Krooninen sairaus

tiivistelmä

epiteelikasvaimet-to-mesenkymaalitransitioon (EMT), fenotyyppiset muutos solujen epiteelin joka mesenkymaaliset tyyppiä, on ajateltu olevan keskeinen tapahtuma invaasiota ja etäpesäkkeiden adenokarsinoomien. Nämä muutokset koskevat menetys keratiini ilmaisun sekä menetys solun polariteetin ja tarttuvuus. Me täällä tavoitteena oli määrittää, onko menetys keratiini ilmaisun itse asemien lisääntynyt invaasio ja etäpesäkkeiden adenokarsinoomista ja onko keratiini menetys johtaa fenotyypin muutosten liittyy EMT. Siksi käytimme äskettäin kuvatun hiiren mallia, jossa ehdollinen poistamista Keratiini klusterin II Cre-rekombinaasin johtaa menetykseen koko keratinmultiprotein perheelle. Nämä hiiret risteytyä vasta luotu Cre-rekom- indusoituva KRAS-driven hiiren keuhkosyöpään malli tutkia vaikutus keratiini tappio morfologia, invaasio ja etäpesäkkeiden sekä ilmentymistä EMT liittyvien geenien tuloksena kasvaimia. Me täällä osoittavat selvästi, että menetys toimiva keratiini tukirankansa ei muuttanut merkitsevästi kasvaimen morfologiaan tai biologian kannalta invaasion, etäpesäke, leviämiseen tai kasvaintaakkaa ja ei johtanut induktion EMT. Edelleen, kasvaimen solut eivät aiheuttaneet synkronoidusti ilmentymä vimentiinista, joka nähdään usein EMT kompensoimiseksi keratiini menetystä. Yhteenvetona tietomme viittaavat siihen, että muutoksia solujen muoto ja muuttoliike että taustalla EMT ovat riippuvaisia ​​muutoksista signaalipolkuja aiheuttaa toissijaisia ​​muutoksia keratiini ilmaisun ja organisaatio. Täten voimme päätellä, että menetys keratiini solun tukirangan sinänsä ei ole riittävä syy ajaa EMT tässä kasvainmuodossa.

Citation: König K, Meder L, Kröger C, Diehl L, Florin A Rommerscheidt-Fuss U, et ai. (2013) menettäminen Keratiini Cytoskeleton ei ole riittävä aiheuttamaan epiteelikasvaimet mesenkymaalitransitioon on Novel KRAS Driven Sporadic Keuhkosyöpä Mouse Model. PLoS ONE 8 (3): e57996. doi: 10,1371 /journal.pone.0057996

Editor: Victoria Lawson, University of Melbourne, Australia

vastaanotettu: 24 syyskuu 2012; Hyväksytty: 30 tammikuu 2013; Julkaistu: 11 maaliskuu 2013

Copyright: © 2013 König et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Työ rahoitti Saksan toimikunnan kautta SFB 832, Projekt A5 ja Z1 ja saksalainen syöpä Aid kautta CIO Köln /Bonn. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

fenotyyppiset muutokset epiteelin joka mesenkyymisolun tyyppi, jota kutsutaan epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon (EMT), ovat keskeisiä vaiheet ja metastaasit syövän. Yksi tunnusmerkki EMT uskotaan remontin solun tukirangan, kuten alas säätely epiteelin keratiineista, mikä johtaa muutoksiin solusta-soluun kiinnikkeistä ja muutoksia napaisuuden ja soluliikkuvuus [1]. Nämä muutokset on kuvattu useimpia adenokarsinoomien ja uskotaan tukemaan invasiivisuus kasvainten ja etäpesäkkeiden muodostumista [2], ja kestävyys kemoterapiaa [3].

Keuhkosyöpä, yleisin syy syöpäkuolemista maailmanlaajuisesti on perinteisesti jaettu pienisoluisen keuhkosyövän (SCLC) ja ei-pienisoluinen keuhkosyövän (NSCLC). SCLCs muodostavat 20% keuhkosyövässä [4]. NSCLCs on edelleen jaettu kolmeen histologinen alatyyppi: okasolusyöpä, adenokarsinooma ja neuroendokriininen kasvaimia. NSCLCs muodostavat suuria yhtenäinen primaaristen kasvainten, jotka poikkeavat SCLCs, jotka ovat kliinisesti erittäin aggressiivinen ja paljastaa kuolleisuus 95% [5]. SCLCs etäispesäkkeitä hyvin varhain, ovat ei-yhtenäinen ja esittävät hajanainen ja infiltratiivinen kasvumalli. Histologisesti, niille on ominaista epätäydellinen ja tiivistetyn keratiini tukirankansa näyttämään rytmittävät ja perinuclear jakelu.

Kun yhä kohdennettujen EGFR tyrosiinikinaasin estäjä (TKI) hoito adenokarsinoomat keuhkojen, useiden resistenssimekanismit vastaan hoito on syntynyt. Yhtäältä mutaatiot aiheuttavat steric muutoksia kohdeproteiiniin tai kiertämisen inhiboitu tavoitteen kautta rekrytointi toisen reseptorin tai signaalinmuuntajana ole havaittu. Toisaalta, linjan transformaatio käynnissä epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon (EMT) [6] tai uusiutumisen TKI käsitellään NSCLS kuin pienisoluinen keuhkosyöpä (SCLC) on kuvattu [7], [8]. Niinpä nämä kliiniset havainnot tukevat olettamusta, että etenemistä NSCLCs ja SCLCs voidaan käynnistää EMT.

Koska menetys keratiini ilmaisun on ajateltu olevan keskeinen EMT, havaitseminen pienentää tai kadonnut ilmaisua keratiineista

vuonna vivo

käytetään markkerina EMT monissa

in vivo

mallissa järjestelmiä sekä histologisen ihmisen osissa. Menetys keratiineista johtaa menetykseen soluliitos, kuten toiminnallinen desmosomeja ja sukkahousut risteykset, ja siksi vahva solu-soluadheesion [9], [10]. Erityisesti ilmaus vyöliitos säädellään EMT-geenien sekä adenokarsinoomia ja okasolusyöpää keuhkojen [11].

Kuitenkin tarkka toiminnallista roolia keratiini tappio kasvaimen kasvun, metastaasin ja invaasion ja sen rooli EMT ei ole selvästi vahvistettu missään tuumorimallissa. Siksi tutkimme, täydellinen menetys keratiini ilmaisun indusoi EMT, invaasio ja metastaasi. Tätä varten olemme kehittäneet uuden indusoituva hiirimallissa keuhkoadenokarsinooma viallisten koko keratiini tyypin II klusterin vajaatoimintaa aiheuttava muodostamaan mitään toiminnallista Keratiinifilamenttipari. Mallin, me täällä osoittaa, että täydellistä keratiinin tappio KRAS mutatoitunut keuhkokasvaimia ei vaikuta kasvain morfologiaan, invaasio tai etäpesäke, mikä osoittaa, että menetys keratiini solun tukirangan ei aja siirtyminen keuhkotuumoreiden pieniksi keuhkosyövän tai sarcomatoid fenotyyppi . Lisäksi EMT markkereita ole ajan säännelty keratiini-puutosta adenokarsinoomia.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Tutkimus toteutettiin tiukasti mukaisesti suositusten FELASA. Protokolla hyväksyi valiokunnan Ethics eläinkokeiden yliopiston Bonnissa. Kaikki pyrittiin minimoida kärsimyksen.

Generation of RASLO siirtogeenisiä hiiriä

indusoimiseksi keuhkotuumoreita, me syntyy ekspressiovektori, joka ilmentää mutatoitunutta KRAS

VAL12 sekä fuusio molekyyli, joka koostuu ovalbumiini, S-tag ja lusiferaasia molekyylin ohjaa 1,8 kb kana ß-aktiinin promoottori [4], kun Cre-välitteistä poistamista STOP-kodonin. RASLO hiiret syntyy esitumaan injektoimalla C57BL /6 x FVB F1 alkioiden kanssa onkogeeninen KRAS rakennetta, joka esitetään kuviossa 1A. Hiiriä kasvatetaan Keski eläimen laitoksen Bonnin yliopiston mukaan Federation of European Laboratory Animal Science Association ohjeita. Eläinten hoito komissio Nordrhein-Westfalenin hyväksyi kaikki hiiren kokeiluja.

(A) Kaavamainen konstruktio osoittaa strategiaa käytetään tuottamaan indusoituvaa KRAS ajettu keuhkosyöpä malli (RASLO). (B) Bio-Luminenssi kuvan kanssa otettuna IVIS-200 (Xenogen) kamera hännän fibroblastien kulttuurien RASLO perustaja hiirillä hoidon jälkeen 2 uM TAT-CRE proteiinia ja lisäämällä lusiferiini juuri ennen kuvantaminen, vahvassa signaalit 5 perustaja hiirillä . (C) Luciferase kuvantaminen (IVIS-200) 1 min ajan väliaineessa herkkyys RASLO hiiret 6 viikkoa induktion jälkeen 2 x 10

7 PFU Adeno-CRE i.n. (+) Tai jalostukseen valvonta (-). -Hiiriin ruiskutettiin i.p. kanssa lusiferiini 200 ul PBS: ää ja nukutetaan isofluraanilla hengitettynä. (D) makroskooppinen kuva keuhkosta RASLO hiiren 6 viikon ajan ja AdCre annon, ja (E) HE värjättiin osio useita kasvaimia 100x ja 400x suurennus. (F) PCR-analyysi DNA eristettiin solulinjoista, jotka ovat peräisin kasvain RASLO ja RASLO × KIIf /d hiiret osoittavat PCR-tuote on 240 bp: n osoittaen, että Stop kasetti on onnistuneesti poistettu CRE rekombinaasia kasvain. Vektori, jota käytetään tuottamaan hiiren kanta (pRASLO) ennen CRE hoitoa esittää 1200 ep: n fragmentti. Sama vektori Seuraavat Cre hoidon in vitro toimii positiivisena kontrollina CRE välittämä leikkaaminen ja näyttää odotetun 240 emäsparin kaistan rekombinaation jälkeen.

Seulonta RASLO siirtogeenisiä hiiriä

Tail leikkeitä perustajien käytettiin perustaa fibroblastiviljelmät ja PCR-analyysillä. Siksi hännänpää steriloitiin 70% etanolia, leikataan pieniksi paloiksi ja pilkottiin kollagenaasia neljä tuntia 37 ° C: ssa. Ne viljeltiin DMEM mukana 8% FCS, 2 mM glutamiinia ja penisilliiniä /streptomysiiniä. Viiden päivän kuluttua, hännän fibroblasteja käsiteltiin 2 uM Tat-Cre-proteiinin seitsemän tuntia ja seuraavana päivänä analysoitiin alla IVIS 200 bioluminenssi kamera lisäämisen jälkeen lusiferiini viljelyalustaan. PCR ja lusiferaasianalyysissä positiiviset perustajien käytettiin luomaan useita RASLO kantoja. Genotyypin suoritettiin hännän PCR: llä käyttämällä eteenpäin (5′- CAGTGCAATGAGGGACCAGT-3 ’) ja reverse-alukkeita (5′-CACCCTGTCTTGTCTTTGCTGATG-3’).

Tuotanto ja hallinto Adenoviraaliset CRE

HEK 293 solut infektoitiin rekombinantti-adenovirusta, joka ekspressoi Cre-rekombinaasia (AdCre) [12], jossa (MOI = 5). Viiden päivän kuluttua solut kerättiin ja virus vapautettiin nopeasti sulatuksen ja jäädyttämistä sykliä. Virus puhdistettiin ultrasentrifugissa cesiumkloridigradientin [13] Sen jälkeen, virus varastot muodostettiin kautta pitoisuus käyttäen Slidalyzer kasetteja (Thermo Fisher Scientific).

Ennen nenän soveltamista AdCre hiiret nukutettiin yhdistelmällä 10 mg /ml ketamiini /0,1% Rompun® PBS: ssä. Riippuen painon hiiren 150 ui ja 200 ui injektoitiin i.p. 2 x 10

7 PFU AdCre pipetoitiin nenän hiirten hengitettäväksi. Eläimet havaittiin vasta täysin hereillä ja mukava. Ei merkkejä stressistä ja epämukavuutta havaittiin. Sen jälkeen kasvain induktio, eläimiä tarkkailtiin päivittäin epämukavuuden merkkejä tai hengitysvaikeudet. Hiiriä ulkopuolelle jatkotutkimuksiin, kun hiiret osoittivat oireita hengitysteiden stressiä. Hiiriä kuvattiin säännöllisesti alle IVIS 200 bioluminenssina kamera (PerkinElmer). Lyhyesti, hiiret nukutettiin isofluraanilla hengitettynä ja sitten sai 2,8 mg D-Luciferin Firefly (Etu) 200 ul PBS i.p. ja kuvaamisen lämmitetylle vaiheessa. Hiiret tapettiin murtamalla niska jälkeen 6 viikkoa ja AdCre annon. Keuhkot olivat heti kiinnitettiin 4% PBS-puskuroituun formaliiniin 24 tuntia parafiiniupotusta tai jäädytettiin nestetyppeen kylmäsäilytys.

polymeraasiketjureaktio (PCR) B

DNA eristettiin solulinjoista tuotetaan siirtogeeninen hiiri keuhkokasvaimia tai tuore (FF) keuhkokudoksesta DNA Mini Kit (Qiagen). 50 ng templaatti-DNA: ta käytettiin reaktiota kohden. Kukin PCR-reaktio sisälsi 1 x puskuri, 0,2 mM dNTP, 2 mM MgCI

2, 0,2 U Taq-polymeraasia ja 0,2 uM aluketta. Osoittaa onnistuneen excision loxP 5 ’Lox5 eteenpäin: 5′-CTGCTAACCATGTTCATGCC-3’ ja 3 ’Ras5 reverse: 5′-CCTACGCCACAAGCTCCAAC-3’ käytettiin, jolloin saatiin tuote 240 bp. Ilman poisto on STOP-kodonin näitä alukkeita, jolloin saatiin tuote 1,2 kb. Vahvista keratiini lokus leikkaaminen seuraavia alukkeita: DEL (eteenpäin 5’TGAACCCAGGAGGTTGAGAC-3 ’ja reverse 5′- TGGCGTCGTGATTAGTGATGA) ja Flox (eteenpäin 5’GATAACCGTATTACCGCCTTTG-3’ ja reverse 5’CGCCCTCTTGTCTATATCAACC-3 ’).

Cell Lines

seuraavat solulinjat ihmisperäisiä käytettiin: A549, H1975, H460, HCC827, DMS114, ja SW1271 saatiin American Type Culture Collection. R. Thomas (Kölnin yliopisto) ystävällisesti: N417 [14], PC9 [15]. GLC1, GLC2 [16], ja GLC36 [17] olivat ystävällinen lahja Dr. L. de Leij (University of Groningen, Groningen, Alankomaat). NSCLC ja SCLC solulinjoja viljeltiin DMEM-alustassa, jota oli täydennetty 8% FCS: ää inkuboitiin 37 ° C: ssa ja 5% CO

2.

Hiiren keuhko- solulinjat muodostettiin RASLO KII + /+ ja KIIf /- hiirillä. Kasvaimet leikattiin leikkausveitsellä ja hajotettiin vähintään 3 tunnin ajan 37 ° C: ssa DMEM-alustassa /Hamin F12 Medium, jossa L-glutamiinia, jota oli täydennetty 2% naudan albumiinia, 0,5 ug /ml hydrokortisonia, 600 U /ml kollagenaasia, 5 ug /ml ihmisen insuliinia, 200 U /ml hyaluronidaasia, Hepes-puskuria 10 mM, ja penisilliiniä /streptomysiiniä. Solususpensio suodatettiin kahdesti ja punasolujen hajotettiin ACK hajotuspuskuria. Soluja viljeltiin DMEM-alustassa, jota oli täydennetty hiiren EGF 20 ng /ml, perus fibroblastikasvutekijät (bFGF) 20 ng /ml, hepariini natriumsuolaa sian suolen limakalvosta 4 ug /ml, B-27 Serum-Free Supplement, penisilliiniä /streptomysiiniä ja gentamysiiniä 35 ug /ml.

qRT-PCR

Kokonais-RNA eristettiin ihmisen keuhkosyövän solulinjoja tai cryo säilynyt hiiren keuhkokudoksesta (5 kertaa 10 um kalvot), jonka RNeasy Mini Kit (Qiagen). 500 ng kokonais-RNA cDNA: ksi käyttäen SuperScript ™ III H

– käänteistransskriptaasi ja Oligo (dt) 12-18 Primer (Life Technologies). qRT-PCR suoritettiin SYBR Green (Qiagen) käyttäen alukkeita, jotka kohdistuvat keratiinin 8 (eteenpäin 5′-GCCGTGGTTGTGAAGAAGA-3 ’ja reverse 5′-CTGTTCCCAGTGCTACCCT-3′). Koska siivous ohjaus käytimme 28 s RNA (eteenpäin 5’- CCCAGTGCTCTGAATGTCAA-3 ’ja reverse 5′- AGTGGGAATCTCGTTCATCC-3′). Lusiferaasi alukkeet oli seuraava sekvenssi: eteenpäin 5’-TTGCATTTTGATCCAGTCGAG-3 ’ja reverse 5′-TCGAGAGCGTGGATCAAACG-3’; ja kuten siivous ohjaus 18 s: eteenpäin 5’ACAGCCAGGTTCTGGCCAACGG-3 ’ja reverse 5’TGACCGCGGACAGAAGGCCC-3’.

Kaikki qRT-PCR: t ajettiin 7900HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems ), ja analysoitiin SDS2.2 ohjelmisto (Applied Biosystems). Kaikki näytteet analysoitiin kolmena rinnakkaisena ja ilmaisun taso laskettiin ΔΔCT menetelmää.

Immunofluoresenssikoe keuhkosyöpään solulinjojen

Solut maljattiin peitinlasien yön yli ja kiinnitettiin jääkylmässä metanoli 5 minuuttia , värjättiin sitten pan-keratiini (1:100, MNF116, Dako) ja DP-1 (1:100, DP-1, Progen) laimennettuna TBS /1% BSA /5% NGS: ssa 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Johdetun vasta vuohen anti-gp

Alexa488 (1:800, Life Technologies), vuohen anti-hiiri

TexasRed (1:800, Life Technologies) ja DAPI (1:1000, Life Technologies) laimennettuna TBS /1% BSA /5% NGS lisättiin soluihin 45 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Kuvat otettiin käännettyä mikroskooppia varustettu ApoTome (Zeiss).

immunohistokemia

Kudokset fiksattiin 4% PBS-puskuroituun formaliiniin, valettiin parafiiniin (FFPE). 3 pm dioja käytettiin histologinen tahrat. Immunohistokemia suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [18]. Seuraavia vasta-aineita käytettiin: Ki67 (01:25, TEC-3, Dako), K8 /18 (1:100, GP11, Progen), vimentiinistä (1:100, EPR3776, Abcam), E-kadheriinin (01:50 , SC-8426, Santa Cruz Biotechnology), ß-kateniinin (1:100, # 4270, Cell Signaling), CD56 (01:50, RNL-1, Abcam), etana (1:200, Abcam), synaptofysiinin (1 :200, SY38, Abcam), kromograniini A (1:200, Abcam), Slug (1:100, Abcam), Perk (01:50, Cell Signaling), CD44 (01:50, Abcam). Kaikki objektilasit skannattiin kanssa Pannoramic 250 dia skanneri (3D Histech.com).

Tilastot

Tilastot laskettiin Excel, Prism ja SPSS. Virhe palkit esittävät keskivirhettä keskiarvon. Studentin t-testiä käytettiin analysoimaan tietoja merkittäviä eroja. P-arvot 0,05 pidettiin merkittävinä ja merkitty kuvioihin seuraavasti: * p≤ 0,05, ** p≤0.01, *** p≤0.001.

Tulokset

Generation of RASLO hiiren keuhkosyöpään Model

syntyy uudenlainen siirtogeenisiä hiirimallissa (RASLO) keuhkojen adenokarsinooma, mikä upon CRE rekom- aiheuttama poistaminen lopetuskodonin ohjaa konstitutiivisesti aktivoitua kasvaimia synnyttävän KRAS

Val12 alla valvontaan 1,8 kb kana ß-aktiinin promoottori. Konstrukti myös ilmentää fuusio geenin, joka koostuu S-tag (immunohistokemiaan), lusiferaasi (in vivo havaitseminen kasvaimia) ja kanan ovalbumiinin (mallina kasvain antigeeni) avulla polyoomaviruk- sisäinen ribosomaalinen re-entry site ( kuva 1A). RASLO hiiret syntyy esitumaan injektoimalla C57BL /6 x FVB F1 alkioita. Tuloksena eläimet seulottiin onnistunut integrointi toiminnallinen konstruktio, inkuboimalla hännän fibroblastiviljelmät yhdistelmä-Tat-Cre-proteiinia [19] valmisteveron stop kasetti ja aktivoi konstruktio

in vitro

. Sen jälkeen, nämä fibroblasteja kuvattiin kanssa IVIS 200 bioluminesenssi kamera lisäämisen jälkeen lusiferiini viljelyalustaan ​​(Fig. 1 B) eläinten tunnistamiseen täysin toimiva integrointi RASLO konstruktin. Viisi perustajien tunnistettiin perustuvat PCR ja Lusiferaasimäärityksiä joista yksi osoitti ituradan siirto.

sovellettu adenoviruksen ilmentävien CRE rekombinaasia (AdCre) intranasaalisesti (i.n.) ja RASLO hiirillä. Keuhkotuumoreita kehitetty näissä hiirissä jälkeen 6-8 viikkoa, että voitaisiin visualisoida

in vivo

havaitsemalla bioluminenssina jälkeen i.p. injektio lusiferiinin (Fig. 1 C) ja olivat makroskooppisesti havaittavia

ex vivo

lukuisia valkoisia kyhmyjä kattaa keuhkoihin (Fig. 1 D). Kasvaimet, jotka syntyvät, RASLO hoidetuilla hiirillä AdCre käsitti useita papillaarikuvioiden adenoomien ja invasiivisia papillaarisen adenokarsinoomia (Fig. 1 E), joka on yhdenmukainen KRAS ajettu keuhkosyöpä mallit kuvattu aiemmin [4], [20]. Kasvaimen muodostuminen yksinomaan perustettiin keuhkoissa, koska emme noudata kasvainten muodostumista muita elin AdCre käsiteltyjen RASLO hiirillä. Genominen PCR-analyysi solulinjoja perustetaan RASLO keuhkokasvaimia paljasti poistamisen onnistuneesti stop-kasetti (Kuva. 1 F).

Alennettu Keratiini ilmentäminen SCLC

menettäminen keratiini ilmaisun on yleisesti havaittu EMT sekä muodonmuutos adenokarsinooma pienelle cell carcinoma (SCLC) [8]. Siksi me värjätään ihmisen keuhkojen adenokarsinoomia ja pienisoluinen keuhkosyöpä yksilöille keratiineista ja havaittiin vain perinuclearly kondensoidaan keratiini värjäytymistä SCLC näytteissä verrattuna vahva sytoplasmista värjäytymistä yhtenäisesti kasvava keuhkojen adenokarsinooman (Fig. 2A ylemmät paneelit). Samanlainen värjäytymät keratiineja havaittiin soluviljelmissä adenokarsinooma ja SCLC solulinjojen immunofluoresenssivärjäyksen (Fig. 2A, alapaneelit). Lisäksi me värjättiin desmoplakin että kun poissa, johtaa enemmän invasiivisia kasvaimen kasvua ja on poissa tai vähennetään monissa ihmisen epiteelisyövissä [21]. Vuonna SCLC, desmoplakin oli poissa, kun taas NSCLC ilmaisi desmoplakin (Fig. 2A). Tutkimme lisäksi, onko keratiineista ilmentyvät differentiaalisesti NSCLC ja SCLC solulinjoissa. Todellakin, SCLC solulinjat ilmensivät vähän tai ei lainkaan mRNA keratiini 8, kun taas NSCLC linjat ilmensivät runsaita tasoja keratiinin 8 mRNA (Fig. 2B).

(A) immunohistokemia on FFPE kasvaimen näytteitä pannulla Keratiini adenokarsinooma keuhkoissa ja tyypillinen SCLC (ylempi paneeli A). Immunofluoresenssi adenokarsinooma (HCC827) ja SCLC solulinja (GLC36) värjättiin pan Keratin (punainen) ja desmoplakin (DSP vihreä) (A, alempi paneeli). (B) Kokonais-RNA eristettiin paneelin ihmisen SCLC ja NSCLC-solulinjat. Suhteellinen mRNA ilmaisu keratiini 8 mitattiin qRT-PCR Mean suhteellinen ilmentyminen neljän rinnakkaisen analysoi kunkin solulinjoja on kuvattu, ja keskivirhe on osoitettu. Tilastollinen merkittävyys laskettiin käyttäen Studentin t-testi: * p≤ 0,05, ** p≤0.01, *** p≤0.001. Edustajalle kolmen erillisen kokeen.

Keratiini Loss in vivo ei johda EMT tai aggressiivisempaa tuumoribiologiassa

Sen tutkimiseksi, menetys keratiinin ilmaisun adenokarsinoomat keuhkojen toiminnallisesti johdot huonompaan tuumoribiologiassa aiheuttamalla EMT tai pienen solun fenotyyppiin, ylitimme RASLO hiirten indusoituvan keratiini KO linja (KII). RASLO hiiret villityyppisen keratiini tyypin II klusteri (KII + /+) tai kätkeminen yhden villityyppisen ja yhden knock-out-alleelin (KII +/-) tai yksi Floxed ja yksi knock-out-alleelin (KII f /-) hoidettiin AdCre intranasaalisesti. Kaikki kolme ryhmää hiirille kehittyi kasvaimia, jotka olivat havaittavissa

in vivo

by bioluminenssina kuvantamisen 6 viikon kuluessa (Fig. 3A). Kuuden viikon kuluttua AdCre hoidon, hiiret tapettiin ja kasvaimen taakkaa ja morfologia arvioitiin. Vahvistaa genotyyppi hiiret ja keuhkojen kasvainten, teimme PCR-reaktiot DNA uutetaan koko keuhkojen hiirten spesifisiä alukkeita RASLO konstrukti, poistettu ja Floxed Keratiini tyypin kaksi klusteri (Fig. 3B). Kaikki hiiret osoittivat läsnäolon RASLO rakentaa, ja odotetusti vain KII +/- ja KII f /- osoitti insertion DEL lokuksen, ja yksinomaan hiiret kanssa KII f /- alleelin antoi odotetun PCR-vyöhyke (Fig. 3B) . Käytimme kolmea eri toimenpiteitä määrällisesti kasvain taakka KII + /+, KII +/- ja KII f /- eläimet. Ensinnäkin määrällisesti kasvaimen taakkaa määrän mittaamiseksi lusiferaasin mRNA tuumoreita keuhkoissa qRT-PCR: llä (Fig. 3C). Lusiferaasin ilmentyminen voidaan korreloida kasvaimen kuorman, koska se on yhdessä ilmaistaan ​​RASLO konstrukti. Emme havainneet tilastollisesti merkittävä ero lusiferaasin mRNA-tasojen ryhmien välillä. Tämä osoittaa, että alennettu Keratiini ilmaisua ei johda lisääntyneeseen kasvaimen kuormitus.

(A) ryhmät RASLO siirtogeenisiä hiiriä ristissä päälle eri Keratiini II klusterin alleelit nukutettiin ketamiinia /rompunin, ja 2 x 10

∧7 pfu AdCre annettiin kuusi viikkoa aikaisemmin. Kasvaimen havaitsemiseen, hiiriin ruiskutettiin i.p. kanssa lusiferiini 200 ul PBS: ää ja kuvaamisen kanssa IVIS-200 (Xenogen) kamera. Bioluminescense verrataan edustava villityypin (ctrl), RASLO siirtogeenisiä villityypin Keratin lokuksen (KII + /+), RASLO siirtogeenisiä heterotsygoottista Keratin klusterin II ilmaisu (KII +/-) ja RASLO siirtogeenisiä hiiriä yhdellä knock-out ja yksi floxed Keratiini klusterin II alleeli (KII f /-) tässä näytetään. Eri ryhmät osoittivat bioluminenssina signaaleja vastaavia intensiteettiä. (B) Alleelispesifinen PCR-analyysejä varten DNA eristettiin kylmäpresipitaattien konservoituneita keuhkojen kasvaimet RASLO hiirillä ilmaisemiseksi Flox, DEL, ja RASLO alleelit suoritettiin. (C) Luciferase mRNA: n ilmentymisen taso määritettiin kylmäpresipitaattien säilytetty keuhkoihin qRT-PCR arvioida kasvaimen kuormaa. Expression taso normalisoitui 18 s RNA. (D) kvantifiointi kasvaintaakkaa alueittain kolmeen osaan per keuhko. Kolme edustavaa HE-per keuhko analysoitiin suhteessa prosenttiosuus kasvaimen alueella (ylempi paneeli) ja kasvaimen kokoa (alempi kuva). FFPE osat värjättiin K8 /18 ja kuvaamisen kanssa Pannoramic250 (3DHistech) dia skanneri. Maksimaalinen kasvaimen halkaisija on enintään kolmekymmentä kasvaimia edustaja kasvain leikettä kohti mitattiin 3DHistech Pannoramic Viewer ja keskimääräisen maksimaalisen halkaisijan vertailla eri genotyyppien. (F) immunohistokemiallinen värjäys keratiineista 8 ja 18 kasvainten RASLO KII f /- hiirissä. (G). Mittakaavapalkki edustaa 100 um. Villityypin RASLO kasvaimet (vasemmalla) verrattuna KII – /- kasvaimia oikealla näkyvät HE värjää (ylempi paneeli) ja keratiini 8 ja 18 (alempi paneelit) Arvot on kuvattu keskiarvona +/- SEM. Tilastollinen merkittävyys laskettiin käyttäen Studentin t-testi: * p≤ 0,05, ** p≤0.01, *** p≤0.001. Edustajalle kolmen erillisen kokeen.

Lisäksi arvioimme kasvain kuorman arvioimalla% keuhkojen kuuluvalla alueella kasvain kolmeen sagittaalista osissa keuhkoihin kaksi sokaissut riippumattomia tarkkailijoita. Tämä osoitti, että kasvaimet vastaavan kokoisia kehitetty RASLO hiirillä kuljettavat eri keratiinin genotyyppien (Fig. 3d). Lisäksi, kasvaimen koko arvioitiin mittaamalla kasvaimen halkaisija kuvien avulla skannattujen histologisia dioja. Kun vertaillaan eri genotyyppiä ei havaittu merkittäviä eroja (Kuva. 3E). Nämä tiedot viittaavat siihen, että puuttuminen ainakin yhden alleelin keratiini tyypin II klusterin ei merkittävästi vaikuta tuumoribiologiassa tässä KRAS perustuva malli keuhkoadenokarsinooma.

aktivointi KRAS konstrukti vaatii luo- välitteisen poisto 800 bp suuri DNA-fragmentti, joka sisältää STOP-kodonin (Fig. 1A). Jos haluat poistaa koko tyypin II keratiini klusteri, DNA-fragmentti 0,68 Mb on poistettava [10], [22]. Siksi emme odota, että kaikki kasvaimista RASLO × KIIf /- hiiret olisivat täysin vailla keratiineista. Visualisoida ne kasvaimia keuhkoissa RASLO × KIIf /- hiirissä, joissa floxed KII-alleeli poistettiin onnistuneesti, meillä värjättiin parafiinileikkeillä varten keratiineista 8/18. Noin 30% kasvaimista puuttuivat kokonaan keratiini ilmaisu, joka osoittaa, että todellakin cre-välitteistä deleetion KII klusterin ei ollut yhtä tehokasta kuin aktivointi KRAS konstruktin (Fig. 3F). Morfologisesti, keratiini puutosta kasvaimet olivat tyypillisiä papillaarikuvioiden ja -adenokarsinoomien erottaa viereisen keratiini kasvaimia varten samalla levyllä (kuva. 3F) tai KRAS aiheuttaman keuhkotulehduksen kasvaimia keratiini villityypin eläimiin (Fig. 3G). Sen tutkimiseksi, keratiini menetys vaikutti leviämiseen tai apoptoosin korko KRAS ajettu keuhkotuumoreita, päätimme leviämisen hinnat ja apoptoosin hinnat Ki67 ja halkaistut kaspaasi 3 värjäystä, vastaavasti, mutta eivät havainneet merkitseviä eroja (kuvio. 4A, B) . Yhteenvetona, nämä tiedot osoitettava, että menetys keratiini ilmaisua ei vaikuta kasvainsolun koko KRAS ajettu hiiren keuhkon adenokarsinooman ja läsnäolo 30% keratiini syöpäkasvain ei muuttanut yleistä tuumorikuorma, mikä viittaa siihen, että menetys keratiini ilmaisua ei suoranaisesti mukana perustamista pienisoluisen ja aggressiivinen fenotyypin SCLC.

(a) Ki-67 immunohistokemia on KII – /- puutteellinen kasvain (vertaa kuvio 5 samasta sarjasta leikesarjojen). (B) muodollinen analyysi 6 alueita kohti keuhko kuusi Keratiini villityypin ja KII – /- kasvaimissa paljastaa samanlainen Ki-67 leviämisen indeksi. Halkaistut kaspaasi 3 värjäys osoitti vain yhden positiivisia soluja (punainen nuoli) sisään Keratin puutteellinen (- /-) ja keratiini ilmentävät kasvaimet (KII).

Keratiini Menetys ei vaikuta ilmentäminen EMT ja Neuroendokriininen merkkiaineiden keuhkokasvaimia

vähentäminen keratiini ilmaisun ja tiivistymistä tulee pistemäinen perinuclear malli on ominaista neuroendokriini pienisoluisen keuhkosyövän ja sitä käytetään laajasti markkerina EMT in adenokarsinooman. Vaikka keratiini syöpäkasvain, joita esiintyy AdCre saaneilla KRAS × KIIf /- hiiret eivät eronneet morfologisesti niiden lähialueilla keratiini positiivisia kasvaimia, tutkimme onko keratiini syöpäkasvain ilmaisi lisämerkkiaineille liittyvät EMT ja SCLC fenotyypin.

immunohistokemia paljasti, että tyyppi III väli hehkulampun proteiini vimentiinista, joka on usein säädelty aikana epiteelin ja mesenkymaalitransitioon (EMT) menetyksen jälkeen keratiinin ilmaisun (Mani ua, 2008), ei ollut ilmaistu keratiini-myönteinen eikä -negatiivisilla kasvaimia ja KRAS x KIIf /- hiirissä (Fig. 5). Lisäksi kromograniinilla A, CD56, ja synaptofysiini ovat immunohistokemiallinen markkereita tyypillisesti ilmaistaan ​​pienisoluista neuroendocrine keuhko- [23], [24]. Kuitenkin sekä keratiini-positiivisia ja -negatiivisilla kasvainten KRAS × KIIf /- hiiret eivät ilmaise mitään näistä merkeistä (Fig. 5). Positiiviset säätimet spesifisyyden värjäykset on esitetty kuvassa S1. Sitten analysoitiin merkkiaineita, jotka liittyvät menetys solu-solu kontakteja aikana EMT. Erityisesti menetys E-kadheriinin aiheuttama useat transkriptiorepresso- kuten Snail, ja Slug [25] on tyypillistä EMT. Emme kuitenkaan ole havainnut, että keratiini-puutosta kasvaimia yli ilmaisi transkriptiorepresso- Snail, Slug tai kadonnut E-kadheriinin ilmentymisen (Fig. 6).

Hiiret nukutettiin ja 2 x 10

7 PFU Adeno -CRE virus pipetoitiin nenän hiiren hengitettäväksi. Hiiret tapettiin sen jälkeen, kun 6 viikkoa ja keuhkot hiiristä poistettiin ja formaliinia kiinnitetyille ja parafiiniin upotettu. IHCs for K8 /18, vimentiinistä, kromograniini A (chromo), CD56 ja synaptofysiinin (synapto) esitetään. Suurempi suurennos on Keratiini negatiivinen kasvain on esitetty oikeanpuoleisessa sarakkeessa ja alue laatikossa vasemmalla.

Kuusi viikkoa sen jälkeen, kun adeno-Cre annon jälkeen hiiret tapettiin ja keuhkot hiiristä poistettiin ja formaliini kiinnitetyille ja parafiiniin upotettuja. Suurempi suurennos on Keratiini negatiivinen kasvain näkyy oikeassa sarakkeessa ja alueelle boxed vasemmalla. Värjäykset sarja- osio EMT markkereita eli E-kadheriinin, Snail, Slug, ja β-kateniinin esitetään.

kehittäminen ja ylläpito vyöliitos riippuu multiproteiinikompleksissa on β-kateniinin, α kateniinin ja E-kadheriinin. Aktivoinnin Wnt signalointia, huomattava osa beta-kateniinin kulkeutuu tumaan kytkeä geenien ilmentymisen liittyy EMT [26]. Me värjättiin ß-kateniinin, mutta ei havainnut mitään ydin- ß-kateniinin ilmentymistä keratiini villityypin tai puutteellisia kasvaimet (Fig. 6). Olemme aiemmin osoittaneet solulinjoissa että puuttuu KII klusterin, ZO1 ja Desmoplakin enää sijaitsevat kalvo [22] Olemme pyrkineet värjäytyä Desmoplakin ja ZO1 päällä hiiren FFPE materiaalista. Kuvassa S2 värjäytymistä Villityypin hiiren ihon ja KII + /+ for ZO1 näkyvät. Voisimme havaita joitakin kalvomainen värjäytymistä ihonäytteen joka toimi positiivisena kontrollina. Emme kuitenkaan näe mitään kalvomainen värjäytymistä villityypin tai KII – /- kasvaimia. Lisäksi meillä värjättiin RASLO villi-typ ja keratiini puutteellinen kasvaimista pMAPK ja CD44 eikä tarkkailla ja ero (kuvio. S2). Yhteenvetona keratiini menetys meidän KRAS keuhkojen kasvain malli ei johtanut kasvainten kehittymisen pienellä solun fenotyyppiin tai ilmaus merkkiaineita, jotka liittyvät EMT. Nämä tiedot osoittavat, että keratiini menetys itsessään ei vastaa alkamisen EMT tai kehittämistä pienen solun fenotyyppi adenokarsinoomat keuhkojen hiirimallissa esitetään tässä.

Keskustelu

Loss keratin ilme on tunnusmerkki sekä pienisoluinen keuhkosyöpä ja EMT ja on ehdotettu parantamaan ja metastaasit. Lisäksi adenokarsinoomat keuhkojen joita on käsitelty uusia EGFR tyrosiinikinaasin estäjät, muuntaminen pienen solun fenotyypin ja EMT on todettu yksi useista resistenssimekanismeja kiertää hoito [8].

Jotta