Krooninen sairaus

tiivistelmä

Mahdollinen strategia diagnosoimiseksi keuhkosyöpä, suurin syy syöpää liittyvä kuolema, on tunnistaa metabolisen allekirjoituksia (biomarkkereita) taudin. Vaikka tiedot tukevat hypoteesia, että haihtuvat yhdisteet voidaan havaita hengitystä keuhkosyöpäpotilaiden jonka hajuaistin tai bioanalyyttisissä tekniikoita, analysointi puhallusnäytettä on hankalaa ja teknisesti haastava, mikä rajoittaa sen sovellettavuutta. Hypoteesi tutkitaan tässä on, että vaihtelut pienimolekyylimassaiseksi haihtuvia orgaanisia yhdisteitä ( ”hajusteita”) virtsaan voitaisiin käyttää biomarkkereita keuhkosyöpään. Osoittaakseen läsnäolo ja kemiallisten rakenteiden haihtuvien biomarkkereiden, tutkittiin hiiren haju–ohjattu käyttäytymistä ja metabolomiikan haihtuvia aineosia virtsaa. Anturi hiiret voidaan kouluttaa syrjiä hajuja Hiirten ja ilman kokeellisia kasvaimia, jotka osoittavat haihtuvat hajusteita riittävät tunnistamiseen on kasvain. Tämän mukaisesti tulos, kemialliset analyysit virtsan haihtuvien osoitti, että määrät useita yhdisteitä olivat dramaattisesti erilainen välillä kasvain ja ohjaus hiirillä. Käyttämällä Pääkomponenttianalyysin ja ohjattua kone-oppimisen, me tarkasti syrjivät kasvain ja kontrolliryhmää, että tulos oli rajat validoitu uusi testi ryhmien. Vaikka jaettiin eroja koe- ja kontrolliryhmissä eläimiä kahdessa kasvaimen mallia, löysimme myös kemiallisia eroja näiden mallien, jotka osoittavat kasvaimen perustuvaa erityisyyttä. Onnistuminen Näiden tutkimusten avulla saadaan aikaan uusi proof-of-periaatteen esittely keuhkojen kasvain diagnoosin kautta virtsaan haihtuvia odorants. Tämä työ pankin tulisi rohkaista samankaltaisia ​​hakuja haihtuvien diagnostisia biomarkkereiden virtsassa ihmisen keuhkosyöpäpotilaiden.

Citation: Matsumuran K, Opiekun M, Oka H, ​​Vachani A, Albelda SM, Yamazaki K, et al . (2010) Virtsan haihtuvat yhdisteet kuten biomarkkereita Lung Cancer: periaatteen todiste Study käyttäminen Haju allekirjoitusten Mouse mallit keuhkosyöpään. PLoS ONE 5 (1): e8819. doi: 10,1371 /journal.pone.0008819

Editor: Xiaoping Pan, East Carolina University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 15 elokuu 2009; Hyväksytty: 16 joulukuu 2009; Julkaistu: 27 tammikuu 2010

Copyright: © 2009 Matsumuran et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Panasonic Corporation. Kuten alla kilpailevan edun osassa, työntekijä Panasonic, tohtori H. Oka, auttoi ajatella alkuperäisen ajatuksen ja tarkistetaan käsikirjoituksen. Mikään muu rooli tässä tutkimuksessa oli soitti tri Oka ja Panasonic.

Kilpailevat edut: Tämä tutkimus tukivat avustusta Panasonic Corporation. Kirjoittajat julistaa ole muita kilpailevia intressejä. Ei ole olemassa patentteja tai patenttihakemuksia perustuu työn ja ei ole syntyvien tuotteiden työstä kehitteillä. Mikään kirjoittajat, syrjään yhden co-kirjailija, joka työskentelee Panasonic (Dr. Oka), olla taloudellisia suhteita, voitaisiin pitää asiaa lukien osakeomistukseen, konsultoitavia tai matka-apurahoja tai palkkioita. Dr. Oka auttoi ajatella alkuperäisen idean tähän työhön ja tarkistetaan käsikirjoitus mutta muut coauthors suunniteltu tutkimus, joka toteutettiin sen, analysoi tiedot ja kirjoitti käsikirjoituksen.

Johdanto

Keuhkosyöpä on suurin syy syöpään liittyvien kuolemien lähes koko maailmassa [1]. Ainoa hoito, että saavutetaan korkea hoito on kirurginen resektio varhaisen taudin (ennen metastaattinen leviäminen tapahtuu). Koska vain noin 25% tapauksista diagnosoidaan jo tässä vaiheessa, tehokas varhainen diagnostinen tekniikoita tarvitaan kipeästi.

Aggressiivinen ja varhainen rinnassa kuvantamisen Riskipotilaiden on nousemassa hallitseva lähestymistapa varhaisen diagnoosin, vaikka suuret tutkimukset vahvistamaan tämä lähestymistapa on vielä käynnissä [2], [3], [4]. Valitettavasti, vaikka kuvantaminen on melko herkkä, sillä on myös suhteellisen epäspesifinen. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että välillä 5-26% korkean riskin tupakoinnin potilailla on havaittavissa keuhkojen kyhmyjä CT seulonta kuitenkin vain keskimäärin noin 4% (vaihteluväli 2-11%) näistä kyhmyt ovat pahanlaatuisia [5]. Selvästi kirurginen resektio kaikkien näiden kyhmyjä ei ole käytännöllistä eikä toivottavaa. Lähestymistapoja mitkä kyhmyjä pitäisi poistaa siis tarvitaan. Yksi houkutteleva strategia olisi yhdistää herkkä kuvantamisen tekniikka biomarkkereiden keuhkosyöpään lisäämiseksi spesifisyyden [6], [7], [8]. Koska esiintyvyys keuhkosyövän tässä ”kyhmy väestö” on huomattavasti suurempi kuin nykyisten tai entisten tupakointi väestön biomarkkereita tässä yhteydessä ei edellytä erittäin korkea herkkyydet ja erityispiirteet tarvitaan väestön seulontaa. Toinen käyttö tällaisen biomarkkereiden voisi olla kulun seuraamiseksi kasvaimen käsittelyn jälkeen.

Kehittämisen kanssa suuren suorituskyvyn tekniikoita biomarkkereiden löytö [9], alan keuhkosyövän biomarkkereiden on viime aikoina laajentunut merkittävästi. Nykyiset biomarkkereiden ehdokkaita verestä, ysköksestä, ja virtsan sisältävät monta luokkaa molekyylejä, mukaan lukien proteiinit, kasvaimen antigeenejä, anti-kasvain-vasta-aineita, solutyyppispesifinen peptidejä, erilaiset metaboliset tuotteet, ja epigeneettisiä ilmiöitä, kuten hyper-metyloitu DNA, RNA, ja erityiset geenin ilmentymistä [10]. Ei kuitenkaan biomarkkereiden tunnistettu tähän mennessä on osoitettu olevan riittävän herkkä, spesifisyys ja toistettavuus voidaan pitää riittävänä käyttöön havaita ja valvoa keuhkosyöpää kehitystä.

Toinen luokka biomarkkereita keuhkosyöpä voi olla pieni molekyylipaino haihtuvia orgaanisia yhdisteitä. Nämä molekyylit, jotka voidaan mieltää hajut (erityisesti eläimet), on osoitettu toimivan ”allekirjoitukset”, jotka välittävät sosiaalisia, emotionaalisia ja terveystietoa muille jäsenille lajien [11]. Saattaa olla kaksi lähdettä haihtuvien merkkiaineiden keuhkosyöpäpotilaita. Tutkimukset ovat osoittaneet, että keuhkosyövän solulinjat voivat vapauttaa tiettyjä haihtuvia orgaanisia yhdisteitä

in vitro

[12]. Läsnäolo kasvava kasvain voi myös aiheuttaa spesifistä aineenvaihdunnan tai ravitsemuksellisia muutoksia, jotka voivat muuttaa tuotantoa tai vapautumista tällaisista yhdisteistä [6].

”haihtuva hypoteesi” keuhkosyöpään on johtanut useita tutkimuksia tutkia hyödyllisyyttä analysoida näiden yhdisteiden uloshengitysilman joko eläimiä (kuten koirat) [13] tai kehittyneempiä biokemialliset tekniikat [14], [15]. Jotkut näistä tutkimukset ovat osoittaneet lupausta. Esimerkiksi tuore tutkimus päässä Chen ryhmä [16] käyttämällä kiinteän faasin mikro-jota seuraa kaasukromatografisesti osoitti, että 1-butanolia ja 3-hydroksi-2-butanonia löydettiin huomattavasti suurempina pitoisuuksina hengityksessä keuhkosyövän potilaista kontrolleihin. Dragonieri et ai. käytti ”elektroninen nenä” ja pystyivät erottamaan potilaille, joilla on keuhkosyöpä verrattuna niihin, joilla on krooninen obstruktiivinen keuhkosairaus suhteellisen suuri herkkyys ja spesifisyys [17].

Valitettavasti kerätä, käsitellä, tallentaa, keskittämällä ja analysoimalla hengityksen näytteet on hankalaa, teknisesti haastavaa, ja voi siten olla helppo soveltaa laajasti. Osittainen ratkaisu näihin ongelmiin olisi käyttää paljon kätevä lähde haihtuvia, kuten virtsanäytteitä vaikka virtsa, kuten hengitys, sisältyvät paitsi endogeeniset haihtuvat vaan ulkosyntyistä niistä lähteistä, kuten ruokavalion ja ympäristöön. Tässä suhteessa, Willis et ai. (2004) raportoi, että koirat voidaan kouluttaa erottamaan virtsarakon syöpä pohjalta virtsan haju menestyksekkäämmin kuin olisi sattumalta odotettua yksin [18]. Valitettavasti seurantatutkimuksessa Gordon ET1 al. [19] ei pystynyt toistamaan nämä havainnot virtsanäytteistä potilaista, joilla on rinta- ja eturauhassyöpää.

Näiden ajatusten pohjalta, hypoteesi tarkastellaan tässä paperissa on, että vaihtelut pienimolekyylimassaiseksi haihtuvia orgaanisia yhdisteitä ( ”odorants ”) virtsassa voidaan käyttää biomarkkereita keuhkosyöpä. Yksi tärkeimmistä vaikeudet yritetään aluksi tunnistaa haihtuvien biomarkkereita ihmisen potilaista on suuri vaihtelu, jota johtua hallitsematon muuttujia kuten geneettinen ja ravinnon eroja, henkilökohtaisen hygienian tuotteen käyttöön, sekä muut ympäristön muuttujia, jotka voivat vaikuttaa kehon tuoksu haihtuvat. Havainto, että koirat voivat ilmeisesti suodattaa ne mahdollisia häiriötekijöitä ja keskittyä taudin allekirjoitus (katso edellä) esittää, että potentiaalisesti hyödyllisiä biomarkkereiden voi olla olemassa.

Kun otetaan huomioon näiden haasteiden valitsimme jatkamaan korkeammalle ohjattu eläinten malli lähestymistapa [20], [21], jossa monet muuttujat, jotka tekevät potilaan työ niin vaikeaa voidaan ohjata (kuvio 1A). Strategiamme oli ensimmäinen osoittaa, että hiiret voidaan koulutettu erottamaan virtsanäytteiden hiirten kasvainten ohjaus hiiriin haju yksin. Kun olimme perustettu tämä oli mahdollista, me sitten palveluksessa metabolinen profilointi (kiinteän faasin-microextraction, jonka jälkeen kaasukromatografia yhdistettynä massaspektrometria) osoittaakseen voisimme tunnistaa tiettyjä malleja haihtuvien virtsassa, jotka erottaisivat on kasvain kontrollieläimistä .

(A) Kohteen koemenetelmä. Meillä työskentelee mouse hajuaistin opastettu käyttäytyminen (vasemmalla) ja metabolomic (oikealla) lähestyy. (B) LKR solut ja LLC-solua injektoitiin ihon alle kylkiin aikuisen hiirillä ja kasvaimen koko mitattiin viikoittain sen jälkeen. Kunakin ajankohtana esitetään keskimääräiset ± SEM kasvaimen kokoa. Yhtenäinen viiva: todellisia tietoja; Pisteviiva: käyrä varustettu kuutiometriä toiminto; LKR: y = 0,092 * x

3-2,8 * x

2 + 38 * x – 18, LLC: y = 0,16 * x

3-0,83 * x

2 + 3,5 * x – 4. hiiren virtsaa kerättiin erikseen kerran päivässä ja käytettiin kemiallista analyysia ja Biotestin ajanjaksoina: for LKR – Days 15-24 ja 25-37 koulutukseen ja päivää 2-7, 9-14, 15-20 , ja 25-37 varten yleistys; For LLC – Days 17-26 koulutus- ja päivää 1-8, 9-16, ja 17-26 varten yleistys. (C) Laatikko käyrä yleistys pistemäärät biotestin ja korrelaatioista keskuudessa testit. Siniset laatikot edustavat alempaa ja yläkvartiilit. Punainen rekki jokaiseen laatikkoon osoittaa mediaani. Katkoviiva välillä havaintoja. Plus (+) merkitsee äärimmäisen outlier havaintoja. *;

P

0,01, **

P

0,001, ***;

P

0,0001 verrattuna nollahypoteesia 50% yleistys pisteet. Vasemmalta, LKR koulutettu hiiri virtsan yleistys LKR hiiren virtsassa (Training 1, kuvio 1 C-i); LKR- koulutettu hiiri virtsan yleistys LKR hiiren virtsassa (Training 2, kuvio 1 C-ii); LLC koulutettu hiiri virtsan yleistys LLC hiiren virtsassa (kuvio 1 C-iii); LKR koulutettu hiiri virtsan yleistys LLC hiiren virtsassa (kuvio 1 C-iv); LLC koulutettu hiiri virtsan yleistys LKR hiiren virtsassa (kuvio 1 C-v).

Tulokset

Hiiri mallit keuhkosyöpään

Keuhkokasvaimia peräisin hiiren solu linjat ovat yhtäläisyyksiä morfologia, histopatologia, ja molekulaariset ominaisuudet ihmisen keuhkojen adenokarsinoomia ja voi olla hyödyllinen ensimmäinen malleja [22]. Käytimme kaksi hiiren keuhkosyöpä solulinjat, LKR joka on peräisin siirtogeenisestä eläimestä ilmentävät mutatoitua Kras ja LLC, Lewisin keuhko- karsinooma, joka syntyi spontaanisti. Kasvaimia indusoitiin istuttamalla kukin näistä solulinjoista eri ryhmiin hiiriä (kontrolli hiiriin injektoitiin ajoneuvon, suolaliuos, samalla aikataululla). Kasvain kasvukäyrät nämä kaksi solulinjaa osoitti samankaltaista (kuvio 1 B). Perustuu kasvaimen kasvukäyrät, keräsimme virtsanäytteistä joka kesti vaiheet kasvaimen kasvua biotestin ja myöhempää kemialliset analyysit.

Haju-havaitseminen Virtsa Haju

koulutettu anturi hiiriä (katso menetelmät) ja erotella hajuja hiiren virtsanäytteitä kerätään LKR-ruiskutetaan hiirten kanssa suuria kasvaimia (Days 25-37 post solu injektio) verrattuna geneettisesti identtisiä kontrollihiiriin ilman kasvaimia. Kun tämä oli onnistunut, testasimme, onko tämä oppiminen yleistää aiemmissa vaiheissa kasvaimen kehitystä. Kuten kuviossa 1C-i, koulutetun hiiret onnistuneesti erotellut virtsoissa kerättiin hiirten kasvaimia 25-37, 15-20 ja 9-14 päivää injektion mutta ei yleistää kasvaimiin hyvin varhaisessa vaiheessa (päivää 1-7 ). Seuraavaksi edelleen koulutettu näitä samoja anturi hiiriin käyttäen virtsoissa kerättiin vuorokausina 15-24 injektion. Vaikka nämä hiiret yleistää tätä koulutusta uusia näytteitä kerättiin hiirten kasvainten samankokoisia, ne eivät ole tehneet niin virtsoissa kerätty Days 9-14 tai 1-7 (kuvio 1 C-ii). Ohjaus kokeita tarkistanut, että koulutettu hiirillä ei eroteltu ruiskutetaan ja injektoimattomat hiirille ennen injektioita, jotka osoittavat, ettei bias alkuperäisessä hiiren virtsassa tai Y-sokkelossa laitteeseen.

tutkimiseksi yleisyyttä tämän tuloksen, koulutimme erillisen ryhmän anturin hiirten syrjiä virtsoissa hiirillä ilman ja ilman LLC aiheuttama kasvain. Tulosten malli oli lähes identtinen, että LKR-tuumoreita (kuvio 1 C-iii).

vieressä kysyttiin, hajuja, jotka liittyvät LKR ja LLC kasvaimet olivat havainnollisesti samanlaisia, testaamalla koulutettu hiirten virtsanäytteitä kerätään kasvain vs. kontrolli hiiriä eläinmalli erilainen kuin että ne oli koulutettu. Eli me kysytään hiiriä koulutettu erottamaan virtsoissa Hiirten ja ilman LKR aiheuttama kasvainten tunnistaisi (yleistää tämä vastaus) LLC kasvainta kantavien hiirten ja päinvastoin. Vastaus oli myöntävä (kuvio 1 C-vi ja -v). Nämä tulokset osoittavat, että kasvaimia aiheuttamien nämä syöpäsolulinjoista tuottaa yhteisiä (joskaan ei samanlainen, katso alla) haihtuvat biomarkkereita, jotka voidaan tunnistaa hajuaistin järjestelmien hiirillä.

karakterisointi Virtsan haihtuvien yhdisteiden

Me seuraavaksi ominaista luonnetta kemiallisen vaihtelun erottaa hiirten kasvainten ne ilman analysoimalla virtsan haihtuvia yhdisteitä kiinteän faasin-microextraction, jonka jälkeen kaasukromatografia yhdistettynä massaspektrometria. Tyypillinen kaikkien ionien kromatogrammit (-lämpökameroissa) suuri monipuolinen joukko piikkien voitiin erottaa (kuva S1). Neljäkymmentä seitsemän piikit valittiin henkilöllisyys Nykimiset perustuu heidän ottaa riittävän suuri piikkien korkeudet ja ei-päällekkäisiä -lämpökameroissa määritettynä silmämääräisesti. Kuten voidaan nähdä taulukosta 1 ja S1, piikit, joka koostuu erilaisia ​​kemiallisia rakenteita ja ovat mahdollisesti mukana useissa biologisissa toiminnoissa, esimerkiksi feromonivektori viestintä (2-heptanoni, 3,4-dehydro-

ekso

-brevicomin ja 2-

sek

-butyyli-4,5-dihydro- 6-hydroksi-6-metyyli-3-heptanoni,

β

-farnesene [23]). Havaitsi olivat yhdisteitä aiemmin raportoitu ihmisen virtsaan (nitrometaani, Dimetyylisulfonin,

o

toluidiinia, 2-etyyliheksaanihapon [24]).

Seuraava käytetään kvantitatiivisia analyyseja kyseisten 47 huiput onko hiiriä ja ilman kokeellisesti aiheuttama kasvaimia voitaisiin erottaa. Vaihtelu raaka-piikkien korkeudet osoitti selvästi eroja suhteelliset määrät eri yhdisteitä, jotka perustuvat läsnäolo tai puuttuminen kasvain ja syövän tyypit (kuvio 2A ja kuvio S2). Havaitsimme melko johdonmukaisia ​​muutoksia monille huippuja ja molempien kasvaimen ryhmille yleisin malli on vähentynyt tuotanto (alassäätöä) kasvaimen ryhmissä ja joko lisääntynyt tuotanto (up-asetus) tai vähäinen muutos lumelääkeryhmän (kuva S3). Esimerkiksi huippu 13 (5-hepeten-2-oni) on alassäädetty dramaattisesti seurauksena kasvaimen läsnä ollessa (kuvio 2B). Näin ollen, yleisen down-regulation haihtuvien yhdisteiden voi olla yhteinen piirre kasvaimen kasvua. Kuitenkin oli muita malleja muutoksen vähemmistön haihtuvia yhdisteitä. Esimerkiksi tuotannon huippu 37 (2-etyyliheksaanihappo) oli koholla molemmissa kasvaimen ryhmissä. Muutokset muissa piikkejä riippui syöpätyyppeihin (ja /tai hiiri kanta). Peak 29 (asetofenoni) oli alassäätöä että LKR-kasvain ryhmä ja ajan sääntelyn LLC kasvainta ryhmä taas huippu 33 oli alassäätöä vain LKR kasvain ryhmään. Kuva array juoni (kuvio 2C) osoittaa selvästi yleistä ero vaikutuksia kasvaimen kasvua.

(A) vertailu varhaisessa vaiheessa ja myöhäisessä vaiheessa 4 havainnollistava huiput valittu 47 piikit analysoitiin. Pystyakseli osoittaa intensiteetti (määrä) TIC; pystyviivat noin keskiarvon osoittavat SEM jokaisessa näytteenottopisteessä. Sininen edustaa alkuvaiheessa kun taas punainen edustaa myöhäisessä vaiheessa. Vaaka-akseli ilmaisee retentioaika. (B) Bar käyrä intensiteetti 4 havainnollistava huiput valittu 47 huiput analysoitu. Piikkien intensiteetti on piirretty jokaisen piikin. Red pylväät edustavat kasvaimen ryhmiä; siniset palkit edustavat kontrolliryhmiin. Vaalean sininen tausta osoittaa merkittävää eroa

P

0,0001 välillä kasvain ja kontrolliryhmiin. (C) raaka-intensiteetti 47 analysoidaan piikit saadaan vähentämällä alkuvaiheessa pois myöhemmin aikana (n = 25 kullekin 4 ryhmää). Tummemmaksi tarkoittaa huippu lisääntynyt kasvaimen kehitystä taas vaaleampi harmaa tarkoittaa huippu lasku seurasi kasvainten kehittymiseen.

syrjintä kasvain ja plaseboryhmän

vieressä eteni metabolomic profilointia tilastollisesti syrjiä ryhmien ja tunnistaa tunnusomaisia ​​piikkejä. Tätä varten yhdistimme kahta erilaista lähestymistapaa: pääkomponenttianalyysi (PCA) ja tukivektorikone (SVM). Ensimmäinen, PCA, mahdollistaa rakenteen Tietojoukon sanella erottamista näytteet ryppäitä yleiseen samankaltaisuus huippuarvot ilman tietoa näytteen identiteettiä. Käyrät PCA tulokset lasketaan normalisoidut arvot 47 huiput osoittivat erottuva erottaminen kemiallisen profiilin välillä kasvaimen ryhmien ja plaseboryhmän sekä syöpäsolulinjoissa (kuvio 3A ja 3B). Toiseksi, valvottu kone-oppimisen lähestymistapaa, joka perustuu SVM käytettiin määrittämään rajan kasvaimen ryhmien ja lumelääkeryhmässä. Tämä algoritmi pidetään kahden ensimmäisen pääkomponentit, PC1 ja PC2, luomaan kuvauksia näytteiden tämän korkean ulotteinen avaruus, ja sitten määritteli hypertaso joka parhaiten erottaa näytteitä kaksi luokkaa. SVM luokittelija onnistuneesti erotteli näytteet kasvain ja lumelääkettä luokat (näytetään hieno ääriviivat väriä sinistä ja punaista kuviossa 3A ja 3B). SVM onnistuneesti luokiteltu useimmat ihmiset antaa luokittelun tarkkuus 94%: n herkkyys on 88% ja spesifisyys 100% (LKR) ja tarkkuus 94%: n herkkyys on 100% ja spesifisyys 88% (LLC). Erityisesti vain 3 50 yksittäisten hiirien meidän Koepakettia oli luokitellut väärin. Siten valitut piikit sisältävät kemiallisia ominaisuuksia erottaa kasvaimen lumelääkettä hiirillä.

erottaminen kasvain ja lumelääkkeen ryhmien Periaate Components Analysis (PCA) ja sen rajan määritystä Support Vector Machine (SVM) on esitetty A (LKR ) ja B (LLC). Ympyrät edustavat yksilöt kasvaimen ryhmien ja kolmiot edustavat yksityishenkilöiden lumelääkeryhmän (Support vektorit: täydet ympyrät ja kolmiot). Taustan ääriviivat väriä, jotka vaihtelevat punaisesta siniseksi, osoittaa luokan todennäköisyys eri alueilla koneessa.

Cross validointi ja Essential Yhdistelmä Peaks

Validoida näiden analyysien, me palveluksessa 10-kertainen cross validointimenetelmän käyttämällä kaikkia 25 näytettä. Lisäanalyysiä, valitsimme 11 piikit alkuperäisestä 47 huiput että vaihteli kasvaimen ja lumeryhmässä,

P

0,0001 (taulukko 1). Koulutimme SVM luokittelija soveltamalla kaikkien loogisesti mahdollisia yhdistelmiä ilman toistoja näistä 11 piikit molempien mallijärjestelmien (LKR ja LLC). Yleistäminen suorituskyky SVM luokittelijoiden työllistää erilaista huippu klustereiden havainnollistettiin vastaanotin toimii (ROC) tilaa. Mikään yksittäinen huippu onnistuneesti luokiteltu joiden tarkkuus on suurempi kuin 95%. Kuitenkin luokittelu useita pareja huippuja johti tarkkuudella jopa 98 ± 2% LKR ja 100%: LLC (taulukko 2-i, -II ja taulukossa S2, kuva S4), joka vahvistaa, että parempi yleistys tukeutuu yhdistelmä huippuja. Jatkotutkimuksissa (tietoja ei esitetty) huomasimme, että SVM oli ylivoimainen suorituskyky Fisher Diskriminanttianalyysi, jota käytetään ilman valvontaa oppimismenetelmiä. Siten tunnusomainen huippu klusterit voivat luotettavasti erottaa kasvain ryhmien plaseboryhmissä ja saattaa olla diagnostista potentiaalia.

arvioimiseksi yleistys voiman huippu klustereiden uuteen ryhmään, loimme itsenäinen harjoittelu sarjaa (13 25 näytettä) ja testi sarjaa (säilyi 12 näytettä). SVM luokittimet harjoitteli 11 valitun huipun klustereita harjoitussarjassa tuotti parhaan yhdistelmän huiput, joiden tarkkuus 95% varten LKR ja 100% varten LLC testata sarjaa (taulukko 2-iii, -v ja taulukko S3, kuva S5 ).

Vaikka LKR ja LLC solulinjat ovat eri mallia järjestelmiä ja ne ruiskutettiin eri sisäsiittoisia hiirilajilla (joka itse todennäköisesti erilainen kehon hajut), meidän käyttäytymiseen tutkimukset ehdotti, että ne yhteisiin hajuja osoittaa läsnäolon tai kasvainten puuttuessa. Tämä havaittiin myös olevan asianlaita metabolomic analyyseissä. Ryhmä huippuja (klusterin), joka parhaiten ennustettu LLC tilan LKR tietojen määritettynä SVM (taulukko 2-iv) oli tarkkuus 98%. Toisaalta ryhmä huippuja, jotka parhaiten ennustettu LKR alkaen LLC (taulukko 2-vi) oli tarkkuus 91%. Vain yksi piikki (# 22; katso taulukko 2-iv, -vi) oli yhteinen näitä kahta ennustavaa klustereita. Luokittelu muiden huippu klustereita myös syntyy korkea diagnostinen tarkkuus (95%) ja merkittävän diagnostisten potentiaali (kuva S6).

Vuorovaikutteinen vaikutus kasvaimia ja Solulinjat

Vaikka oli yhtäläisyyksiä välillä kasvainmuodosta edelleen tilastolliset analyysit osoittivat myös, että vaikutukset kahden kasvaimen mallit metaboliaprofiilien eivät olleet identtisiä. Vuorovaikutusta kahden eri solulinjojen (LKR ja LLC) ja kasvaimen vs. plasebo analysoitiin 2-tie-analyysit varianssianalyysillä (kasvain ja plaseboryhmän kunkin kahden kasvainmuodossa) kullekin 47 huiput (kuvio 4 ja S7 ). Merkittävä vuorovaikutus ilmaisee kasvainspesifisyys. 47 erilliset analyysit, vuorovaikutus w’as merkittävä (

P

0,05) 11 tapauksessa (taulukko S3). Kontrolloimiseksi vääriä positiivisia johtuen testaus 47 huiput, meidän rajoitettu huomioon 4 piikkiä (nro 1, 7, 29, ja 33), jossa

P

0,002. Nämä vuorovaikutukset on esitetty kuvassa 4, jossa, esimerkiksi, huippu 29 ei osoita mitään eroa kasvain- ja lumelääkettä (

P

= 0,0387), mutta suuri ero kasvainmalleissa (

P

= 0,0002) . On tarpeeksi spesifinen erottamaan haihtuvat profiilit kahden kasvaintyypeissä.

Normalisoitu intensiteetti (pystyakselin) neljä piikkiä (A-D), jossa kaksisuuntainen ANOVA osoitti merkittävää (

P

0,002) vuorovaikutuksia osoittaa välisiä eroja kasvainmuodoista. Vaaka-akselilla on kunkin 4 paneelit (A-D) osoittaa, että kaksi vaihetta, aikaisin – ennen merkittävää kasvaimen kehittymisen vasemmalla ja myöhemmin – kehittymisen jälkeen merkittävää kasvaimen koko. Punainen: kasvain, Blue: lumelääke, Circle: LKR, Star: LLC.

Keskustelu

tunnistaminen haihtuvia biomarkkereita virtsassa tautien diagnoosi on alue erittäin lupaavia, mutta se perustuu rajoitettu ennen Tutkijavoimavarojen. Tiedot tässä asiakirjassa ovat sopusoinnussa hypoteesin, että diagnostisesti hyödyllisiä haihtuvia yhdisteitä valmistetaan potilailla, joilla on keuhkosyöpä ja erittyy virtsaan, mikä antaa tukea tämän diagnostisen lähestymistavan keuhkosyöpään.

Erityisesti meidän tutkimukset osoittivat, että eläinten hajuaistin lajien kuten hiiri (joka on herkkä hajuaistin järjestelmä [25], [26]), voi olla diagnostinen menestystä havaitsemaan keuhkosyövän allekirjoitukset virtsaan. Vielä tärkeämpää on, pystyimme matkimaan tätä kykyä käyttää bioanalytic tekniikoita. Tämä viittaa siihen, että on mahdollista luoda Biomimeettinen anturi perustuu tietoon hajuaistijärjestelmän seulonnassa diagnostisia hajusteita, jotka voivat olla käytännöllistä laajalti sovelluksia [27], [28], [29], [30]. Todellakin, geneettisesti ilmentävän hiivan haju reseptorin ja sen signaalitransduktion järjestelmä on osoitettu kykenevän havaitsemaan 2,4-dinitrotolueeni, yhdiste diagnostinen räjähteiden [31]. Keinotekoinen hajuaistin polymeeriin epiteelin ja malli glomeruli voisi havaita hajusteita siten matkien biologisen hajuaistin järjestelmä [32]. Lopulta, kuten anturit voisi johtaa kehitystä kaupallisesti saatavilla testipakkauksia. Kuitenkin myös siltä, ​​että metabolinen profilointi (kiinteän faasin-microextraction, jonka jälkeen kaasukromatografia yhdistettynä massaspektrometria) on toteuttamiskelpoinen vaihtoehto, joka olisi tutkittava tarkemmin.

metabolinen alkuperä monien diagnostisten biomarkkerit me tunnistettu ei tiedetä ja emme voi tunnistaa yhteisiä kemiallisia ominaisuuksia. Sen sijaan he saivat alkunsa joko erilaisia ​​endogeenisen biokemiallisia reittejä tai ympäristön (ulkopuolista) lähteistä. Nämä viimeksi mainitut yhdisteet (esim.

o

toluidiinia, ja 2-etyyliheksaanihapon) eivät todennäköisesti ole diagnostisesti hyödyllisiä. Niistä endogeenisen aineenvaihduntatuotteita, 2-heptanoni, feromoni, on raportoitu lisääntyvän pitoisuuden korosti rotilla, ja on havaittu ihmisen virtsassa [33]. 6-hydroksi-6-metyyli-3-heptanoni on myös aikaisemmin tunnistettu hiiren virtsassa vaikka emme voi löytää mitään raportin tämän yhdisteen ihmisen virtsasta. Havaittu vaihtelu ketonit funktiona tuumorin kasvua viittaa siihen, että ketogenesic reitit voivat olla mukana näissä malleissa keuhkosyöpään. Lisätutkimuksia olisi tarpeen määrittää, mitkä näistä diagnostisten aineenvaihduntatuotteiden kasvaimen alkuperää ja jotka ovat peräisin normaalista metabolisia prosesseja ja ovat joko myötä- tai ajan säätelee kasvainten.

Yhteinen alassäätöä havaitsimme seuraavat kasvainten kehittymistä monien yhdisteiden on huomionarvoista. Useimmat biomarkkerit raportoimat muut tutkijat ovat ajan säännelty. Yksi selitys näille eri havainnoilla asua havaitsemista strategiat muiden tunnistaa biomarkkereita. Joissain tutkimuksissa voi olla bias kohti etsiä uusi (ja siksi säädelty) biomarkkereiden yhdisteet taas menetelmämme ei ollut tällaisia ​​harhaa. Toinen mahdollisuus on, että tämä usein alassäätöä johtuu monimutkainen vaikutuksista kasvaimen eläimen aineenvaihdunnassa.

Vaikka SVM löytyy klustereita huippujen että ennusti kahden mallin välillä syövän (LKR LLC ja päinvastoin: Taulukko 2) suurella tarkkuudella, klustereiden olivat pääasiassa eri ennustamiseksi kahteen suuntaan. Tämä tulos näyttää olevan ristiriidassa eläin koulutus tutkimuksista, osoitti, että hiiret koulutettu erottamaan yksi kasvainmuotoja yleistää tämä oppi vasteen ilman lisäkoulutusta muille mallia. Tämä merkitsee sitä, että on joukko haihtuvien yhdisteiden (hajusteita) yhteiset kaksi mallia, jotka erottavat kasvain ei-kasvain hiirillä. Yksi todennäköinen selitys tälle ilmeistä epäkohta on, että yhdistelmät haihtuvien komponentteja, jotka olemme tunnistaneet kanssa SVM luokittelijoiden eivät ole samoja, jotka hiiret laittamaan sisään koulutuksen aikana ja testaus; ehkä muitakin komponentteja yhteistä kaksi mallia, jotka emme ole vielä tunnistettu. Jos näin on, yksi seuraavan haasteista on tunnistaa nämä uusien biomarkkereiden. Vaihtoehtoisesti voidaan todeta, että siellä oli yhtä yhdistettä, joka oli yhteinen ennuste molempiin suuntiin (# 22), emmekä voi sulkea pois sitä mahdollisuutta, että se oli tätä yhdistettä hiiret käytetään tekemään ero molemmissa tapauksissa.

tärkeä näkökohta mitään käytännön diagnostinen työkalu on sen kyky syrjiä eri tautitilojen. Vaikka kaksi mallia keuhkosyövän selvästi yhtäläisyyksiä haihtuvien profiileja, niillä on myös riittävän erilaiset, että ne voidaan erottaa vuonna metabolomic analyyseissä (kuva 4). Tämä kyky erotella läheistä sukua hiiren malleja keuhkosyöpään merkitsee sitä, että tietyn tyyppisten syöpien voi olla mahdollista diagnostista erilaistumista analyysien haihtuvien profiileja kuten kuvattu nykyinen tutkimus.

Future työtä eläinmalleissa voisi edetä kolme yhtenevät linjat. Ensinnäkin on tärkeää seurata kehityshäiriöitä muutoksia merkkiaineiden aikaisemmissa vaiheissa kasvaimen kehitystä. Ei vain tämä merkitystä määritettäessä, miten varhaisdiagnostiikan markkereita voidaan osoittaa, mutta se voi valaista mahdollisten mekanismien muutoksia haihtuvat seurauksena kasvaimen etenemistä. Toinen, erilaisia ​​kasvaintyyppien olisi tutkittava Lisäksi kaksi läheistä sukua tässä kuvatut. Tämä voisi myös tarjota tärkeitä vihjeitä mekanismi. Kolmanneksi, in vitro tutkimukset tuumorisoluihin on ratkaisevan tärkeää mekanismien ymmärtämiseksi.

Yhteenvetona pystyimme ensimmäistä kertaa tunnistaa haihtuvien kemiallisten allekirjoituksia virtsassa hiirimalleissa keuhkosyöpään käyttäen tiukkoja kokeellista käyttäytymisen ja analyyttinen tekniikat. Tämän merkitys tutkimus on se, että se mahdollisuutta käyttää virtsan haihtuvien havaita keuhkosyöpään. Kyky helposti kerätä ja tallentaa virtsanäytteistä on merkittävä etu tämän lähestymistavan yli analysointi haihtuvat uloshengitysilman. Vaikka tämä tutkimus on herättänyt monia kysymyksiä identiteetin ja lähde yhdisteiden havaittiin meidän hiiri malleja, emme aio jatkaa tähän suuntaan. Sen sijaan pidämme tätä tutkimusta tärkeänä todisteena pääasiallisen arvon tutkia virtsan haihtuvien käyttämällä biokemiallisia ja bioinformatiikan tekniikoita diagnostiikassa ihmisen keuhkosyöpä (ja ehkä muita syöpiä). Niinpä olemme aloittaneet kliiniset tutkimukset ihmisen potilaita. Nämä tutkimukset keskeisiin kysymyksiin herkkyys, spesifisyys, kokoa kasvaimia, jotka voidaan tarkasti havaita, mekanismeista havaitut muutokset haihtuvia profiilit, kyky yleistää eri tyyppisiä keuhkosyövässä, ja vaikutus nykyisten tai entisten tupakointi .

Materiaalit ja menetelmät

keuhkosyöpä solulinjat

Kras aiheuttama hiiren keuhkosyöpä (LKR) ja Lewis-keuhko karsinooma (LLC) solulinjat hankittiin ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA).