Krooninen sairaus

tiivistelmä

Melanooma antigeeni A (MAGE-A) proteiinit käsittävät rakenteellisesti ja biokemiallisesti kaltaiset alaryhmä of Cancer /kivesantigeenien jotka ilmentyvät monissa syövän tyypit ja uskotaan osallistumaan aktiivisesti maligniteetti. MAGE-A proteiinit perustettu sääntelyviranomaisten tiettyjen syöpään liittyvien transkriptiotekijöiden, kuten p53, ja ovat aktivaattoreita useiden etusormi riippuva ubikitiinipromoottori E3 ligaasit. Tässä osoitamme, että MAGE-A2 kumppaniaan MDM2, joka on ubikitiini E3-ligaasi, joka välittää ubiquitylation yli 20 alustoilla pääasiassa p53, MDM2 itse, ja MDM4, voimakas p53-estäjän ja MDM2 kumppani, joka on rakenteellisesti sukua MDM2. Huomaamme, että MAGE-A2 vuorovaikutuksessa MDM2 kautta N-terminaalista p53-sitova tasku ja nimetön sormi verkkotunnuksen MDM2 joka vaaditaan homo /hetero-dimerisaatio ja E2 ligaasin vuorovaikutukseen. Yhdenmukainen nämä tiedot, osoitamme, että MAGE-A2 on voimakas estäjä E3 ubikitiinipromoottori ligaasiaktiivisuus MDM2, mutta se ei ole merkittävää vaikutusta p53 liikevaihdon välittämää MDM2. Silmiinpistävän kuitenkin lisääntynyt MAGE-A2 ilmaisu johtaa vähentyneeseen ubiquitylation ja kohonneeseen MDM4. Samoin hiljentäminen endogeenisen MAGE-A ilmaisu vähenee MDM4 tasoilla tavalla, joka voidaan pelastaa jonka proteasomaalisten estäjä, bortezomid, ja luvat kasvoivat MDM2 /MDM4 -alueella. Nämä tiedot viittaavat siihen, että MAGE-A proteiinit voivat: (i) irrottaa ubikitiinipromoottori ligaasilla ja hajoaminen tehtävät MDM2; (Ii) toimivat estäjän E3 ligaasin toiminta; ja (iii) säädellä liikevaihdon MDM4. Olemme myös yhdistyksen välillä läsnäolo MAGE-A ja lisääntynyt MDM4 tasoilla ensisijainen rintasyövän, mikä viittaa siihen, että MAGE-A-riippuva ohjaus MDM4 tasoilla on merkitystä syövän kliinisesti.

Citation: Marcar L, Ihrig B, Hourihan J, Bray SE, Quinlan PR, Jordan LB, et al. (2015) MAGE-A Cancer /kivesantigeenien esto MDM2 Ubiquitylation Function ja edistää kohonneeseen MDM4. PLoS ONE 10 (5): e0127713. doi: 10,1371 /journal.pone.0127713

Academic Editor: Chunhong Yan, Georgia Regents University, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 22 tammikuu 2015; Hyväksytty: 17 huhtikuu 2015; Julkaistu: 22 toukokuu 2015

Copyright: © 2015 Marcar et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat lupanumeroita: 2008NovPR32 ja 2001NovPhD07, URL: https://www.breastcancercampaign.org. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

melanooma liittyviä antigeenejä (MAGE) alun perin löydettiin syöpään liittyvien antigeenien melanoomapotilailla [1], ja nyt tiedetään käsittävän super-perheen (kattaa useita alaryhmää) on enemmän kuin 60 geenien ihmisillä [2,3]. MAGE jaetaan kahteen ryhmään, MAGE-I ja MAGE-II, joka perustuu sijainnit kromosomissa geenien ja jakautuminen kudoksiin niiden tuotteiden [2,3]. MAGE-I-proteiinien (käsittäen alaryhmää MAGE-A, -B ja -C) ovat jäseniä laajemman perheen Cancer /Kives (CT) antigeenit, jotka ovat fysiologisesti ilmaistaan ​​pääasiassa sukusolujen, mutta poikkeavasti ilmaistu lähinnä epigeneettiset uudelleenohjelmointi, monenlaisia ​​syöpiä mukaan lukien rinta-, munasarja-, keuhko-, ja virtsarakon [3,4,5,6]. MAGE-II proteiineja laajemmin ilmaistuna eikä niitä normaalisti liittyvät syöpään.

jäsenet MAGE-A alaryhmä näyttää silmiinpistävää rakenteellinen ja toiminnallinen samankaltaisuus toisiaan [3]. Expression of MAGE-A havaitaan lähinnä syöpiä, jotka ovat hankkineet pahanlaatuinen fenotyypit kuten invasiivisuus tai etäpesäkkeitä, ja korreloi huonon ennusteen [3]. Erikoista, että MAGE-A-geenit ovat usein yhteistyössä ilmaistuna, useimmat syövät osoittaa läsnä on vähintään kaksi tai useampia näistä antigeeneistä. Ekspressiotasoja voi myös vaihdella suuresti, ja se voi näin ollen vaikuttaa biologisen kohtalon näitä proteiineja ilmentäviin soluihin. Yhdenmukainen syöpä edistävää roolia, MAGE-A ilmaisu stimuloi solusyklin etenemisen, maahanmuuttoluku ja invasiivisuus viljeltyjen solujen

in vitro

ja voivat edistää korotukset kasvaimen koon ja määrän ja koon metastaasipesäkkeiden eläinten mallit [7,8]. Yhdessä nämä tiedot tukevat ajatusta, että MAGE-A ilmentyminen voi myötävaikuttaa maligniteetti.

normaali toiminto (t) MAGE-perhe on tuntematon mutta kasvava todisteet osoittavat näiden proteiinien moduloida keskeiset transkriptiotekijöitä kuten SKIP , p300, P160 (TIF2) androgeenireseptorin ER-alfa, ja p53-tuumorisuppressorin [3,7,9,10,11,12,13,14,15]. Vuorovaikutuksessa näiden proteiinien MAGE-A (ja muut MAGE I proteiinit) voidaan säädellä transkription tapahtumia erilaisilla mekanismeilla, kuten rekrytointi ja kohdentamalla histonideasetylaasi (HDAC) aktiivisuutta SKIP tai p53 [11,13,16], edistää vuorovaikutusta androgeenireseptorin kanssa P160 ja muiden koaktivaattoria proteiinit [14], tai kytkentä co-repressori, KAP1 /TRIM28, että KRAB domain sinkkisormipolypeptidiin (KZNF) transkriptiotekijöitä [8,17,18]. Lisäksi nämä vaikutukset, viimeaikaiset todisteet osoittavat, että useita MAGE-proteiinit (molemmat tyypit I ja II) voidaan edistää ubiquitylation toimimalla aktivaattoreina RING (todella mielenkiintoinen uusi geeni) sormi-tyyppinen E3 ubikitiinistä ligaasit [8,17,19] . Esimerkiksi MAGE-G1 voi stimuloida ubikitiinipromoottori ligaasilla toimintaa NSE1. Vastaavasti, vuorovaikutus MAGE-C2 kanssa KAP1 (TRIM28) corepressor proteiini voi stimuloida KAP1 riippuvainen liikevaihdon p53 tuumorisuppressorin riippumatta suuret p53 säädin, MDM2 [17]. Tämä yhdistävä teema MAGE-proteiinit modulaattoreina etusormi ligaasit taustalla on havainto, että yhdeksän romaani MAGE-I sitoutumispartnereihin tunnistaa TAP-tag /massaspektrometria analyysi ovat etusormi proteiineja [17]. Sisällä MAGE-A family, nykyinen biokemiallinen näyttö viittaa siihen, korkea toiminnallinen irtisanomisen, esimerkiksi säätelyssä p53-toiminto [12,13]. Toisaalta, uusien julkaisujen mukaan voi olla voimakkaan spesifinen in MAGE /kumppani vuorovaikutusten, ainakin joidenkin kumppaneiden [14,15,17].

p53 toimii lähinnä transkriptiotekijä, joka eliminoi syöpäsolut koordinoimalla muutoksia geenien ilmentyminen, mikä johtaa solusyklin pysähtymiseen, vanhenemista tai apoptoosin [20]. p53 säätelee ensisijaisesti sen vaikutuksen MDM2, joka on nimetön sormi-tyyppinen ubikitiinipromoottori E3 ligaasilla. MDM2 ja p53 toimivat takaisinkytkentäsilmukan, jossa p53 stimuloi

MDM2

ilmaisua, joka johtaa alas-säätely p53 tasoilla MDM2. Induktio ja aktivointi p53 erilaisilla stressi ärsykkeiden saavutetaan erilaisia, mutta päällekkäisiä mekanismeja, jotka pääasiallisesti irrottaa p53 /MDM2 [21]. Tärkeimmät ominaisuudet MDM2-proteiinin ovat: N-terminaalinen p53 sitova domeeni, jossa N-pää p53 vuorovaikutuksessa hydrofobinen tasku MDM2; ydin- vienti ja tuonti sekvenssit, jotka välittävät nucleo-sytoplasmista shuttling sekä MDM2 ja p53; erittäin hapan ja erittäin fosforyloituu keskialue on keskeisen tärkeä p53 hajoamista; ja C-terminaalinen RING finger jota tarvitaan sekä ubiquitylation ja hajoamista p53. Nämä verkkotunnukset tukevat useita biokemiallisia toimintoja MDM2, jotka toimivat peräkkäin ja yhteistoiminnassa sen alas-säädellä p53 tasot: nämä sisältävät pääasiassa ubiquitylation, nucleo-soluliman liikenne, ja kohdentamiseen p53 että proteasomin heikentymisen. Lisäksi nämä biokemialliset toiminnot voidaan säädellä

itsenäisesti

toisistaan. Kun esimerkiksi multi-site fosforylaation happaman keskustasossa MDM2 ei ole havaittavaa vaikutusta sen kyky välittää ubiquitylation p53, nämä muutokset on ratkaiseva rooli liikevaihdon p53 stimuloimalla yhdistyksen MDM2 useiden komponenttien proteasomista [22,23]. Vaikka kykenevät välittämään vuorovaikutusta proteasomin, tarkkaa mekanismia (t), johon MDM2 ohjaa p53 hajoaminen on puutteellisesti.

MDM4 (tunnetaan myös nimellä MDMX tai HDMX) on viallinen ubikitiinipromoottori ligaasilla, joka on rakenteellisesti sukua MDM2 ja estää p53 kautta päällekkäisten mekanismien [24,25]. Ensinnäkin se on stimuloiva kumppani MDM2 [26], joka on itse säätelee MDM2-välitteisen ubiquitylation [27,28,29]. Lisäksi, kuten MDM2, p53 sitoutuu MDM4 pääasiassa N-terminaalista hydrofobista taskuun siten steerisesti estävät vuorovaikutusta p53-transaktivaatiodomeenin (TAD1) ja transkription koneet ja siten alaspäin säätäminen p53-välitteisen transaktivaation [30].

p53-toiminto menetetään kehityksen aikana suuri osa syöpien eri mutaation kautta ja

TP53

geenin (joka koodaa p53). Joissakin syöpien, kuitenkin

TP53

mutaatio taajuus on pienempi, mutta muita mekanismeja, kuten muuttunut ilmentyminen tai p53: n mutaatio säätölaitteet (esim MDM2, MDM4, ARF) ajatellaan poistaa p53: n funktiona [31]. Me ja muut ovat osoittaneet, että eri jäsenten MAGE-perhe, jotka kaikki osoittavat silmiinpistävää sekvenssin samankaltaisuus, toimivat samalla tavalla ja ovat voimakkaita estäjiä p53-välitteisen transkription ja apoptoosin [8,12,13]. Kaksi näistä tutkimuksista osoittavat, että MAGE-A säädökset, ainakin osittain, sitoutumalla ydin (paikkasidonnainen DNA sitova) domain p53 ja säätämällä sen alavirran transkription toiminto [12,13]. MAGE-A voi myös säädellä p53 asetylointi (aktivointi) kautta HDAC3 rekrytointi ja vuorovaikutus PML ydin- elinten [13,16]. Näillä järjestelmillä MAGE-A voi resistenssin lääkkeille, jotka toimivat läpi p53-reitin [13]. Mielenkiintoista, jotkut [17,32], mutta ei kaikki [12,13], tutkimukset viittaavat siihen, että MAGE-proteiinit voivat säädellä p53 tasoja, esimerkiksi vuorovaikutuksessa E3 ligaaseilla kuten KAP1 (TRIM28) [17]. Tätä kysymystä ei ole ratkaistu. Kun lisäksi otetaan huomioon nyt vakiintunut asema MAGE-proteiineja säätelijöinä nimetön sormi E3-ligaasi sitä ei ole osoitettu, ovatko nämä proteiinit voivat vaikuttaa roolia MDM2.

Tässä tutkimuksessa osoitetaan, että endogeeninen MAGE -A proteiineja ja kautta kohdunulkoinen ilmaisu, MAGE-A2, assosioituvat MDM2

riippumatta

p53. Tämä havainto sai meidät tutkimaan vuorovaikutuksen näiden kahden proteiinin perusteellisemmin, jotta ymmärtämään toiminnallista merkitystä niiden -alueella. Tuloksemme osoittavat, että sen lisäksi, säännellä p53 toiminnon suoraan, MAGE-A voi vaikuttaa selektiivisesti tasot MDM4 vuorovaikutuksessa MDM2, ja tukevat ajatusta, että tämän perheen proteiinien säätelee p53-toiminto useiden riippumattomien mutta toisiaan täydentävät mekanistinen tapahtumia. Olemme myös vahvistaa, että MAGE-proteiineja, kun taas toimii stimuloivat joidenkin etusormi tyyppi proteiinit [17], voivat myös käyttäytyä kuin tehokkaan estäjän MDM2 nimetön sormi tyyppi E3 ubikitiinipromoottori ligaasilla.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat, transfektiot, ja plasmidit

U2OS (ihmisen osteosarkooma-johdetut solut) ja H1299 (ihmisen keuhkokarsinooma-johdettu) solut saatiin Cancer Research UK talletus-. Solut testattiin p53- ja MAGE-A aseman western blottauksella. Transfektiot suoritettiin käyttäen Lipofectamine-reagenssia (Invitrogen), kuten valmistajan ohjeiden mukaisesti. Plasmidit, joita käytetään humaani cDNA olivat johdannaisia ​​pcDNA3 ja olivat seuraavat (jossa luettelo numerot suluissa): villityypin p53 pCDNA3 (DWM715), HA-merkittyä MAGE-A2 pCDNA3 (DWM1574), ihmisen villityypin MDM2 ( alle CMV promoottori; DWM1127), MDM2-C464A (DWM1214), HA-merkitty (N-pää) ihmisen MDM4 (1318), His

6 tagged ubikitiinipromoottori (DWM1432). Glutationi-S-transferaasi (GST) -fusion proteiinit koodattu johdannaisia ​​vektorin, pGEX-4T. Näihin sisältyi joukko aiemmin julkaistu MDM2 ”mini-proteiinit”, jossa päällekkäisiä verkkotunnuksia MDM2 fuusioidaan GST [33,34] ja olivat seuraavat: GST yksin (DWM223), GST-MP1 (DWM1074), GST-MP2 (DWM1093 ), GST-MP3 (DWM1076), GST-MP4 (DWM1077).

Vasta-aineet ja Western blot-analyysi

SDS-PAGE ja Western blotting suoritettiin käyttäen normaaliolosuhteissa. Käytetyt vasta-aineet olivat seuraavat: 6C1 (pan MAGE-A), ja H164 (p21) saatiin Santa Cruz Biotechnology. DO1 (p53), 4B2 (MDM2) ja SMP14 (MDM2) olivat Moravian Biotechnology. CM1 oli ystävällinen lahjoitus Prof. Sir D. Lane. Anti-MDM4 vasta-aineet 8C6 ja BL1258 saatiin Millipore ja Bethyl Laboratories vastaavasti. 12CA5 (HA-tag) oli peräisin Cancer Research UK ja 20-33 (aktiini) oli Sigma-Aldrich. HRP (piparjuuriperoksidaasi) konjugoitua kanin anti-hiiri ja vuohen anti-kani-vasta-aineita ostettiin Dako ja Bio-Rad, vastaavasti. Proteiinit havaittiin tehostetulla kemiluminesenssin mukaan valmistajan ohjeiden (Pierce Biotechnology, Inc.).

GST-pull-down Experiment

GST-merkitty MDM2 fuusioproteiinit [33,34] (tai GST yksinään kontrollina) sidottiin GSH (Glutationi Sepharose 4B) helmiä (Amersham) ja sen jälkeen inkuboitiin

35S-leimattua MAGE-A2 (valmistettu

in vitro

transkriptio /käännetty TNT T7 System (Promega )). Sen jälkeen laajasti pesun helmiä, immobilisoidut proteiinit eluoitiin 2 x SDS-näytepuskuria ja havaitaan western blottauksella.

In vitro

alasvetovastukset määrityksissä käyttäen biotinyloitua peptidejä

Biotinylated peptidit hankittiin Mimotopes, ja yleensä se on seuraavassa muodossa: ”biotiini-SGSG-peptidi-amidi”. Peptidejä, jotka edustavat N- ja C-päät olivat vastaavasti: ”Amiini-peptidi-GSG-biosytiinin amidi” ja ”biotiini-SGSG-peptidi-happo”. Streptavidiini-agaroosi-helmiä (Sigma), pestiin PBS: ssä, joka sisälsi 0,1% (v /v) Tween-20, ennen kuin lisättiin 10 ug biotinyloitua peptidiä. Helmet inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa ja sen jälkeen pestiin samalla puskurilla.

35S-leimattua MAGE-A2 (valmistettu

in vitro

transkriptio /translaatio TNT T7 System (Promega)) lisättiin helmiin ja inkuboitiin 2 tuntia 4 ° C: ssa. Helmet pestiin sen jälkeen 4 kertaa PBS /Tween-20 ja suspendoitiin uudelleen SDS-PAGE-näytepuskuria. Kerasaostamalla proteiini SDS-PAGE: lla ja detektoitiin fluorografialla.

immunosaostus

Solut lyysattiin jäillä 30 minuuttia IP-puskurissa (50 mM Tris-HCI [pH 7,5], 150 mM NaCl, 1% (v /v) NP-40, 2 mM EDTA: a ja proteaasi-inhibiittorin (Roche)), sentrifugoitiin 10 minuutin ajan 13000 x g: ssä ja supernatantti poistettiin analyysiä varten. Sitten lysaatti esipuhdistettiin 50 ui liete, proteiini-G-helmiä (Sigma) 30 min 4 ° C: ssa, sentrifugoitiin 3 minuuttia 2000 x g, ja helmet hylätään. Yhteensä 1-2 ug proteiinia inkuboitiin 2 ug /ml vasta-ainetta yli yön 4 ° C: ssa ja immunosaostettiin seuraavana päivänä 50 ui liete, proteiini-G-helmiä (Sigma) 2 tunnin ajan 4 ° C: ssa. Sakat pestiin kolme kertaa 5 minuuttia IP-puskurissa 4 ° C: ssa, ennen kuin lisättiin SDS-geelin-latauspuskuria ja immunosaostettiin proteiinit havaittiin Western blot.

Ubiquitylation määrityksessä

ubiquitylation määritys perustuu solujen transfektio plasmidilla, joka koodaa His-merkitty ubikitiini seurasi talteenotto ja puhdistus ubiquitylated proteiinien solu-uutteista käyttäen nikkeli-agaroosi-helmiä. Tämä määritys on kuvattu merkittävän yksityiskohtaisesti muualla [35]. Puhdistettu ubiquitylated proteiinit analysoitiin western-blottauksella.

geenien käyttäen siRNA

MAGE-A-ekspressio vaiennettu käyttäen kahta itsenäistä, aiemmin julkaistu siRNA oligonukleotidit [12,13]: MAGE-A siRNA (1) [13] ja MAGE-A siRNA (2) [12] on kohdistettu kahteen eri sekvenssien yhteinen kullekin Mage-A perheen jäsenet paitsi Mage-A10 ja ovat seuraavat:

MAGE- Oligo 1 [13] 5′-AACCAGCUAUGUGAAAGUC-3 ’

MAGE-A Oligo 2 [12] 5′-UCACAAAGGCAGAAAUGCU-3′

Non-hiljentäminen Oligo (valvonta) 5′- CAGUCGCGUUUGCGACUGG-3 ’

siRNA oligonukleotidit valmisti Dharmacon ja vietiin soluihin käänteisfaasi-transfektiolla käyttämällä RNAiMAX (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Solut kerättiin 48 tuntia transfektion jälkeen.

Potilaat, Suostumus ja immunohistokemia (IHC) B

kohortti Tässä tutkimuksessa käytetty (TMA24) on raportoitu aikaisemmin [36,37] ja sisältää ensisijaiset, aiemmin hoitamaton rintasyöpä 225 valitsematta ennen ja jälkeen vaihdevuodet ohittaneilla naisilla (iältään 28-89; mediaani 62 vuotta) hoidettiin Tayside yliopistosairaaloissa, Skotlanti vuodesta 1997 vuoteen 2002. hankinta näytteiden ja valmistelua kasvaimen mikrosiru (TMA) on esitetty yksityiskohtaisesti muualla [36,37]. Tutkimus sai eettinen hyväksyntä sekä Tayside tutkimus- ja eettisen komitean (Ref. 07 /S1402 /90) ja Tayside Kudospankki komitean (Ref. TR000236). Generic, kirjallinen suostumus saatiin kunkin potilaan ennen kudoksen hankintaa ja ennen leikkausta toteutettiin, prosessi hyväksymä Research toimikunta, käytöstä ylimääräistä kudosta ei tarvita tekee diagnoosin ja laskimoverta piirtää käytettäväksi tutkimuksessa .

Palasia TMA lohkon (nimellisesti 4 mikronin paksuinen) valmistettiin ja käsiteltiin kuten aiemmin on kuvattu [37]. Spesifisten vasta-aineiden proteiineja käytetään tutkimuksessa olivat: 6C1 (pan-MAGE-A); ja BL1258 (MDM4).

TMA Tilanne MAGE-A ja MDM4 toteutettiin asiantuntija rintojen patologi (LBJ) käyttäen Quickscore menetelmää [38], että intensiteetti ja solujen osuus on värjätty sopivan vasta- .

tulokset

MAGE-A-proteiinien vuorovaikutuksessa MDM2 viljellyissä soluissa

Voit selvittää MAGE-A-proteiinien suorassa vuorovaikutuksessa MDM2 itsenäisesti p53, samanaikainen immunosaostus endogeenisesti ekspressoidut proteiinit tehtiin käyttämällä H1299-soluja (jotka eivät ilmennä p53). Kontrollina, kokeet on suoritettu myös villityypin p53-ilmentävät U2OS soluja, jotka me ja muut ovat käyttäneet aikaisemmin MAGE-A /p53 vuorovaikutus tutkimuksissa [12,13,16]; molemmat linjat ilmentävät useat havaittavissa jäseniä MAGE-perhe (S1 Kuva). Sopusoinnussa tämän havainnon yleiseurooppalaisen MAGE-A-vasta, 6C1, havaittiin useita tiiviisti siirryttäessä vyöhykettä, jotka vastasivat eri MAGE-A perheenjäsenet solussa uutteet (kuvio 1A, alempi paneeli). Immunosaostus MAGE-A käyttäen 6C1 johti samanaikainen immunosaostus MDM2 (kuvio 1A, yläpaneeli). Vastavuoroisesti analyysi, MAGE-A-proteiinien havaittiin olevan läsnä immunosaostumissa MDM2 samasta uutteet käyttäen vasta-aineita, 4B2 ja SMP14 (alempi paneeli). Co-immunosaostus suoritettiin myös käyttämällä U2OS soluja (jotka ilmentävät villityyppistä p53) vastaavia löydöksiä. Hitaampi-muuttavien MDM2-proteiinien nähty yhteistyöhön immuunisaostumassa jossa MAGE-A molemmissa solulinjoissa mukaan MAGE-A-proteiinit voivat ensisijaisesti vuorovaikutuksessa translaation jälkeen muokatussa muodossa (t) MDM2. Samoin hitaammin liikkuvasta bändejä MAGE-A voi päätellä, että modifioitu MAGE-A-proteiinien ensisijaisesti liittävät MDM2 tai vaihtoehtoisesti että MDM2 osakkuusyritysten ensisijaisesti erityisiä MAGE-A perheenjäseniä. Meillä ei ole lopullisia vastauksia näihin kysymyksiin tällä hetkellä. MAGE-A-proteiinien ei havaittavissa MDM4 immunosaostumissa tai, käänteisesti, teki MDM4 co-immuunisaostumassa, kun anti-MAGE-A-vasta-ainetta käytettiin (tietoja ei ole esitetty). Nämä tiedot merkitsevät spesifisyys kanssa MAGE-A /MDM2. Yhteenvetona nämä tulokset osoittavat, että MDM2 ja MAGE-A, liittyvät solun yhteydessä.

(A) H1299 soluja (vasemmalla paneelit) tai U2OS soluja (oikeanpuoleinen paneeli) hajotettiin ja immunosaostus suoritettiin käyttäen vasta-aineita MAGE-A (6C1), MDM2 (SMP14 ja 4B2), tai kontrollina, epäspesifistä hiiren IgG. Blotteja tutkittiin läsnäolo MDM2 (ylä- paneelit) tai MAGE-A (alapaneelit). Sijainnit vasta-aineen raskaan ketjun (HC) ja kevyen ketjun (LC) on ilmoitettu alempi paneelit. (B) GST pull-down määritykset suoritettiin joka

35S-radioaktiivisesti MAGE-A2 vangittiin glutationi Sepharose 4B käyttämällä GST liittyy täyspitkä MDM2 tai neljä mini-proteiinien (kutsutaan MP1, -2, -3 ja -4) edustavat päällekkäisiä alueita MDM2 [33,34]. Yhteistyössä saostetaan MAGE-A2 havaittiin SDS-PAGE ja sen jälkeen fluorografialla (ylempi paneeli). Keskimmäinen paneeli osoittaa, että läsnä GST-MDM2-proteiinien seuraavat sitovat glutationia helmiä. Alapaneeli on kaaviokuva täyspitkä MDM2 yhdessä päällekkäisten alueiden sisältyvät sisällä mini-proteiineja. Tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen.

MAGE-A-proteiinien vuorovaikutuksessa MDM2

in vitro

Voit selvittää MDM2 ja MAGE-A vuorovaikutuksessa

in vitro

, GST pull-down kokeet suoritettiin käyttämällä sarjaa GST-fuusioproteiineja, jotka käsittävät GST-ihmisen täyspitkän MDM2 yhdessä aiemmin julkaistu sarja GST-fuusioproteiinien liittyy päällekkäisten domeeneihin MDM2 [33, 34]. Tiedot (kuvio 1 B) vahvistaa, että

35S-leimattua

in vitro

-translated MAGE-A2 vuorovaikutuksessa MDM2 eikä GST osa fuusioproteiinin avattavassa analyysi. (MAGE-A2 valittiin tämän analyysin, koska se on hyvin tunnettu säätelijänä p53-reitin, joka suorittaa yhtä hyvin verrattuna muihin MAGE-A-proteiinien (A 1 ja -A6) niiden kyky estää p53: n toiminta [12,13 ].) tiedot osoittavat myös, että MAGE-A2 voimakkaassa vuorovaikutuksessa N-terminaalista 110 aminohappoa MDM2 ja C-terminaalinen alue, joka käsittää aminohapot 279-491. On heikko vuorovaikutus MDM2 aminohappojen 108-207, mutta hyvin vähän yhdessä aminohappojen 203-282 käsittävät lähinnä tärkeä hapan verkkotunnuksen.

tutkia tarkemmin sivuston (t) vuorovaikutuksen, kyky MDM2 aminohapposekvenssit yhteistyöhön sakka

35S-leimatun

in vitro

-translated MAGE-A2 mitattiin pepscan määrityksissä. Näissä määrityksissä käytetään vastaavan sarjan 15-mer biotyinylated peptidien sidottu streptavidiiniin-helmiä, kunkin peptidin päällekkäin seuraavan sarjaan 5 tai useampia aminohappoja, ja joka käsittää vastaavasti koko ihmisen MDM2 aminohapposekvenssi (S2 kuvassa). Olemme aiemmin käytetty samanlaista lähestymistapaa määrittää sivustoja vuorovaikutuksen MAGE-A2 p53 [12]. Tiedot Tämän analyysin tunnistaa useita peptidejä vuorovaikutuksessa MAGE-A2 (kuvio 2A ja koottu kuvioon 2B). On olemassa kaksi vahvasti vuorovaikutuksessa peptidejä, jotka edustavat N-terminaalista aminohappoa (51-65 ja erityisesti 91-105) ja kolme peptidiä edustavat sekvenssien C-päähän MDM2 (451-465, 461-475 ja 481-491). Tiedot korostavat myös heikompi vuorovaikutusta peptidit, jotka vastasivat aminohappoja 151-165 ja 171-185, joka sisältää vastaavasti kaksi perustettu tumaanohjaussignaali sekvenssien MDM2. Heikko mutta havaittavia yhteisvaikutuksia, havaittiin 191-205, 291-305, ja 311-325. Silmiinpistävän, nämä tiedot ovat erinomaisessa kanssa GST avattavasta kokeissa (kuvio 1 B). (Viisi suurta vuorovaikutuksessa peptidien N- ja C-pään alueisiin MDM2 näkyvät linjassa vastaavien sekvenssien MDM4 S3 kuvassa. Näitä linjauksia esiin useita merkittäviä eroja aminohapposekvenssien ainakin neljässä peptidien, erityisesti peptidi, joka vastaa aminohappoja 91-105 MDM2 joka osoitti suurimmassa määrin vuorovaikutusta (kuvio 2A). Nämä erot sekvenssi voi selittää, miksi MDM4 ei voitu yhteistyössä immunosaostettiin anti-MAGE-A-vasta-ainetta (kuvio 1) .) B

(A) Pepscan määritykset (pull-down kokeilut) tehtiin jossa sarja 15-mer biotinyloitu peptidejä (numeroitu 1-49) päällekkäiset 5 tai enemmän aminohappoja ja edustaa koko MDM2 aminohapon happosekvenssi kytkettiin streptavidiini-sefaroosihelmet ja kaapata

35S-leimattu, in vitro-kääntänyt MAGE-A2. Yhteistyössä saostetaan MAGE-A2 havaittiin SDS-PAGE ja sen jälkeen fluorografialla. Ohjaus- avattavassa (alhaalla vasemmalla paneeli) oli peptidi edustaa BoxIV /V-alueen p53 jota aiemmin vahvistettu sitoutuu erittäin tiukasti MAGE-A2 [12]. (B) Kaaviokuva alueiden edustaa vuorovaikutuksessa peptidien avattavassa määrityksessä. Vahvat ja heikot sitovat alueet ilmoitetaan yhteydessä merkittäviä toiminnallisia domeenia MDM2-proteiinin. Tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen. (C) Malli osoittaa dimeeri MDM2 RING sormet, jotka perustuvat julkaistuihin 3D-rakenteen (Protein Data Bank tulonumero: 2HDP). Kaksi samanlaista alayksiköiden dimeerin ovat edustettuina harmaa ja vaaleansininen vastaavasti. Kuva oikealla puolella saatiin pyörittämällä 3D-rakenteen noin 90 ° oikealle vaakatasossa. Sijainti MAGE-A2-sitovia peptidejä on esitetty toiseen alayksikköön: aminohapot 456-470 edustavat punaista, kun taas aminohapot 486-491 on esitetty vaalean oranssi.

MDM2 C-terminaalinen peptidejä johon MAGE-A2 sitoutuu sijaitsevat nimetön sormi verkkotunnus, joka on ratkaiseva homo-dimerisaatiota ja hetero-dimerisaatio kanssa MDM4. Tämä alue on myös ratkaiseva rooli vuorovaikutuksessa, ja välittämisessä siirtoa ubikitiinin, E2 ligaasien alustoille [39,40,41,42,43]. Lisäksi, kun sitä tarkastellaan yhteydessä 3D-rakenteen MDM2 RING, nämä peptidisekvenssejä makaavat vierekkäin pinnalla on rengas, joka on ehdotettu välittävän kosketukseen E2-ligaasilla, UbcH5 ([39,40,42] Kuvio 2C). Lisäksi ne sisältävät useita aminohappoja, jotka ovat osoittaneet mutageneesillä analyysin keskeinen rooli MDM2-riippuvainen p53 ubiquitylation ja automaattinen ubiquitylation [39,40,41,42,43]. Sitoutumisen MAGE-A2 tämän alueen viittaa siihen, että se voisi vaikuttaa MDM2-riippuvainen ubiquitylation, mahdollisesti estävä tavalla.

MAGE-A2 vuorovaikutuksessa N-päähän MDM2

in vitro

samalla tavalla p53

lisätutkimukset yhdistyksen MAGE-A2, N-terminaalissa MDM2 osoitti, että kaksi vuorovaikutuksessa peptidit edustavat vastaavasti kummallekin puolelle hydrofobisen lehto, joka on vastuussa välittävä vuorovaikutus N-terminaalinen domeeni p53. Sijainnit Näiden peptidien sisällä kiderakenne MDM2 N-pään alueen [44] on korostettu punaisella ja magenta vastaavasti kuviossa 3A. Aminohappojen sekä näiden alueiden tarvitaan p53 sitoutumisen [44] viittaa siihen, että joko MAGE-A2 voivat olla vuorovaikutuksessa MDM2 tavalla samanlainen kuin p53: n, tai että se voi vaikuttaa p53 /MDM2. Sen määrittämiseksi, onko MAGE-A2 sitoutuu N-terminaaliseen päähän MDM2 solukko- yhteydessä ”MP1” MDM2 mini-proteiinin (joka käsittää aminohapot 1-110 MDM2) ilmennettiin fuusioproteiinina, jossa on vihreä fluoresoiva proteiini (GFP; kuvio 3B) yhdessä MAGE-A2 H1299 soluissa. Positiivisena kontrollina, p53 ilmennettiin sijasta GFP-MP1. Co-immunosaostusanalyysille (kuvio 3C) vahvisti, että molemmat MAGE-A2 ja p53-ohjaus pystyivät yhdistää GFP-MP1 (MDM2) viljellyissä soluissa. Yhteyttä ei ole havaittu, kun GFP, josta puuttuu MP1 laajennus on käytetty.

(A) rakenne N-päähän (p53-sitova domeeni) ja MDM2 (1YCR) esittää kantoja MAGE-A2-sitovia peptidejä 51 -65 (punainen) ja 91-105 (magenta). Selkäranka näkyy vihreällä. Sijainnit aminohappoa kyljet kunkin näistä peptideistä on esitetty. (B) Kaaviokuva rakenteen GST-MDM2 mini-proteiinia, MP1, käytettiin tässä kokeessa. Versio, jossa GST vaihdettiin GFP ja käytettiin viljelty solu ilmaisun ja immunosaostusanalyysille. (C) Co-immunosaostusanalyysille suoritettiin seuraava lauseke GFP-MP1 (tai GFP yksin kontrolli) H1299-soluissa yhdessä MAGE-A2 tai p53 (positiivisena kontrollina). (D) GST pull-down määritykset suoritettiin joka

35S-radioaktiivisesti MAGE-A2 tai

35S-radioaktiivisesti p53 verrokkina, vangittiin glutationi Sepharose 4B käyttämällä GST liittyy MDM2 mini-proteiinia, MP1, joka kattaa aminohapot 1-110 lukien hydrofobinen p53 sitova uurre. Yhdistyksen MAGE-A2 tai p53 mitattiin, kun läsnä on kasvavia pitoisuuksia Nutlin-3a. Yhteistyössä saostetaan MAGE-A2 ja p53-proteiinit havaittiin SDS-PAGE ja sen jälkeen fluorografialla. Huomaa, että

in vitro

transkriptio /translaation p53 synnyttää kaksi polypeptidiä. (E) kvantifiointi avattavasta kokeilu seuraavan densitometria. Kaikissa tapauksissa tiedot edustavat vähintään kolmen erillisen kokeen.

Voit testata ajatusta, että p53 ja MAGE-A2 sitoutuvat MDM2 samalla tavalla, GST pull-down Kokeet suoritettiin

in vitro

onko kilpaileva estäjä, Nutlin-3a, joka matkii p53 ja sitoo tiukasti sisällä hydrofobista uraan MDM2 joka muodostaa p53 sitoutumiskohtaan, voisivat estää vuorovaikutusta MAGE-A2 MDM2 [45] . Tiedot osoittavat, että kasvavien pitoisuuksien Nutlin-3a todellakin estää MAGE-A2 sitoutumisen N-päähän MDM2 (kuvio 3D ja 3E). Vuorovaikutus p53 kanssa MDM2, joka mitattiin samassa kokeessa kontrollina, myös progressiivisesti estää lisäämällä pitoisuuksia Nutlin-3a (kuvio 3D ja 3E). IC

50-arvot dissosiaatio p53 ja MAGE-A2 vastaavasti MDM2 oli 18 uM ja 10 uM osoittaa, että p53 sitoutuu tällä alueella verrattain paremmin kuin MAGE-A2. Kummallista, korkeampi Nutlin-3a todella päinvastaiseksi esto ja stimuloi sitoutumisen MAGE-A2 MDM2, vaikutus, joka ei ilmaantunut p53. Yksi mahdollinen selitys tämän vaikutus on, että ennen sitoutumisen p53 (tai p53 analoginen) voi vaikuttaa myöhemmän sitoutumisen MAGE-A2.

MAGE-A2 estää MDM2-välitteisen ubiquitylation viljellyissä soluissa mutta ei vaikuta p53 liikevaihdon

sen määrittämiseksi, onko todellakin MAGE-A-proteiinien voivat toimia MDM2 säätölaitteet, perustettu soluviljelmissä-pohjainen ubiquitylation määritystä käytettiin [35], jossa H1299-solut transfektoitiin yhdessä plasmideilla ilmentävät ihmisen villityypin p53 , MDM2, His-merkitty ubikitiini, ja kasvavia määriä MAGE-A2. 36 h transfektion jälkeen, solut lyysattiin 6 M guani- puskurissa, olosuhteet, jotka estävät deubiquitylation proteiinien ja häiritä tahansa ei-kovalenttisilla proteiini-proteiini-vuorovaikutuksia. His-merkitty ubiquitylated proteiinit puhdistettiin affiniteettikromatografialla käyttämällä Ni

2 + -agaroosihelmillä, sitten tämän jälkeen eluoitiin ja analysoitiin Western-blottauksella anti-p53-vasta-aine, DO-1. Tiedot (kuvio 4A, ylempi paneeli) vahvisti, että MDM2 pystyi ubiquitylate p53 tässä määrityksessä, ja tärkeintä, vähentävät p53 tasoilla. Erityisesti p53 ei ubiquitylated mukaan MAGE-A2 yksinään (vertaa kaistoja 1, 2 ja 3).