Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

ET-743 (trabektediinia, Yondelis®) ja PM00104 (Zalypsis®) ovat meren peräisin olevat yhdisteet, joilla on kasvaimia torjuvaa aktiivisuutta. ET-743 ja PM00104 altistuminen yli pitkäaikaisesti hoidon johtaa lääkeresistenssin kehittymisen, mutta mekanismeja, jotka johtavat vastus ei ole vielä ymmärretty.

Menetelmät /Principal Havainnot

Human kondrosarkoomassa solulinjat resistenttejä ET-743 (CS-1 /ER) tai PM00104 (CS-1 /PR) perustettiin tässä tutkimuksessa. CS-1 /ER ja CS-1 /PR osoittivat ristiresistenssiä sisplatiinin ja metotreksaatin muttei doksorubisiinille. Human Affymetrix Gene Chip matriiseja käytettiin tutkimaan suhteessa geenin ilmentymisen näissä solulinjoissa. Olemme havainneet, että suuri määrä geenejä ovat muuttuneet ekspressiotasot CS-1 /ER ja CS-1 /PR verrattuna emosolulinjassa. 595 CS-1 /ER ja 498 CS-1 /PR geenit tunnistettiin yli-ilmentävät; 856 CS-1 /ER ja 874 CS-1 /PR selostukset tunnistettiin underexpressing. Kolme sinkkisormipolypeptidiin proteiini (ZnF) geenit olivat päällä 10 yliekspressoitu geenejä lista. Näiden geenien ei ole aikaisemmin liittynyt lääkeresistenssin kasvainsoluissa. Differential ilmauksia ZNF93 ja ZNF43 geenien vahvistettiin sekä CS-1 /ER ja CS-1 /PR resistenttejä solulinjoja reaaliaikaisella RT-PCR. ZNF93 oli yli-ilmentynyt kaksi ET-743 resistenttejä Ewingin sarkooma solulinjoissa sekä sisplatiini kestävä munasarjasyövän solulinja, mutta ei yli-ilmentynyt paklitakseli resistenttejä solulinjoja. ZNF93 pudotus siRNA CS-1 /ER ja CS-1 /PR aiheutti lisääntynyt herkkyys ET-743, PM00104, ja sisplatiini. Lisäksi ZNF93 transfektoiduissa CS-1-solut ovat suhteellisen resistenttejä ET-743, PM00104 ja sisplatiini.

Johtopäätökset /merkitys

Tämä tutkimus osoittaa, että sinkki sormi proteiineja, ja ZNF93 erityisesti, ovat mukana vastustuskykyä eT-743 ja PM00104.

Citation: Duan Z, Choy E, Harmon D, Yang C, Ryu K, Schwab J, et al. (2009) ZNF93 paremman suojan ET-743 (Trabektediini, Yondelis®) ja PM00104 (Zalypsis®) in Human Cancer Cell Lines. PLoS ONE 4 (9): e6967. doi: 10,1371 /journal.pone.0006967

Editor: Nils Cordes, Dresdenin teknillinen yliopisto, Saksa

vastaanotettu: 02 huhtikuu 2009; Hyväksytty: 10 elokuu 2009; Julkaistu: 09 syyskuu 2009

Copyright: © 2009 Duan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Hanke tukivat, osittain avustusta PharmaMar. Dr. Duan tuetaan osittain kautta avustusta Munasarjojen Cancer Research Foundation (oCRF), ja avustusta National Cancer Institute, NIH (Nanotechnology Platform Partnership), R01-CA119617. Dr. Choy tukee Jennifer Hunter Yates Foundation. Tuki on myös tarjoamia Gattegno ja Wechsler funds.The rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Tunnustamme myös, että 2 out useita kemoterapiaa huumeita käytetään tässä tutkimuksessa, ET-743 ja PM00104, valmistettiin ja Yhtiön antamien, PharmaMar joka myös osittain rahoitti työtä.

Kilpailevat edut: Vakuutan PharmaMar USA, Inc ei ole vaikutusta tuloksiin ja tutkimuksen lopputuloksia. Vakuutan myös, että tulokset ja johtopäätökset eivät vaikuttaneet avustusta PharmaMar USA, Inc. Vaikka tässä tutkimuksessa tukivat, osittain avustusta PharmaMar, tämä ei muuta meidän noudattamista kaikki PLoS ONE politiikkaa tietojen jakamista ja materiaaleja muut tutkijat. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Tunnustamme myös, että 2 out useita kemoterapiaa huumeita käytetään tässä tutkimuksessa, ET-743 ja PM00104, valmistettiin ja Yhtiön antamien, PharmaMar joka myös osittain rahoitti työtä.

Johdanto

ET-743 (Yondelis®; Trabektediini) on meren alkaloidijohdannainen eristettiin Karibian merellä squirt

Ecteinascidia turbinate

[1], [2]. ET-743 on laaja aktiivisuuden kirjo kasvainsolulinjoissa on pM ja matala nM, ja se on myös kliininen aktiivisuus munasarjasyöpä, rintasyöpä, ja sarkoomat [2], [3]. ET-743 on hyväksynyt EMEA /EU potilailla, joilla on kehittynyt sarkoomat, jotka ovat joko edennyt hoidon jälkeen antrasykliini tai eivät ole kliinisesti sopiva vastaanottamaan taudinaiheuttajien [4]. ET-743 koostuu kolmesta tetrahydroisokinoliini alayksiköstä, jotka sisältävät keskeisen karbinoliamiinivälituote osan, jotta se voi sitoutua kovalenttisesti DNA: han. ET-743 sitoutuu pieneen uraan DNA heliksin sekvenssi-spesifinen sitoutuminen mieltymys GC-rikas kolmoset ja myöhemmin muodostaa kovalenttisen addukteja N2-asemaan guaniini. Tämän seurauksena, pienessä urassa on alttiina, ja käännetään kohti suuria uraan. Kun tällainen sitoutuminen tapahtuu, DNA-säikeet tulevat silloitettuja ja ei voida toistaa, johtaen solukuolemaan [5], [6]. Suunta DNA käännekohta on uusi piirre DNA pieneen uraan-interaktiivinen aineita, jolloin ET-743 ainutlaatuinen.

PM00104 (Zalypsis®), johdettu nilviäisiä, on uusi kemiallinen kokonaisuus liittyvät Jorumycin, joka on meren luonnollinen yhdiste, joka kuuluu perheeseen

renieramysiinit

, saatu sienet [7], [8]. PM00104 on

in vitro

ja

in vivo

antituumorivaikutuksen kohti erilaisia ​​kiinteiden ja hematologiset kasvaimet. Kuten ET-743, PM00104 myös sitoutuu DNA ja on sytotoksinen; kuitenkin, toisin kuin ET-743, PM00104 ei aktivoi ”DNA-vaurion tarkistuspisteen” vastaus. Siten sytotoksisia vaikutuksia PM00104, vaikka riippuvainen DNA sitova, ei laukaista DNA-vaurioita torjuntamekanismeissa [8].

Kuten muiden kemoterapia lääkkeet, ET-743 ja PM00104 altistuminen yli pitkäaikaisesti Hoidon johtaa lääkeresistenssin kehittymisen, mutta mekanismit eivät ole hyvin ymmärretty. Eri tutkimuksissa on raportoitu ristiriitaisia ​​kuvauksia suhdetta ABCB1 ilmaisun ja ET-743 resistenssin ihmisen syöpäsolulinjoissa [9], [10]. Ihmisen munasarjan solulinja IGROV-1, joka on valittu ET-743 vastus, ABCB1 on yli-ilmentynyt [11]. Herkkyys voidaan palauttaa lisäämällä Pgp1 inhibiittorin PSC-833, mikä viittaa siihen, että ET-743 voi olla Pgp1 substraatti. Toisessa tutkimuksessa havaittiin kuitenkin, että kaksi Pgp yli-ilmentävät ihmisen epidermaalista syöpäsolulinjoissa (KB-8-5 ja KB-C-2), eivät ole resistenttejä ET-743 [9]. Varsinkin subletaali pitoisuudet ET-743 voi kääntää vastustuskyvyn doksorubisiinin ja vinkristiinin näissä solulinjoissa. Ei ole olemassa raportteja kuvaavat mekanismia PM00104 resistenssin kasvainsoluissa.

kondrosarkoomissa ovat heterogeeninen mesenkymaaliset kasvaimet, jotka kehittävät luun tai ruston ja näyttää chondrocytic ominaisuudet [12]. Nämä kasvaimet vastaavan huonosti perinteisiin hoitoihin, kuten kemoterapiaa ja säteily, ja ennuste liittyy kasvaimen ja erilaistumista tila. Herkkyys sarkoomasoluja ET-743 ja PM00104 on johtanut meidät ja toiset pitävät näitä yhdisteitä kiinnostaviin ehdokkaita tulevaisuuden hoitoon Kondrosarkooman [13], [14], [15]. Kuten muiden kemoterapia-aineiden, rasituksilta syöpäsolujen kehittää vastustuskykyä ET-743 tai PM00104 merkittävä haaste käyttää tätä lääkettä pidemmän aikaa. Tavoitteena Tämän tutkimuksen tarkoituksena on selvittää mekanismeja ET-743 tai PM00104 vastus kondrosarkoomaso.

Materiaalit ja menetelmät

Kemoterapia huumeita

ET-743 (Yondelis®; trabektediini) ja PM00104 (Zalypsis®) toimitti PharmaMar (Espanja). Paklitakseli (Taxol®), doksorubisiini (adriamysiini RDF®, EC nro 2468183), metotreksaatti (Trexall) ja sisplatiinia (sisplatiini, CDDP) on saatu käyttämättömän jäljellä kliinisestä materiaalista, jonka apteekissa Massachusetts General Hospital. Kantaliuos huumeiden valmistettiin huumausaineen mukaan tekniset ja säilytettiin -20 ° C: ssa.

kondrosarkoomasolulinjassa CS-1

Ihmisen chonodrosarcoma solulinja, lisätyistä vuodesta 1999 ja nimetty CS -1, perustettiin kirurgisesti resektoitiin ihmisen korkealaatuista chonodrosarcoma, jota ei aiemmin altistuneet kemoterapiaa tai sädehoitoa, ja kasvatettu yksikerroksisessa. Lyhyesti, kudos aseptisesti saatiin välittömästi resektio, sijoitetaan RPMI-1640 kudosviljelyväliainetta täydennetty 10% naudan sikiön seerumia, ja kudos viljeltiin 37 ° C: ssa inkubaattorissa, joka sisälsi 5% CO2: [13], [14]. Yksityiskohtainen analyysi CS-1: n on raportoitu aiemmin [13], [14], [15], [16], [17]. Kokonais-RNA uutettiin sen jälkeen, kun CS-1 siirrostettiin neljä kertaa.

perustaminen ET-743 tai PM00104 resistentti solulinja

CS-1 /ER ja CS-1 /PR resistenttejä soluja ET -743 tai PM00104 määritettiin CS-1 emosolulinjan altistuminen ET-743 tai PM00104 askel-askeleelta lisäys pitoisuuden ET-743 tai PM00104 yhden vuoden käyttäen samanlaista menetelmää kuten on aiemmin kuvattu [18], [19 ], [20]. Lyhyesti, viljeltiin CS-1-soluja altistettiin 0,00001 uM joko ET-743 tai PM00104 ja 7 päivää ja sitten pestiin ja viljeltiin elatusaineessa, joka sisälsi 0,00003 uM 7 päivää. Jos CS-1-soluissa osoitti cytotoxicities altistumisen jälkeen tietyn pitoisuuden ET-743 tai PM00104, ne pestiin ja niitä viljeltiin huumeiden väliaineessa 7 päivää. Esimerkiksi, olemme huomanneet, 90% CS-1-solut tapettiin, kun solut altistettiin 0,001 uM ET-743 tai 0,003 uM PM00104 varten 7 päivää. Kun eläviä soluja oli takaisin, ne ympättiin väliaineeseen, joka sisälsi viimeksi altistetaan lääkkeen pitoisuus uudelleen 3 päivää. Jälkeen toistetaan useita syklejä, ja kun solut kasvoivat jopa 70% konfluenssiin viljelyalustassa, joka sisältää lääkkeitä, pitoisuus huumeita nostetaan seuraavalle tasolle. Vuoden kuluttua, ET-743 kestävä solulinjaa CS-1 /ER ja PM00104 kestävä solulinjaa CS-1 /PR perustettiin määritettynä MTT: llä. Nämä solut ovat väestön huumeiden resistenttien solujen sijasta valitun kloonattu väestöstä. CS-1 /ER voi kasvaa pitoisuuksina 0,005 uM ET-743 ja CS-1 /PR voi kasvaa pitoisuuden 0,01 uM PM00104.

Muut lääkkeille vastustuskykyiset solulinjaa käytettiin tässä tutkimuksessa

ihmisen munasarjasyövän solulinjoissa SKOV-3 ja A2780 ja ihmisen rintasyövän MCF-7 hankittiin American Type Tissue Collection (Rockville, MD). Paklitakseli-resistenttejä SKOV-3

TR, MCF-7

TR ja sisplatiini kestävä A2780cp solulinjat perustettiin aiemmin raportoitu [19], [20]. Dr. Katia. Scotlandi (Institute Orthopedics Rizzoli, Italia), joka on Ewingin sarkooma ET-743 resistentti solulinja TC-ET [21].

Kudosviljelytutkimusten

Kaikki solulinjat viljeltiin RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia, 100 yksikköä /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä (Invitrogen). Soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa 5% CO

2-95% ilma ilmakehässä ja siirrostettiin kun lähellä konfluentteja yksisolukerrosten saavutettiin käyttämällä trypsiini-EDTA-liuosta. Lääkeresistenttiä solulinjat määräajoin viljeltiin vastaavissa huumeiden vahvistamaan lääkeresistenssin ominaisuudet. Soluja ilmainen mykoplasmakontaminaation testattuna MycoAlert (R) Mycoplasma Detection Kit Cambrex (Rockland, ME).

Sytotoksisuusmääritvs

Drug sytotoksisuutta arvioitiin in vitro käyttäen MTT-määritystä, kuten aikaisemmin kuvattu [22]. Lyhyesti, 2 x 10

3 solua per kuoppa maljattiin 96-kuoppaisille levyille viljelyväliaineessa (RPMI 1640, johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia ja penisilliiniä /streptomysiiniä), joka sisälsi kasvavia konsentraatioita lääkeainetta. Jälkeen 7 päivää viljelyn, 10 ui MTT: tä (5 mg /ml PBS: ssä, Sigma) lisättiin kuhunkin kuoppaan ja levyjä inkuboitiin 4 tuntia. Saatu formatsaanituote liuotettiin hapolla-isopropanolia ja absorbanssi aallonpituudella 490 nm (A

490) luettiin SPECTRAmax® Microplate Spectrophotometer (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Absorbanssi normalisoitiin antamalla arvo ohjauslinjan keskipitkällä ilman lääkettä 1,0 ja arvo ei ole solun ohjaus 0. Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

RNA

Kokonais-RNA kerättiin CS-1 (emosolulinjassa kanssa -jaettuja 4 kertaa), CS-1 /ER ja CS-1 /PR (kestävä tytär solulinjoja viljellyillä yhden vuoden) käyttäen TRIzol® Reagent (GIBCO, Grand Island , NY) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Jotta voidaan ottaa huomioon ja poistaa biologinen melu, RNA eristettiin kolme erillistä pulloissa, kustakin solulinjasta. Nämä biologinen rinnakkaista yhdistettiin. RNA laatu määritettiin

kautta

etidiumbromidivärjäyksellä seuraavat agaroosi /formaldehydi geelielektroforeesilla.

Gene transkription profilointiin

Yhteensä RNA käsitelty ja hybridisoitiin Affymetrix Gene Chip U133 Plus 2.0 paneelit (Santa Clara, CA), jonka Gene Array Technology Center Harvard Medical School (https://genome.med.harvard.edu). Affymetrix Gene Chip U133 Plus 2.0 ensimmäisessä ja kattavin koko ihmisen genomin ilmaisun array. Tämä joukko täydentää kattavuus koko ihmisen genomin yli 47000 selostukset. Jokainen anturi koostuu 20 erillistä 23-mer oligonukleotidit. Ilmaisu taso kunkin mRNA kvantitoidaan mittaamalla sen hybridisaatiolla näille 23-meerit verrattuna sen hybridisaatio yhden emäksen yhteensopimattomuus oligonukleotidia.

Tietojen analysointi

GeneSifter käytettiin analysoimaan microarray data (https://www.genesifter.net/web/). GeneSifter tarjoaa tehokkaita analyyttinen algoritmeja (RMA, PAM, ANOVA, CLARASSA Benjamini-Hochberg jne) kautta intuitiivinen web-käyttöliittymä. GeneSifter voi tunnistaa ilmentyvät eri geenien ja ryhmäanalyysi tunnistamiseksi malleja geenien ilmentymisen ja eristämällä geenit perustuvat näihin malleihin. Kertainen muutos ilmaisun välillä herkkiä tai resistenttejä solulinjoja arvioitiin käyttämällä Mann-Whitney testiä. Kymmenkertainen tai suurempi muutos intensiteetti yhdistettynä Mann-Whitney liittyvä P-arvo alle 0,05 käytettiin perusteena lisättäväksi suodatettua tietokokonaisuutta. Intensiteetti tiedot vietiin Microsoft Excel tarpeen.

TaqMan käänteistranskriptio-PCR kvantifiointiin differentiaalisesti ilmaisi geenin

Reaaliaikainen RT-PCR suoritettiin vahvistamaan ilmentyvät eri geenit. Geeniekspression havaitseminen, cDNA käänteinen transkriptio suoritettiin kokonais-RNA näytteistä käyttämällä spesifisiä oligo- dT-alukkeita Taq-Man-RNA-määritykset ja reagensseja TaqMan RNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems). Saatu cDNA monistettiin PCR: llä käyttämällä Taq-Man Zinc finger-proteiinin 93 (ZNF93), ZNF43 ja Thada geenin määritys alukkeita, Taq-Man Universal PCR Master Mix, ja analysoitiin StepOnePlus Reaaliaikainen PCR mukainen järjestelmä valmistajan ohjeiden (Applied Biosystems) . GAPDH ja aktiini käytettiin kontrollina. Suhteellisen geeni-ilmentymisen laskettiin asianomaisten signaalien normalisoinnin signaalin GAPDH tai aktiinin ilmentymistä. PCR-reaktioseokset sisälsivät Taq Man ihmisen ZNF93 tai ZNF43 ja Thada ja Universal PCR Master Mix kokonaistilavuudessa 20 AL. Pyöräily muuttujat olivat seuraavat: 95 ° C: ssa 10 min, mitä seurasi 40 sykliä 95 ° C: ssa (15 s) ja pariutumis /pidennys 60 ° C: ssa (1 min). Kaikki reaktiot suoritettiin kolminkertaisina.

ZNF93 siRNA määrityksessä

ZNF93 (GenBank: NM_031218) häiriöitä, tunnistavat ZNF93 oligo (5′-CCUCUACCCUUAGUUCACAtt-3 ’) ja antisense ZNF93 oligo ( 5’-UGUGAACUAAGGGUAGAGGag-3 ’) hankittiin Applied Biosystems, ja käytettiin mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Validointi ZNF93 RNAi spesifinen, siGenome SMARTpool Human ZNF93 siRNA: t hankittiin Dharmacon (Chicago, IL) ja seuraavat neljä kohdesekvenssien ja ZNF93 geenin. Kohdesekvenssi 1: 5’-GGACUUAACCAGUGUAGUA-3 ’; kohdesekvenssi 2: 5’-AACCAAUCCUCGACACUUA-3 ’; kohdesekvenssin 3: 5′-GCCCUACGUUUGUGAAGAA-3′ ja kohdesekvenssin 4: 5’-CCUUAUAGAUGUAGAGAAU-3 ’. Transfektioon, solut maljattiin joko 96 kuopan levyille MTT määrityksistä tai maljattiin ruokia RNA. Transfektiot suoritettiin SIPORT ™

NeoFX

™ siRNA transfektioreagensseja (Ambion. Inc, Austin, TX) ohjeiden mukaisesti valmistaja. Äänenvaimennin ™ EGFP siRNA (Ambion) ja siRNA Control reagenssia (Dharmacon) käytettiin positiivisten ja negatiivisten kontrollien kaikissa kokeissa. Sillä ZNF93 esto, lopullinen konsentraatio siRNA oli joko 25 nM tai 100 nM. Media korvattiin RPMI1640 täydennettynä 10% FBS: ää 24 tuntia transfektion jälkeen. Totaali-RNA eristettiin kuluttua 72 tunnin ZNF93 siRNA transfektion reaaliaikaiseen RT-PCR vahvistusta.

pIRESiin

ZNF93 ekspressiovektorin rakentaminen ja transfektio

1907 emäsparin cDNA-fragmentti, joka sisältää koko ORF ihmisen ZNF93 monistettiin RT-PCR: llä RNA-CS-1 /PR solulinja, joka erittäin yli-ilmentää ZNF93. RT-PCR suoritettiin käyttäen sense- ja antisense-alukkeita ihmisen ZNF93: sense-aluke 5′-ATAAGAATGCGGCCCGGAAGCCTAGAAATGGGACCATTG-3 ’käyttöön Notl alleviivattuna, ja antisense-aluke: 5′-GGTGGATCCTCACACTTCTAGGGTTTCT-3’ (GenBank # NM_031218) ja käyttöön BamHI alleviivattuna. Viety restriktioentsyymikohdat suunniteltu transfektion jälkeen tutkimuksia. Clontech n (Palo Atlo, CA) nisäkkään ilmentämisvektoriin pIRESneo käytettiin funktionaalisen ilmentymisen tutkimus. Saatu ZNF93 RT-PCR-tuote kloonattiin pCR®2.1 vektoriin käyttäen Invitrogen Original TA Cloning Kit. Sen jälkeen, kun sekvenssin vahvistus, ZNF93 leikattiin pCR®2.1 vektori, puhdistettu, subkloonattiin MCS ekspressiovektorin pIRESneo, ja sen jälkeen sekvensoitiin oikean ORF. Expression of ZNF93 cDNA oli valvonnassa pCMV. Transfektiot suoritetaan käyttämällä LipofectAmine Plus reagensseja (Invitrogen) seuraavasti: noin 5 x 10

5 CS-1-soluja maljattiin 90 mm: n kudosviljelymaljoihin ja viljeltiin yön yli. Ennen transfektiota, kasvualusta korvattiin seerumivapaalla RPMI 1640 ja viljeltiin kolme tuntia. Lipofektamiinireagenssia sisälsi 5 ug pIRESiin

tyhjä, pIRESiin

ZNF93 yhdistettiin Plus reagenssilla ja soluille. Viljelyn jälkeen neljän tunnin ajan, elatusaine korvattiin RPMI 1640, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia. G418 sulfaatti (Invitrogen) valinta (300 ug /ml) aloitettiin 24 tunnin transfektion jälkeen. Valinta väliaine vaihdettiin joka 2. päivä. Vaikutukset yli-ilmentymisen ZNF93 ET-743 ja PM00104 määritettiin MTT sytotoksisuusanalyysin.

Tulokset

CS-1 /ER, CS-1 /PR solulinjat ovat vastustuskykyisiä useille kemoterapia-aineiden

CS-1 /ER ja CS-1 /PR valittiin emosolulinjassa, CS-1, altistuminen vaiheittain kasvaa ET-743 tai PM00104 pitoisuuksia varten yhden vuoden ajan. Lääke resistenssifenotyyppi havaittiin olevan stabiili 14 kuukauden kuluttua jatkuvan viljelyn huumeiden tai ainakin 6 kuukauden ajan alle lääkkeetön olosuhteissa. Mitään merkittävää eroa CS-1 ja CS-1 /ER tai CS-1 /PR-solujen havaittiin

in vitro

solujen kasvua (samanlainen kaksinkertaistamista aika) ja mikroskooppinen morfologia. MTT sytotoksisuus analyysi osoittaa, että CS-1 /ER, CS-1 /PR ovat 10- 20 kertaa enemmän resistenttejä ET-743 ja PM00104 verrattuna herkkien emosolulinjan. IC

50-arvo on ET-743: n CS-1-soluissa oli 0. 0008 uM verrattuna 0. 01 uM CS-1 /ER-soluja (12,5-kertainen resistenssi). IC

50-arvo PM00104 CS-1-soluissa oli 0. 002 uM verrattuna 0. 04 uM CS-1 /PR-solut (20-kertainen resistenssi). Lisäksi CS-1 /ER ja CS-1 /PR esiintyy vastustuskykyä sisplatiinin ja metotreksaatin muttei doksorubisiinille (Fig. 1).

CS-1 /ER, CS-1 /PR ja CS- 1 solut altistettiin vaihtelevia pitoisuuksia lääkkeiden 6 päivää. Kasvun estäminen määritettiin inkuboimalla tetratsoliumväriaine MTT ja absorbanssimittausta 490 nm: ssä. Tiedot kuvaavat kolme toistoa kutakin pitoisuutta.

suuri määrä geenejä, jotka liittyvät ET-743 ja PM00104 vastus

Human Affymetrix Gene Chip U133 Plus 2.0 matriiseja käytettiin tutkimaan suhteellisen RNA ekspressiotasot välillä CS-1, CS-1 /ER, ja CS-1 /PR. Ilmaisu profiilit näiden kolmen kondrosarkooman solulinjoja arvioitiin Genesifter. Lisäksi olemme toimittaneet microarray data Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) ja nämä array tiedot on määritetty GEO hakunumero kuin GSE16748. Olemme löytäneet useita geenejä, oli merkittävästi erilaiset ekspressiotasot CS-1 /ER ja CS-1 /PR verrattuna CS-1. Keskittyä geenejä vain merkittäviä muutoksia ekspressiotasot tunnistimme geenejä kymmenkertaista tai suurempia muutoksia ekspressiotasoja. Käyttämällä tätä kriteerit, 595 (CS-1 /ER), 498 (CS-1 /PR) geenien näytteille yli kymmenkertaiseksi yli- ilmeneminen ET-743 ja PM00104 kestävä linjat suhteessa niiden ilmentymistä herkkä vanhempien linjat (Fig. 2A). Lisäksi, 856 (CS-1 /ER), 874 (CS-1 /PR) transkriptit olivat yli kymmenkertaisesti vähentynyt resistenttejä solulinjoja verrattuna kontrolleihin (Fig. 2B). Muutokset ekspressiotasot vaihtelivat 10- ja 536- kertaiseksi. Tunnistettujen geenien olivat suureksi osaksi ei-päällekkäistä välillä solulinjojen ja koodattuja proteiineja, joilla on erilaisia ​​biokemiallisia toimintoja. Tunnistettujen geenien koodaavat proteiineja, jotka sitovat DNA on katalyyttinen toiminta, molekyyli anturin toimintaa, sääteli, kuljetus- proteiinien ja molekyylien säätelevät entsyymejä ja monia muita geenejä, joilla on rajallinen luonnehdinta. Top 20 eniten yli-ilmennetään ja ali-ilmentynyt geenejä kussakin resistenttejä solulinjoja on esitetty yhteenvetona taulukossa 1. Oli seitsemän geenien yli-ilmentyy sekä CS-1 /ER ja CS-1 /PR, ja yksi geeni, joka on ali-ilmentynyt molemmissa solulinjoissa. Näissä kahdessa resistenttejä solulinjoja, on enemmän päällekkäin niiden geenin top 20 yli ilmaistuna geenejä lista verrattuna alle ilmaisi geenien lista. Olemme myös huomanneet asteen muutos geenien ilmentyminen oli voimakkaampaa sarjassa alle ilmaisi geenien (taulukko 1).

Genes yli ilmaistuna /alle ilmaistaan ​​useamman kuin yhden solun rivi on ilmoitettu päällekkäisiä alueilla piireissä.

Geenit differentiaalisesti ilmaistut sekä kestävä solulinjoissa

Kuva. 2 Venn-kaavio osoittaa, että 185 geeniä yliekspressoituina 174 geeniä ali-ilmentynyt vuonna sekä CS-1 /ER, ja CS-1 /PR resistenttejä solulinjoja verrattuna CS-1 (Fig. 2A ja Fig. 2B). Top 20 eniten overexpresssed geenejä sekä resistenttejä solulinjoja on koottu taulukkoon 2. 3 ulos top 20 overecpressing geenejä sekä CS-1 /ER, ja CS-1 /PR resistenttejä solulinjoja ovat sinkkisormipolypeptidiin proteiinin geenejä (ZNF93, ZNF43 ja ZNF568), päätimme edelleen vahvistaa näiden geenien reaaliaikaisella RT-PCR.

TaqMan reaaliaikaisen RT-PCR-analyysi erilaisesti ilmaisi geenien

validoimiseksi array data, suoritimme Real-Time RT-PCR kolme geeniä, jotka ilmentyvät differentiaalisesti kahden resistenttejä solulinjoja. ZNF93, ZNF43, ja Thada RNA ilmentyminen mitattiin TaqMan RNA koekittiä. Differential ilmaus ZNF93 ja ZNF43 vahvistettiin sekä CS-1 /ER ja CS-1 /PR resistenttejä solulinjoja (Fig. 3A, Fig. 3B ja Fig. 3C). Thada yliekspressio ei ole vahvistettu kestävä solulinjassa CS-1 /ER (Fig. 3d).

: Vahvistus tontin β-aktiini-geenin.

B

: Vahvistus tontin ZNF93 geeni.

C

: Suhteellinen ekspressiotasot ZNF93 mRNA.

D

: Yhteenveto suhteellinen ekspressiotasot ZNF93, ZNF43 ja Thada mRNA.

ilmentäminen ZNF93 muissa monilääkeresistenssi- solulinjat

ZNF93 geenin yli-ilmennetään molemmissa CS-1 /ER ja CS-1 /PR solulinjat ja toiminta ZNF93 on epäselvä, vaikka proteiini on osallisena solun transkription säätelyyn. Kuten ZNF93 geeniä ei ole aiemmin liitetty lääkeresistenssin ja valittiin jatkotutkimuksiin. Arvioimme lisäksi ekspression ZNF93 muissa monilääkeresistenttiä solulinjat reaaliaikaisella RT-PCR: llä. Tulokset osoittivat, että ZNF93 yli-ilmennetään kaksi ET-743 resistenttejä Ewingin sarkooma-solulinjassa, TC-ET, samoin kuin sisplatiini kestävä munasarjasyövän solulinja, A2780cp, verrattuna niiden ET-743 tai sisplatiinin herkkä kantasolulinjoista, mutta ZNF93 ei yli-ilmennetään paklitakseli resistenttejä solulinjoja SKOV-3

TR ja MCF-7

TR (Fig. 4).

Kaikki reaaliaikaisen RT-PCR tiedot on normalisoitu p aktiini.

vaikutukset eston ZNF93 ilmentymisen siRNA on lääkeherkkyyksiä

Voit selvittää ZNF93 on rooli ET-743 ja PM00104 herkkyys, me esti ilmaisunsa CS -1 /PR-soluihin käyttäen siRNA knockdown. Suhteellinen lääkeherkkyyksiä arvioitiin vertaamalla IC

50-arvot määritettiin MTT siRNA-käsitelty, ei-spesifinen siRNA-käsiteltyjen ja ei-käsiteltyjen ohjaus monilääkeresistenttejä solulinjoja. Ensinnäkin, sytotoksisuus ET-743 ja PM00104 mitattiin 4 päivää transfektion jälkeen resistenttien solujen ZNF93 siRNA oligoilla Applied Biosystems. Havaitsimme, että ZNF93 alassäätöä ei osittain toipua herkkyyttä PM00104 (Fig. 5A) CS-1 /PR solulinjassa. Reaaliaikainen RT-PCR paljasti ZNF93 ilmentyminen oli merkittävästi vähentynyt jälkeen, kun solut on käsitelty siRNA (Fig. 5B). Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin lääkkeille resistentti solulinja CS-1 /ER (tietoja ei esitetty). Lisäksi validointi ZNF93 RNAi spesifinen, siGenome SMARTpool Human ZNF93 siRNA: ita ostettiin Dharmacon neljällä kohdesekvenssien of ZNF93 geenin ja testattiin cisplantin kestävä solulinjassa A2780cp. Ilmaisu ZNF93 siRNA transfektoiduissa A2780cp solujen väheni huomattavasti arvioituna Real-Time RT-PCR (Kuva. 5D). MTT-analyysi osoitti, että IC

50-arvot siRNA käsiteltyjen A2780cp solut olivat alhaisempia verrattuna käsittelemättömään resistenttien linjojen (Fig. 5c), mikä viittaa siihen, että ZNF93 siRNA estää ZNF93 ilmaisun ja osittain palauttaa herkkyys resistenttejä solulinjan sisplatiinin .

: CS-1 /PR transfektoitiin ZNF93 siRNA * (Applied Biosystems) sekä ei-spesifisiä siRNA.

C

: A2780cp transfektoitiin ZNF93 siRNA

† (Dharmacon) sekä ei-spesifinen siRNA. Suhteellinen herkkyys hoidon aloittamista PM00104 tai sisplatiinia määritettiin MTT-analyysi 72 tuntia transfektion jälkeen.

B ja D

: Vahvistus ZNF93 pudotus reaaliaikaisella RT-PCR. Kokonais-RNA eristettiin 72 tuntia transfektion jälkeen ja ZNF93 ilmentyminen analysoitiin reaaliaikaisella RT-PCR: llä.

vaikutukset yliekspressio ZNF93 on ET-743, PM00104 ja sisplatiinin herkkyydet

Analyysimme endogeenisen ZNF93 ilmaisun osoittaneet ZNF93 usein yliaktiivista ET-743, PM00104 ja sisplatiini useita lääkkeille vastustuskykyiset syöpäsolulinjoilla, ZNF93 alassäätöä siRNA voi osittain toipua herkkyyttä ET-743, PM00104 ja cispatin. Nämä tulokset viittaavat siihen, että ZNF93 proteiini voi olla kriittisesti mukana resistenssin kehittymistä näiden lääkkeiden. Edelleen onko ZNF93 suoraan osallistuu perustamisen resistenttien fenotyypin, transfektoimme ET-743 ja PM00104 herkkä solulinja CS-1, jossa on ZNF93 ekspressiovektorilla ja syntyy vakaa solulinjasta yli-ilmentävät ZNF93 (kuvio 6D). Sitten kysytään eksogeeninen yliekspressio ZNF93 riitti antamaan lisääntynyt ET-743 ja PM00104 vastus. Tulokset MTT-määritystä, että transfektoiduissa solulinjoissa on esitetty kuviossa. 6. ZNF93 transfektoitu CS-1-solut ovat suhteellisen resistenttejä ET-743, PM00104 ja sisplatiini, kun taas mitään merkittävää muutosta vastuksessa ei havaittu CS-1-soluissa, jotka oli transfektoitu tyhjällä vektorilla (kuvio 6A-C). Kohonnut ZNF93 ilmentyminen transfektoiduissa soluissa varmistettiin reaaliaikaisen RT-PCR (Kuva. 6D).

,

B

ja

C

: Suhteellinen sytotoksisuuden ET-743, PM00104 ja sisplatiinin CS-1 solulinjat (CS-1 /pIRES

ZNF93) stabiilisti transfektoitu pIRES

ZNF93 ekspressiovektori ja vanhempien (CS-1) ja tyhjän vektorin (CS-1 /pIRES) kontrollit arvioitiin käyttäen MTT-määritystä. Kaikki näytteet analysoitiin kolmena kappaleena.

D

: Vahvistus ZNF93 yli-ilmentymisen pIRESiin

ZNF93 transfektoiduissa CS-1-solujen reaaliaikaisella RT-PCR kuvatulla Materiaalit ja menetelmät.

Keskustelu

tulokset useissa kliinisissä tutkimuksissa osoittavat, että ET-743 on antituumoriaktiivisuus useita syöpätyyppejä, mukaan lukien pehmytkudossarkoomat, rintasyöpä, ja munasarjasyöpä [2], [3]. Potilaat, joilla on kehittynyt munasarja- ja rintasyövän sekä luu- tai pehmytkudossarkoomien tyypillisesti tehdään useita rivejä syövän hoito ennen lopulta sortuminen heidän sairautensa. Monilääkeresistenssiä ajatellaan olevan tärkeä rooli väistämätön epäonnistuminen kasvainten vastata kunkin peräkkäisen rivin kemoterapiaa. Siksi ymmärtäminen malleja ja mekanismeja ristiresistenssiä ja löytää keinoja voittaa se on tärkeä tavoite. Useat tutkimukset ovat tutkineet mekanismeja ET-743 lääkeresistensseihin erilaisia ​​lähestymistapoja. Kuitenkin ristiriitaisia ​​tuloksia on julkaistu eri ryhmistä yrittää korreloida vastustuskyvyn eri ekspressiotasoja RNA: iden ja proteiinien resistenttien solujen [9], [10], [13], [14], [21]. Edelleen resoluutio eroja nämä tulokset voidaan parhaiten helpottaa genominlaajuisia transkription erilaisia ​​analyysi.

Tässä tutkimuksessa me raportoimme perustamisen onnistuminen kahden kondrosarkoomasolun riviä vastustuskykyisiä ET-743 tai PM00104. Sitten kysyttiin, miten geeniekspressiotasot liittyviä eroja lääkeresistenssin näissä kahdessa solulinjassa. Käytimme Affymetrix Gene Chip U133 Plus 2 tutkia genominlaajuisten ilmentymisen RNA-transkriptien. Verrattuna useisiin tutkimuksiin käyttämällä pienempiä geenijärjestelyillä, tämä array peittää koko ihmisen genomin yli 47000 selostukset. Me validoitu geeni array tulokset geenien kanssa merkittävimpiä muutoksia reaaliaikainen RT-PCR. Kuten odotettua, on olemassa suuri määrä transkription muutoksia, jotka liittyvät

in vitro

hankittu resistenssi ET-743 ja PM00104. Itse asiassa noin 5%: sta 10% (jossa raja-arvo on 2-kertainen) selostukset yliekspressoitujen tai alle ilmaistu resistenttejä solulinjoja CS-1 /ER ja CS-1 /PR verrattuna herkkiä vanhempien solu line.

listan top 20 yli ilmentävät geenejä sekä CS-1 /ER ja CS-1 /PR, samat kolme sinkkisormen proteiinin geenejä, ZNF93, ZNF43 ja ZNF568 (taulukko 2) olivat kaikki tunnistettu. Näitä geenejä ei ole aiemmin liittynyt lääkeresistenssin. Reaaliaikainen PCR vahvisti ZNF93 ja ZNF43 ovat jatkuvasti yli ilmaistu näissä resistenttejä solulinjoja (Fig. 3). Alustava arviointi ZNF93 vahvistaa, että sen ilmentyminen liittyy monilääkeresistentti fenotyypin muita solulinjoja.