Krooninen sairaus

tiivistelmä

tasot proteiineja, jotka ohjaavat solusyklin säätelevät ubikitiinistä välittämän hajoamisen kautta ubikitiinipromoottori-proteasomin järjestelmä (UPS) by substraattispesifisten E3 ubikitiinipromoottori ligaasit. Sykliiniriippuvaisen kinaasi-inhibiittorin, p27kip1 (P27), joka estää solusyklin G1, on ubiquitylated E3-ligaasi-SCF-Skp2 /Cks1 hajoamisesta UPS. Puolestaan ​​Skp2 ja Cks1 ovat ubiquitylated mukaan E3-ligaasi monimutkainen APC /Cdh1 hävitettäväksi ylläpitäen runsaita tasoja ydin- p27. Olemme aiemmin osoittaneet, että ikuinen proteasomaalisten hajoaminen p27 on varhainen tapahtuma Tyyppi I kohdun limakalvon syövän synnyn (ECA), estrogeeni (E2) aiheuttama syöpä. Esillä tutkimukset osoittavat, että E2 stimuloi kasvua ECA solulinjojen ja normaali ensisijainen kohdun limakalvon epiteelisolujen (EECS) ja indusoi MAPK-ERK1 /2-riippuvainen fosforylaatio P27 on Thr187, edellytys p27 ubiquitylation ydinmagneettisella SCF-Skp2 /Cks1 ja myöhemmät hajoamista. Lisäksi E2 vähentää E3-ligaasi [APC] Cdh1 lähtevät Skp2 ja Cks1 ehjänä aiheuttaa p27 hajoamista. Lisäksi koputtaa alas Skp2 ehkäisee E2 aiheuttama P27 hajoamista ja kasvun kiihtyminen viittaa siihen, että patogeneesin E2 aiheuttama ECA riippuu Skp2 välittämän hajoamisen p27. Kääntäen, progesteroni (Pg) estäjänä kohdun limakalvon proliferaatiota lisää ydinaseiden P27 ja Cdh1 perusterveydenhuollossa EECS ja ECA soluja. Pg, myös lisää Cdh1 sitoutuminen APC muodostamiseksi aktiivisen E3ligase. Koputtaa alas Cdh1 vältytään Pg aiheuttama vakauttaminen p27 ja kasvun estoon. Erityisesti kumpikaan E2 eikä Pg vaikuttaa transkription Cdh1, Skp2, Cks1 eikä p27. Nämä tutkimukset tarjoavat uusia oivalluksia hormoni solujen jakautumisen kautta UPS. Tiedot syytöksiä että estetään ydinvoiman p27 hajoamista estämällä Skp2 /Cks1 välittämää hajoamista p27 tai lisätä Cdh1 välittävän hajoaminen Skp2-Cks1 ovat mahdollisia strategioita ehkäisyyn ja hoitoon ECA.

Citation: Huang KT, Pavlides SC, Lecanda J, Blank SV, Mittal KR, Gold LI (2012) estrogeeni ja progesteroni Asetus p27kip1 tasot kautta Ubiquitin-Proteasome System: Patogeenisia ja terapeuttinen vaikutukset kohdun limakalvon syöpä. PLoS ONE 7 (9): e46072. doi: 10,1371 /journal.pone.0046072

Editor: Irina Agoulnik, Florida International University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 12 huhtikuu 2012; Hyväksytty: 27 elokuu 2012; Julkaistu: 27 syyskuu 2012

Copyright: © Huang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Institutes of Health, National Cancer Institute, R01 CA 89175 www.nih.gov (LIG); ja New York University (NYU) Cancer Institute Pilottihanke Grant (LIG). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

estrogeenin (E2) stimuloi lisääntymistä kohdun limakalvon ja progesteroni (Pg) vaimentaa E2-indusoituun. Linjassa vaikutuksia näiden hormonien kasvuun, E2 indusoi tyypin I kohtukarsinooma (ECA; korko: 85% kaikista vientiluottolaitosten) ja päinvastoin, Pg käytetään terapeuttisena aineena endometriumhyperplasia, edeltäjä ECA [1]. ECA on yleisin gynekologinen maligniteetti esiintyvyys 136000 maailmanlaajuinen tapausta vuodessa [2]. Vähintään 50% naisista, joilla on kohdun limakalvon epätyypillinen hyperplasia (AEH) on rinnakkainen ECA; lisäksi 30% etenee ECA [3]. Vaihtoehtona kohdunpoisto, progestiineja kääntää AEH ja hyvin erilaistunut ECA johtaa korkea onnistuneiden raskauksien [4], [5]. Molekyylitasolla ymmärtäminen normaalin ja pahanlaatuisen kasvun säätelyssä kohdun limakalvon E2 ja Pg on tärkeää edistää alan määriteltäessä uusia ennaltaehkäiseviä ja terapeuttisia molekyylikohteista tähän tautiin. Olemme aiemmin raportoitu, että sykliiniriippuvaisen kinaasi (Cdk) estäjä, p27kip1 (P27) kriittinen kasvun pysähtymisen, puuttuu rauhaset sekä AEH ja ECA kudosten pikaisen ja ikuinen hajoaminen p27 kautta ubikitiinipromoottori proteasomi järjestelmä (UPS) syytetään menetys p27 esiintyy aikaisin oncogenesis ECA [6]. Linjassa vastakkaisten vaikutusten E2 ja Pg on leviämisen, me osoitti lisäksi, että E2 aiheutti proteasomaalisten hajoamisen p27 perusterveydenhuollossa EECS taas Pg lisääntyi merkittävästi p27 sekä ensimmäisen kohdun limakalvon epiteelisolujen (EECS) ja ECA soluja. Nämä tiedot viittaavat siihen, että p27 on merkittävä molekyylikohteena mukana sekä patogeneesissä ja hoidossa ECA.

Koska tuumorisuppressorina ja jäsenenä CIP /Kip perheen Cdk estäjien, p27 pidätykset soluproliferaation G1 vaiheeseen solusyklin estämällä sykliini /Cdk2- aktiivisuus [7]. Toisin kuin muut tuumorisuppressoreilla ja alipaineensäätöventtiileillä solun syklin p27-geenin

CDKN1B

, on harvoin mutatoitunut ihmisen syövissä vaan p27 tasot ovat erittäin säätelee translaation jälkeisiä modifikaatioita [7]. Pitoisuus, solunosasijaintia, ja fosforylaatiota tiettyjen aminohappojen sisällä p27-molekyylin lopulta säännellä sen vaikutus Cdk2- toimintaa ja siten solujen lisääntymistä. P27 käännös ja proteiini vakaus ovat korkeimmat G0 ja varhaisen G1 kun p27 sitoutuu ja estää sykliini /Cdk2- solusyklin pidätyksen. Koska solusyklin etenee G1, vähitellen pienenee p27 lisätä toiminnan CylcinE ja CyclinA sidottu Cdk2-, jotka aktivoivat geenit osallistuvat etenemisen G1: stä S ja aloittamisen DNA: n replikaation [8]. Pienemmillä pitoisuuksilla, p27 on fosforyloitiin T187 [p-p27 (T187)], jonka sykliini /Cdk2, joka säilyttää p-p27 (T187) tumaan, jossa se on ubiquitylated, joka vaaditaan hajoamista Skp2 /Cks1 SCF

Skp2 E3-ligaasi monimutkainen [7], [9]. Fosforylaatio P27 on T187 vaatii edellisestä tyrosiinifosforylaatiota p27 kolmessa toimipaikassa sen Cdk2- estävä domain, joka voidaan saavuttaa Abi tai Src-ryhmän kinaasien [10]. Fosforylaatio p27 muita aminohappotähteitä eri kinaasien sanelee sen solunosasijaintia [7], [11], [12], [13], [14]. Onko p27 hajoaa tumassa tai erottautuvat sytoplasmassa, solusyklin pysähtymisen ei tapahdu, ellei ole riittävää ydin- p27 estää Cdk2-. Tärkeää on, että ydin, p27 on kasvaimen tukahduttava mutta sytoplasmassa, se on onkogeeninen koska se medicates muuttoliike /etäpesäke [15], [16], [17]. Kuten ECA, puute ydin- p27 on todettu lukuisissa epiteelin pahanlaatuinen kasvain [6], [7], [17], [18], [19] ja molemmat käänteinen suhde tasojen ydinvoiman p27 (pieni) ja Skp2 (korkea) ja varastoimalla p27 sytoplasmassa liittyy pienentynyt selviytymisen [7], [15], [20], [21].

SCF (Skp1-Cul1-Skp2 /Fbox; SCF -Skp2 /Cks1) ja Anaphase edistäminen monimutkainen (APC; APC /Cdh1; APC /Cdc20) ovat monen alayksikön E3 ligaasilla komplekseja UPS, jotka aiheuttavat proteasomaalisten hajoamista sykliini /CDK ja niiden Cdk estäjiä tarkkaa ajoitusta synkronoida ja säädellä etenemisen ja pidättäminen solusyklin syklisellä tavalla [22], [23]. Polyubiquitin konjugointi proteiinin alustojen lysiineihin saavutetaan kolme entsyymiä, joka siirtää /Aktivoi (E1), konjugaatteja (E2) ja ligates (E3) ubikitiini proteiinin selektiivistä tunnustamista ja hajoamista 26S-proteasomin [24]. F-box-proteiini, Skp2, on substraattitunnistus moduuli SCF-Skp2 /Cks1. Skp2 liitännät lisälaitteen proteiini Cks1 muodostaa tasku, joka tunnistaa p-p27 (T187) ja ubiquitylates molekyylin päälle lysiiniä 134, 153, ja 165 [22], [23], [25]; Skp2 ja Cks1 ovat nopeutta rajoittava varten p27 hajoaminen [9]. Loppuvuodesta G1-S, kun taso SCF-Skp2 /Cks1 on korkein, Skp2 ja Cks1 tulla substraattitunnistus tavoitteet APC /Cdh1 E3-ligaasi monimutkainen ubikitiinistä välittämä hajoaminen [26]. Tämä hajoaminen Skp2 ja Cks1 johtaa tumakertymään p27 G1 pidätys [7], [9], [27]. Yhdessä kasvu APC /Cdh1 lisää epäsuorasti ydinaseiden p27 tasot aiheuttamalla hajoamisen Skp2 ja Cks1 ja tämä lasku Skp2 /Cks1 suoraan lisää ydinaseiden tasoja p27. Lisäksi tasot ydin- Skp2 ja p27 ovat käänteisesti verrannollisia kasvun kiihtyminen ja kasvun esto yhteydessä on prooncogenic tai tuumoria tukahduttavan, vastaavasti.

Tämä tutkimukset osoittavat uudella mekanismilla, jolla munasarjan steroidien säätelevät kasvua kohdun limakalvon, joka on manipuloimalla tasojen proteiinien UPS eikä transkription. Tarkemmin, me raportoimme että E2 aiheuttaa MAPK-ERK1 /2-riippuvainen fosforylaatio ydin- P27 on T187 ja vähentää E3-ligaasi APC /Cdh1 jättäen Skp2 /Cks1 ehjänä ubiquitylate ydinvoiman p27 hajoamiselle jolloin proliferaation of EECS ja ECA solulinjoja . Kääntäen, Pg lisää Cdh1 ja sen sitoutumista APC; APC /Cdh1 E3-ligaasi aiheuttaa proteasomaalisten hajoamista Skp2 ja Cks1 jättäen p27 ehjänä kasvun estäminen. Ehdotamme, että p27 on merkittävä molekyyli tavoite hormonin kasvuun valvonta kohdun limakalvon ja jotka estävät p27 hajoaminen joko estämällä Skp2 /Cks1 tai lisäämällä Cdh1 ovat järkeviä lähestymistapoja terapeuttista väliintuloa AEH ja ECA.

Tulokset

estrogeenin ja progesteronin on vastakkaiset vaikutukset soluproliferaatioon ja tasot p27, Skp2, ja Cks1 proteiinit

yhdenmukainen hormonaalisten kasvua sääntelyn vaikutukset endometriumiin, me aikaisemmin osoittaneet, että munasarjahormonit, estrogeenin (E2) ja progesteroni (Pg, läsnä ollessa E2 lisätä Pg reseptoreihin [PR] fysiologisen vasteen, joka jäljittelee kuukautiskierto [6], [28], [29]) oli vastakkainen vaikutus tasot p27 perus EECS siten, että E2 vähentynyt tasot p27 kautta ubikitiinistä välittämän hajoamisen ja kääntäen, Pg indusoi selvästi lisääntynyt p27 tasoilla sekä EECS ja ensisijainen ECA solut [6]. Koska Skp2 ja Cks1 osina SCF

Skp2 E3-ligaasi syy hajoamista p27 [7], [9], [23], ehdotimme, että E2 ja Pg samojen käänteisesti vaikuttaa tasot Skp2 ja Cks1 stimulaatiota ja soluproliferaation inhibointi, vastaavasti. Käyttämällä ECC-1 soluja, jotka ilmentävät sekä ER ja PR, osoitamme, että E2 indusoi annoksesta riippuvan ja ajasta riippuva väheneminen p27 36% ja 33% ruuhka vastaukset 1 ja 10 nM, vastaavasti, ja käänteisesti vaikuttaa Skp2 ja Cks1 tasot jossa on 5,4-kertainen ja 3-kertainen vastaavasti vastehuippu 100 nM E2 (kuvio 1A, B). Väheneminen p27 alkoi jo 2 tuntia, ja se säilyi 24 h, kun taas kasvu Skp2 ja Cks1 tapahtui myöhemmin, korkeimmillaan 24 tuntia. ER negatiivinen KLE solulinjassa ei vastannut E2 vaan ilmaistuna korkea Skp2 ja Cks1 jättämättä juurikaan mitään p27. Päinvastainen vaikutus osoitettiin Pg (plus E2), joka indusoi 2,8-kertaisen kasvun p27 100 nM Pg ja samanaikaisesti 84% ja 75%: n lasku Skp2 ja Cks1, vastaavasti (kuvio 1C). p27 nostetaan asteittain 12-48 h, 3-kertainen kasvu 48 h, joka laantunut 2-kertaiseksi 72 h, kun taas Skp2 ja Cks1 väheni ajan ja oli lähes poissa 24 h (kuvio 1 D). On tärkeää huomata, että altistuminen aikoina blotit vähemmän seuraavan induktion Pg verrattuna E2 koska tasot p27 olivat niin runsaat ja ei ole määrällisesti verrattuna aktiini. Siten tasot p27 nolla aika blotit osoittavat E2 aiheuttama vähenemistä p27 olivat johdonmukaisesti korkeampia ja ne osoittavat Pg aiheuttama nousu olivat alhaisempia. Enemmän kvantitatiivisesti arvioida vaikutuksia E2 ja erikseen, Pg (plus E2) on p27 ja Skp2 vakautta, ECC-1-soluja inkuboitiin sykloheksimidin (CHX) yksinään tai E2: n läsnäollessa tai Pg. Kuten kuviossa 1E, kuluttua 6 h viljelyssä, E2 vähentynyt tasot p27 61% verrattuna 47%: iin CHX yksin tuotti odotetaan vähenevän p27 puoliintumisaika 1,5 h (6,2 h vs. 4,7 h; yhteensä inkubaatioajan = 18 h). Yhdenmukainen nopeampi hajoaminen p27 aiheuttama E2, Skp2 proteiini kohoamiseen 1,3 kertaiseksi tänä ajankohtana. Sen sijaan, Pg vakiintui p27 kuin taso p27-proteiinin määrä kasvoi 1,5-kertaiseksi 6 h kun Skp2 proteiinin tasot laskivat 45% verrattuna 24%: iin CHX yksin tuotti ja odotetaan vähenevän Skp2 puoliintumisaika 6,2 h (12,9 h vs. 6,7 h yhteensä inkubaatioaika = 48 h).

tiedot ovat materiaalit ja menetelmät ja jokainen kuva. A, E2 annos-vaste: ECC-1 ja KLE soluja käsiteltiin E2 ja p27, Skp2, ja Cks1 proteiinin tasot määritettiin immunoblottauksella. B, E2 ajan funktiona: ECC-1-soluja käsiteltiin E2 annettu aika ja proteiinin tasot määritettiin kuten edellä. C, Pg annos-vaste: ECC-1 soluja käsiteltiin Pg /E2 ja p27, Skp2 ja Cks1 proteiinin tasot määritettiin kuten edellä. D, Pg ajankulku: ECC-1 soluja käsiteltiin PG /E2 varten näytetyt ajat ja proteiinin tasot yllä. Densitomet- skannaa kaikista proteiinin bändit ovat osoittaneet kuvaajia oikealle kunkin blot. Jokainen bändi oli normalisoitiin aktiini ja verrattiin 0 aikaa tai käsittelemätön kontrolli. Tiedot ilmaistaan ​​suhteellinen intensiteetti kunkin kaistan ± keskihajonta. E, E2 /Pg sykloheksimidiä (CHX) käsittely: ECC-1-soluja käsiteltiin E2: ssa 18 tuntia, tai E2: n ja s: ssa 48 tuntia. CHX lisättiin 6 tuntia ennen lopullista satoa. Solut kerättiin 0,1,2, ja 6 tunnin ajankohtina. CHX yksin oli peruskontrolli-. Lysaatit valmistettiin ja immunoblotattiin varten p27 ja Skp2 ja tasot kunkin proteiinin kaistan määritettiin densitometrillä (bändi intensiteetti). Prosentuaalinen muutos kussakin hoidon parametrin laskettiin nolla ajankohtana kullekin ryhmälle. Proteiini vaihtuvuuden määritettiin vertaamalla käsiteltyjen solujen CHX yksin verrattuna CHX läsnäollessa kunkin hormonin jokaisena ajankohtana. Viiva kuvaajat vastaavan suhteellisen hyvin kummankin kaistan normalisoida aktiini kullekin ryhmälle. F, G: E2 stimuloi ja Pg estää leviämisen: ECC-1-soluja käsiteltiin E2 tai PG /E2 ja soluproliferaation määritettiin MTS-määrityksellä (materiaalit ja menetelmät) * p 0,05. H, Cell cycle jakelu: ECC-1-soluja käsiteltiin E2 tai E2 /Pg ja solusyklin analyysi suoritettiin kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät.

Yhdenmukainen huippu E2-pitoisuuksilla ja Pg vaikutuksia p27 , Skp2, ja Cks1, E2 indusoi soluproliferaatiota ruuhka vasteet 26-20% yli käsittelemättömiin kontrolleihin 0,1 nM ja 1 nM (kuvio 1 F) vastaavasti, kun taas Pg estivät leviämisen vastehuippu 27%, jossa on 100 nM (kuvio 1G). Sen jälkeen solusyklin analyysi, me vahvisti, että hormonit vaikuttavat solujen lisääntymistä, mikä heijastuu niiden vaikutuksia solukierron jakelu (kuvio 1 H). 18 tunnin kuluttua hoidon E2 määrä ECC-1 soluja G1 laski 58%: sta 49% ja lisääntyi G2 ja S 14%: 15% ja 29% ja 36%, vastaavasti. Sen jälkeen kun Pg käsittely 48 h, osa solujen G1 nousi 58%: sta 67% ja laski G2 ja S 13%: sta 10% ja 27%: sta 23%: iin.

Estrogeeni indusoi ERK -riippuvaisella fosforylaatio p27 on Thr187

fosforylaatio p27 at T187 sisältä konformaatio sen ubiquitylation SCF-Skp2 /Cks1 [22]. Kuvio 2A osoittaa, että E2 indusoi 2,5-kertaisen ja 2,3-kertainen nousu fosforylaation p27 on T187 (p-p27 [T187]) 1 nM ja 10 nM E2 vastaavasti ECC-1-soluja (ja HEC-1B-solut; Kuva S1A), jossa on 11-kertainen huippuvaste p-p27 (T187) 18 h käsittelyn jälkeen (kuvio 2B), joka oli MAPK-riippuvaista (kuvio S1B). Kuten kuvassa, tämä on sama huippu annos ja aika vaste joissa p27 hajotetaan E2 (sopusoinnussa kuviot 1A ja 1C) ECC-1-soluissa. Alustavissa kokeissa kumpikaan proteasomin estäjä, laktakystiiniä ja seriini /fosfataasinestäjällä, okadahappo oli välttämätöntä säilyttää p27 on erittäin p-p27 (T187) tila viittaa siihen, että korko proteasomaalisten hajoamisen p-p27 (T187) on hitaampaa kuin fosforylaatiota T187. Me osoittavat lisäksi, että ERK aktivoituu E2 alavirtaan MEK1 (estetty U0126) (kuvio 2C). Näiden tietojen, voimme päätellä, että E2-indusoitua fosforylaatiota p27 on T187 ovat MAPK /ERK-riippuvaisen ja ER-vasteita. Lopuksi, siRNA knock-down ERK1 ja erikseen, ERK2 (82%, 70% hyötysuhde, vastaavasti) väheni p-p27 (T187) käsittelemättömän knockdown solujen vertailuryhmän siRNA (kuvio 2D). Kuten esitetään sekä transfektoimattomissa ja ohjata siRNA transfektoituja soluja, näyttää siltä, ​​että ERK2 on enemmän ilmentyy voimakkaasti kuin ERK1 (huom: saattaa johtua suuremman spesifisyyden vasta-aineen ERK2 kuin ERK1). Täplää osoittaa kaatamalla ERK2 vähensi fosforylaatiota p27 suuremmassa määrin kuin nakutuksen alas ERK1 (vertaa tasot p-p27 (T187) in ERK1 ja ERK2 knock-down hallita siRNA). Koska knock-alas tehokkuus ja suurempi ilmaus ERK näiden solujen kanssa ja ilman E2-induktio, on vaikea määrittää panos ERK1 ja ERK2 E2 aiheuttama MAPK perustuva fosforylaatio p27 klo T187. Kuitenkin näyttää siltä, ​​että E2 aktivoi sekä ERK1 ja ERK2 varten fosforylaatioon p27 on T187 tunnustamista SCF-Skp2 /Cks1 (Kuva 2D ja kuvio S1B).

A, E2 annos-vaste: EEC-1 käsiteltiin E2 ja immunoblot-analyysi suoritettiin käyttäen kaniinin anti-ihmis-fosfo-p27 (p-p27 [T187]), kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. B, E2 ajan funktiona: ECC-1-soluja käsiteltiin E2: n ja proteiinin tasot määritettiin immunoblottauksella, kuten A. C, E2, fosfo-ERK: ECC-1-soluja käsiteltiin E2: n läsnä ollessa U0126 tai ICI ja solulysaateista immunoblot p-p27 (T187), fosfori ERK (p-ERK), ja yhteensä ERK, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. D, E2, analyysi ERK1 ja ERK2 aktivoinnin jälkeen, kun ne knock-down siRNA: ECC-1-solut transfektoitiin ERK1, ERK2, tai ohjata siRNA, käsiteltiin E2: n läsnä tai poissa ollessa ICI, minkä jälkeen solufraktioinnin, ja immunoblottaus täydellistä ja fosfo-ERK-1 (p-ERK1) ja ERK2 (p-ERK2), kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät.

kaatamalla Skp2 lisääntynyt ydin- ja sytoplasman p27 ja tukossa estrogeeni aiheuttama hajoaminen p27 [SCF-Skp2 /Cks1] sekä solun osiin

osoittavat selvästi, että kun Skp2 ja Cks1 arvo nousee, p27 tasojen lasku liittyy kasvun kiihtyminen vastauksena E2 (kuviot 1A, B, E). Kuten kuviossa 3A, kaatamalla Skp2 (SKP2 siRNA; 80%: n hyötysuhde) aiheutti 8,2-kertaiseen kasvuun p27. Hajoaminen p27 by Skp2 on raportoitu esiintyvän tumaan [9], [30]. Kuitenkin olemme huomanneet, että E2 indusoi 2,5-kertaiseksi ja 1,9-kertaiseksi kasvu Skp2 tumassa ja sytoplasminen jakeet, vastaavasti, ja 50%: n lasku p27 sekä fraktioissa (kuvio 3B, vasen paneeli). Tärkeää on, me osoitamme, että seuraavat knockdovvn Skp2, E2 aiheuttama p27 hajoaminen on estetty sytoplasmassa ja tumassa (kuvio 3B, oikea paneeli ja kuvio S2), että solujen lisääntymisen stimuloituminen E2 on kokonaan vältetty (kuvio 3C), ja että E2 aiheuttama lasku P27 oli ER- ja proteasomin riippuvaista sekä subsellulaarisia jakeet (kuvio 3B, vasen paneeli). Todennäköistä, lasku kasvun seuraavissa Skp2 Knockdown johtuu kasvusta tasojen p27 (kuten kuviossa 3B, oikea paneeli). Näissä kokeissa sotkea Skp2 SCF-Skp2 /Cks1 suorana välittäjänä E2-indusoimaa hajoamista p27.

A, B, E2, Skp2 pudotus: ECC-1-soluja transfektoitiin ohimenevästi Skp2 tai kontrolli-siRNA , käsiteltiin E2 yksin tai, kun läsnä on 1 uM laktakystiini (Lac) tai 10 nM ICI, suoritettiin solujen fraktiointi, P27 ja Skp2 tasot määritettiin immunoblottauksella, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Paneelissa A, knock-down tehokkuutta määritettiin vertaamalla solulysaatteja Skp2 siRNA ja ohjaus siRNA käsitellyissä soluissa immunoblottauksella. Suhteelliset p27 tasot edustaa densitometrinen skannaus alapuolella blot. E2, solujen lisääntymistä Skp2 pudotus solut: ECC-1-solut, jotka on transfektoitu Skp2 tai valvoa siRNA, käsiteltiin E2 ei käsitellä ja proliferaatiota määritettiin MTS-määrityksellä, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Tiedot esitetään keskiarvona kahdesta toisistaan ​​riippumattomasta kokeesta. * P≤0.05.

estrogeenin ja progesteronin on vastakkainen vaikutus Cdh1 proteiinin tasot lopulta säädellä tasoa ydin- p27-proteiinin; Pg ja E2 eivät vaikuta mRNA tasoilla Cdh1, Skp2, Cks1 tai p27

ubiquitylation ja hajoamista Skp2 ja Cks1 E3-ligaasi-APC /Cdh1 estäisi hajoamista p27. Siksi me arveltu, että [APC] Cdh1 tasot vaihtelisi suoraan p27 ja siksi säänneltävä vastakkaisen tavalla E2 ja Pg. Tämän mukaisesti hypoteesin, kun taas E2 hoito ECC-1-soluissa ajan riippuvaa laskua Cdh1 ja maksimaalinen vaikutus on 56% 18 h (kuvio 4A), s-hoito lisäsi Cdh1 ajan vastehuippu 1,7-kertainen 48 h (kuvio 4B). Sen sijaan ei ole E2 tai Pg vaikuttaa transkription Cdh1, p27, Skp2 tai Cks1 varhaisessa ajanhetkillä 24 h (kuvio 4C), ja 12 h (kuvio 4D), vastaavasti, kun taas mRNA: n vaste yhteisen sisältävien geenien transkription reagoivat elementit ER ja PR, nimittäin, PR ja glycodelin vastaavasti on korkea (kuvio 4D).

A, B, aikakäyrä E2 ja Pg [plus E2] hoidossa ETY-1-soluissa. ECC-1-soluja käsiteltiin E2 ja Pg plus E2, kokeet lopetettiin aikoina osoitettu, lysaatit valmistettiin, ja Cdh1 proteiinin tasot määritettiin immunoblottauksella, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. C, D, E2, Pg, mRNA-tasot p27, Skp2, Cks1 ja Cdh1: ECC-1-soluja käsiteltiin E2 tai PG /E2, kokonais-RNA aikoina on esitetty, ja kvantitatiivisen tosiaikaisen RT-PCR suoritettiin, kaikki materiaalit ja menetelmät. PR ja glycodelin alukkeita käytettiin kontrolleina ER ja PR kohdegeeneistä, vastaavasti. Tiedot esitetään keskiarvona kahden itsenäisen kokeen.

jälkeen E2- hoitoon ECC-1-soluissa ja sen jälkeen subsellulaarifraktiointikokeet, 21%: n lasku Cdh1 on esitetty ydin- osa. Tämä lasku tason Cdh1 purettiin laktakystiiniä (kuvio 5A) viittaa siihen, että E2 säätelee tasoa Cdh1 mukaan proteasomaalisten hajoamista. Mielenkiintoista on, että taso Skp2 pieneni 18% E2 hoidon läsnä ollessa laktakystiini sekä tumassa ja sytoplasmassa ja, jonka laktakystiini yksin, on esitetty tässä kokosoluliuotteissa (37%, insertti kuvio 5A). Tämä tulos on vaikea selittää ja vaikka laktakystiiniä käytetään laajalti estämään proteasomin hajoamista, saattaa olla off-tavoite vaikutuksia, kuten proteolyysin Skp2 eri hajoamisreitit.

A, E2; B, Pg, Cell fraktiointi ja analysointi Cdh1, Skp2, Cks1, P27 proteiinit ja p-p27 (T187): Solut olivat joko käsittelemättömiä, käsiteltiin E2, E2 plus Lac tai käsitelty PG /E2 kanssa tai ilman 1 uM laktakystiiniä ( Lac) tai RU486. Solut fraktioitiin ja proteiinit analysoitiin immunoblottauksella, kaikki kuvattu Materiaalit ja menetelmät.

upotettavat A

osoittaa, että laktakystiiniä vähenee Skp2 proteiinin tasoja. C., s, Cdh1 sitoutuminen APC: Soluja käsiteltiin Pg /E2, solulysaatit immunosaostettiin anti-Cdh1 sen jälkeen immunoblottauksella anti-Cdc27, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. D, kaavio kuvaa APC /Cdh1 ylävirran E3-ligaasi, että ubiquitylates Skp2 /Cks1 (SCF kompleksi), joka on alavirtaan E3-ligaasi, että ubiquitylates p27 säädellä p27-proteiinin tasoja.

On huomattava, että toisin kuin Skp2, Cks1, ja p27, Cdh1 ei ole läsnä solulimassa. Samanaikainen väheneminen p27 havaittiin sekä ydin- ja sytoplasman jakeet 30% ja 61%, vastaavasti, verrattuna käsittelemättömiin kontrolleihin (pohjapinta p27 oli suurempi tumassa kuin sytoplasmassa käsittelemättömien solujen). Yhdenmukainen ydinvoiman väheneminen p27, p-P27 (T187) lisättiin tunnistamista ja ubiquitylation p27 by Skp2 /Cks1 sen hajoamista. Lisäksi laktakystiiniä esti p27 hajoamista sekä tumassa ja sytoplasmassa lisääntynyt p-p27 (T187) 2,4-kertaiseksi vain tumafraktios- vahvistetaan, että p27 on fosforyloitu T187 tumassa ja lisäksi pysyy ja kerääntyy tumaan, kun sen hajoaminen estyy laktakystiiniä (sama kuin kuvio 3B, vasen paneeli). Ennakoidun käänteinen suhde P27 ja Skp2 tasoja näytettiin seuraavat E2-kohtelu sekä ydin- ja sytoplasman jakeet. Kääntäen, Pg hoito ECC-1-soluissa indusoi 1,65-kertainen sekä Cdh1 ja p27 tumassa, kun taas tämän hormonin laski Skp2 66% sytoplasmassa ja molemmat Skp2 ja Cks1 62% vuonna tumafraktios-; nämä vasteet olivat PR-spesifinen (kuvio 5B). Toisin E2 käsittely, jossa p27 hajoaminen tapahtui molemmissa solun osiin, p27 pitkälti vakiintui tumassa PG (1,7 vs. 1,1-kertainen). On mahdollista, että Skp2 ja Cks1 hajosivat kautta UPS koska laktakystiini lisääntynyt Skp2 ja Cks1 tumassa ja Cks1 sytoplasmassa samoin. Kun taas me osoitamme Cdh1 tasoja korotetaan Pg, tämä proteiini on sitoutunut APC kompleksi [on hypophosphorylated tilassa] käyttämään sen erityisen E3 ligaasiaktiivisuus [31], [32], [33]. Kuten kuviossa 5C esitetään, s todellakin lisännyt sitoutumisen Cdh1 APC näennäisesti kasvattaa E3-ligaasi-aktiivisuutta Skp2 ja Cks1 ja siten niiden proteasomaalisten hajoamista. Yhdessä kuvassa 5D, meidän tulokset osoittavat Cdh1 ylävirran säätelijänä tasojen p27 kautta UPS (eli SCF-Skp2 /Cks1) ja kriittinen linkki toteuttavan hormonaalisen säätelyn kasvun.

kaatamalla Cdh1 lohkot Pg välittämää kertymistä ydin- P27 ja kasvun estäminen

Kuva 6A havainnollistaa, että kaatamalla Cdh1 (

fzr

geeni; 87%: n hyötysuhde) esti täydellisesti Pg aiheuttaman 1.6- kertainen ydin- p27 (kuvio 6B, oikea paneelit) ja 30% kasvua estävä vaikutus (kuvio 6C). Lisäksi proliferaatio osittain estetty käsittelemättömän ja Pg-käsiteltyjen Cdh1 siRNA transfektoiduista soluista. Kun taas Pg vähensi ydin- Skp2 ja Cks1 (kuviot 5B, 6B), puute Cdh1 E3 ligaasin aktiivisuutta knock-down-solut, odotetusti lisää pohjapinta tasoa ydin- Skp2 ja Cks1 (kuvio 6B, oikea paneeli). Lisäksi, s-hoito laski sytoplasmista Skp2 sekä ohjaus siRNA ja Cdh1 siRNA 51% ja 45%, vastaavasti (kuvio 6B, vasen paneeli). Nämä tiedot tukevat vahvasti mekanismi, joka PR-välitteisen Pg toiminta kasvattaa ydinvoiman p27 varten lisäkasvun estäminen nostamalla Cdh1 tumassa, mikä puolestaan ​​heikentää Cks1 ja Skp2, mistä on osoituksena niiden kasvu läsnäollessa laktakystiiniä ja Pg [ ,,,0],plus E2] (kuvio 5B).

A, s, Cdh1 pudotus: ECC-1-soluja transfektoitiin ohimenevästi Cdh1 siRNA seurasi sytoplasmisen /ydin- erottaminen, ja pudotus tehokkuus määritettiin kussakin fraktiossa vertaamalla ohjaus siRNA ja Cdh1 siRNA transfektoitu solulysaateista. B, Pg, Cdh1 knock-down ja subsellulaarifraktiointikokeet: transfektoituja soluja käsiteltiin PG /E2 tai ilman RU486, altistetaan solu fraktiointi, ja immunoblot-analyysi suoritettiin knock-alas ja ohjata siRNA solujen proteiinien osoitettu; kaikki kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Densitometristä skannaukset (suhteellinen voimakkuus) kunkin proteiinin edustava vyöhyke vastetasot suhteessa aktiini ja verrattiin käsittelemättömiin kontrolleihin on esitetty kaaviossa. C, Pg, soluproliferaatiota Cdh1 pudotus solut: solut, jotka on transfektoitu Cdh1 tai ohjaus siRNA käsiteltiin Pg /E2 tai ei käsitelty ja lisääntymistä analysoitiin MTS-määritys, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät; * P 0,05.

estrogeenin ja progesteronin on vastakkainen vaikutus p27 ja proteiinit ubikitiinistä proteasomin järjestelmän ensisijainen endometriumin epiteelisoluissa

EECS päässä kohdun kudoksesta saatiin samanlaiset vasteet p27 , Cdh1, Skp2 ja Cks1 kuten esitetty ECC-1 solulinja hoidon jälkeen E2 ja Pg. Erityisesti, E2 kautta ER laski p27 88% (kuvio 6A) ja Cdh1 71% ja nousi Skp2 ja Cks1 1,2 ja 2,3-kertaiseksi. Sen sijaan, Pg-potilaiden primaarisesti EECS lisääntynyt p27 ja Cdh1 2,7-kertaiseksi ja 1,8-kertaiseksi, kun taas Skp2 ja Cks1 molemmat laski 69% (kuvio 7B). Primaarisen solujen E2 stimuloi kasvua 18% ja 15% kun taas Pg (plus E2) esti kasvua 33% ja 29%, joka oli lähes läpipääsemätön RU486 (kuvio 7C ja 7D) sekä potilaiden. Nuclear-sytoplasminen jakotislaamalla EECS yhden normaalin kohdun limakalvon kudos osoitti, että Cdh1 oli läsnä vain tumassa, ja että E2 laski Cdh1 41%, pieneni p27 pääasiassa tumassa (50%), lisääntynyt Skp2 molemmissa fraktioissa, mutta enimmäkseen nucleus (1,3-kertainen), ja lisääntynyt Cks1 molemmissa fraktioissa mutta enemmän sytoplasmassa (1,5-kertainen, kuvio 7E). Suorana vastakohtana Pg pääasiassa lisääntynyt ydinvoiman p27 2,6-kertaiseksi ja ydinvoiman Cdh1 1,3-kertaisesti kun taas Skp2 väheni tumassa ja sytoplasmassa 41%, ja 89%: lla. Pg vähennetään Cks1 50% tumassa ja vähemmän sytoplasmassa. Mielenkiintoista, kun taas Cdh1 ei löytynyt sytoplasmassa ECC-1-solulinjassa ja ensisijainen normaali EECS (n = 3), Cdh1 havaittiin sytoplasmaan ensisijaisen ECA soluissa (n = 3, laadut II, III, kuvio 7F) , joka väheni 44% tällä solunosafraktio kun se nostettiin tumassa 44%, seuraavat s hoitoa. Sama kaava on esitetty p27, joka oli läsnä sytoplasmassa ja lisääntynyt tumassa 1,4-kertaiseksi vasteena Pg. Johdonmukainen vastaukset E2 ja Pg havaittu keskuudessa tavalliset neljä ensisijaista EECS paitsi sotkea että johdonmukaisuus voidaan saavuttaa huolimatta potilas heterogeenisuus, mutta osoittavat hormonivasteisiin havaitsimme, että kuolemattomia solulinjoja ovat todennäköisesti fysiologisia.

A, E2; B, Pg hoitoon ensisijainen EECS: normaali EECS alkaen proliferatiivinen vaihe hoidettiin joko E2 ilman tai ICI tai käsitelty PG /E2 tai ilman RU486, solulysaateista valmis ja immunoblotattu proteiinin tasot on esitetty, kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät. A ja B ovat erilaisia ​​potilaita näyttää erilaisia ​​pohjapinta tasoilla p27 ja Cdh1. C, D: E2, E2 plus Pg hoito, solujen lisääntymistä (MTS-määritys): rinnan kokeilu potilas # 2, kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät; * P 0,05. E, E2, s hoito, subsellulaarifraktiointikokeet: Ensisijainen EECS alkaen proliferatiivinen vaihe käsiteltiin E2 tai PG /E2, suoritettiin subsellulaarinen fraktiointi, ja immunoblot-analyysi proteiinin tasot on esitetty, ja suoritetaan, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät.