Krooninen sairaus

tiivistelmä

kasvain microenvironement on tärkeä toimija munasarjasyövän etenemisen mutta suhteiden mesenkyymisolujen ja munasarjasyöpäsoluja jää epäselväksi. Tavoitteena Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli määrittää munasarjasyöpäsoluja ’biologisia muutoksia aiheuttama mesenkyymisolujen. Tämän kysymyksen, käytimme kahta eri munasarjasyövän solulinjoissa (NIH: OVCAR3 ja SKOV3) ja yhteistyö viljeltiin niitä mesenkyymisolujen. Samanakaiseen kulttuurin eri solupopulaatioiden lajiteltiin tutkia niiden transcriptome ja biologisia ominaisuuksia. Transcriptomic analyysi paljasti kolme biologinen-toiminto geeniryppäät rikastettiin kosketuksessa mesenkyymisolujen. Nämä korotukseen liittyvistä metastaattisen kykyjä (tarttuvuus, muuttoliike ja invaasio), lisääntymistä ja chemoresistance

in vitro

. Siksi kosketusta mesenkyymisolun kapealla voisi lisätä metastaattisen aloittamisen ja laajentamisen kautta muuttaminen syöpäsoluja. Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että reittejä mukana hetero-solujen vuorovaikutuksia voidaan kohdistaa häiritä hankittu pro-metastasoitunut profiilin.

Citation: Lis R, Touboul C, Raynaud CM, Malek JA, Suhre K, Mirshahi M , et ai. (2012) mesenkyymisolun Vuorovaikutus munasarjasyöpäsoluja Triggers Pro-Metastasoitunut Properties. PLoS ONE 7 (5): e38340. doi: 10,1371 /journal.pone.0038340

Editor: Eric Deutsch, Institut Gustave Roussy, Ranska

vastaanotettu: 09 helmikuu 2012; Hyväksytty: 4. toukokuuta 2012 Julkaistu: 30 toukokuu 2012

Copyright: © 2012 Lis et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä julkaisu oli mahdollista avustusta Qatar National Research Fund sen National painopisteet Research Program palkinto numero NPRP 09-1174-3-291 ja NPRP 4-640-1-096. Sen sisältö ovat yksin vastuussa kirjoittajien eivätkä välttämättä edusta näkemykset Qatarin National Research Fund. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Useimmat munasarjasyöpäpotilaalle yleensä kuolee vatsakalvon tautiin [1]. Kehittäminen vatsakalvon carcinomatosis liittyy määritelty kriittinen toimenpiteet, mukaan lukien solujen irtoaminen, vuorovaikutus ja tarttuvuus mesothelial kerros, ja leviämisen osaksi sub-mesothelium [2]. Useat raportit kuvaavat pre-metastaattinen kapealla kohde-elimeen, mikä helpottaa ensimmäisen eloonjäämisen kasvainsolujen [3], [4], [5].

Mesenkymaaliset solut (MC: t) ovat pluripotentteja soluja, jotka aiheuttavat erilaisia ​​sidekudoksen solutyyppien [6]. Luuytimestä peräisin mesenkymaaliset kantasolut (BM-MSC) rekrytoidaan huomattava määrä kasvaimen sivustot, joissa ne edistävät invaasio, etäpesäkkeitä, ja kestävyys kemoterapia munasarjasyövän solulinjoissa [7], [8], [9], [ ,,,0],10], [11]. MSC on osoitettu edistää munasarjasyöpään tuumorigeenisyystesti kautta muuttunut tuotanto Luun morfogeneettisen proteiinin (BMP2) mikä voimistaa munasarjasyöpäsolujen (OCC) leviämisen

in vitro

ja

in vivo

[ ,,,0],12]. Vaikka monet tutkimukset keskittyvät tiettyihin tekijöihin hankinnassa metastaattisen profiilin, vain harvat tutkimukset arvioidaan maailmanlaajuisen transcriptomic tapahtuvat muutokset syöpäsoluja heidän vuorovaikutusta mesenkymaaliset kantasolut (MSC) [13]. Zhang S et al.

13 raportoitu muuttaminen eturauhasen syöpäsolun transcriptome aiheuttama vuorovaikutus MC. Muutokset määritteli uuden pro-metastaattisessa. Ymmärtäminen reittejä vaikutti vuorovaikutusta syöpäsolujen ja niiden mikroympäristön sekä aiheuttama maailmanlaajuinen muutokset on pakollista voidakseen kohdistaa mikroympäristölle tiettyjä reittejä [13].

Täällä tutkimme yhdessä viljelemisen kahden eri tyyppisiä OCC linjat MC. Osoitamme, että tämä vuorovaikutus lisää metastaattisen kyvyt OCC. Käyttämällä transcriptomic analyysi ja toiminnallisia määrityksiä; osoitamme, että geenit liittyvät solujen kiinnittyminen, invaasio, muuttoliike, leviämisen ja chemoresistance muutetaan kun OCC /MC kontakti solulinjassa erityisellä tavalla. Tuloksemme viittaavat siihen, että tiettyjä reittejä voidaan kohdistaa häiritä hankittu pro-metastasoitunut profiilin.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

Munasarjasyöpä solulinjoissa SKOV3 (HTB-77 ) ja OVCAR3 (HTB-161) ostettiin ATCC ja ylläpitää viljelmässä seuraavat ATCC suositusten (DMEM korkea glukoosi [Hyclone, Thermo Scientific], 10% FBS [Hyclone, Thermo Scientific], 1% penisilliini-streptomysiini-Amphotericyn B ratkaisu [ ,,,0],Sigma], 1X Non Essential amino-Acid [Hyclone, Thermo Scientific]). Munasarjasyöpä solulinjat stabiilisti transduktio lentivirusvektoreilla, jotka koodaavat eGFP (Genethon, Evry). Mesenkyymisolujen hankittiin Stem Cells, Inc. (MSC-001F, Vancouver, CA) ylläpidetään ja lisätään viljelmässä käyttäen MesenCult® MSC Basal Medium täydennettynä mesenkymaalisten kantasolujen Elvyttävään ravintolisät (Kantasolujen Inc, Vancouver, CA). Niiden kyky erilaistua rasvasolut, osteoblastien ja chnodrocytes varmistettiin kohti toimittajan ohjeiden (tuloksia ei ole esitetty).

Co-Cultures

perustettu yhteistyössä viljelmistä eGFP-OCC kanssa BM- MC on suhde 1:02 24 tuntia. OCC erottuivat BM-MC perustuu niiden eGFP ja Ep-Cam. Eri solupopulaatioita lajiteltiin käyttäen Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS).

fluoresoiva solulajittelulla

Solut kerättiin ja blokattiin PBS-5% FBS-1% BSA-10% FcR estoreagenssia (Myltenyi Biotec). Single-solususpensiota analysoitiin ja lajitella Sorp FACSAria2 (BD Biosciences). Tiedot käsiteltiin kanssa FACSDiva 6.3 (BD ​​Biosciences). Doublets suljettiin pois FSC-W × FSC-H ja SSC-W x SSC-H analyysi, yksi värjätty kanavia käytettiin korvauksia, ja fluorofori miinus yksi (FMO) tarkastukset käytettiin gating. eGFP fluoresenssi mitattiin 488 nm sinistä laseria ja 510/50 nm emissio, 50 000 tapahtumaa hankittiin näytettä kohti. Kaavioita näyttää mediaani fluoresenssin intensiteetti (MFI) kontrolliin verrattuna. Aikana solu-lajittelu puhtaus vaiheen naamio on sovellettu. OCC monokulttuureja käsiteltiin ja lajitellaan kontrolleina.

geeniekspressioanalyysissä

Kun solulaji mRNA eristettiin käyttämällä Trizol reagenssia seurasi puhdistus käyttämällä RNAeasy Extraction Kit Qiagen. 200 ng kokonais-RNA analysoitiin Affymetrix GeneChip- Human Genome U133 Plus 2.0 Array. Aineisto analysoitiin Partek ohjelmistoa (St Louis, MO). Luokan vertailu eri olosuhteissa (kolme biologinen toistoa) suoritettiin tunnistamiseksi geeniekspression muutoksia merkittäviä ilme eroja ja kaksijakoinen lisääntynyt tai vähentynyt ilmentyminen [14], [15], [16]. Pääkomponenttianalyysi (PCA) suoritettiin käyttäen Partek standardin asetukset. Tilastolliset vertailut microarray tiedot laskettiin kaksisuuntaisella Studentin t-testiä. Benjamini-Hochberg korjausta käytettiin rajoittaa positiivisen vääriä löytö korko 5%. Tilastolliset vertailut kategorisen datan saavutettiin käyttämällä Chi-neliö testi. Korrelaatiot suoritettiin käyttäen Pearsonin korrelaatiota. Kaikki muut tilastolliset vertailut laskettiin käyttäen kaksisuuntainen t-testi.

Ingenuity Pathway Analysis

Käytimme Ingenuity Pathway Analyysiohjelmisto (IPA) (Ingenuity Systems, Redwood City, CA) verkkoanalyysissa geenien, jotka säädellään eri tavalla samanakaiseen kulttuuri. Me määritelty globaali geeni luettelot edustavat IPA avainsanat: ”etäpesäke”, ”proliferaatio solulinjat” ja ”Cell kuoleman kasvainsolulinjaa”. Kaikki reunat tukevat ainakin yhden viite kirjallisuudesta, oppikirja tai kanoninen tallennettuja tietoja Ingenuity Pathways tietoa tietokannasta.

P

arvot rikastamiseen biologisista toiminnoista kertyi perustuu hypergeometrisen jakelua ja lasketaan oikea-pyrstö Fisherin 2 × 2 virhematriiseja toteutettuna kekseliäisyyttä.

Liittyminen määritys

96 hyvin levyjä päällystettiin matrigeelin (BD-Biosciences). 20 000 OCC-eGFP ympättiin per kuoppa ja inkuboitiin 5% CO 2-inkubaattorissa 37 ° C: ssa 15, 30 ja 60 minuuttia. Tarttumattomat solut pestiin pois. Kiinnittyneet solut kvantitoitiin käyttäen fluoresenssilevylukijaa (Wallac, Perkin Elmer) (488 nm eksitaatio, 510 emissio). Kaikki toiminnalliset kokeet suoritettiin biologisen kolmena rinnakkaisena.

Migration /Invasion määritykset

8 um huokosia siirtokuoppaan läpäisevä tukee päällystettiin Matrigel. 50 000 elinkelpoinen OCC (lajiteltuna yhteis- ja yksipuolinen) ympättiin kuoppaa kohti ja inkuboitiin 5% CO 2 37 ° C: ssa 12 ja 24 tuntia. OCC muuttoliike ja invaasion jälkeen arvioitiin käyttämällä fluoresenssilevylukijaa (Wallac, Perkin Elmer).

Proliferaatiomääritys

5000 OCC ympättiin yksipuolinen tai MSC-Morange yksikerroksista seerumivapaassa /sytokiinien vapaa media. OCC laskettiin joka toinen päivä 14 päällystettiin Matrigel. 50 000 päivää mikroskoopilla käyttäen GFP fluoresenssia. Joka päivä kymmenen kentät kvantitoitiin.

Chemoresistance

100000 OCC ympättiin yksipuolinen tai BM-MSC 01:02 suhteessa. Mono- ja yhdessä viljelemisen käsiteltiin 90 uM sisplatiinia ja 6 uM Paklitakseli (Sigma) 24 tuntia. Sitten solut värjättiin Calcein Red-Orange, LIVE /DEAD Aqua sininen (Invitrogen, Molecular Probes), CD73-APC (Biolegend, klooni: AD2) mukaan valmistajan ohjeiden ja analysoitiin FACS: llä. OCC määriteltiin solujen GFP + CD73-, elävät OCC määriteltiin kalseiini Red-Oranssi + LIVE /DEAD AQUA-. 50 000 tapahtumaa hankittiin näytettä kohti.

Tilastollinen

Student-t testejä, Fisherin eksakti testejä ja chi-neliö suoritettiin tarvittaessa. Kaikki p-arvot ovat kaksipuolisia, joissa tilastollista merkittävyyttä arvioitiin 0,05 alfapitoisuudet. Yhdeksänkymmentäviisi prosenttia luottamusväli (95% CI) laskettiin arvioimiseksi tarkkuutta saadaan arvioiden. Kaikki tilastollinen analyysi tehtiin käyttäen tietojen analysointi plug-in Microsoft Excel 2008

Tulokset

muuttaminen OCC transcriptome kun vuorovaikutuksessa MC

Tutkiakseen muutoksia OCC transcriptome kun MC yhteyttä, suunnittelimme yhteisviljelmä mallia, jossa OCC viljellään yksinään (kontrolli ehto) tai läsnä ollessa MC (testiolosuhteissa) aikana 24 tunnin ajan seerumittomassa, sytokiinien väliaineessa. OCC (ohjaus ja testiolosuhteissa) sitten lajiteltu FACS perustuu niiden ilmentäminen rinnakkain epiteelin adheesiomolekyyliä (EpCAM, CD326) ja tehostetun-vihreä fluoresoiva proteiini (eGFP) (kuvio 1 A).

käyrästö, joka osoittaa tyypillisen syrjintää OCC ja MC FACS. OCC määriteltiin eGFP + EpCAM + (vihreä väestö) taas MC määriteltiin eGFP-EpCAM- (tummanharmaa väestöstä). B. PCA analyysi munasarjasyöpäsoluja linjat yksin tai post-kosketuksessa mesenkyymisolujen.

Kun MC kosketuksen transcriptome kahden solulinjoista testasimme (NIH: OVCAR3-eGFP ja SKOV3 -eGFP) oli huomattavasti muutettu (kuva 1 B). NIH: OVCAR3 merkittävästi voimistunut 26 geenejä ja vaimentua 10 geenejä (taulukko S1); SKOV3 merkittävästi voimistunut 18 geenejä ja vaimentua 3 geenejä (taulukko S2). Muutokset havaittiin kahdessa munasarjasyövän solulinjoissa ei salli meidän yhteisen geenin allekirjoituksen yhteydessä MC yhteystiedot (Kuva 1 B, taulukko S1, taulukko S2). Kuitenkin käyttämällä Nerokkuus Pathway Analysis ohjelmisto, pystyimme tunnistamaan kolme biologisen toiminnan klustereita rikastettu kosketuksessa MC: ”Etäpesäke” (NIH: OVCAR3, p = 6,48 * 10

-6; SKOV3, p = 5,42 * 10

-5), ”proliferaatio solulinjat” (NIH: OVCAR3, p = 4.36.48 * 10

-7; SKOV3, p = 6,79 * 10

-6) ja ”Cell kuoleman kasvainsolulinjan ”(NIH: OVCAR3, p = 5,68 * 10

-8; SKOV3, p = 7,62 * 10

-5). Nämä klusterit ovat jaettu NIH: OVCAR3-eGFP ja SKOV3-eGFP (taulukko 1).

Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että puuttumisesta huolimatta päällekkäisten koskevat geenit ylös-tai alas-säädellä MC kontakti, sama biologinen funktio klustereita rikastuneet kaksi munasarjasyövän solulinja testasimme. Tässä artikkelissa, me esitetty ajatus, että MC kohdistavat pro-metastaattinen vaikutus OCC, siksi päätimme vahvistaa biologisen toiminnan klustereita on kuvattu taulukossa 1, jossa

in vitro

kokeilujen.

MC lisätä OCC etäpesäke biologinen funktio: kiinnittyminen, maahanmuutto ja invaasio

Peritoneaalidialyysi etäpesäke aloittamisesta merkitsee sitoutumista, muuttoliike, ja hyökkäyksen kautta mesothelium. Käyttämällä IPA ohjelmisto, tunnistimme biologinen toiminto klusterin: ”etäpesäke”, joka oli rikastettu upon munasarjasyöpäsolu joutumista MC. Siksi tutkittiin biologinen vaikutus vastaa tätä genomista pro-metastasoitunut muutos suorittamista

in vitro

muuttoliike, tarttuvuus ja invaasio määrityksissä. Kun 24 tuntia rinnakkaisviljelemällä MC, OCC (EpCAM + eGFP +) lajiteltiin (kuvio 1A). Sitten testattiin OCC kyky ”noudattaa ECM. OCC (NIH: OVCAR3 ja SKOV3) ympättiin Matrigel (BD Biosciences) pinnoitettu hyvin 10 min, 15 min, 30 min ja 1 tunnin ajan. Olemme määritelleet sitoutuminen ECM jäännösfraktiona GFP fluoresenssi pystyimme hankkimaan seuraavat PBS pesua. Kuten näkyy kuviossa 2.A sekä munasarjasyövän solulinja osoittavat lisääntynyt noudattaminen ECM: 1,38 kertainen lisäys verrattuna kontrolliin NIH: OVCAR3-eGFP 10 min, ja 1,94 kertainen lisäys 1 h, 1,28 ja 1,85-kertainen SKOV3–eGFP 10 min ja 1 tunnin vastaavasti.

. OCC-eGFP (NIH: OVCAR3, vasen kaavio ja SKOV3, oikea kaavio) ympättiin Matrigel (BD Biosciences) pinnoitettu hyvin 10 minuuttia, 15 min, 30 min ja 1 tunti. Lisääntynyt sitoutuminen ECM havaitaan, kun OCC oli preemptively viljellään MC (vaaleanharmaa palkit) verrattuna kontrolliryhmään (tumman harmaat palkit). B. Kaaviossa edustaa hyökkäyksen ja migraatiokokeessa. C. Lajittele OCC ympättiin (un) päällystetty siirtoaltaat ja GFP-signaalin kunkin kuopan alle pinnoitettu kalvo on hankittu 24 tunnin kuluttua. Lisääntynyt maahanmuutto ja hyökkäyksen läpi ECM havaitaan, kun OCC oli preemptively viljellään MC (vaaleanharmaa palkit) verrattuna kontrolliryhmään (tumman harmaat palkit). SEM ovat edustettuina, n = 3,