Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

havaittu epätavallinen HOXB7 ilmentymistä ruokatorven okasolusyöpä (ESCC) aikaisemmin. Tämä tutkimus oli arvioida ennustetekijöiden merkitystä HOXB7 ja paljastaa mahdolliset mekanismi.

Methods

Immunohistokemiaa käytettiin vahvistamaan epänormaali ilmentyminen HOXB7 in ESCC. Prognostisia merkitys HOXB7 ilmentyminen analysoitiin kahden itsenäisen ikäryhmät. RNAi käytettiin luomaan kaksi stabiilia HOXB7-pudotus solukantoja. CCK8 määritys, solun kasvun käyrä määrityksessä, pesäkemuodostusta, virtaus syklin analyysi ja tuumorigeenisyystesti määritys nude-hiiriä käytettiin vaikutuksen tutkimiseksi HOXB7 proliferaatioon in vitro ja in vivo.

Tulokset

immunohistokemia vahvisti epänormaali ilmentyminen HOXB7 in ESCC verrattuna paracancerous limakalvon (18/23 vs. 9/23, p = 0,039). HOXB7 ilmentyminen korreloi positiivisesti T vaiheessa, imusolmuke etäpesäke ja TNM-luokitus. Mediaanielossaolosta potilailla, joilla on korkea HOXB7 ilme oli huomattavasti lyhyempi kuin alhaisen ilme (45 kk vs. 137 kuukautta, p = 0,007 varten kohortin 1; 19 kuukautta vs. 34 kuukautta, p = 0,001 varten kohortin 2). Monimuuttuja selviytyminen analyysi osoitti, että HOXB7 ilme oli toinen itsenäinen ennustetekijä (HR [95% CI] = 0,573 [,341-0,963], p = 0,036 varten kohortin 1; HR [95% CI] = 0,543 [0,350-0,844], p = 0,024 for kohortti 2). Kokeet in vitro ja in vivo osoitti, että kun knockdovvn HOXB7, leviämisen laski, kasvu laskeutui, pesäkkeitä muodostuminen kyky pienentää, G1-vaiheen pysähtymisen tapahtunut ja tuumorigeenisyyden supistuneet huomattavasti.

Johtopäätökset

HOXB7 voisi edistää syöpäsolujen lisääntymistä ja voi olla itsenäinen ennustetekijä potilaille, joilla ESCC.

Citation: Li H, Shen LY, Yan WP, Dong B, Kang XZ, Dai L, et al. (2015) vapautettiin HOXB7 Expression ennustaa huono prognoosi Potilaat, joilla Ruokatorven Okasolusyöpä ja Säätelee Cancer Cell Proliferation In vitro ja in vivo. PLoS ONE 10 (6): e0130551. doi: 10,1371 /journal.pone.0130551

Academic Editor: Nikki Pui-Yue Lee, The University of Hong Kong, HONGKONG

vastaanotettu: 27 tammikuu 2015; Hyväksytty: 21 toukokuu 2015; Julkaistu: 15 kesäkuu 2015

Copyright: © 2015 Li et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

rahoitus: kirjoittajat saanut mitään erityistä rahoitusta tähän työhön.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä olemassa.

Johdanto

tällä hetkellä ruokatorven syöpä on yksi yleisimmistä pahanlaatuisia kasvaimia maailmanlaajuisesti, ja ruokatorven okasolusyöpä (ESCC) on yleisin patologinen tyyppi Kiinan väestöstä [1, 2]. Vaikka leikkaus hallitseman monialaista hoitoa on lisännyt merkittävästi viimeisten kahden vuosikymmenen suhteen diagnosointiin ja hoitoon ESCC, ja tulos hoito on parantunut, pitkän aikavälin selviytyminen on edelleen epätyydyttävä [3]. Yksi parantamiseksi tehokkaita toimenpiteitä kokonaiselossaoloaikaa liittyy tunnistaminen kliinisen biomarkkereita kanssa ennustetekijöiden merkitys ohjata hoitoon. HOX-geenit ovat ryhmä säätelevien geenien alkionkehityksen. Perhe, jossa on 39 jäsentä, on jaettu neljään ryhmään, nimittäin A, B, C, ja D, jotka on sijoitettu neljään eri kromosomeissa [4, 5]. HOX-geenit koodaavat perheen transkriptiotekijöiden, ja niiden epänormaali ilmentyminen liittyy usein sairauksia, mikä houkuttelee entistä enemmän huomiota syöpätutkimuksessa [6, 7]. Aiemmat tutkimukset kehitysbiologian ovat osoittaneet, että HOXB7 normaalisti ilmaistaan ​​inhimillisen ruokatorven [8]. Niistä 39 HOX-geenit tutkittiin edellisessä tutkimuksessa kahdeksan ilmaistiin vain pahanlaatuinen kudos ESCC potilaista, mutta ei pariksi viereisen normaaleissa kudoksissa, mukaan lukien HOXB7 kanssa 58,3% positiivinen ilmentymisnopeudessa [9]. Siksi me arveltu, että HOXB7 ollut erityinen rooli ilmenemisestä ja kehittymisestä ESCC ja saattaa olla hyödyllinen molekulaarinen merkkiaine ennustamiseen ennustetta ja jopa ohjata hoitoon. Parhaan tietomme mukaan on olemassa harvinaisia ​​tutkimuksia HOXB7 ilmaisun ja ennusteeseen ESCC joihin liittyy suuri otoskoko, eikä in vivo ja in vitro tutkimukset keskustella taustalla olevaa mekanismia. Siksi esillä Tutkimuksessa tarkasteltiin ennustetekijöiden merkitys ja toiminnallinen mekanismi HOXB7 in ESCC kudoksissa.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Kaikki tutkimukseen liittyy ihmisen osallistujat hyväksyttiin jonka eettisten toimikuntien Peking Cancer Hospital, Kiina, ja suoritetaan noudattaen Helsingin julistuksen. Kirjallinen tietoon perustuva suostumus on saatu kaikille osallistujille.

Potilaiden ja kudosnäytteiden

validoimiseksi korkea ilmentyminen HOXB7 vuonna ESCC kudoksissa raportoitu edellisessä tutkimuksessa [9], 23 ESCC potilasta rekrytoitiin ja parafinoidut kasvain ja pariksi noncancerous kudosleikkeiden haettiin.

tutkimiseksi yhdistys HOXB7 proteiinin ilmentymisen kanssa ennusteen potilaita, joilla ESCC, kaksi riippumatonta tutkimusta ikäluokat sisällytettiin:

kohortti I.

tutkimusryhmä perustanut mahdollisille tietokanta ruokatorven syöpään sitten tammikuun 2000 1249 tapauksia esophagectomy suorittaa yhdellä-kirurgi joukkue (Dr. KN Chen) on peräkkäin kerätty. Tässä tutkimuksessa mukaanottokriteereihin oli seuraava: potilaista, jotka olivat patologisesti diagnosoitu ESCC ja tehtiin radikaali esophagectomy ilman induktiohoitona ennen leikkausta välillä tammikuu 2000 ja joulukuu 2011 yhteensä 177 tapausta täytti (taulukko 1). 7. painos TNM pysähdyspaikan järjestelmä (AJCC ja UICC, 2009) käytettiin luokitella potilaille.

kohortti II.

kohortti II mukana 103 potilasta, jotka olivat patologisesti diagnosoitu ESCC ja tehtiin radikaali esophagectomy useat kirurgit ilman induktiohoitona ennen mahdollisille perustettu tietokanta 1996-2002 (taulukko 1). Aineisto takautuvasti kerättiin mukaan potilastietoja ilman mahdollisille tietoja. TNM lavastus järjestelmä UICC 1987 käytettiin arvioimaan potilaille.

Follow-up menetelmillä

seurantatiedot kohorttiin I kerättiin mahdollisille tietokannasta. Leikkauksen jälkeen, avohoidon seurantakäyntejä tehtiin kerran joka 3 kuukausi ensimmäisen 2 vuotta, kerran 6 kuukauden välein 2-5 vuotta, ja kerran vuodessa 5 vuoden kuluttua. Yleinen eloonjääminen määritettiin aikana alkaen leikkauksen kuolemaan tai Viimeisimmässä seurannassa. Viimeinen seurannassa tarkastuspiste oli elokuu 2013. koko seuranta korko tietokantaamme oli 96,1%: 80,2% avohoitokäyntien ja 15,9% puhelimitse tai kirjain seurantaa. Puhelimitse tai kirjeitse seurantaan lähinnä mukana ne potilaat käymättä että poliklinikalla aikataulussa. Avohoidon seurannat mukana tallennus oireita ja useita tutkimuksia kuten CT, ylemmän ruoansulatuskanavan kuvantaminen, vatsan ja kahdenvälistä supraclavicular ultraääni, ja gastroskopian tarvittaessa. Vuoden 2010 jälkeen joillakin potilailla tehtiin positroniemissiotomografia TT (PET-CT) tutkimukset.

seurantatiedot kohorttiin 2 kerättiin tarkistamisen potilastietoja. Viimeinen seuranta-aika oli helmikuu, 2008 ja seuranta oli 80%.

Soluviljelmät

Ihmisen ESCC solulinjat EC109 ja KYSE150 saatiin Cell Bank of Chinese Academy of Medical Sciences, Peking, Kiina. EC109 viljeltiin DMEM-alustassa (Gibco), jota oli täydennetty 10% FBS: ää (Gbico) 37 ° C: ssa 5% CO2-ilmakehässä. KYSE150 viljeltiin RPMI 1640 -alustassa (Gibco), jossa 10% FBS (Gbico) 37 ° C: ssa 5% CO2 ilmakehässä.

Vektorit rakentaminen ja lentiviraalinen infektio

alassäätöä of HOXB7, neljä lyhyttä hiusneula (shRNA) sekvenssit (GCCGAGTTCCTTCAACATGCA/CGAGAGTAACTTCCGGATCTA/GCCTCACGGAAAGACAGATCA/CGAGAGTAACTTCCGGATCTA/GCCTCACGGAAAGACAGATCA/ACCTGTTCTGTAGCTTTCTGG) kloonattiin pGLV-h1-GFP-puro. Salattu sekvenssi (ACTACCGTTGTTATAGGTG) käytettiin kontrolleina. Lentivirusvektori rakentaminen ja pakkaus suoritettiin GenePharma Company (Shanghai, Kiina). Solut infektoitiin 50 ui suodatettua lentivirukselle supernatantti (1 x 10

9 TU /ml) kussakin kuopassa 24 kuopan levy läsnäolo 8 ug /ml polybreeniä (Millipore). Pysyvä so- kannat ilmentävät shHOXB7 valittiin 2 ug /ml puromysiiniä.

RNA, RT-PCR ja reaaliaikainen PCR

Kokonais-RNA soluja uutettiin TRIzolia (Invitrogen, Carlsbad , Kalifornia). RNA käänteinen litteroitiin cDNA: ita RT-PCR: llä (Fermentas Life Science). Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttämällä SYBR Green Realtime PCR Maser Mix (Applied Biosystems) havaitsemiseksi mRNA: n ilmentymisen tasoa kohdegeenien. GAPDH (glyseraldehydi-3-fosfaatti) käytettiin endogeenisen ohjaus. Sekvenssi käytetyt alukkeet ovat seuraavat: ja HOXB7, eteenpäin 5′-TATGGGCTCGAGCCGAGTT- 3 ’, käänteinen 5′-GGCCTCGTTTGCGGTCAGT -3′; GAPDH, eteenpäin 5’-TGCACCACCAACTGCTTAGC -3 ’, käänteinen 5’GGCATGGACTGTGGTCATGAG -3 ”. Kaikki määritykset suoritettiin kolmena kappaleena alle 7500 reaaliaikainen PCR-järjestelmää (Applied Biosystems) ja toistettiin kolme kertaa, mukaan valmistajan protokollaa. Arviointi suhteellinen ekspressio laskettiin vertaileva CT (kynnys sykli) menetelmällä. 2

-ΔΔCt viittasi kertaiseksi mRNA ilmaisun kohdegeenin verrattuna GAPDH ilmaisua samasta näytteestä.

Western blotting

Yhteensä solu-uutteet valmistettiin 1 x SDS latauspuskuria, erotettiin SDS-PAGE: ssa, siirrettiin osaksi PVDF-kalvoille, sitten immunoreagoida hiiren monoklonaalisella anti-HOXB7-vasta-aine (Abnova) primaarisena vasta-aineena. Vuohen anti-hiiri piparjuuriperoksidaasi-konjugoitua lgG: tä käytettiin sekundäärisenä vasta-aineena. Immunoreaktiivisuus havaittiin tehostetun kemiluminesenssin reaktio Kit (GE Healthcare). Latauskontrollina, glyceraldehyde- 3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) havaittiin käyttäen hiiren monoklonaalista vasta-ainetta (Abcam).

immunohistokemia

Kun rutiini deparaffinization ja nesteytys, kudosleikkeet käsiteltiin 3 % vetyperoksidia ja sitten kuumennetaan sitraattiliuosta (pH = 6,0) antigeenin haku. HOXB7 antigeeni-vasta-reaktio tapahtui yön yli 4 ° C: ssa sen jälkeen, kun vuohen seerumia esto. Hiiren monoklonaalinen anti-HOXB7-vasta-aine (Abnova) käytettiin 1 ug /ml (1: 1000), ja vuohen anti-hiiri-biotiini-konjugoitu IgG käytettiin sekundaarisena vasta-aineena. Immuunihistokemialliset signaaleja tekee kaksi riippumatonta tarkkailijaa. Tulokset laskettiin määrä värjäytyneiden solujen jaettuna määrä syöpäsoluja. Viisi edustava korkean tehon kentät (X400) leikettä kohti laskettiin ja tulokset laskettiin keskiarvo. Yksiselitteinen värjäys tuman 25% syöpäsolujen pidettiin korkealla ilme.

CCK8 määritys ja solujen kasvua käyrä

soluproliferaatiota määritettiin Cell Counting Kit-8 värjäys (Dojinodo , Shanghai, Kiina) mukaan valmistajan ohjeiden. Solut ympättiin 96-kuoppalevyille alkutiheydellä 5 x 10

3 solua /kuoppa. Kunakin ajankohtana, solut värjättiin 10 ui CCK8 väriaineen 90μl viljelyalustaan ​​2 tuntia 37 ° C: ssa. Absorbanssi mitattiin 450 nm: ssä, 650 nm: ssä vertailukohtana aallonpituudella. Tulokset vahvistavat manuaalisen solujen määrää. Solut ympättiin 24-kuoppalevyille alkutiheydellä 5 x 10

3 solua /kuoppa ja kerättiin eri ajankohtina ja laskettiin käyttäen hematosytometrillä. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

Pesäkkeenmuodostusta määrityksessä

Solut trypsinoitiin ja maljattiin 6-kuoppaisille levyille (300-500 solua /kuoppa) ja viljeltiin 3 viikkoa. Pesäkkeet värjättiin Giemsa tahra: ssa 30 minuuttia sen jälkeen, kun kiinnityksen 4% paraformaldehydillä 15 minuutin ajan. Kolme itsenäistä koetta suoritettiin.

Solusyklianalyysiä

Cell cycle jakelu tutkittiin virtaussytometrialla. 1×10

6 solua kerättiin ja kiinnitettiin 70% kylmällä etanolilla. Kiinnityksen jälkeen PI-värjäys ratkaisu RNaasi A: lla (BD Biosciences) lisättiin. 30 minuutin inkuboinnin, värjätään näytteet ajettiin FACScania cytometry (BD Biosciences), ja tiedot analysoitiin käyttäen FlowJo ohjelmistoa (Puu Star).

tuumorigeneesiä nude-hiirissä

Eläinkokeet olivat hyväksymä eettisten toimikuntien Peking Cancer Hospital, Kiina, ja suoritetaan noudattaen oppaassa hoito ja käyttö Laboratory Animals. Hiiriä pidettiin edelleen hoidossa laboratorion eläinten yksikkö Peking Cancer Hospital, Kiina. Vakaa shRNA transfektoidut solut (1 x 10

6) 100 ul: aan seerumivapaata DMEM: ää /RPMI 1640 injektoitiin s.c. oikeaan kylkeen on 4 6 viikon ikäisten Balb /C kateenkorvattomia nude-hiirissä. Kaikki hiiret pidettiin ja ylläpidettiin spesifisissä patogeenivapaissa olosuhteissa. Ksenograftikasvaimissa luotiin ja hiiret tapettiin taittamalla niiltä niskat kuluessa 4 viikkoa. Kasvaimet leikattiin, mitattiin työntömitalla ja painotettuna sähköinen analyysivaakaa. Kasvaintilavuudet laskettiin käyttämällä seuraavaa kaavaa: kasvaimen tilavuus = [(pituus) x (leveys) x (leveys)] /2. Kaikki kokeet tehtiin mukaisesti institutionaalisten vakiosuuntaviivat Pekingin yliopiston School of Oncology eläinkokeiden.

tilastollinen

Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen SPSS 19.0 tilastollinen ohjelmistopaketti. Kaikki in vitro kokeet suoritettiin ainakin kolmesti kolmena rinnakkaisena. Vertailut ryhmien välillä tilastollisen merkitsevyyden suoritettiin 2-tailed paritonta Studentin t-testiä. Baarit ja virhe baareja kuvaajat sekä tiedot tekstissä edustavat keskiarvoa ± SD. Vertailuja syövän ja pariksi normaaleissa kudoksissa testattiin käyttämällä Wilcoxonin testi. Väliset suhteet HOXB7 ilmaisun ja ennusteeseen viittaavia ominaisuuksia testattiin käyttämällä Chi-square testi. Survival käyrät piirrettiin Kaplan-Meier menetelmällä ja verrattiin log rank -testi. Cox suhteellisten riskien mallia vaiheittaisella menettelyä käytettiin monimuuttuja-analyysiin. P 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

ilmentymistä HOXB7 oli yläreguloituja ESCC verrattuna pariksi noncancerous kudosten

aiemmin raportoitu 8 39 HOX-geenit, mukaan lukien HOXB7 , poikkeuksellisen ilmaistuna ESCC kudoksissa, mutta ei noncancerous kudoksissa käyttäen käänteistranskriptio-PCR: llä [9]. Edelleen selvittämiseksi ilmentymisen HOXB7 proteiinin ESCC, immunohistokemia (IHC) tahra suoritettiin kasvaimet ja pariksi noncancerous kudosten ESCC potilaista. Todettiin, että HOXB7 proteiini pääasiassa tumassa normaalin ruokatorven epiteelisoluissa pohjapinta ja suprabasaalisissa kerroksia, kun taas kasvaimissa, HOXB7-positiivisten solujen jaettu laajalti. Vertaileva analyysi osoitti, että HOXB7 oli merkittävästi yläreguloituja 23 tutkittiin kasvaimen näytteistä (18/23) verrattuna viereisten noncancerous kudosten (9/23) (kuvio 1A, P = 0,039).

(A) edustaja näyte pariksi normaaleissa kudoksissa (a, b) ja ESCC (c, d). Normaalissa ruokatorven epiteelin, HOXB7 ilme oli rajoittuu lähinnä ytimen epiteelisolujen sijaitsee pohjapinta ja suprabasaalisissa kerroksia, kun taas ESCC, HOXB7-positiiviset solut laajasti havaittu kasvain (asia ei. 53865). (B) kuva a ja b, negatiivinen kontrolli, jossa primaarisen vasta-aineen korvataan PBS (Asia ei. 40146). Kuva c ja d, alhainen ilmentyminen HOXB7 vuonna ESCC (asia ei. 42873). Kuva e ja f, korkea ilmentyminen HOXB7 vuonna ESCC (asia ei. 36840). (C) Kaplan-Meier selviytymisen käyrän 177 potilasta kohortin I. Keskimääräinen elinaika oli 45 kuukautta korkea ilmaisun potilaille, mikä oli huomattavasti lyhyempi kuin 137 kuukautta heikkoa ilmentymistä potilailla (P = 0,007). (D) Kaplan-Meier selviytymisen käyrän 103 potilasta kohortin II. Keskimääräinen elinaika oli 19 kuukautta voimakas ilmentyminen potilaille, mikä oli huomattavasti lyhyempi kuin 34 kuukautta heikkoa ilmentymistä potilailla (P = 0,001).

HOXB7 proteiinin ilmentyminen liittyi kliinisiä piirteitä ja kokonaiselossaoloaika

kohortin I, korkea ilmentyminen HOXB7 proteiinin havaittiin 124 177 (70,1%) kasvain näytteissä (kuvio 1 B). Chi-square testi osoitti, että ekspressiotasot HOXB7 proteiinin korreloi merkitsevästi TNM (P = 0,034), T vaihe (P = 0,036) ja imusolmukkeen etäpesäke (taulukko 1, P = 0,042). Univariate analyysi osoitti, että potilailla, joilla oli matala HOXB7 ekspressiotasot elivät paljon pidempään (kuvio 1 C, P = 0,007). Keskimääräinen elinaika oli 45 kuukautta potilailla, joilla on korkea ilme, joka oli huomattavasti lyhyempi kuin 137 kuukautta potilailla, joilla on matala ilme (taulukko 2). Monimuuttuja selviytyminen analyysi vahvisti, että HOXB7 ilmaisun ja TNM-luokitus oli kaksi riippumatonta ennustavat tekijät kokonaiselossaoloaikaa potilailla, joilla ESCC (taulukko 3, HR [95% CI] = 0,573 [0,341-0,963], p = 0,036 varten HOXB7 heikkoa ilmentymistä).

kohortin II, korkeasta ilmentymisestä HOXB7-proteiinia ei havaittu 61 103 (59,2%) tapauksista kasvain kudosnäytteitä (kuvio 1B). Chi-square testi osoitti, että ekspressiotasot HOXB7 proteiinin korreloi merkitsevästi TNM (P = 0,001), T vaihe (P = 0,000) ja imusolmukkeen etäpesäke (taulukko 1, P = 0,006). Univariate analyysi käyttäen log rank testi osoitti, että potilailla, joilla on alhainen HOXB7 ekspressiotasot oli pitempi keskimääräinen eloonjäämisaika kuin suurella HOXB7 ilme (34 mons vs. 19 mons, P = 0,001) (kuvio 1D, taulukko 2). Monimuuttuja selviytyminen analyysi osoitti, että HOXB7 ilmentymistaso ja TNM-luokitus oli kaksi riippumatonta ennustavat tekijät kokonaiselossaoloaikaa potilailla, joilla ESCC (taulukko 3, HR [95% CI] = 0,543 [,350-,844], p = 0,024 varten HOXB7 alhainen ilmaus) .

Down-regulation of HOXB7 proteiinin väheni soluproliferaatiota in vitro

arvioimiseksi mahdollista roolia HOXB7 lisääntymisessä ihmisen ESCC solujen, me ensin havainnut ilmentymistä HOXB7 useissa ESCC solussa linjat. Reaaliaikainen PCR ja western blotting-analyysi paljasti, että EC109 ja KYSE150 todettiin suhteellisen endogeenisen ilmentymisen HOXB7. Siksi päätimme EC109 ja KYSE150 solulinjojen tutkimusta ja pudotti HOXB7 ilmaisua käyttäen RNA-interferenssi. Neljästä lentivirus lyhyillä hiusneula-RNA, paras valittiin perustettiin -solukanta vakaa knockdovvn HOXB7 proteiinia. Samaan aikaan, yksi lentivirus muokkaussalaus shRNA käytettiin kontrollina. Lopuksi EC109 /Scramble, EC109 /shHOXB7 ja KYSE150 /Scramble, KYSE150 /shHOXB7 perustettiin. Tehoa Knockdown tutkittiin reaaliaikainen PCR ja Western blotting. HOXB7 mRNA ja -proteiiniekspressio tehokkaasti alennetaan 80%: sta 85%: in EC109 ja KYSE150 solulinjoissa (kuvio 2A). CCK8 määritys osoitti, että HOXB7 pudotus laski leviämisen EC109 ja KYSE150 kontrolliin verrattuna soluihin (kuvio 2B; P 0,05). Manuaalinen solujen määrä on solujen vahvisti lasku leviämisen nähdään CCK8 määrityksessä. (Kuvio 2C; P 0,05). Pesäkemuodostusta paljasti, että EC109 /shHOXB7 ja KYSE150 /shHOXB7 solut muodostivat vähemmän ja pienempiä pesäkkeitä kuin kontrollisolut (kuvio 2D; P 0,05).

(A) pudotus endogeenisen HOXB7 tietyissä shRNA -transduced vakaa EC109 ja KYSE150 soluja, analysoitiin reaaliaikainen PCR ja western-blottauksella. (B) knockdovvn HOXB7 estää solujen kasvua määritettynä CCK8 määrityksessä. (C) knockdovvn HOXB7 estää solujen kasvua vahvistama manuaalinen solujen määrää. (D) knockdovvn HOXB7 estää solun kasvua osoitti mukaan pesäkemuodostusta. Virhepalkit edustavat keskiarvoa ± SD 3 erilliselle kokeelle. *, P 0,05.

Down-regulation of HOXB7 proteiinin väheni kasvaimen kasvua in vivo

Vahvista vaikutuksen HOXB7 on kasvaimia toimintaa ESCC solujen in vivo, suoritimme tuumorigeneesiä määrityksissä nude-hiirissä. Cell kantojen EC109 /Scramble, EC109 /shHOXB7 ja KYSE150 /Scramble, KYSE150 /shHOXB7 solua injektoitiin paljaisiin hiiriin. Ksenograftikasvaimissa poistettiin 4 viikon kuluttua injektion ja mitattiin ja painotetaan. Kuten on esitetty kuviossa 3A ja 3B, kasvaimet muodostama EC109 /shHOXB7 ja KYSE150 /shHOXB7 solut olivat merkittävästi pienempiä kuin kontrolli-solujen muodostettu kasvaimia. Keskimääräinen paino ja tilavuus kasvainten EC109 /shHOXB7 ryhmä olivat 869 ± 295 mg ja 870 ± 370 mm

3, vastaavasti, verrattuna 1292 ± 453 mg ja 1416 ± 472 mm

3. EC109 /Scramble ryhmä (P 0,05). Keskimääräinen paino ja tilavuus kasvainten KYSE150 /shHOXB7 ryhmä olivat 415 ± 254 mg ja 603 ± 362 mm

3, vastaavasti, verrattuna 697 ± 253 mg ja 1069 ± 377 mm

3. KYSE150 /Scramble ryhmä (P 0,05).

(A) Kasvaimet muodostetaan ruiskuttamalla EC109 /KYSE150 vakain knockdown HOXB7 proteiinia ja ohjaus soluja. (B) paino ja tilavuus kasvainten HOXB7-knockdown-soluja olivat suhteellisen pienempiä kuin kontrollisoluihin. (C) edustaja histogrammit analysoitiin virtaussytometrialla osoitti solusyklin profiilit ESCC soluja. Soluissa vakaa Knockdown HOXB7 proteiinia, solujen määrä S ja G2 vaiheisiin laski verrattuna kontrolliin soluihin. (D) osuus solujen eri vaiheissa solusyklin. Virhepalkit edustavat keskiarvoa ± SD 3 erilliselle kokeelle. *, P 0,05.

HOXB7 kiihtyi solusyklin etenemisen

Tavoitteena on tutkia mahdollisia mekanismi HOXB7 edistämisessä ESCC soluproliferaatioon, testasimme solusyklin jakautumisen virtaussytometrialla. Kuten kuviossa 3C, knockdovvn HOXB7 proteiinin johti G1 pidätys, joiden kasvu G1 suhteessa ja lasku S ja G2 osuus. Prosenttiosuus solujen S- ja G2-vaihetta EC109 /shHOXB7 ryhmässä oli 30,18% ± 1,16% ja 9,51% ± 0,23%: lla, mikä oli pienempi kuin kontrollisoluissa (31,75% ± 0,55% ja 14,36% ± 0,94%, kuvio 3D, P 0,05). Keskimääräinen prosenttiosuus solujen S- ja G2-vaihetta KYSE150 /shHOXB7 ryhmässä oli 37,31% ± 1,09% ja 28,70% ± 1,22% verrattuna kanssa 41.00% ± 1,32% ja 30,92% ± 2,21% vuonna KYSE150 /Scramble ryhmä (kuvio 3D, P 0,05). Nämä tulokset osoittivat, että HOXB7 saattaisi kiihdyttää G1 S-faasimuutos in ESCC solulinjoissa, joka osaltaan ESCC solujen lisääntymisen.

Keskustelu

Ideal kasvain biomarkkerit on hyvä ennusteen arvioinnissa ja voi ohjata kliininen käytännössä ja siksi etsiä arvokkaan ennustetekijöiden biomarkkereiden on saavuttanut pääkohteena onkologian tutkimukseen. Näistä epänormaali ilmentyminen alkionkehityksen liittyvien geenien maligniteetti on aina saanut paljon huomiota [10]. Esimerkiksi suhde karsinoembryonaalinen antigeeni (CEA) ja peräsuolen syövän ja että välillä alfafetoproteiinin (AFP) ja maksasyövän, joita on sovellettu onnistuneesti kliinisissä. Kuitenkin vasta nyt, hyvä kasvain markkereita ESCC ei ole tunnistettu käytettäväksi kliinisessä työssä. Meidän aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, epänormaali ilmentyminen 39 jäsentä HOX geenien mRNA-tasolla pahanlaatuinen ruokatorven kudok-. Niistä kahdeksan ilmennettiin vain pahanlaatuisen kudoksen ESCC potilaista, mutta ei pariksi viereisen normaaleissa kudoksissa, mukaan lukien HOXB7 [9]. Muut tutkimus osoitti myös, että HOXB7 ei ilmenny normaali ruokatorvi, mutta ilmentyy korkeammilla tasoilla mRNA tasolla ESCC [11]. Tämä tutkimus vahvisti nämä alustavat havainnot. Se osoitti, että ilmaus HOXB7 oli merkitsevästi korkeampi 23 näytettä pahanlaatuinen ruokatorven kudosta kuin pariksi viereisen normaali limakalvo, joka tarjoaa hyvän perustan harkita HOXB7 mahdollisena molekyyli- merkkiaine ESCC. Sitten tammikuun 2000 olemme yhtenäisen-kirurgi (Dr. Chen) mahdollisille ruokatorven syöpä tietokantaan ja peräkkäin palvelukseen 1249 potilaalla on ruokatorven syöpä, joille on tehty kirurginen resektio. Seurantakäynnit oli tarkoitus kaikille potilaille tietokantaan kuuluvan sen kuolemaansa saakka. HOXB7 ilmentyminen puretut 177 tapausta, jotka täyttivät kriteerit tutkittiin, ja sen suhde ennuste analysoitiin. Tulokset osoittivat, että HOXB7 ilmentyminen korreloi positiivisesti TNM vaiheessa (P = 0,034), T vaihe (P = 0,036), imusolmuke etäpesäke (P = 0,042). Keskimääräinen elinaika potilailla, joilla on korkea HOXB7 ilme oli huomattavasti lyhyempi kuin potilailla, joilla on alhainen HOXB7 ilme (45 kuukautta vs. 137 kuukautta, p = 0,007). Edelleen vahvistaa tämän tuloksen, teimme retrospektiivinen tutkimus toisella edellisestä kohortin potilaista, joilla ei ole mahdollinen tietojen. Samanlainen suuntaus havaittiin tuloksemme: HOXB7 ilmaus tässä kohortissa osoitti myös positiivinen korrelaatio TNM (P = 0,001), T vaihe (P = 0,000) ja imusolmuke etäpesäke (P = 0,006). Mediaani elinaika potilailla, joilla on korkea HOXB7 ilmentyminen oli huomattavasti lyhyempi kuin potilaiden, joilla on alhainen HOXB7 lauseke (19 kuukautta vs. 34 kuukautta, p = 0,001). Lisäksi monimuuttujamenetelmin muuttujien kuten ikä, sukupuoli, kasvaimen sijainti, TNM vaiheessa T vaiheessa N vaiheessa ja HOXB7 ilme osoitti, että HOXB7 ilmaisun ja TNM olivat riippumattomia ennustettaessa 177 potilasta rekrytoitiin mahdollisille tietokannassa (HR [95% CI] = 0,573, [+0,341-,963], p = 0,036) ja 103 potilasta rekrytoitiin toisessa kohortissa ilman mahdollisille tiedot (HR [95% CI] = 0,543, [+0,350-0,844], p = 0,024), mikä osoittaa, että HOXB7 oli ennusteen arvioinnissa potilaille, joilla ESCC.

tutkimaan edelleen toiminnallinen mekanismi HOXB7 esiintymisen ja kehittämiseen ESCC, tarkastelimme HOXB7 ilmentymistä useissa ESCC solulinjoissa ja jatkoon kaksi solulinjaa osoittaa korkea ilmentymisen HOXB7 (EC109 ja KYSE150) in vitro ja in vivo tutkimuksissa.

Ensimmäinen, RNA-interferenssi tekniikka käytettiin vakaan HOXB7-knockdovvn solu kantoja, joita sitten käytetään suorittamaan CCK8 määrityksen, pesäkkeitä muodostavat korko määritys, ja solusyklin analyysi virtaussytometrialla tarkkailla vaikutus HOXB7 solun proliferaatiota ESCC. Tuloksemme osoittivat, että nopeus soluproliferaation oli hitaampaa HOXB7-pudotus solukantoja, pesäkkeiden muodostumisen nopeus alennettiin, G1-vaiheen pysähtymisen tapahtui pahanlaatuisia soluja ja solujen osuus G1 vaiheissa lisääntyi merkittävästi. Edelleen todentamiseksi vaikutus HOXB7 in vivo soluproliferaatioon, käytimme knockdown solukantoja perustaa tuumorigeenisyystesti nude hiirimallissa ja totesi, että kasvaimia kapasiteetti naistaintumisprosenttia solukantoja oli huomattavasti alhaisempi kuin kontrolli soluja.

Itse asiassa dysregulaatio HOXB7 ekspression on raportoitu erilaisia ​​kasvaimia, mukaan lukien rintasyövän [12-14], munasarjasyöpä [15], suusyöpä [16], paksusuolen ja peräsuolen syövän [17], keuhkosyöpä [18] , melanooma [19-21] ja haimasyövän [22-24]. Yli-ilmentyminen HOXB7 oli osoitti liittyvän huonoon ennusteeseen rintasyövässä [14], suusyövästä [16], peräsuolen syöpä [17], keuhkosyöpä [18] ja haiman adenokarsinooma [22, 23]. Mutta kliinistä merkitystä HOXB7 in ESCC harvoin raportoitu. Oli kaksi artikkelia tutkimalla ennustetekijöiden merkitys HOXB7 ilmentymisen mRNA ja proteiini tasolla ESCC äskettäin, mutta otokset olivat hyvin vähäisiä, ja ne eivät vahvistaneet havaintonsa itsenäinen kohortin [25, 26]. Verrattuna näihin tutkimuksiin, emme ainoastaan ​​todentaa luotettavuutta havainnoistamme kahdessa itsenäisessä ikäluokat lukien 280 tapausta, mutta myös tutkittu edelleen tutkimaan mahdollisia toiminta HOXB7 in ESCC. On havaittu, että HOXB7 voisi edistää kasvainsolujen proliferaatiota muiden kiinteiden kasvainten [13-19, 27]. Mutta tähän mennessä ei ole tutkimuksia, joissa kartoitetaan mahdollinen rooli HOXB7 ja sen taustalla olevien mekanismien ESCC. Perustuen edellä keskusteltu alustavat havainnot, uskomme, että HOXB7 todennäköisesti tunnistettu ennustetyövälineenä biomarkkeri ESCC potilaille, ja epänormaali HOXB7 ilme voi vaikuttaa proliferatiivista kapasiteettia soluja.

Samalla olemme huomattava positiivinen korrelaatio korkeampi HOXB7 proteiinin ilmentymisen ja alueelliset imusolmuke etäpesäke. Niinpä teimme TranswellTM migraatiokokeessa ja Matrigel invaasiomääritys, mikä osoitti, että HOXB7 pudotus esti solujen vaeltamiseen ja invaasiota kyky EC109 ja KYSE150 (S1 kuvio; P 0,05). Mutta toiminta HOXB7 solujen invaasiota ja etäpesäkkeiden ESCC tarvitaan vielä etsintä.

mekanismeihin, jotka ovat asemaa HOXB7 in ESCC on epäselvä. Etsintä mekanismi mutkistaa sekvenssin samankaltaisuus HOX-geenit ja toiminnallinen redundanssi kirjataan HOX-geenin järjestelmä [7]. Kuten transkriptiotekijä, HOXB7 välittää sen vaikutuksia säätelemällä kohdegeenien transkription. Vaikka monien geenien on osoitettu olevan suoraan tai epäsuorasti säätelee HOXB7 muissa syöpäsoluissa, vain harvat niistä on todettu suoria tavoitteita, mukaan lukien bFGF [13, 22, 28]. HOXB7 voi suoraan aktivoida ilmentymistä emäksinen fibroblastikasvutekijä (bFGF) ja kasvun edistämiseksi erilaisten kasvainten, kuten rintasyövän ja melanooma [13, 19, 29]. Ja bFGF oli osallisena erilaisissa biologisissa prosesseissa, kuten proliferaatiota, erilaistumista, selviytyminen, ja muuttoliike [30]. HOXB7 ilmaus voisi edistää solujen kasvua laukaisemalla sekä intracrine ja autokriinisen bFGF kasvua stimuloiva reittejä munasarjakarsinoomissa [15]. Ilmaisu PAF voi aktivoida Ras-RAF-MAPK-reitin kautta autokriiniset signalointikaskadien rintasyövässä [12]. Se osoitti, että PI3K /AKT ja MAPK reittejä aktivoitiin HOXB7 kolorektaalisyövässä, mikä voi selittää kiihtyvä G1-S siirtymisen aiheuttama HOXB7 [17]. Yhteenvetona, nämä tulokset vahvistimme havaintoja ja selkeytetty tärkeyttä HOXB7 kasvainten synnyssä. Lisätutkimukset tunnistaa mekanismit noin HOXB7 ylävirtaan aktivaattoreita, loppupään tavoitteet ja toiminnalliset kumppanien kannattaisi paremmin ymmärtää roolin HOXB7 vuonna ESCC.

Tämä tutkimus on joitakin rajoituksia: kliiniset tiedot saatiin yhdestä keskuksesta, otoskoko ei ollut riittävän suuri, ja lääketieteellisiä tutkimuksia olivat takautuva todellisuudessa. Sen vuoksi tulevaisuudessa tutkimuksissa otoskoko olisi lisättävä, ja potilaita useista keskustasta olisi sisällytettävä selvittämään, onko HOXB7 voi toimia tietyn molekyyli- prognostinen markkeri ESCC. Lisäksi perusteellisen tutkimuksen molekyylitason mekanismeja, jotka ovat Euroopan roolia HOXB7 edistämisessä leviämisen ESCC solujen on perusteltua.

tukeminen Information

S1 Kuva. HOXB7 edistää ihmisen ESCC solujen vaeltamiseen ja invaasiota.

(A) knockdovvn HOXB7 estää solumigraation määritettynä TranswellTM migraatiokokeessa. (B) knockdovvn HOXB7 estää solun kasvua osoitti mukaan Matrigel invaasiomääritys. Virhepalkit edustavat keskiarvoa ± SD 3 erilliselle kokeelle. *, P 0,05.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0130551.s001

(TIF) B S1 tiedosto.