Krooninen sairaus

tiivistelmä

tavoite

Tetrameeristä α

2- makroglobuliinista (α

2M), plasma panproteinase estäjä, aktivoidaan kohdistamalla vuorovaikutusta proteinaasi, ja tehdään merkittäviä konformaation muutoksen paljastaen reseptorin tunnistuskohdan kussakin sen alayksiköistä. Aktivoidut α

2M (α

2M *) sitoutuu syöpäsolujen pinnalla GRP78 ja laukaisee proliferatiivisia ja antiapoptoottisten signalointi. Olemme tutkineet rooli α

2M * säätelyssä mTORC1 ja TORC2 signalointi kasvua ihmisen eturauhasen syöpäsolujen.

Methods

Käyttävät immunosaostustekniikoilla ja Western blotting samoin kuten kinaasimäärityksiä, aktivointi mTORC1 ja mTORC2 komplekseja sekä alas stream tavoitteita tutkittiin. RNAi käytettiin myös vaientaa ilmaisua Raptor, Rictor tai GRP78 rinnakkain tutkimuksissa.

Tulokset

stimulaatio solujen α

2M * edistää fosforylaatiota mTOR, TSC2, S6- Kinase, 4EBP, Akt

T308, ja Akt

S473 pitoisuutena ja ajasta riippuva tavalla. Rheb, Raptor, ja Rictor myös lisääntynyt. α

2M * solujen käsittely kohonnut mTORC1 kinaasiaktiivisuutta määritettynä kinaasimäärityksiä mTOR tai Raptor-immunosaostumissa. mTORC1 toiminta oli herkkä LY294002: n ja rapamysiinin tai solujen transfektio GRP78 dsRNA. Down säätely Raptor ilmaisun RNAi vähensi α

2M * aiheuttama S6-Kinase fosforylaation T389 ja kinaasiaktiivisuutta Raptor immunopresipitaatit. α

2M * hoidetun solut osoittavat noin kaksinkertaistamiseksi mTORC2 kinaasiaktiivisuutta määritettynä kinaasimäritykselle Akt

S473 fosforylaatiota ja tasot p-Akt

S473 vuonna mTOR ja Rictor immunopresipitaatit. mTORC2 toiminta oli herkkä LY294002 ja solujen transfektio GRP78 dsRNA, mutta herkkä rapamysiiniä. Down säätely Rictor ilmaisun RNAi vähentää merkittävästi α

2M * indusoima fosforylaatio Akt

S473 fosforylaatiota Rictor immunosaostumissa.

Johtopäätös

Sitovat α

2M * eturauhassyövän solupinnan GRP78 ylössäätelee mTORC1 ja mTORC2 aktivointi ja proteiinisynteesiä eturauhasen syöpäsoluja.

Citation: Misra UK, Pizzo SV (2012) Reseptori-Tunnistetut α

2-makroglobuliini sitoutuvan Cell pinta-Associated GRP78 ja aktivoi mTORC1 ja mTORC2 Signaling eturauhassyöpäsoluissa. PLoS ONE 7 (12): e51735. doi: 10,1371 /journal.pone.0051735

Editor: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Itävalta

vastaanotettu: 19 kesäkuu 2012; Hyväksytty: 5. marraskuuta 2012 Julkaistu: 14 joulukuu 2012

Copyright: © 2012 Misra, Pizzo. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kyky syöpäsolujen viihtyvät

in vivo

riippuu monista tekijöistä joiden joukossa ohjelmistoon proteiinien moduloivan niiden ympäristössä. Vaikka maksa tuottaa suuria määriä proteinaasinestäjä α

2-makroglobuliinireseptori (α

2M) se on valmistettu syöpäsoluja ja liittyy kasvaimen kasvuun [1]. α

2M tuotetaan myös paikallisesti kasvaimen strooman kudokseen kuten liittyy eturauhassyöpään [2]. Se on yleiseurooppalainen proteinaasinestäjä joka reagoi tuumorista peräisin matriksin metalloproteinaasien ja prostataspesifisen antigeenin (PSA). Vaikka PSA läheisimmin tunnistetaan, joilla on eturauhassyöpä, se tuottaa myös muita kasvaimia, mukaan lukien rinta- [3]. Kun proteinaasit hyökkäys ”syötti alueella” kussakin neljästä α

2M alayksiköt, tioliestereitä repeämä ja proteiini käy läpi erittäin suuri konformationaalisen muutoksen paljastaen reseptorin tunnistuskohtia kussakin alayksikössä [4]. Lisäksi tiiniproteinaasit altistuminen α

2M pieniin primäärisiä amiineja tai ammoniakkia, jonka suoran hyökkäyksen tioliestereitä, indusoi myös suuri konformaatiomuutos altistaa nämä reseptori tunnustamista sivustoja [4]. Nämä aktivoidut muodot merkitään α

2M *. Vaikka GRP78 (glukoosi säätelemä proteiini herra ~78000) tunnetaan ennen kaikkea asuva Endoplasmakalvosto kaperoni-, se näkyy solun pinnalla monentyyppistä pahanlaatuisten solujen [5] – [10]. Sitoutuminen α

2M * kasvainsolupinta pintaan GRP78 aiheuttaa sen autofosforylaatio [11], [12] aktivoimalla alas stream pro-proliferatiivisia ja antiapoptooppinen signa- kuten RAS /MAPK ja PI 3-kinaasi /Akt [5] – [10]. Se on siis esitetty, että säätelyä solun pinnan GRP78 on osa aggressiivinen fenotyypin eri syöpiä, kuten eturauhas- ja melanooma [8]. Sopusoinnussa tämän hypoteesin, autovasta-aineita vastaan ​​NH

2-terminaalisen domeenin GPR78 näkyvät seerumeissa eturauhassyövän ja melanoomapotilaita, jos ne ovat biomarkkeri aggressiiviseen käyttäytymiseen [13], [14]. Nämä vasta-aineet ovat agonisteja, jotka sitoutuvat samalla alueella GRP78 jossa α

2M * sitoutuu [15]. Sen sijaan monoklonaalisia vasta-aineita vastaan ​​suunnattuja karboksipään domeeniin GRP78 ovat antagonisteja α

2M * ja anti-GRP78-NH

2-terminaalinen domeeni-vasta-aineita soluviljelmässä ja hiirillä [10], [12], [16] – [20]. Perustuen näihin ja muut havainnot oletamme, että aktivoituna α

2M toimii kuten kasvutekijä ja solun pinnan liittyviä GRP78 kasvutekijänä kaltainen reseptori [5] – [10].

paneelissa A . α

2M * riippuu pitoisuudesta proteiinisynteesiä. Paneeli B. modulointi α

2M * aiheuttama-proteiinisynteesiä 1-LN-solujen. Tangot ovat: (1) puskuri; (2) α

2M * (50 pM); (3) wortmanniini 30 nM /20 min sitten α

2M * (50 pM); (4) LY294002 (20 uM /20 min) jälkeen α

2M *; (5) Rapamysiinin (100 nM /20 min), sitten α

2M *; (6) aktinomysiini D (5 ug /ml /15 min) ja sitten α

2M *. Arvot paneeli A ja B ovat keskiarvo ± SE neljästä itsenäisestä kokeesta. Arvot merkittävästi erilaisia ​​5% tasolla α

2M * hoidetun solut on merkitty tähdellä (*).

Akt on Ser /Thr-kinaasi ilmaistuna isoformeja, Akt1, Akt2, ja Akt3, joita koodaavat kolme erilaista geenejä [21]. Nämä isoformit ovat lähes identtinen aminohapposekvenssi; kuitenkin niiden suhteellinen ilmentyminen eroaa eri nisäkkäiden kudoksissa [21]. Akt on merkittävä alavirtavaikuttajainhibiittorit PI 3-kinaasi-reitin ja se säätelee solujen selviytymistä, proliferaatiota, ja aineenvaihduntaa. PI-3-kinaasi fosforyloi PIP2 tuottaa PIP3 joka sitoutuu Akt siten edistää sen translokaation solukalvon, jossa se fosforyloituu Thr308 on katalyyttinen domeeni, jonka PDK1 ja Ser473 hydrofobinen motiivi domeenin mTORC2 [21] – [24]. Fosforylaatio molemmissa näissä asemissa tarvitaan täydelliseen aktivaatioon Akt1. Akt1 on myös fosforyloituu yhteistyötä translocationally klo Thr450 että ”turn” motiivi by mTORC2 [25] – [27]. Vaihteessa motiivi fosforylaatio Akt on välttämätöntä syntetisoituneeseen Akt kantamaan oikean laskostumisen ja vakautta. Mutaatiot RAS jotka aktivoivat Akt, esiintyy -30% ja kasvaimia ja Akt-geenin monistaminen tapahtuu myös osajoukko ihmisen syövissä. Lisäksi osittainen ablaatio Akt on riittävä estämään kasvainten kehittymisen PTEN +/- hiirissä [28], [29]. Kliinisistä näytteistä eturauhassyövän yliekspressio ja aktivointi Akt1 liittyy korkea ennen leikkausta PSA-arvot, suurempi Gleason laadut, ja lyhyemmät taudin uusiutumisen kertaa [29] – [32]. Immunohistokemialliset tutkimukset osoittavat suuresti parannettu värjäytymisen p-Akt

S473 huonosti eriytetty eturauhassyövän [29], [32].

paneelissa A esitetään vaikutus ajan inkuboinnin solujen α

2M * (50 pM), ja paneeli B on esitetty vaikutus vaihtelevia pitoisuuksia α

2M * 25 min ekspressioon: p-mTOR

T2481 (O); Raptor (▵); Rictor (▴); GβL (□); p-TSC (•); ja Rheb (▪), kuten määritettiin Western-blottauksella. Edustaja immunoblot kolmesta viiteen kokeissa on esitetty kunkin proteiinin paneeli A ja paneeli B: n ilmentyminen näiden proteiinien on esitetty mielivaltaisina fluoresenssiyksikköinä ja ilmaistaan ​​keskiarvona ± SE kolmesta viiteen toisistaan ​​riippumattomasta kokeesta. Proteiinimäärän valvonta, joko fosforyloimaton kohdeproteiinit tai aktiini, tehtiin sekä paneeli A ja paneeli B on esitetty alapuolella immunobloteissa.

Mammalian rapamysiinin kohde (mTOR), evoluutiossa säilyneitä Ser /Thr- kinaasi on keskeinen säätelijä Akt-fosforylaation (ks arviot [33] – [37], ja siinä olevat viitteet). On kasvavaa kiinnostusta kohdistaminen mTOR hoidossa syöpien, kuten eturauhas- [28], [33], [34], [36], [37]. Tämä tavoite voidaan hankaloittaa se, että mTOR on läsnä kaksi fyysisesti ja toiminnallisesti erillisiä proteiini kompleksit nimetty mTORC1 ja mTORC2, vastaavasti (katso arvostelua 33-37, ja siinä olevat viitteet). Nämä kaksi kompleksit eroavat asetuksessa loppupään tavoitteet, ja herkkyys estäjä rapamysiini. mTORC1 on homodimeeri sisältävä mTOR Raptor, ja GβL; se on herkkä rapamysiini. Aktivoidut mTORC1 edistää solujen kasvua osittain suoraan fosforyloimalla translationaalisen sääntelyviranomaisten S6-Kinase ja EIF4E sitovan proteiinin (4EBP) (35). Akt aiheuttama fosforylaatiota PRAS40 ja Deptor aiheuttaa niiden irtaantuu Raptor ja edistää rekrytointia sen loppupään substraattien S6-Kinase1 ja 2, 4EBP1, ja 4EBP2 (katso arviot [33] – [37] ja siinä olevat viitteet). Sitovat Rheb • GTP mTORC1 tuloksia mTORC1 aktivointi, kun taas sitoutuminen Rheb • BKT sen eston. Fosforylaatiota TSC2 mukaan Akt1 estää sen GTPaasi toiminta johtaa lisääntyneeseen GTP kuormitusta Rheb ja johtuva lisääntynyt mTORC1 aktiivisuuden (katso arviot [33] – [37] ja siinä olevat viitteet). S6-Kinase säätelee mTORC1 läpi negatiivista palautetta signalointireitin fosforyloi IRS ja estää PI 3-kinaasin ja Akt aktivointi. MTORC2 monimutkainen, lisäksi mTOR, sisältää Rictor, GβL, Deptor, Protor, ja mSIN1 ja on epäherkkä akuutti rapamysiini inhibition (katso [33] – [37], ja siinä olevat viitteet). Kuitenkin pitkäaikainen mTORC2 altistuminen rapamysiini estää mTORC2 joissakin solutyypeissä [24], [33] – [35]. Protor sitoutuu tiukasti Rictor, mutta ei tarvita mTORC2 toimintaa [33] – [35]. Sekä mTORC1 ja mTORC2 aktivoidaan kasvutekijöitä, mukaan lukien insuliinin ja insuliinin kaltaisen kasvutekijä [33] – [35]. Kuitenkin mekanismit, jotka kasvutekijät aktivoivat mTORC2 ei ymmärretty [33] – [37]. mTORC2 assosioituu ribosomien ja tämä voi toimia ylävirran sääntelymekanismina [38], [39]. Insuliinistimulaation normaalien ja syöpäsolujen edistää mTORC2 sitoutumalla ribosomien ja PI 3-kinaasisignaloinnin [38], [39]. GβL sitoo mTORC1 ja mTORC2 lähellä kinaasialue ja tarvitaan mTORC2 eheyden. Deptor myös sitoutuu sekä mTORC1 ja mTORC2 lähellä kinaasialue ja säätelee negatiivisesti sekä mTORC1 ja mTORC2 toimintaa [33] – [37].

Meidän aiemmissa tutkimuksissa osoitimme, että α

2M * -NH

2: n sitoutumista solun pinnan liittyviä GRP78 eturauhassyöpäsoluissa laukaisee proliferaation ja anti-apoptoottisten signalointia. Solujen esikäsittely estäjien näiden signalointireittien, esikäsittely vasta-aineita karboksi-terminaalisen domeenin GRP78 tai solujen transfektio dsGRP78 RNA syvästi estää näiden signaalireittien [10], [12], [16] – [20] . Stimulointi eturauhassyövän solut α

2M * indusoi myös synteesiä GRP78 joka osittain välittyy transkriptiotekijä TFII-I koska solun transfektiota dsTFII-I RNA suppressoi merkittävästi GRP78 säätelyä [40]. Tämä käsittely estää myös solun pinnan translokaatio TFII-I, edistänyt kalsiumin pääsy, ja apoptoottisten signalointi [40]. Stimulointi eturauhassyövän solut α

2M * aiheuttaa myös transkriptionaalisen ja translationaalisen säätelyä PSA synteesi [10], joka erittyy ja komplekseja α

2M. Solujen käsittely α

2M-PSA kompleksi edistää DNA: n ja proteiinien synteesiä ja ylössäätelee RAS /MAPK ja PI 3-kinaasi /Akt signalointireittien samanlaisia ​​kuin vuonna α

2M-NH

2 stimuloiduissa soluissa [10 ]. Kuten α

2M-NH

2, α

2M-PSA, aiheuttaa lisääntyneen ekspression p-S6-Kinase, p-Akt

T308 ja p-Akt

S473, efektori signalointi komponentit aktivoidaan mTORC1 ja mTORC2 [10]. Kun otetaan huomioon keskeinen rooli mTOR signaloinnin kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden, ja meidän havaintoja α

2M * aiheuttama eturauhasen syöpäsolujen kasvua, solujen lisääntymisen ja ylössäätely PI 3-kinaasi /Akt signalointi [6], [7 ], [9], [10], [12], [16], [17], [18], olemme arvioineet roolin mTORC1 ja mTORC2 signaalireaktioteissä eturauhasen syöpäsolujen stimuloidaan α

2M *. Arvioida spesifisyyden solun pinnan GRP78 in α

2M * aiheuttama signalointi tapahtumia, olemme vaiennettu ilmaus GRP78 RNAi sekä solujen esikäsittely vasta-aineita karboksipään domeeniin GRP78. Voit selvittää spesifisyys mTORC1 aktivoinnissa sen loppupään alustan S6-Kinase ja mTORC2 in fosforyloivaan Akt

S473, olemme palkanneet Raptor ja Rictor RNAi hoitoa, vastaavasti. Tässä osoitamme, että α

2M * aktivoi mTORC1 kinaasi määritettynä S6-Kinase ja 4EBP1 fosforylaatiota ja mTORC2 kinaasi määritettynä Akt

S473 fosforylaatiota. Hiljentäminen GRP78 geeniekspression RNAi tai käsittelemällä GRP78 vasta suuresti tukahdutetaan α

2M * indusoima aktivointi mTORC1 ja mTORC2 näissä soluissa. Nämä tutkimukset osoittavat edelleen roolia kiertävän α

2M, yleiseurooppalainen proteinaasinestäjä, kasvutekijänä ja saattaja GRP78 kuin kasvutekijän reseptori tärkeä solujen kasvulle patofysiologisille ympäristöissä.

Edustaja immunoblot p-S6-kinaasi-(O) ja p-4EBP1 (•) kolmesta viiteen kokeissa on esitetty kunkin proteiinin Paneelit A ja B p-S6-kinaasi-(O) ja p-4EBP1 (•) on ilmaistu mielivaltaiset fluoresenssiyksiköt keinona ± SE kolmesta neljään itsenäisestä kokeesta. Proteiini lastaus ohjaus paneeli A ja paneeli B on esitetty alapuolella immunobloteissa.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

Kasvualustat ostettiin Invitrogen. Receptor-tunnustettu α

2M * tuotettiin reaktiolla α

2M metyyliamiinin kuten aiemmin on kuvattu [9). Vasta-aineet mTOR, p-mTOR

S2481, GβL, p-TSC2

T1462, Rheb, S6-Kinase, p-S6-Kinase

T235 /236, p-S6-Kinase

T389, p-S6-Kinase

T229, 4EBP1, p-4EBP1

T37 /46, Akt1, p-Akt

T308, p-Akt

S473 ostettiin Cell Signaling Technology (Danvers, MA) . Vasta-aineet Raptor, Rictor, Protor oli Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Anti-mSIN1 vasta-aine oli peräisin Bethyl Laboratories, Inc (Montgomery, TX). Anti-aktiini-vasta-aine oli Sigmalta (St. Louis, MO). PHAS-1 (4EBP1) oli peräisin Stratgene. GST-S6-Kinase konstruktio ilmennettiin ja puhdistettiin protokollan mukaisesti, jonka prof Blenis (Harvard University Medical School). Vasta-aineita karboksipään domeeniin GRP78 olivat Aventa Biopharmaceutical Corp (San Diego, CA). [

3H] leusiinilla (spesifinen aktiivisuus 115,4 Ci /mmol) ja [

33P] -γ-ATP (spesifinen aktiivisuus 3000Ci /mmol) saatiin Perkin-Elmer Life Sciences. Rapamysiini ja LY294002 olivat Biomol (Plymouth, PA). Kaikki muut materiaalit olivat analyyttistä laatua ja hankittiin paikallisesti.

•) määritettynä Western-blottauksella. Edustava immunoblottia p-Akt

T308 ja p-Akt

S473 kolmesta neljään kokeiluja on esitetty alla kaaviossa. Ilmaisu Näiden proteiinien on esitetty mielivaltaisina fluoresenssiyksikköinä ja ilmaistaan ​​keskiarvona ± SE kolmesta neljään kokeissa. Proteiini lastaus säätimet paneeli A ja paneeli B on esitetty alapuolella immunobloteissa.

Eturauhassyöpäsolulinjat

Aikaisemmassa raportissa, olemme tutkineet kaksi eturauhassyöpä linjat 1-LN ja DU-145, joka esittää GRP78 pinnallaan ja PC-3 eturauhassyöpä linja, joka ilmentää vain vähän GRP78 sen solun pinnalla [10], [12]. Erittäin metastaattinen 1-LN solulinja on johdettu PC-3 linjan ja oli ystävällinen lahja Dr. Phillip Walther (Duke University Medical Center, Durham, NC). PC-3 ja DU-145-solulinjat saatiin American Type Culture Collection. 1-LN-solulinja oli peräisin kylki kasvain malli, jossa PC-3-soluja istutettiin nude-hiirissä. Solut saatiin imusolmuke etäpesäke näissä hiirissä. Koska tämä solulinja ilmentää GRP78 solun pinnalla ja ei yhtään tai hyvin vähän LRP olemme laajasti käytetty tämän linjan tutkimuksiin, jotka koskevat solun pinnan GRP78 syöpäsolun kasvua. Tämä solulinja on saatavissa minkä tahansa tutkija, joka haluaa käyttää niitä. Riippuen kokeissa, näitä soluja kasvatettiin joko 6, 12, 24- tai 48-kuoppaisille levyille konfluenssiin RPMI, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia, 2 mM glutamiinia, 12,5 yksikköä /ml penisilliiniä, 6,5 ug /ml streptomysiiniä ja 10 nM insuliinia (RPMI-S) kostutetussa CO

2 (5%) inkubaattorissa. Klo 90% konfluenssiin väliaine imettiin. Yksittäiskerroksia pestiin jääkylmällä HHBSS, tuoretta kasvatusliuosta lisättiin ja soluja käytetään kokeissa kuvatulla tavalla.

edustaja immunoblot kolmesta neljään kokeiluja mTOR, Raptor, GβL, mSIN1, Rictor ja Protor läsnäolo mainituilta immunosaostumissa. Soluja käsiteltiin: (1) puskurin ja (2) 50 pM α

2M * 25 min.

määrittäminen vaikutukset α

2M * proteiinisynteesiin in 1-LN Cells

1-LN-soluja (300 x 10

3 solua /kuoppa) 48 kuopan levyille kasvatettiin RPMI-S väliaine kostutetussa CO

2 (5%) inkubaattorissa 37 ° C: ssa. Noin 90% konfluenssiin, väliaine aspiroitiin tilavuuteen RPMI-S lisättiin, minkä jälkeen lisättiin joko puskuria tai α

2M * (50 pM). Kuhunkin kuoppaan lisättiin [

3H] leusiinia (2 uCi /ml) ja soluja inkuboitiin yli yön. Reaktiot lopetettiin imemällä väliaine ja yksisolukerrokset pestiin kolmesti kahdesti jääkylmällä 5% TCA, jota seurasi kolme pesua jääkylmällä PBS: llä. Solut hajotettiin tilavuudessa 1 NaOH: a (40 ° C /2 h), proteiini arvioitiin ja lysaatit laskettiin nestetuikelaskurilla. Kokeissa, joissa modulaatio α

2M * indusoimaan proteiinisynteesiä tutkittiin solut esikäsiteltiin PI 3-kinaasi-inhibiittori LY294002 (20 uM /20 min), mTOR-estäjä rapamysiini (100 nM /15 min) tai aktinomysiini D (5 ug /ml /20 min), ennen lisäämistä α

2M * (50 pM /yön yli). Muita yksityiskohtia määrällisesti [

3 H] leusiinin sisällyttäminen soluproteiinit kuvatulla [41].

fosforylaatio S6-Kinase ja 4EBP1 määritettiin [

33P] -γ-ATP sisällyttäminen ja autoradiografia (AR) ja immunoblottauksella (IB). Paneeli A. baari, joka esittää α

2M * indusoima aktivointi mTORC1 ja sen modulaatiota LY294002 ja rapamysiinin mTOR immunosaostumissa määritettynä autoradiografialla. Pylväät ja kaistojen autoradiografit ovat: (1) puskuri; (2) α

2M * (50 pM /25 min); (3) LY294002 (20 uM /20 min) jälkeen α

2M * (50 pM /25 min); ja (4) rapamysiini (100 nM /15 min) jälkeen α

2M * (50 pM /25 min). Edustava autoradiografia (AR) kolmesta erillisestä kokeesta alapuolella pylväskaaviona. Fosforylaation S6-kinaasi-(▪) ja 4EBP1 (□) ilmaistaan ​​mielivaltainen fluoresenssi yksiköihin ja on keskiarvo ± kolmesta itsenäisestä kokeesta. Alla esitetään myös AR on edustava immunoblot (IB) kolmesta kokeesta p-S6-kinaasi-ja p-4EBP1 saatu mTOR immunosaostumissa soluja käsitellään autoradiografialla analyysin Paneeli A. Paneeli B. pylväsdiagrammi, joka esittää vaikutusta hiljentäminen GRP78 ilme RNAi on α

2M * indusoima aktivointi mTORC1 vuonna mTOR immunopreciptates in 1-LN-solujen määritettynä autoradiografialla. Pylväät ja kaistojen Autoradiogrammin (AR) ovat: (1) Lipofectamine + puskuri; (2) lipfectamine + α

2M (50 pM /25 min); (3) GRP78 dsRNA (100 nM /48h) sitten α

2M * (PM /25 min); ja (4) salattu dsRNA (100 nM /48h) kuin α

2M * (PM /25 min). Edustava autoradiografi S6-Kinase (▪) ja 4EBP1 (□) kolmesta kokeesta esitetään alla pylväskaaviona. Fosforylaation S6-kinaasi-(▪) ja 4EBP1 (□) ilmaistaan ​​mielivaltainen fluoresenssi yksiköissä keskiarvo ± SE kolmesta itsenäisestä kokeesta. Alla esitetään myös Autoradiogrammin (AR) on edustava immunoblot (IB) p-S6-kinaasi-ja p-4EBP1 saatu mTOR immunosaostumissa 1-LN-soluja käsiteltiin kuten autoradiografinen analyysi Panel B. immunoblot edustaja kolmesta kokeesta osoittavat ilmentymistä GRP78 transfektoiduissa soluissa GRP78 dsRNA on myös esitetty. Kaistat immunoblot ovat: (1) Lipofectamine + puskuri; (2) Lipofectamine + α

2M * (50 pm /25 min); (3) GRP78 dsRNA (100 nM /48h) + α

2M *; ja (4) salattu dsRNAi (100 nM /48h) + α

2M *. Paneeli C. pylväsdiagrammi, joka osoittaa hiljentäminen GRP78 ilmaisun RNAi on α

2M * indusoima fosforylaatio S6-Kinase (▪) ja 4EBP1 (□) in Raptor immunopresipi 1-LN-solujen määritettynä autoradiografialla. Pylväät ja kaistojen Autoradiogrammin (AR) ovat samoja kuin pylväsdiagrammi ja autoradiografia ruudussa B. edustaja autoradiografia (AR) on S6-Kinase ja 4EBP1 kolmesta kokeesta esitetään alla pylväskaaviona. Fosforylaation S6-kinaasi-(▪) ja 4EBP1 (□) ilmaistaan ​​mielivaltainen fluoresenssi yksiköiden keskiarvona ± SE kolmen kokeen. Alla esitetään myös Autoradiogrammin (AR) on edustava immunoblot (IB) kolmesta kokeesta p-S6-Kinase ja p-4EBP1 saatu Raptor immunopresipi 1-LN soluja käsiteltiin kuten autoradiografia- analyysi Panel C. Paneeli D. autoradiogrammi esittää α

2M * indusoima fosforylaatio S6-kinaasi-ja 4EBP1 DU-145 eturauhassyövän soluissa, mutta ei PC-3 eturauhasen syöpäsoluja. Kaistojen Autoradiogrammin ovat: (1) puskuri; (2) α

2M *. Lisätietoja on kohdassa ”Kokeelliset menetelmät” -osassa. Autoradiogrammi on esitetty edustaa neljä kokeissa. Paneeli E. pylväsdiagrammi, joka osoittaa, että vasta-aineita karboksipään domeeniin GRP78 estävät α

2M * indusoima fosforylaatio S6-kinaasi-(▪) ja 4EBP1 (□) in mTOR immunosaostumissa 1-LN-soluja. Tangot ovat: (1) puskuri; (2) α

2M * (50 pM /25 min); (3) vasta-aineita karboksipään domeeniin GRP78 (3 ug /ml /1 h), niin α

2M *. Fosforylaation S6-kinaasi-ja 4EBP1 määritettiin autoradiografisella analyysi ja ilmaistaan ​​mielivaltaisina yksikköinä, ja se on keskiarvo ± SE kolmen kokeen. Arvot merkittävästi erilainen 5% α

2M * ja salattu dsRNA käsiteltyjä soluja on merkitty tähdellä (*) kaikissa Paneelit A-E

Effects of 1-LN Cell Inkubointi α

2M * s-mTOR

S2481, p-TSC2

T1462, Rheb, Raptor, Rictor, GβL, p-S6-Kinase, p-4EBP1, p-Akt

T308, ja p-Akt

S473

1-LN-soluja (300 x 10

3 solua /kaivo) RPMI-S-elatusaineessa 6-kuoppalevyillä inkuboitiin kuten edellä. 90% konfluenssiin, väliaine aspiroitiin, tilavuuteen RPMI-S-elatusaineeseen lisättiin kuhunkin kuoppaan. Yhdessä koesarjassa soluja stimuloitiin vaihtelevilla α

2M * ja inkuboitiin 30 minuutin ajan. Toisessa sarjassa tutkimuksia soluja stimuloitiin 50 pM α

2M * ja inkuboitiin eri aikoja 37 ° C: ssa kostutetussa CO

2 (5%) inkubaattorissa. Reaktiot lopetettiin imemällä väliaine, tilavuus lyysipuskuria A, joka sisälsi 50 mM Tris • HCI: ää (pH 7,5), 120 mM NaOH, 0,1% NP40, 25 mM natriumfluoridi, 1 mM natriumpyrofosfaattia, 0,1 mM natriumortovanadaattia, 1 mM PMSF, 1 mM bentsamidiinia, ja leupeptiiniä (10 ug /ml) lisättiin ja laitettiin jäihin 15 min. Lysaatit siirrettiin Eppendorf-putkiin ja sentrifugoitiin 1000 rpm: llä 5 minuutin ajan 4 ° C: ssa, solujäänteiden poistamiseksi. Supernatantit poistettiin uusiin putkiin ja niiden proteiinipitoisuus määritettiin [42]. On yhtä suuri määrä proteiinia, jonka tilavuus oli 4 x näytepuskuria lisättiin putkiin keitettiin 5 min ajan ja sentrifugoitiin. Näytteet ajettiin elektroforeesilla polyakryyliamidigeeleillä (12,5%, 10% tai 4-20% gradienttigeeleillä tarpeen mukaan). Proteiini bändejä geelit siirrettiin Hybond-P kalvot ja erillisissä kokeissa kalvoja immunoblotattu vasta-aineita p-mTOR

S2481, p-TSC2

T1462, Raptor, Rictor, GβL, Rheb, p-S6-Kinase

S235 /236, p-4EBP1

T37 /46, p-Akt

T308 tai p-Akt

S473 16 tuntia 4 ° C: ssa rotaatiossa. Toteamiseen ja määrän Immunoblottien vastaaville antigeeneille suoritettiin ECF ja Storm 860 -fosforikuvantamis-. Vastaavat membraanit proteiinin lastaus valvonta, fosforyloitumaton kohdeproteiiniin tai aktiini, tässä ja seuraavissa tutkimuksissa. Vasta-aineiden spesifisyys tässä käytetään ja alla kuvatuissa kokeissa määritettiin käsittelemällä soluja ei-immuuni-vasta-aineita ja solulysaateista käsiteltiin edellä kuvatulla tavalla. Koeolosuhteissa, ei reaktiivisuus nämä tarkastukset havaittiin [10], [43], [44].

Paneeli A. Bar, joka esittää tasoja Raptor transfektoiduissa soluissa Raptor dsRNA ja stimuloidaan α

2M * tai insuliinia. Tangot ovat: (1) Lipofectamine + puskuri; (2) Lipofectamine + α

2M * (50 pM /25 min); (3) lipofektamiinin + insuliinia (200 nM /20 min); (4) salattu dsRNA (100 nM /48 h) + insuliini; (5) Raptor dsRNA (100 nM /48 h); (6) Raptor dsRNA (100 nM /48 h) jälkeen α

2M *; (7) Raptor dsRNA (100 nM /48 h) jälkeen insuliini (200 nM /20 min); (8) rapamysiini (100 nM /20 min), sitten insuliinia. Arvot ovat keskiarvo ± SE kolmesta neljään toisistaan ​​riippumattomasta kokeesta ja ne ilmaistaan ​​mielivaltainen fluoresenssi yksikköä. Arvot merkittävästi erilaisia ​​5% tasolla α

2M *, insuliini ja salattu dsRNA käsitellyt solut merkitty tähdellä (*). Edustava immunoblottia Raptor kolmesta neljään kokeita yhdessä sen proteiinimäärän ohjaus aktiini alla näkyy pylväskaaviona. Paneeli B. baari, joka esittää mTORC1 aktivointi soluissa käsitelty α

2M * ja insuliini ja vaikutus transfektion Raptor dsRNA sen aktivaatiota mitattuna määrittämällä fosforylaatio S6-Kinase autoradiografialla. Pylväät ja kaistojen autoradiografiakuvasta ovat: (1) Lipofectamine + puskuri; (2) Lipofectamine + α

2M * (50 pM /25 min); (3) Raptor dsRNA (100 nM /48 h); (4) Raptor dsRNA + α

2M *; (5) lipofektamiinin + insuliinia (200 nM /20 min); (6) salattu dsRNA (100 nM /48 h) + insuliini; (7) Raptor dsRNA (100 nM /20 min) jälkeen insuliini; (8) rapamysiini (100 nM /20 min) jälkeen α

2M *; (9) LY294002 (20 mM /20 min) jälkeen insuliini; (10) rapamysiini (100 nM /20 min), sitten insuliinia. Edustava autoradiografi kolme kokeissa S6-Kinase fosforylaatio alla näkyy pylväskaaviona. Arvot ovat keskiarvo ± SE kolmesta kokeesta ja ne ilmaistaan ​​mielivaltaisina yksikköinä. Arvot merkittävästi erilaisia ​​5% tasoilla α

2M *, insuliini ja salattu dsRNA käsitellyt solut merkitty tähdellä (*). Paneeli C. baari, joka esittää tasoja S6-Kinase fosforyloitiin T389 (▪); T229 (ks harmaa neliö) ja T 235/236 (□) stimuloiduissa soluissa α

2M * tai insuliinin ja transfektoidaan Raptor dsRNA. Palkit ovat kuin paneeli A. edustaja immunobloteista p-S6-Kinase

T389, p-S6-Kinase

T229 ja p-S6-Kinase

T235 /236 kolmesta kokeesta sekä sen proteiinimäärän ohjaus alla näkyy pylväskaaviona. Arvot ovat keskiarvo ± SE kolmesta kokeesta ja ne ilmaistaan ​​mielivaltaisina fluoresenssin yksiköissä. Arvot merkittävästi erilaisia ​​5% tasolla α

2M *, insuliini tai salattu dsRNA on merkitty tähdellä (*). Paneeli D. baari, joka esittää fosforylaation tasoja 4EBP1, käsitellyissä soluissa α

2M * ja insuliini tai transfektoitu Raptor dsRNA. Palkit ovat kuin paneeli A. edustaja immunoblottia p-4EBP1 kolmesta kokeesta sekä sen proteiinimäärän ohjaus alla näkyy pylväskaaviona. Arvot ovat keskiarvo ± SE kolmesta kokeesta ja ne ilmaistaan ​​mielivaltaisina fluoresenssin yksiköissä. Arvot merkittävästi erilaisia ​​5% tasolla α

2M *, insuliini ja salattu dsRNA käsiteltyjä soluja on merkitty tähdellä (*).

karakterisointi osat mTORC1 ja mTORC2 komplekseja 1-LN Eturauhassyöpä stimuloitu α

2M *

1-LN-soluja (3 x 10

6 kuoppaa kohti 6-kuoppalevyille) inkuboitiin yön RPMI-S väliaine pestiin kahdesti jääkylmää HHBSS ja tilavuus RPMI-S-elatusaineeseen lisättiin kuhunkin kuoppaan. Lämpötilan tasapainottamisen jälkeen, solu kuopat altistettiin joko puskurin tai α

2M * (50 pM /25 min), ja inkuboitiin kuten edellä. Reaktiot pysäytettiin imemällä väliaine ja tilavuus CHAPS lyysipuskuria (puskuri B), joka sisälsi 40 mM Hepe (pH 7,5), 120 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM natriumpyrofosfaatti, 10 mM β-glyserofosfaatti, 0,5 mM natriumortovanadaatti , 0,3% CHAPS ja Roche proteaasiestäjäseostabletit tabletti (1 tabletti /10 ml) lisättiin ja solut hajotettiin jäällä 15 min ajan. Lysaatit siirrettiin erottamiseksi Eppendorf-putkiin, sentrifugoitiin (1000 rpm /5 min /4 ° C) ja supernatantit käytettiin proteiinin arviointi ja immunosaostus. Yhtä suuret määrät lysaatin proteiinia (200-250 ug) erillisissä kokeissa käytettiin immunosaostuksella Raptor vasta-aineita (01:50, Santa Cruz Cat # sc81537), tai Rictor vasta-aineita (01:50, Santa Cruz cat # 81538), jota seuraa lisäksi 40 ui proteiini-A-agaroosin ja sisältö inkuboitiin rotaatiossa yön yli 4 ° C: ssa. Raptor ja Rictor immunosaostumat otettiin talteen mikro-sentrifugoimalla (2000 rpm /5 min /4 ° C) ja pestään kahdesti kylmällä lyysipuskurilla B. Raptor ja Rictor immunosaostaa määrä 4 x näytepuskuria lisättiin putkiin keitettiin 5 min , sentrifugoitiin, elektroforeesilla (4-20%, 12,5% tai 10% akryyliamidigeelejä), siirrettiin Hybond-P -kalvoille ja kalvot immunoblotattu spesifisten vasta-aineiden mTOR, Raptor, Rictor, GβL, mSIN1 ja Protor. Proteiinivyöhykkeet kalvoilla kvantifioitiin kuten edellä [43], [44].

Paneeli A. baari, joka esittää α

2M * indusoima fosforylaatio Akt at T308 (▪) ja S473 ( □) in kinaasimäärityk- mTOR immunopresipitaatit. Pylväät ja kaistojen immunoblot ovat: (1) puskuri; (2) α

2M * (50 pM /25 min); (3) LY294002 (20 uM /25 min) jälkeen α

2M *; (4) rapamysiini (100 nM /20 min) jälkeen α

2M *. Arvot ovat keskiarvo ± SE neljästä itsenäisestä kokeesta ja ne ilmaistaan ​​fmol [

33P] -γ-ATP: /mg solun proteiinia. Arvot merkittävästi erilaisia ​​klo 5% tasolla α

2M * hoidetun solut on merkitty tähdellä (*). Paneeli B. baari, joka esittää α

2M * indusoima fosforylaatio Akt at T308 (▪) ja S473 (□) in kinaasimäärityk- of Rictor immunopresipitaatit. Pylväät ja kaistat immunotäp- ovat: (1) puskuri; (2) α

2M * (50 pM /25 min); (3) LY294002 (20 mM /25 min) jälkeen α

2M * ja (4) Rapamysiinin (100 nM /20 min).