Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Äskettäin piikkinahkaisten microtubule- liittyvän proteiinin kaltainen 4- anaplastinen lymfooma kinaasia (

EML4-ALK

) fuusio geeni on tullut tärkeä biomarkkeri ALK tyrosiinikinaasiestäjä (crizotinib) hoitoa NSCLC. Kuitenkin paras havaitsemismenetelmä ja merkitys

EML4-ALK

variantti tyyppisiä jää epävarmaksi.

Methods

Käänteistranskriptaasilla-polymeraasiketjureaktio (RT-PCR), fluoresenssi in situ hybridisaatio (FISH) ja immunohistokemiallinen (IHC) tahra tehtiin tuumorikudoksista 312 NSCLC potilaiden havaitsemiseksi

ALK

uudelleenjärjestelyjä. Mutaatio analyysit

EGFR

ja

KRAS

geenit tehtiin myös.

Tulokset

Kolmetoista 312 potilasta (4,17%) oli

ALK

uudelleenjärjestelyt havaita RT-PCR: llä. Jos RT-PCR tietoja käytettiin kultakannasta FISH testit oli alhainen herkkyys (58,33%), mutta erittäin hyvä spesifisyys (99,32%). IHC tahra oli parempi herkkyys (91,67%) kuin FISH, mutta alempi spesifisyys (79,52%), kun leikattu pois oli IHC2 +. Kaikki 8 potilailla, joilla on korkea runsaasti

EML4-ALK

positiivisten solujen tuumorikudoksissa (arvioitu signaali-intensiteetit, RT-PCR-tuote), oli myös korkea ilmentymisen ALK proteiinin (IHC3 +), ja positiivinen FISH, paitsi yksi epäonnistunut FISH. Vaihtoehdot 3a + 3b (4/5, 80%)

EML4-ALK

fuusio geeni yleisempää on korkea runsaasti

EML4-ALK

positiivisten solujen kasvain kudosten kuin vaihtoehto 1 ( 1/3, 33,3%). Meta-analyysi julkaistut tiedot 2273 NSCLC potilaiden paljasti, että variantti 3 (23/44, 52,3%) oli yleisin Kiinan väestöstä, kun taas vaihtoehto 1 (28/37, 75,7%) oli yleisin valkoihoisilla.

päätelmät

kolmesta havaitsemismenetelmät, RT-PCR: llä voisi havaita paitsi läsnäolo

EML4-ALK

fuusiogeenin ja niiden variantti tyyppejä, mutta myös runsaasti

EML4-ALK

positiivisten solujen NSCLC tuumorikudoksissa. Jälkimmäiset kaksi tekijää saattavat vaikuttaa hoitovaste anti-ALK estäjä. Mukaan lukien RT-PCR, kuten diagnostinen testi ALK estäjä hoidon mahdollinen kliinisissä tutkimuksissa on suositeltavaa.

Citation: Wu Y-C, Chang I-C, Wang C-L, Chen T-D, Chen Y-T, Liu H-P, et ai. (2013) vertailu IHC, FISH ja RT-PCR Methods for havaitseminen

ALK

uudelleenjärjestelyt 312 ei-pienisoluinen keuhkosyöpä Potilaat, Taiwanissa. PLoS ONE 8 (8): e70839. doi: 10,1371 /journal.pone.0070839

Editor: Syed A. Aziz, Health Canada ja Ottawan yliopisto, Kanada

vastaanotettu: 15 huhtikuu 2013; Hyväksytty: 24 Kesäkuu 2013; Julkaistu: 07 elokuu 2013

Copyright: © 2013 Wu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia National Health Research Institutes (NHRI-A1-MG-100-PP-04, NHRI-A1-MG-101-PP-04), ja National Science neuvoston (NSC97-2320-B-400-006- MY3) Dr. Shiu-Feng Huang. Fluoresenssi in situ hybridisaatio (FISH) tutkimus tukivat avustus Pfizer (WS2084622) Dr. Yi-Cheng Wu. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Meillä on seuraavat edut: fluoresenssi in situ hybridisaatio (FISH) tutkimus tuettiin avustus Pfizer (WS2084622) Dr. Yi-Cheng Wu. Pfizer Taiwanissa tuli käymään joukkue vuonna 2011 tukemaan tutkimusta ALK uudelleenjärjestely NSCLC potilaiden Taiwanissa, mikä oli tärkeää heille, koska tämä tieto puuttui vielä Taiwanissa (data Hong Kong on julkaistu vuoden 2010 ja 2009, vastaavasti). Ne halusi tukea tutkimusta, joka voi sisältää yli 300 pienisoluista keuhkosyöpää (naiivia ALK estäjä hoitoa) ja kuten kalaa havaitsemismenetelmä. He lähinnä halusi tietää esiintyvyys ALK uudelleen järjestelyjä NSCLC potilaiden Taiwanissa. Pfizer ilmoitti, että he eivät häiritse tutkimuksen suunnittelu, menetelmät, tulokset ja tulevat julkaisut. Loppuun mennessä apurahan tukea, meidän tarvitsee vain esittää lyhyt selvitys Tutkimustulosten joka oli samanlainen kuin muut rahoituslähteistä. Niinpä päätimme hyväksyä tämän avustusta Pfizer jälkeen tämän sopimuksen. Loppuvuodesta 2012, olemme esittäneet kahden sivun lyhyt raportti Pfizer ajoissa (lopussa avustus tuki), jonka mukaan vain raakatietoja. Sen jälkeen meidän ei tarvitse antaa mitään lisätietoja Pfizer. Dr. Shiu-Feng Huang on kutsuttu jäseneksi Pfizerin antava komitea NSCLC tutkimuksessa Taiwanissa. Ei ole olemassa patentteja, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta meidän noudattamista kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamiseen ja materiaaleja, yksityiskohtaisena online-oppaassa tekijöille.

Johdanto

keuhkosyövässä, erityisesti ei-pienisoluinen keuhkosyövässä (NSCLC) on johtava syy syövän kuoleman maailmassa, ja potilas numero kasvaa yhä [1,2]. Suuri menestys täsmähoitoihin epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR) -tyrosiinia kinaasiestäjä (TKI): gefitinibi ja erlotinibi, hoitoon keuhkoadenokarsinooma on tehnyt täsmähoitoihin tullut suosituin liikennemuotojen tärkeimpien ihmisen syövissä [3-7]. Etsivät uusia ja tehokkaita tavoitteita muiden kuin EGFR keuhkosyövän hoidossa ei ole onnistunut vuoteen 2007, jolloin Soda, et al tunnistanut piikkinahkaisten microtubule- liittyvän proteiinin kaltainen-4 ja anaplastinen lymfooma kinaasia (

EML4-ALK

) fuusio geenin kanssa muuttamassa kyky pienisoluista keuhkosyöpää [8]. ALK proteiini on 200 kD reseptorityrosiinikinaasia. Sen signaali reittiin kuuluu solujen lisääntymistä, erilaistumista, ja anti-apoptoosin [8,9]. Ennen tunnistaminen

EML4-ALK

-fuusiogeenin,

Nucleophosmin

–

ALK

(NPM-ALK) fuusio geeni tunnistettiin ensimmäisen kerran vuonna anaplastinen suuri solujen lymfooma [10]. Erilaisia ​​yhdistelmiä ALK muiden proteiinien on löydetty eri kasvainten, kuten levinnyttä suuri B-solujen lymfooma, tulehduksellinen myofibroblastic kasvain, neuroblastooma, okasolusyöpä ruokatorven, ja munuaissolukarsinooma [11-13]. Mutta

EML4-ALK

fuusio-geeni on ainutlaatuinen NSCLC [14]. ALK on nyt tunnustettu tärkeäksi onkogeenisen kuljettaja NSCLC. Useita

EML4-ALK

variantit NSCLCs on tunnistettu, kaikki sisältävät samat C-terminaalista kinaasidomeenin, ja antaa voitto-of-function ominaisuuksien [14]. Vaikka

EML4

geeni on vallitseva fuusio kumppani

ALK

NSCLC, muut fuusio- kumppani geenien myös on tunnistettu, joka sisälsi

KIF5B-ALK, KLC1-ALK ja TFG-ALK

-fuusiogeenit [15-18]. Valtaosa

ALK

uudelleenjärjestelyjä havaittiin adenokarsinoomaa ja tupakoimattomien [8,14,18-28]. Ilmaantuvuus

EML4-ALK

fuusio geenin NSCLC oli noin 1,4-11,6% ilman merkittäviä eroja Aasian ja länsimaiden [8,14,18-28]. Vaikka

EML4-ALK

fuusio tunnistettiin NSCLC, uusi ALK tyrosiinikinaasiestäjä (ALK-TKI): crizotinib kehitettiin lähes samanaikaisesti. Tämä lääke oli alun perin suunniteltu MET tyrosiinikinaasin estäjä hoitoon pienisoluista keuhkosyöpää, mutta sen havaittiin olevan ALK estäjä, myös. Siten prospektiivisessa kliinisessä tutkimuksessa suunniteltiin ja aloitettiin nopeasti NSCLC potilaalla on

EML4-ALK

-fuusiogeenit. Faasi II kliinisen tutkimuksen julkaistiin vuonna 2010, joka osoitti dramaattinen vaste ja pidempään ilman taudin etenemistä ja crizotinib hoitoon potilailla, joilla on

EML4-ALK

fuusio geeni [29-31], samanlainen EGFR-TKI on NSCLC potilaalla on

EGFR

mutaatioita [3-7]. Crizotinib oli hyväksynyt Food and Drug Administration (FDA) Yhdysvaltojen vuonna 2011 hoitoon pienisoluista keuhkosyöpää, ja kumppani diagnostisen testin Vysis ALK hajota FISH Probe Kit, joka voisi auttaa määrittämään, jos potilaalla on epänormaali

ALK

geeni [32].

EML4-ALK

fuusio geeni tulee uusi merkittävä molekyyli merkkiaine crizotinib hoitoa pienisoluista keuhkosyöpää. Kuitenkin paras osoitusmenetelmäksi

EML4-ALK

fuusiogeenin on edelleen kiistanalainen. Teoriassa, käänteistranskriptaasi-polymeraasiketjureaktiolla (RT-PCR) ja fluoresenssi in situ -hybridisaatiota (FISH) ovat kaksi standardimenetelmiä havaitsemiseksi -fuusiogeenit, mutta molemmat ovat merkittäviä rajoituksia kliinisessä käytännössä. RT-PCR vaatii tuore kudosnäytteiden RNA: n, ja luotettava FISH määritys vaatii hyvää fluoresenssi laajuus ja teknistä asiantuntemusta. Immunohistokemiallinen (IHC) tahra havaitsemiseksi ALK yli-ilmentyminen on vakiintunut menetelmä havaitsemiseksi

ALK

uudelleenjärjestelyjä, kuten NPM-ALK, hematologisissa maligniteetit vuosia [33,34]. Koska kustannukset IHC tahra määrityksessä on paljon pienempi kuin FISH määrityksen, IHC tahroja voisi olla paljon helpompaa ja kustannustehokkaampaa seulontamenetelmä

ALK

uudelleenjärjestelyihin NSCLCs verrattuna FISH tai RT-PCR . Kuitenkin herkkyys IHC tahra pysyi kiistanalainen. Monet tutkimusryhmät raportoitu hyvä korrelaatioita IHC tahra ja FISH havaitsemiseksi

EML4-ALK

fuusio geeni [16,35-38], mutta jotkut kertoi, että IHC tahra oli ei-herkkä havaitseminen

EML4 alk

-fuusiogeenin [25,39-41]. Olisi kaikkein ihanteellinen suorittaa kaikilla tavoilla (IHC, FISH ja RT-PCR) suuri joukko NSCLC kasvainten suoraa vertailua niiden efficacies.

Aikaisemmin olemme raportoineet hyvä korrelaatio IHC tahra ALK ja RT-PCR-tutkimus tunnistamiseen

EML4-ALK

-fuusiogeenit 64 pienisoluista keuhkosyöpää [42]. Olemme laajentaneet tutkimuksen 312 NSCLC potilaiden ja suorittaa kaikilla tavoilla (IHC, FISH, ja RT-PCR) varten suora vertailu herkkyys ja spesifisyys.

Tulokset

ALK

toisiintuminen havaita RT-PCR

klinikalla-patologinen ominaisuudet 312 potilasta on esitetty taulukossa S1. Niistä 312 potilasta mukana RT-PCR tutkimuksessa, kolmetoista potilasta (13/312, 4,17%), kolme urosta (yksi oli koskaan tupakoitsija) ja kymmenen naisen (seitsemän oli tupakoimattomia), todettiin olevan

ALK

uudelleenjärjestely. Kaksitoista oli

EML4-ALK

fuusio geeni ja yksi oli

KIF5B-ALK

fuusio geeni. Patologian diagnoosit olivat adenokarsinoomat (ADC) yhdessätoista potilailla, levyepiteelisyöpä (SCC) yhdellä potilaalla, ja adenosquamous karsinooma (ADSC) yhdelle potilaalle. Yhdelläkään 13 potilaalla oli samanaikaisesti voimassa

EGFR

tai

KRAS

mutaatioita. Ilmaantuvuus

ALK

uudelleenjärjestelystä EGFR-villityypin, ei-SCC potilaista oli 12% (12/100).

KLC1-ALK

, ja

TFG-ALK

-fuusiogeenit ei tunnistettu. Niistä 12 potilaasta, joilla

EML4-ALK

-fuusiogeenin kolme oli variantti 1, yksi oli variantti 2, viisi oli variantti 3a + 3b kanssa 3b hallitseva kaksi oli variantti 3a, ja yksi oli variantti 3b.

ALK

uudelleenjärjestelyn vasta merkitsevästi yhteydessä naissukupuoli (P = 0,0248) mukaan yhden muuttujan analyysiin,. Vaikka enemmistö (8/13, 61,5%) potilaista, joilla

ALK

uudelleenjärjestelyn oli I vaiheessa mikään ei ollut IV vaiheessa, assosiaatio kasvain vaiheessa ei ollut tilastollisesti merkitsevä (p = 0,5740). Monimuuttuja-analyysi että yhdessä viiden kliinis-patologisten ominaisuuksien, eli sukupuoli, ikä, tupakointi historia, histologian tyypit ja kasvaimen vaiheessa suoritettiin binary logistinen regressio testi. Lisäksi naissukupuoli (p = 0,007), tupakoi tuli myös merkitsevästi yhteydessä

ALK

uudelleenjärjestelyjä (p = 0,022), sillä oli suuri ero tupakointimäärään mies- ja naispotilaiden (ei koskaan tupakoitsijat olivat 38% miespuolisilla vs. 94,4% naisten, p 0,0001). Kasvain vaihe jäi ei-merkitsevä. P-arvot kussakin vaiheessa olivat: Vaihe I: P = 0,6220, vaihe II: P = 0,4040, Vaihe III: P = 0,6190, ja vaiheen IV: P = 0,9990, vastaavasti.

ALK

uudelleenjärjestely määritettiin FISH

Niistä 312 potilasta, FISH tutkimuksia ei ole tehty kahdella potilaalla, koska mitään jäljellä kasvain kudosta voitaisiin löytyä parafiinileikkeillä. FISH tutkimukset epäonnistui toisessa 5 potilaalla. Tämän seurauksena, FISH-analyysillä tietoja oli saatavilla yhteensä 305 potilasta. Yhdeksän potilasta (9/305, 2,95%) olivat positiiviset hajota FISH tutkimus. Kaikki heistä oli adenokarsinooma. Yksi oli miespotilas (nykyinen tupakoitsija), ja kahdeksan oli naisia ​​potilasta (kaksi oli tupakoijilla). Vain 7 9 potilaista oli myös RT-PCR (+).

ALK proteiinin ilmentyminen havaita IHC tahra

Kaikkiaan 310 potilasta oli menestyksekäs IHC tahra havaitsemiseksi ALK proteiinin ilmentymisen, koska 2: lla potilaista ilman kasvaimen osaa kudosleikkeiden suljettiin pois. Kaikki 78 potilasta, joilla negatiivinen IHC tahra oli RT-PCR (-) ja FISH (-). Sillä 159 potilasta, joilla IHC 1+, vain yksi potilas oli RT-PCR (+), mutta FISH (-), se oli ainoa SCC positiiviseksi RT-PCR. Sillä 61 potilasta, joilla IHC 2+, kolme potilasta oli RT-PCR: llä (+), mutta FISH (-), ja yksi potilailla oli RT-PCR: llä (-), mutta FISH (+). Sillä 12 potilasta, joilla IHC 3+, yhdeksän oli RT-PCR (+). Seitsemän heistä olivat myös FISH (+), johon sisältyi vain yksi potilas, jolla

KIF5B-ALK

fuusio geenin (kuva S1). Toinen oli FISH (-) ja viimeinen epäonnistunut FISH. Jäljellä 3 potilaalla on IHC3 + ja RT-PCR (-), yksi oli FISH (+) (kuvio S2), yksi oli FISH (-), ja yksi epäonnistunut FISH. Jälkimmäinen 2 potilaalla oli myös EGFR mutaatioita.

EGFR-mutaatio analysoi

Niistä 312 pienisoluista keuhkosyöpää,

EGFR

mutaatio oli 43,91% (137/312). Kaikki eivät olleet SCC, johon kuului 133 ADC ja 4 ADSC.

EGFR

mutaatio korko kuin SCC potilaista oli 57,81% (137/237). Ei-SCC potilailla,

EGFR

mutaatioita vasta merkitsevästi yhteydessä tupakoimattomia (p = 0,0002), mutta ei iän tai sukupuolen mukaan. Yhdelläkään potilaalla oli samanaikaisesti voimassa

ALK

tai

KRAS

mutaatioita.

KRAS-mutaatio analysoi

Niistä 312 pienisoluista keuhkosyöpää,

KRAS

mutaatio oli 5,77% (18/312), joka sisälsi 16 adenokarsinooman ja kaksi adenosquamous karsinoomat. Mutaatio korko kuin SCC oli 7,59% (18/237). Kaksitoista potilasta oli miehiä (10 olivat tupakoitsijoita) ja 6 oli naisia ​​(yksikään ei ollut tupakoitsijoita).

KRAS

mutaatioita vasta merkitsevästi liittyvä histologia tyypin (ei-levyepiteelikarsinooma) (p = 0,0091).

vertailu kolmesta havaitsemismenetelmät

Yhteensä 305 potilaalla oli tiedot kaikkien kolmen tunnistusmenetelmiä (RT-PCR, FISH ja IHC) suoraa vertailua. Tulokset on esitetty taulukossa S2. Tutkimuksen tulokset kaikista 17 potilasta positiivinen joko RT-PCR, tai kalaa tai korkea ALK ilmentyminen oli yhteenveto taulukossa S3. Histologinen ominaisuuksista kaikissa 17 potilasta uudelleen. Kaikki adenokarsinomia positiivisia ALK koostuivat sekoitettu histologisten kuvioita.

spesifisyys ja herkkyys FISH ja IHC mukaan RT-PCR data

Jos RT-PCR tuloksia käytetty kultakantaan ALK uudelleenjärjestely, ja cut-off ALK proteiinin ilmentyminen oli IHC 2+, herkkyys ja spesifisyys IHC oli 91,67% ja 79,52%, tässä järjestyksessä. Positiivinen ennustearvo IHC oli vain 15,49% ja negatiivinen ennustearvo oli 99,57%. Jos leikkauksen oli IHC 3+, herkkyys ja spesifisyys IHC oli 66,67% ja 99,32%, tässä järjestyksessä. Positiivinen ennustearvo IHC oli 80,00% ja negatiivinen ennustearvo oli 98,64%. FISH testiä, vaikka sen herkkyys oli vain 58,33%, spesifisyys oli hyvin korkea (99,32%). Positiivinen ennustearvo FISH oli 77,78% ja negatiivinen ennustearvo oli 98,31%.

arviointi runsaasti EML4-ALK positiivisten solujen tuumorikudoksissa RT-PCR

runsaus

EML4-ALK

positiivisten solujen kasvainkudoksissa arvioitiin mukainen intensiteetit RT-PCR-tuotteiden geelielektroforeesilla. Vuoksi kunkin kasvaimen verrattiin FISH ja IHC (taulukko S3). Kahdeksan 13 RT-PCR: llä (+) kasvaimia oli voimakas intensiteetti RT-PCR-tuotteet, jotka ehdotetaan esiintyy runsaasti

on EML4-ALK

positiivisten solujen kasvainkudoksessa. Kaikki nämä 8 potilasta oli IHC 3+, ja FISH (+), paitsi yksi epäonnistunut FISH tutkimuksessa. Sillä 5 potilasta, joilla on heikko intensiteetti RT-PCR-tuotteet, jotka viittasi pieneen runsaasti

EML4-ALK

positiivisten solujen tuumorikudoksissa, ne kaikki olivat FISH (-) ja vain yksi oli IHC 3+. Jälkimmäinen oli kasvain kuului Variant 3a + 3b. Edustavia tapauksia kuvassa S3. Kun verrataan varianttitaudista tietojen runsaus

EML4-ALK

positiivisten solujen kasvaimen kudokset olivat yleisempiä Variant 3a + 3b (4/5, 80%) kuin Vaihtoehto 1 (1/3, 33,3 %) (taulukko S3).

Meta-analyysi alkuperään ja variantti tyypit liittyy

EML4-ALK

-fuusiogeenin

Meta-analyysi kahdeksantoista tutkimusten (mukaan lukien Tässä tutkimuksessa), joka oli tehty RT-PCR tutkimus havaitsemiseksi

EML4

–

ALK

fuusio geeni tehtiin ja esitetään taulukossa S4 ja Taulukko S5 [8,15,16,18- 28,40,41,43]. Niistä 2273 NSCLC-potilaalla, joiden etnisyys ja varianttitaudista tiedot

EML4

–

ALK

-fuusiogeenin, Vaihtoehto 3 (23/44, 52,3%) oli yleisin Kiinan väestöstä, kun taas Vaihtoehto 1 (28/37, 75,7%) oli yleisin valkoihoisilla. Ero oli tilastollisesti merkitsevä sekä Vaihtoehto 1 (p = 0,0000) ja Vaihtoehto 3 (p = 0,0020). Mitä Japani potilaille, Vaihtoehto 1 (11/33, 33%) oli myös yleisin vaihtoehdot, mutta se ei ollut niin hallitseva kuin valkoihoisilla.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa, ilmaantuvuus

ALK

uudelleenjärjestelyjä NSCLC potilaiden Taiwanissa oli melko alhainen (4,17%) mukaan RT-PCR-tuloksiin. Sillä

EGFR

-wild tyyppi, ei-SCC potilaille, se oli 12% (12/100).

ALK

uudelleenjärjestelyn vasta merkitsevästi yhteydessä naissukupuoli ja tupakoimattomien monimuuttuja analyysit. Edellä esitetyt tulokset olivat melko samanlaisia ​​aiemmin julkaistu raportteja Aasian tai länsimaissa. Huomasimme, että vaihe jakelu NSCLC potilaalla on

ALK

uudelleenjärjestelyt olivat kaikki hyvin samankaltaisia, eli suurin numero vaiheessa I ja yhtään tai hyvin vähän vaiheessa IV, välillä tutkimus ja 4 julkaistut raportit [21,24, 25,27], miksi se ei merkittävästi liittynyt kasvain vaihe oli, että potilailla, joilla ei

ALK

uudelleenjärjestelyt oli myös eniten potilasnumero I vaiheessa ja pienin vaihe IV kaikissa näissä 5 tutkimuksista (vain 2-14 potilaalla vaiheen IV). Tämä epätasainen vaihe jakautuminen johtui todennäköisesti saatavuutta tuore kudosten RT-PCR, jotka olivat saatavilla toimintakuntoisia potilaista (vaihe I-III), ja vaikea vaihe IV potilaalle. Mielenkiintoista ilmaantuvuudessa

ALK

uudelleenjärjestelyihin vaiheen III potilaat olivat kaikki suurempi kuin muissa vaiheissa tutkimuksessamme ja 3 edellä 4 raporteissa [21,24,27]. Se vaatisi suuren numerolla onko esiintyvyys

ALK

uudelleenjärjestelyjä kasvaisi kasvaimen vaiheessa, koska esiintyvyys

ALK

uudelleenjärjestelyjä oli melko alhainen.

yksi tärkeä tavoite tämän tutkimuksen tarkoituksena oli verrata herkkyyttä ja spesifisyyttä joukossa kolme havaitsemismenetelmät (IHC, FISH, ja RT-PCR). Se paljasti, että FISH oli alhainen herkkyys (58,33%), mutta erittäin hyvä spesifisyys (99,32%). Sen sijaan IHC tahra näytti olevan parempi herkkyys (91,67%) kuin FISH, mutta spesifisyys (79,52%) oli paljon alhaisempi, kun katkaisurajasäännöksiä oli IHC2 +. Ymmärtää onko käytetyt vasta-aineet vaikuttaisivat IHC tuloksia tai ei, olemme suorittaneet IHC tahrat kaikille RT-PCR (+) kasvaimen ylimääräisiä ALK vasta eri yritysten, jotka sisälsivät 5A4 (Histofine, Nichirei), 5A4 (Abcam), 5A4 (Novocastra), ja D5F3 (Cell Signaling), vertaamaan niiden herkkyys ja spesifisyys. Kaikki edellä mainitut ALK-vasta-aineita on käytetty julkaistuissa raporteissa [15,25,35,36,38-40]. Kävi ilmi, että kun kasvaimet oli korkea ALK lauseke (IHC 3+) anti-ALK-vasta-ainetta käytettiin (ZAL4), ne myös positiivinen korkean intensiteetin kaikki muut anti-ALK-vasta-aineita (tuloksia ei ole esitetty). Sitä vastoin, jos kasvaimet oli vain kohtalainen ALK ilmaisu (IHC 2+), jonka ZAL4 nämä kasvaimet olisi täysin negatiivinen ALK muiden anti-ALK-vasta-aineita. Kuten on esitetty taulukossa S3, neljä RT-PCR: llä (+) tai FISH (+) kasvaimia tässä tutkimuksessa olivat IHC 2+. Näin ollen, ZAL4 näytti olevan suurempi herkkiä havaitsemiseksi ALK ilmaisun kuin muut anti-ALK-vasta-aineita, mutta joilla on alhaisempi spesifisyys.

Olemme tutkineet kaikki geelielektroforeesin kuvaa RT-PCR: llä (+) kasvaimet tarkistaa jos se voitaisiin korreloida ALK proteiinin ekspressiotaso IHC tahra. Yllätykseksemme RT-PCR tulokset olivat hyviä korrelaatio, paitsi ALK proteiinin ilmentymisen, mutta myös FISH tiedot. Kaikki 8 kasvainten voimakas intensiteetti PCR-tuotteiden (mikä viittaa siihen, runsaus

EML4-ALK

positiivisten solujen kasvaimen kudokset) oli myös korkea ilmentyminen ALK proteiinin IHC tahrat ja kaikki positiivinen FISH testit, paitsi yksi epäonnistunut FISH (taulukko S3). Tämä korrelaatio ei ole koskaan aikaisemmin raportoitu. Koska meillä on vain arvioitu 100 kasvainsolujen FISH testitulos kaikille kasvain oli kohtuullista, että korkea runsaasti

EML4-ALK

positiivisten solujen kasvain kudoksissa olisi suurempi mahdollisuus olla positiivinen FISH. Koska kalat on hyväksytty luotettavana diagnostinen testi crizotinib (ALK estäjä) hoito [32], havaintomme voisi luulla, että runsaus

EML4-ALK

positiivisten solujen kasvain kudosten voitaisiin myös liittyvän hoitoon vastauksena ALK estäjien.

oli myös mielenkiintoista todeta, että korkea runsaasti

EML4-ALK

positiivisten solujen kasvaimen kudokset olivat yleisempiä Variant 3a + 3b (4/5, 80% ) kuin Vaihtoehto 1 (1/3, 33,3%). Korkea ALK proteiinin ilmentymisen (IHC3 +) oli myös yleisempää Variant 3a + 3b (5/5, 100%) kuin Vaihtoehto 1 (1/3, 33,33%). Tämä oli samanlainen kuin raportin Wallander, et al. He havaitsivat, että siellä oli 100% yhtäpitävyyttä havaitsemiseksi

EML4-ALK

variantti 3a + 3b kaikilla 3 tunnistusmenetelmiä (RT-PCR, FISH ja IHC), mutta ei variantti 1 tutkimuksessa, jossa 46 valkoihoisiin [41]. Koska yleisin variantti valkoihoisia NSCLC potilaiden oli Vaihtoehto 1, se voi olla yksi syy, miksi IHC menetelmiä todettiin olevan ei-herkkä raporteissa joidenkin Länsi tutkimusraportit [25,40,41], mutta oli hyvä korrelaatio FISH tutkimuksessa raportit Aasian maista [35,36,38]. Äskettäin

EML4-ALK

variantteja todettiin myös olla eri herkkyys ALK estäjä in vitro tutkimuksessa. Vaihtoehto 1 oli herkin ALK estäjä, jonka jälkeen Variant 2 ja Variant 3b (yhtä herkkä), ja viimeinen oli variantti 3a [44]. Olisi kiinnostavaa tarkistaa, onko muunnos tyypit

EML4-ALK

ja potilaiden etnisen voi vaikuttaa hoitovasteen ALK estäjä vai ei.

Toinen havainto arvoinen keskustelulle oli kaksi potilailla, joilla on EGFR mutaatioita ja korkea ilmentyminen ALK proteiinin (IHC3 +), mutta negatiivinen RT-PCR tutkimuksessa. Yksi heistä oli FISH (-) ja toinen epäonnistunut FISH. Koska rinnakkaiselo

ALK

ja

EGFR

mutaatiot olivat hyvin harvinaisia, toinen mahdollinen selitys tähän yhdistys on, että korkea ilmentyminen ALK voisi indusoida

EGFR

mutaatioita vuorovaikutuksen kautta näiden kahden kinaasin proteiineja. Samanaikainen aktivointi ALK ja EGFR signalointireitteihin on raportoitu keuhkosyövän solulinjat, ja näistä solulinjoista voi vain vaimentaa dual inhibition sekä ALK ja EGFR [21,45].

Yhteenvetona, joukossa kolme havaitsemismenetelmät ALK uudelleenjärjestelyt, RT-PCR: llä voisi havaita paitsi läsnäolo

EML4-ALK

fuusiogeenin ja variantti tyyppejä, mutta myös runsaasti

EML4-ALK

positiivisten solujen NSCLC tuumorikudoksissa. Jälkimmäiset kaksi tekijää saattavat vaikuttaa hoitovaste anti-ALK estäjä. Sisältää RT-PCR kuin diagnostinen testi ALK estäjä hoidon mahdollinen kliinisissä tutkimuksissa on suositeltavaa.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaille ja kudosten

tuore kasvain yksilöitä 328 pienisoluista keuhkosyöpää (274 potilasta toukokuusta 2002 huhtikuussa 2006 ja 54 potilasta lokakuusta 2009 toukokuuhun 2012) vastaanottaa kirurgisen resektion Chang Gung Memorial Hospital ja allekirjoitettu suostumus saatiin kudospankille Chang Gung Memorial Hospital for RNA ja molekyylitason biomarkkereiden tutkimuksissa. Kukaan potilaista ei saanut ALK estäjä hoitoa ennen. Jäädytetyt leikkeet suoritetaan kullekin tuore keuhkosyöpä kudoksia määrittämiseksi kasvaimen% patologi (SFH) ennen tutkimusta. Ainoastaan ​​potilaat, joiden kasvain% suurempi kuin 70% olivat mukana tutkimuksessa. Jotkut tuumorikudoksista alhainen kasvain% ja runsaat kuitu- strooman oli microdissected manuaalisesti mikroskoopilla saavuttaa korkeampi kasvaimen%. Kaikki potilaat mukana täytyy myös olla käytettävissä parafiinileikkeillä keuhkojen kasvain ALK IHC tahra ja FISH tutkimus. Lopuksi, yhteensä 312 potilaalla oli riittävä yksilöitä päästä tässä tutkimuksessa. Kliiniset tiedot ja tupakointi historia saatiin potilastietoja. Kukaan potilaista ei saanut crizotinib hoitoa ennen. Tutkimus protokolla oli tarkistanut ja hyväksynyt Institutional Review Board of Chang Gung Memorial Hospital ja National Health Research Institutes. Niistä 312 potilasta, ALK uudelleenjärjestely ja IHC tutkimustulokset 64 potilasta on julkaistu aiemmin [42].

RNA ja täydentäviä DNA-synteesiin

tuore kasvainkudoksista käytettiin lähtöaineina for kokonais-RNA uuttamalla Trizol menetelmällä (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornia.). RNA laatu varmistettiin geelielektroforeesilla. Kaksi ug kokonais-RNA: ta käytettiin aloitettiin materiaalina komplementaarinen DNA (cDNA) synteesi by työllistetyt SuperScript III käänteiskopioijaentsyymi (200U /ul, Invitrogen, Carlsbad, Kalifornia.). Sen jälkeen, kun käänteisen transkription reaktio oli päättynyt, kokonaistilavuudessa 40 ui cDNA: ta saatiin. Yksi ui Saatu cDNA käytettiin edelleen PCR-reaktioissa.

polymeraasiketjureaktiota (RT-PCR) paljastaa eri ALK järjestelynä eri kumppaneiden

EML4-ALK

fuusio geeni.

RT-PCR yhdistettynä Sangerin sekvensoinnilla PCR-tuotteiden tehtiin. Kaksi Alukesarjat (esitetty taulukossa S6) on suunniteltu mukaan julkaistut raportit tunnistaa

EML4-ALK

Variant 1 ja Variant Non-1, vastaavasti [8,26,46]. Jälkimmäinen voi havaita

EML4-ALK

Variant 2 7. lämpökäsittelyn olosuhteet olivat erilaiset Vaihtoehto 1 ja Variant Non-1. Sillä

EML4-ALK

Variant 1 lämpökäsittelyn olosuhteet oli esi-inkubointi 4 minuutin ajan 95 ° C: ssa ensimmäisen aktivoinnin, jota seurasi 35 sykliä denaturointi 30 sekuntia 95 ° C: ssa, alukkeen 30 sekuntia 55 ° C: ssa, ja venymä 2 minuuttia 30 sekuntia 72 ° C.

EML4-ALK

Variant Non-1, terminen sykli oli: 15 minuuttia 95 ° C: ssa, jota seurasi 35 sykliä denaturointi 30 sekuntia 95 ° C: ssa, alukkeen 30 sekuntia 66 ° C: ssa, ja pidennys 1 minuutti 72 ° C: Arvioitu PCR-tuotteen koko (emäsparin) kunkin variantin mainittiin seuraavat: variantti 1 (247 bp) , variantti 2 (2303 bp), variantti 3 a (728 emäsparia), variantti 3b (761 emäsparia), variantti 4 (1664 bp), variantti 5a (269 emäsparia), variantti 5b (386 emäsparia), variantti 6 (1619 bp) ja variantti 7 (1688 bp).

KIF5B-ALK

,

KLC1-ALK

ja

TFG-ALK

-fuusiogeenit.

mahdollinen olemassaolo

KIF5B-ALK

,

KLC1-ALK

ja

TFG-ALK

, tutkittiin kaikkien potilaiden kasvaimia, jotka olivat negatiivisia

EML4-ALK

fuusiogeenin. Alukesarjat (esitetty taulukossa S6) ja PCR kunto suunniteltiin mukaan aiemmin julkaistut raportit [15-18]. Lämpösykli edellytykset

KIF5B-ALK

oli 95 ° C: ssa 4 minuuttia, minkä jälkeen 40 sykliä 30 sekuntia 95 ° C: ssa, 30 sekuntia 50 ° C: ssa, ja 2 minuuttia 30 sekuntia 72 ° C: ssa 40 sykliä. Jos

KLC1-ALK

, se oli 95 ° C: ssa 4 minuuttia, minkä jälkeen 40 sykliä 30 sekuntia 95 ° C: ssa, 30 sekuntia 55 ° C: ssa ja 3 minuuttia 72 ° C.

TFG-ALK

, se oli 4 minuuttia 94 ° C: ssa, mitä seurasi 40 sykliä, joissa 45 sekuntia 94 ° C: ssa, 45 sekuntia 65 ° C: ssa, ja 1 minuutti 30 sekuntia 72 ° C: ssa

sen jälkeen kun PCR-reaktio oli valmis, yhteensä PCR-tuote (20 ui) ja kunkin tapauksen käytettiin DNA geelielektroforeesilla. Jos mikä tahansa PCR-tuotteen kanssa Saatiin odotetun kokoinen, nukleotidisekvensoinnilla (Applied Biosystems PRISMR 3730 DNA Analyzer Sequencer) suoritettiin. Nukleotidisekvenssejä saadaan tarkasti BLAST ohjelma NCBI. Kaikki positiiviset tulokset toistettiin toisella teknikko vahvistusta.

ALK

uudelleenjärjestely määräytyy hajota FISH tutkimus

FISH havaitseminen tehtiin unstained 5-pm paksu parafinoidut formaliinilla kiinnitetyt kudosleikkeet. Mukaan hematoksyliinillä ja eosiini tahra saman kudoksen lohko, kasvain osuus kullakin dian valittiin ja kiersi yksi patologi (SFH) ennen kalan tutkimus.

ALK

käytettävä koetin oli Vysis ALK hajota FISH Probe (Abbott Molecular Inc. Des Plaines, IL, USA). Parafiini kudosleikkeet esikäsitellään ensin 100 mM Tris, 50 mM EDTA, pH 7,0 liuosta 92 ° C: ssa 15 minuuttia, minkä jälkeen fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) pesun jälkeen pilkottiin 300 ul: Digest-all (Zymed, Inc., South San Francisco, CA) 37 ° C: ssa 90-120 minuuttia, riippuen koosta kudosleikkeiden. Pilkkominen pysäytettiin 10% neutraaliin formaliiniin huoneenlämmössä 1 minuutin ajan ja pestiin PBS: llä jälleen. Kymmenen ui

ALK

Koetin kumpaankin kuivattu ja ilmakuivattua dia, ja denaturoitu 94 ° C: ssa 4 minuutin ajan, sitten hybridisoidaan yön yli 37 ° C: ssa Vysis HYBrite (Abbott Molecular Inc. Des Plaines, IL, USA). Hybridisaation jälkeinen pesu suoritettiin 2x standardin suolaliuoksella sitraatti 72 ° C: ssa 5 minuuttia ja huuhdeltiin sitten PBS: ssä, jossa 0,25% Tween 20 (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO). Levyjä pidettiin sitten asennetaan 10 ui Vectashield kiinnitysväliaine (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) ja 0,1 ug /ml: lla 4 ’, 6-diamidino-2- fenyyli-. FISH Tutkimuksen tuloksia arvioitiin Leica DMR fluoresenssi mikroskoopin (Leica Microsystems Nussloch GmbH, Nussloch, Saksa). FISH signaalit arvioitiin ensin kaksi kokenutta teknikot itsenäisesti (THW, YTC) ja tarkastetaan yksi patologi (SFH) niille FISH positiivinen kasvaimia. Vähintään 100 ei-päällekkäisiä ja ehjät kasvainten tumat arvioitiin. Kasvain solut katsottiin olevan positiivinen FISH tutkimuksen mukaan valmistajan ohjeita, eli kun punainen ja vihreä signaalit olivat levällään yli 2 ytimet tai aiemmin menettänyt pariksi vihreä merkkivalo (yksittäinen punainen signaali, IRS). Vain kasvaimia yli 15% syöpäsoluja, joilla on positiivinen break-erilleen FISH signaaleja katsottiin olevan

ALK

uudelleenjärjestelyjä.