää ei ilmaistu homotyyppisessä TC-1-soluissa, yhdenmukaisia ​​immunohistokemiallista dataa meidän in vivo -mallissa. Lisäksi vahvistimme, että MMP-9: ää ei ole ilmaistu TC-1-soluissa käyttämällä transwell yhdessä viljelemisen malli (Fig. S2). Siksi MMP-9 Yhdessä viljelemisen ehto oli peräisin ei TC-1-soluja vaan fibroblasteissa. MMP-2 gelatinaasiaktiivisuutta todettiin kaikissa soluviljelmässä olosuhteissa, kuten homotyyppisessä TC-1 soluviljelmissä, ja ei muuttunut yhdessä viljelemisen olosuhteissa (kuvio 5B, 5D). MMP-9 gelatinase toiminta oli kuitenkin havaittavissa fibroblasti-TC-1-solu-yhteisviljelmässä viljelmissä, vaikka MMP-9 gelatinaasin toimintaa, johon rasva-1-fibroblasteja tukahtui selvästi verrattuna villityypin fibroblasteissa (kuvio 5B, 5C), mikä tukee käsite, että MMP-9 ilmaisun ja gelatinaasiaktiivisuutta vaimennetaan endogeenisen omega-3 PUFA valuuttalisiin johdettu rasva-1-hiirissä.

(A) eristetty fibroblastit viljeltiin yhdessä TC-1-soluja 24 tunnin ajan ja ilmaisu MMP-9 fibroblasteissa mitattiin RT-qPCR. Expression MMP-9 normalisoitiin p-aktiini sisäisenä standardina. Tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen. Aineisto analysoitiin Studentin

t

-testi. Tähdellä osoittaa ne vertailut (rasva-1 vs. villityypin (WT) hiiret) kanssa tilastollista merkitsevyyttä (p 0,05). ”N.D.” osoittaa ”ei havaittu”. (B) gelatiinitsymografialla: Supernatantit fibroblastien homotyyppisessä kulttuureista ja fibroblasti /TC-1 co-viljelmät kerättiin ja erotettiin elektroforeettisesti. Gelatinaasin toiminta visualisoitiin normaaleja värjäystekniikoita. (C, D) varten semi-kvantitatiiviset analyysit, gelatiinitsymografialla bändejä analysoitiin käyttäen kuva-analyysi-ohjelmisto. Tulokset esitetään keskiarvona ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta. Aineisto analysoitiin Studentin

t

-testi. Tähdellä osoittaa ne vertailut (rasva-1 vs. villityypin (WT) hiiret) kanssa tilastollista merkitsevyyttä (p 0,05).

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa selvitimme osallistuminen määriteltyjen ruokavaliotekijät (omega-3 ja omega-6 PUFA) kasvainten synnyssä käyttäen HPV-positiivisten TC-1-soluissa ja ehdotti uutta kasvainten vastaisen mekanismi omega-3 PUFA joka riippuu toiminnasta valuuttalisien. Omega-3-PUFA: t on osoitettu tukahduttaa syövän esiintyvyys ja kasvua eri syövissä [18], [19], [27]. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että omega-3 PUFA näitä vaikutuksia kautta tulehdusta vasteita suoraan ja /tai epäsuorasti [25] – [27] kautta sekä indusoimalla tuumorisolujen apoptoosin ja /tai tukahduttamaan kasvainsoluproliferaation [18], [19 ]. Kuitenkin on ollut muutamia raportteja vaikutuksista omega-3 PUFA on valuuttalisien. Valuuttalisiin ovat sekaantuneet helpottaa kasvua useiden kasvainten suoraan stimuloimalla kasvainsoluproliferaation ja tehostamalla angiogeneesiä [34], [35]. Kohdistaminen geenejä ja signalointireitteihin välittävät vuorovaikutusta valuuttalisiin ja kasvaimen mikroympäristön pidetään välttämätöntä kehittää uusia ja tehokkaita syövän hoitomuotoja [36], [37]. Tässä tutkimuksessa käytetään rasva-1 hiirissä ja TC-1 kasvainsolut, pystyimme selvittämään vaikutuksen omega-3 PUFA-rikas valuuttalisiin on kasvaimien syntyyn.

Monet molekyylit, mukaan lukien kasvutekijät, sytokiinit, ja MMP, pelata stimuloivat että estävät roolit angiogeneesin edistämiseen [21]. Tutkimme geenien ilmentyminen angiogeneesiin liittyvien sytokiinien, kasvutekijöiden ja MMP TC-1 kasvainten rasvaa-1 ja villin tyypin hiirten cDNA microarray. Ilmentymistasojen lähes kaikki inflammatoristen sytokiinien /kemokiinien ja kasvutekijöiden TC-1 kasvainten rasva-1 hiiret olivat korkeammat kuin kasvainten villityypin kontrolleihin. Sen sijaan, EGF ja MMP-2 ja -9 ekspressiotasot fat-1 hiiret olivat alhaisempia kuin villityypin hiirillä. Koska alas-säätely EGF TC-1 kasvaimia rasvasta-1 hiirissä ennustettiin edistämään TC-1 soluproliferaatiota vaan kasvaimen kokoon rasva-1 hiirillä oli merkitsevästi pienempi kuin villityypin valvontaa oletamme, että erot MMP tuotannossa välillä rasva-1 ja villin tyypin hiirten voi olla vastuussa tukahduttaminen TC-1 kasvaimen kasvua. Meidän in vitro -tiedot todentaa, että MMP-9 johdettu valuuttalisiin aktivoidaan TC-1 solujen altistus vaimentua rasvassa-1 hiirissä. MMP raportoidaan vaikuttaa kasvaimen etenemistä helpottamalla tapahtumien ratkaisevaa uudissuonittumisen ja perustamaan kaukainen etäpesäke mukaan lukien proliferaatiota, eloonjäämistä ja migraatio endoteelin, kasvain ja stroomasolujen [8], [9]. MMP-estäjät vähentävät angiogeneesiä, kasvaimen määrän, ja kasvaimen kasvun, samoin kuin geneettinen ablaatio MMP-9 [38]. Toisin kuin MMP-2, joka ilmentyy, MMP-9 tasot ovat yleensä pieniä ja entsyymi-ekspressio indusoi sytokiinien, jotka stimuloivat NF-KB [8], [39]. Lisäksi seerumin ja kudosten MMP-9 on raportoitu liittyvän syövän eteneminen ja metastaasit [40]. Rintasyövän, MMP-9 -aktiivisuuden on paikannettu noin valuuttalisiin ja valuuttalisiin viljeltiin yhdessä syövän solut, jotka erittävät TGF-β, TNF-α, ja muiden sytokiinien, tuotannon lisäämiseksi MMP-9: [11], vastaa meidän in vitro data. Meidän data, tukahduttaminen MMP-9 edistäisi mukana hypo-angiogeneesi tuumorin strooman osa rasva-1 kasvain.

useita transkriptiotekijöitä, mukaan lukien aktivaattori proteiini-1 (AP-1), SP- 1, ja NF-KB, raportoidaan osallistuvan muutoksia MMP-9 ilmaisun altistuminen erilaisten sytokiinien [41] – [43]. Kääntäen, useita raportteja ovat osoittaneet, että omega-3-PUFA: t on estävä vaikutus NF-KB-reitin, kun on aktivoitu eri ärsykkeiden [43] – [47]. Omat tiedot viittaavat siihen, että aktivointi NF-KB-reitin upon rinnakkaisviljelemällä TC-1 solut voidaan vaimentaa kohonnut taso omega-3 PUFA fibroblastien saatu rasva-1 hiirissä.

kokeissa olemme johdonmukaisesti käytetty ensisijainen fibroblastit, joita oli siirrostettiin 3-4 kertaa vain. Kuitenkin rasva-välittäjä analyysi fibroblastien paljasti, että ne, jotka ovat peräisin rasva-1 hiiret tuottivat suurempia määriä omega-3-PUFA: t, mukaan lukien EPA-johdettujen metaboliittien verrattuna, jotka ovat peräisin villityypin kontrolleihin (Fig.S3), joka vahvistaa, että viljellyt fibroblastit säilytti ominaisuus tehdä omega-3 PUFA rikas ympäristö.

TC-1 kasvain microarray tiedot osoittivat, että useat tulehduksellisten sytokiinien /kemokiinien ja kasvutekijät olivat yläreguloituja rasva-1 hiirissä. Kuitenkin tulokset osoittivat, geeni-ilmentymisen tasoa sekä TC-1-soluja ja strooman komponentteja, kuten fibroblastit, endoteelisolut ja immuunijärjestelmän solujen. Siksi ekspressiotasot kutakin sytokiinien /kemokiinin olivat riippuvaisia ​​niiden ensisijainen lähteet. MMP-9 on tuottanut saaduissa fibroblasteissa rasva-1-hiirissä, mutta ei TC-1-soluja. Näin ollen, tukahduttaminen NF-KB-reitin kohonnut omega-3-PUFA: rasva-1-johdettu peruskudoskomponentit voi olla erityinen ja voimakas vaikutus MMP-9 ekspressiotasoja verrattuna muiden inflammatoristen sytokiinien /kemokiinien. Toisaalta, aiemman tutkimus osoittaa, että omega-3-PUFA: t aktivoivat NK-soluja ja lisätä suhteessa aktivoitujen CD8 + -solujen; tätä seuraa parempi syövänvastainen vaikutus [48]. Siksi omega-3 PUFA voidaan käyttää sekä tulehdusta ja proinflammatoristen vaikutuksia immuunijärjestelmän soluihin.

Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että omega-3 PUFA-rikas mikroympäristölle voi estää MMP-9 erittymisen valuuttalisiin ja että tähän liittyy myöhemmin kasvain hypo-angiogeneesiä. Tässä tutkimuksessa ehdotetaan uutta antituumorivaikutuksen omega-3 PUFA moduloimalla kasvain mikroympäristölle erityisesti valuuttalisiin.

tukeminen Information

Kuva S1.

ekspressiotasot E6 ja E7-mRNA TC-1 kasvain. Kokonais-RNA uutettiin TC-1 kasvaimia, jota seuraa käänteistranskriptio. E6 ja E7-mRNA-tasot mitattiin qRT-PCR. Ekspressiotasot E6: n ja E7-mRNA: n normalisoitiin p-aktiini sisäisenä standardina. E6 alukkeet olivat eteenpäin, 5’TGCACAGAGCTGCAAACAAC -3 ’, ja kääntää, 5’AGCATATGGATTCCCATCTC -3 ”. E7 alukkeet olivat eteenpäin, 5’TTTGCAACCAGAGACAACTGA -3 ’, ja kääntää, 5’GCCCATTAACAGGTCTTCCA -3 ”.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0089605.s001

(TIF) B Kuva S2 .