Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tarkoitus

MAGE-A3 on potentiaalinen kohde immunoterapian koska sen kasvain-erityisluonne ja ilmaisun useissa kasvaintyypeissä. Kliiniset tiedot MAGE-A3 immunoterapia ovat herättäneet monia kysymyksiä, jotka voidaan ratkaista vain käyttämällä eläinmalleissa. Esillä olevassa tutkimuksessa, eri näkökohtia hiiren anti-kasvain immuunivasteiden aiheuttama rekombinantti MAGE-A3-proteiinin (recMAGE-A3) yhdessä eri immunostimulanteista (AS01, AS02, CpG7909 tai AS15) tutkittiin.

kokeellinen suunnittelu ja tulokset

Perustuu sytokiiniprofiilia analysoi ja suojan altistusta MAGE-A3-ilmentävä kasvain, yhdistelmä recMAGE-A3 + AS15 valittiin edelleen kokeellista työtä, erityisesti tutkia mekanismeja anti -tumor vastauksia. Käyttämällä MHC-luokka I, MHC-luokan II, perforin-, B-solu- ja IFN-y- knock-out hiiret ja CD4

+ T solu-, CD8

+ T solu- ja NK solu- köyhdytettyä hiiret, osoitimme, että CD4

+ T-solujen ja NK-solut ovat tärkeimmät kasvaimen vastaisen -efektiboksejamme ja että IFN-γ on merkittävä efektorimolekyyliin. Tämä hiiri kasvainmuoto vahvistetaan myös tarpeen toistaa recMAGE-A3 + AS15 injektiot ylläpitämään tehokasta anti-tuumorivasteita. Lisäksi meidän tulokset osoittivat, että tehokkuus kasvaimen hylännyt esiin anti-MAGE-A3 vastauksia riippuu osuus ilmentävien kasvainsolujen MAGE-A3.

Johtopäätökset

recMAGE-A3 + AS15 syövän immunoterapiassa tehokkaasti indusoi antigeenispesifisiä, toimiva ja pitkäkestoinen immuunivaste osaa tunnistaa ja poistaa MAGE-A3-ilmentäviä tuumorisoluja jopa useita kuukausia viimeisen immunisoinnin jälkeen hiirillä. Tiedot korosti immunostimulantti indusoida Th1-tyypin immuunivasteen, sekä keskeinen rooli IFN-γ, CD4

+ T-solujen ja NK-solujen antituumorivaikutus.

Citation: Gérard C, Baudson N Ory T, Louahed J (2014) Kasvaimen Mouse Model vahvistaa MAGE-A3 Cancer Immunoterapeuttiset tehokkaana indusoija pitkäkestoiseen Anti-Kasvaimen vasteet. PLoS ONE 9 (5): e94883. doi: 10,1371 /journal.pone.0094883

Editor: Ramon Arens, Leiden University Medical Center, Alankomaat

vastaanotettu: 21. 2014; Hyväksytty: 20 maaliskuu 2014; Julkaistu: May 15, 2014

Copyright: © 2014 Gérard et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: rahoittajien oli rooli tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. GlaxoSmithKline Biologicals SA oli rahoituslähteen ja oli mukana kaikissa vaiheissa tutkimuksen suorittamisesta ja analyysi. GlaxoSmithKline Biologicals SA rahoitetaan myös kaikki kustannukset, jotka liittyvät kehittämiseen ja julkaiseminen nykyisen käsikirjoituksen. JL oli mukana tutkimuksessa valvonta kaikissa vaiheissa. Kaikki kirjoittajat olivat mukana tutkimuksen suunnittelu, tarkastelu tutkimus, tietojen analysointi ja tulkinta. NB ja TO suoritti tutkimuksen ja olivat mukana luonti. Kaikki kirjoittajat osallistuivat laatimisesta ja hyväksymisestä käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Olen lukenut lehden politiikan ja ovat seuraavat ristiriitoja: CG, NB, TO, JL ovat työntekijöitä GlaxoSmithKline Rokotteet. CG ja JL julistaa varastossa omistuksen GlaxoSmithKline konserni. CG ja JL ovat myös keksijän omistamat patentit GlaxoSmithKline konserni (WO /2013/096430). Tämä ei muuta meidän noudattamista PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

lähtien William Coley huomautukset 19. vuosisadalla, että syöpä voidaan hoitaa ottamalla käyttöön potilaan oman immuunijärjestelmän , perimmäisenä tavoitteena syövän immunologit on ollut toistuvasti saavuttamiseksi potilailla. Mutatoidun poikkeava proteiinit, aktivoida uudelleen tai yli-ilmentynyt kasvainsoluissa, edustavat mahdollisten ”kasvaimen antigeenejä”, joka voidaan kohdistaa immuunijärjestelmä [1] – [3].

Poikkeava geenin promoottori demetylaatio on tärkeä mekanismi, jonka ilmentymistä normaalisti hiljainen geenien aktivoituu uudelleen kasvainsoluissa. Tämä on asianlaita

MAGEA

perheen geenejä, jotka normaalisti ilmaistaan ​​aikana alkion elämän [4] ja istukan [5], [6], mutta ovat hiljaa normaaleissa aikuisen kudoksissa, paitsi ituradan soluissa kiveksen [5].

MAGE-A3, jäsen tämän MAGE-perheenä on houkutteleva kasvain antigeeni, koska i) se on lähes yksinomaan ilmaistaan ​​kasvaimia, poistaa vaaran asentamalla aktiivinen immuunivaste normaaleissa kudoksissa (sukusoluissa kivesten ovat vain normaaleja soluja, jotka ilmentävät MAGE-A3, mutta niillä ei ole klassisen luokan I HLA-II-molekyylejä ja näin ollen ei ole antigeenin esittelyn ominaisuuksia, jotka sulkevat pois kehityksen immuunijärjestelmän liittyviä toksisuutta MAGE-A3 immunoterapia), ii) se ilmentyy monissa eri syöpätyyppejä, ja iii) se on luonnostaan ​​immunogeeninen, sillä CD8

+ T-lymfosyyttien spesifisiä MAGE-A3 havaittiin tunkeutua tuumorikohdat melanoomapotilailla [ ,,,0],7].

Kliiniset tiedot tuotetaan viime vuosikymmenen aikana eri immunotherapeutic lähestymistapoja osoitti, että tuottaa MAGE-A3 puhdistettuna rekombinanttiproteiinin muotoiltu immunostimulantti saattaa olla lupaava lähestymistapa [8] – [11]. Huolimatta rohkaisevia tuloksia, monet kysymykset ovat edelleen ratkaisematta parantamaan edelleen MAGE-A3-siedätyshoidon. Erityisesti parantamalla MAGE-A3-immunostimulantti yhdistelmä aiheuttaa pitkäaikaisia ​​anti-kasvain immuunivasteen edelleen välttämätöntä. Lisäksi hienomekanismin ja avain immuuni effektorit johtavat kasvaimen hyljinnän ei tunneta, eikä selvää immuuni korreloi kliiniseen tehoon ei ole vielä määritelty. Ei ole myöskään tiedossa, missä määrin polttovälin mallia MAGE-A3 ilme sisällä kasvain voi rajoittaa kliinistä tehoa. Tällaiset kysymykset ja hypoteesit voida kohtuudella käsiteltävä kliinisissä tutkimuksissa, koska pitkä kesto ja rajoitettu määrä potilaita. Siksi prekliinisissä tutkimuksissa edelleen välttämättömiä ohjata kliinisen kehittämisen MAGE-A3-siedätyshoidon.

käsiteltiin joitakin näistä kysymyksistä esillä olevassa tutkimuksessa. Ensimmäisessä koesarjassa hiiriä immunisoitiin rekombinantilla MAGE-A3 (recMAGE-A3) muotoiltu eri immunostimulanteista: AS01, AS02, AS15 tai CpG7909. AS15 on valittu tästä paneelista jatkotutkimuksiin, koska sen kyky ajaa immuunijärjestelmän kohti Th1-tyypin immuunivasteen, ja tuloksena tuumorin vastaista aktiivisuutta MAGE-A3-ilmentäviä tuumorisoluja. Hiiret vuoksi immunisoitu valittua recMAGE-A3 + AS15 formulaatio Toisessa koesarjassa arvioidaan i) avaimen efektorit mukana antituumorivaikutuksen, ii) vaikutuksen tehosteinjektiot ja iii) vaikutus kasvaimen heterogeenisyys -i.e. osuus ilmentävien kasvainsolujen MAGE-A3- tästä antituumorivaikutuksen.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Kokeet suoritettiin GlaxoSmithKline Vaccines laboratorioissa tai GlaxoSmithKline henkilökunta Armand Frappier Institute (IAF – Kanada). Eläinkokeissa esitetty tässä käsikirjoitus oli eettisesti tarkistanut ja hyväksynyt GlaxoSmithKline Vaccines ”Belgian eettisen komitean koe-eläintoimikunnan tai eettinen komitea IAF. Ne mukaisesti suoritettu EU direktiivin 2010/63 /EU, CCAC standardit (Canadian neuvoston Animal Care) ja GlaxoSmithKline rokotteet valiokunnalle Care, hyvinvointi ja hoito eläimet. Molemmat GlaxoSmithKline Vaccine laitos ja IAF ovat AAALAC (Association for arviointi ja akkreditointi Laboratory Animal Care) akkreditoitu. Kaikki pyrittiin minimoimaan kärsimyksen: kasvaimet ylittää suurimman sallitun koon 17 mm x 17 mm, haavaumia, tuumorinekroositekijä, kouristukset, sairastavuutta ja kiertolähestyminen käyttäytyminen olivat ehtoja, jotka edellyttävät eutanasia intraperitoneaalisena injektion barbituurihapon johdannaisen (yliannostus).

antigeeni kuvaus, tuotanto ja puhdistus

fuusioproteiini ProtD-MAGE-A3-His, myös lyhennettä recMAGE-A3, sisältää ensimmäiset 127 tähdettä proteiini D johdettu

Haemophilus influenzae

sen N-päässä on parantaa proteiinin ilmentyminen bakteeri-järjestelmässä, ja sekvenssi histidiinitähteitä sen C-päähän helpottaa fuusioproteiinin puhdistusta.

tuotanto recMAGE-A3 suoritettiin

Escherichia coli

AR58, kuten aiemmin on kuvattu [11]. Toinen yhdistelmä-MAGE-A3-proteiinin, joka koostuu ensimmäisen 314 aminohapon MAGE-A3 ja sen jälkeen 6 histidiinitähdettä, on tuotettu bakulovirus [11]. Tämä proteiini, jota kutsutaan bacMAGE-A3, käytettiin seurantaa immuunivasteita.

kuvaus Immunostimulantit

AS02 muodostuu öljy-vedessä-emulsio, joka sisältää 3-

O

-desacyl-4′-monofosforyylilipidi A (MPL, GlaxoSmithKline Vaccines, Rixensart, Belgia), Toll-kaltainen reseptori (TLR) -4 agonisti, ja QS-21 (

suopapuu

Molina jae 21, Antigenics Inc, kokonaan omistama tytäryhtiö Agenus Inc., Lexington, MA, USA), joka on molekyylin saponiinia perheen [12]. AS01 on adjuvantti, joka sisältää MPL, QS-21 ja liposomin. AS15 sisältää MPL, QS-21, liposomi, ja TLR-9-ligandin CpG7909 (synteettinen oligodeoksiribonukleotidin [ODN: t], joka sisältää metyloimattomia CpG-motiiveja, kutsutaan tässä CpG).

Hiiri Kannat ja Immunizations

C57BL /6 tai CB6F1 (hybridi C57BL /6 ja BALB /c) naarashiiriä (6-8 viikkoa vanhoja) hankittiin Harlan (Horst, Alankomaat) ja pidettiin spesifisissä patogeenivapaissa olosuhteissa.

hiiret olivat yleensä pistetään 2 tai 4 kertaa lihakseen 2 viikon välein 1 tai 10 ug recMAGE-A3 50 ui immunostimulant.

tutkimiseksi pitkäaikainen suoja, hiiret saivat 2 injektiota joko recMAGE-A3 + AS15 tai fosfaattipuskuroituun liuokseen (PBS) 2 viikon välein. Kahdeksan viikkoa toisen immunisaation jälkeen, eläimet altistettiin TC1-MAGE-A3 kasvain (katso kuvaus kasvainsolujen alla;

Tumor malleihin ja haasteita

). Päivänä 150, 80 päivän kuluttua kasvaimen haaste, kasvaimettomina eläimiä recMAGE-A3 + AS15 ryhmä satunnaistettiin ja jaettu kahteen ryhmään. Yksi ryhmä sai neljä booster injektioita recMAGE-A3 + AS15 at 4 viikon välein ja toinen ryhmä sai injektioita PBS noudattaen samaa aikataulua. Kolmekymmentä päivää viimeisen injektion, hiiret tehtiin kasvain haaste samaan kylkeen, ja kasvaimen kasvua seurattiin aikana 46 päivää (enintään Day 319). Lisäksi kasvainsoluja ruiskutettiin ryhmään kymmenen PBS-immunisoidut hiiret, positiivisena kontrollina kasvaimen kasvua.

roolin arvioimiseksi IFN-γ, perforiini ja MHC-luokan I tai II molekyylien kasvaimen suojan seuraavat MAGE-A3 immunoterapia, immuunivajaisiin hiiriä käytettiin samalla immunisaatiossa kuten edellä on kuvattu. Seuraavat kannat hankittiin Jackson Institute: IFNy-tyrmäsi (KO) hiiriä (B6.129S7-Ifngtm1Ts /J), MHC-luokan I-KO (B6.129P2-b2mtm1Unc), MHC-luokan II-KO (B6.129S2 -H2-dIAb1-Ea00451), B-solu-KO (B6.129S2.IgHmTm1Cgn) ja perforiini-KO hiiret (C57BL /6-Prf1 tm1Sdz /J).

arvioimiseksi mahdollinen rooli T-solujen, recMAGE-A3-immunisoitujen C57BL /6-hiiriä köyhdytettyä CD4

+ tai CD8

+ T-soluja injektoimalla 0,5 mg rotan anti-hiiri-vasta-aineita (GK1,5 [TIB-207 ATCC] ja 2,43 [TIB- 210 ATCC], vastaavasti) viikkoa ennen kasvaimen haaste ja sitten viikoittain kokeen. NK-solujen väheneminen saavutettiin injektoimalla anti-asialo-GM1-vasta-ainetta (Cedarlane) kaksi kertaa viikossa alkaen päivänä 49 (eli 7 päivää ennen kasvaimen haaste) ja loppuun asti kokeen (0,1 ml per injektio). Häviämisen varmistettiin virtaussytometrillä (tuloksia ei ole esitetty). Ohjaus vasta samanlaisia ​​isotyyppien kuin tuhoavien vasta-aineita käytettiin negatiivisina kontrolleina.

kasvainmuodoista ja haasteet

TC1-MAGE-A3-solut ovat hiiren tuumorisoluja muuntogeenisten ilmaista ihmisen MAGE-A3. TC1 kasvainsoluja (saatu tri T. Wu, John Hopkins University) ovat mielenkiintoisia, koska he toistavat eri vaiheet, jotka johtavat kasvaimia solulinjaan. Alunperin TC1 kasvain solulinja C57BL /6 ensisijainen keuhkojen epiteelisoluissa kuolemattomiksi transfektoimalla

HPV-16 e6

ja

e7

geenejä ja muunnettu aktivoidun

Ras

onkogeeni [13]. Nämä solut transfektoitiin pcDNA3-plasmidi, joka sisälsi

MAGEA3

cDNA: n ja

zeocin

selektiogeenin. Kloonit resistenttejä zeosiinille hoitoon testattiin

MAGEA3

ilmentymisen RT-PCR: llä ja MHC-luokan I ilmentymisen virtaussytometrialla (tietoja ei esitetty). Paras klooni osoittaa toistettavia tuumorigeenisyystesti hiirillä valittiin.

Kunkin haaste, eläimet saivat ihonalaisen 2 x 10

6 TC1-MAGE-A3-solut (200 ui kylkeen). Yksittäiset kasvaimen kasvu oli kahdesti viikossa, mittaamalla tuotteen 2 tärkeimmät halkaisijat kasvaimen seurannan aikana vaiheessa, joka alkaa 7 päivää sen jälkeen, kun päivän haaste. Hiiret tapettiin tutkimuksen aikana, kun kasvaimen koko saavutti 289 mm

2. Tällaisessa tapauksessa arvo viimeisen mittauksen saatu ennen tappamista siirrettiin seuraavaan ajankohtana (t).

Voit selvittää, onko kynnys prosenttiosuus MAGE-A3-ilmentäviä tuumorisoluja tarvitaan aikaansaamaan kasvaimen hyljinnän immuunijärjestelmää, PBS-lumeimmunisoitua hiirissä ja hiirissä, jotka oli immunisoitu recMAGE-A3 + AS15 altistettiin TC1 emosoluista (100% MAGE-A3-negatiiviset solut), TC1-MAGE-A3-soluja (100% MAGE- A3 ilmentävien solujen), tai erilaiset suhteet TC1 /TC1-MAGE-A3: eli 10/90, 50/50 tai 90/10%, vastaavasti.

Cytokine Production

eristetty hiiren pernasolujen viljeltiin, kun läsnä on 1 ug /ml bacMAGE-A3. 72 tunnin jälkeen, pitoisuudet IL-2, IL-4, IL-5: n, IFN-γ: n ja TNF-α supernatanteissa mitattiin sytometria helmi array (CBA, Pharmingen cat nro 551287), mukaisesti valmistajan ohjeiden .

Solunsisäinen Sytokiiniagonistit Värjäys ja virtaussytometria

Perifeerisen veren mononukleaariset solut eristettiin immunisoiduista eläimistä stimuloitiin

in vitro

96-pyöreäpohjaisessa kuopan levyille joko väliaineen (no stimulaatio ) tai altaan viisikymmentäseitsemän 15 mer peptidien päällekkäin 10 aminohappoa, joka kattaa koko sekvenssin MAGE-A3 (1 ug /ml kutakin peptidiä), lopullisessa tilavuudessa 200 ui RPMI, 5% vasikan sikiön seerumia (FCS), joka sisälsi kaniinin anti-hiiri-anti-CD49d ja anti-CD28-vasta-aineita (Becton Dickinson, BD nro 553154 ja nro 553295 vastaavasti; lopullinen pitoisuus: 1 ug /ml kutakin). 2 h kuluttua inkuboinnin 37 ° C: ssa, sytokiinien estettiin lisäämällä 50 ui brefeldin (Golgi Plug, BD nro 555029: 1/1000 RPMI 5% FCS). Solut siirrettiin 96-kartiomainen pohja kuoppalevylle, sentrifugoitiin ja pestiin 250 ul PBS: ää, joka sisälsi 1% FCS: ää (FACS-puskuri). Solupelletit inkuboitiin 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa, kun läsnä oli rotan anti-hiiri-CD16 /CD32 (2.4G2, BD nro 553142; 0,5 mg /ml) estää Fcy-reseptoreihin. CD4

+ ja CD8

+ T-solut värjättiin 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa lisäämällä 50 ui fykoerytriini-leimatun rotan anti-hiiri-CD4-monoklonaalisella vasta-aineella (BD nro 556616) tai peridinin klorofylli proteiini-leimattu rotan anti -hiiri CD8 monoklonaalinen vasta-aine (BD nro 553036). Pesuvaiheen jälkeen, solut kiinnitettiin 200 ul: ssa Cytofix-Cytoperm liuosta (BD n ° 554722) 20 minuutin ajan 4 ° C: ssa ja läpäiseviksi lisäämällä permWASH liuosta (BD nro 554723). Sentrifugoinnin jälkeen soluja inkuboitiin 2 tunnin ajan 4 ° C: ssa 50 ui sekoitus allofykosyaniini-leimattu anti-IFN-γ (BD nro 554413). Solut pestiin, sentrifugoitiin ja suspendoitiin uudelleen FACS-puskuriin ennen virtaussytometria-analyysiä (LSR2 BD). Gating tehtiin T-solujen, ja yhteensä noin 20000 CD4

+ T-solut hankittiin. Tiedot ilmaistiin prosentteina MAGE-A3-erityisiä IFN-γ tuottavien CD4

+ tai CD8

+ T-solujen joukossa koko väestöstä CD4

+ tai CD8

+ T-soluja, vastaavasti , vähentämisen jälkeen verrokkiravintoalusta arvosta.

TILASTOANALYYSI

Sytokiini analyysit tehtiin käyttäen ANOVA ryhmään kuin tekijä jälkeen log-datalle. Muiden analyysejä, tilastollista mallia oli toistuvia ANOVA ryhmä, aika ja ryhmä-by-aikaa vuorovaikutukseen tekijöinä; korrelaatio kahden mittauksen samasta hiiret oletetaan olevan autoregressive, eli korrelaatiot laskevan eksponentiaalisesti ajan. Varianssien oletettiin olevan erilainen eri ryhmien, mutta samat koko ajankohtina. Vertailut keskiarvon kasvainten koot tehtiin edellisen kerran piste.

Tulokset

Immuunijärjestelmän ja Anti-kasvain vasteet immunisoitujen hiirten recMAGE-A3 Yhdistettynä eri Immunostimulantit

neljän immunizations C57BL /6-hiirissä, joilla recMAGE-A3, yksin tai formuloituna immunostimulantti (AS01, AS02, CpG- tai AS15), sekä humoraalisen ja soluvälitteisen immuunivasteen arvioitiin. Vasta-vaste oli alhainen immunisoinnin jälkeen recMAGE-A3 yksin verrattuna immunisointiin recMAGE-A3 muotoiltu immunostimulantti (kuva S1). Humoraalisen indusoimia recMAGE-A3 muotoiltu eri immunostimulanteista katsottiin vastaavan riippumatta immunostimulantti. Samoin ei ole suuria eroja havaittu välillä Immunostimulanttien niiden kyky indusoida T-soluvasteita arvioituna Lympho leviämisen kokeita (kuva S2).

Sen sijaan, asiaa erot Immunostimulanttien havaittiin, kun

in vitro

sytokiinin tuotanto pernasoluja eristettiin immunisoiduista eläimistä mitattiin CBA viljelmien supernatanteissa (kuvio 1). Vaikka pieni määrä hiirien (n = 2 tai 3) kussakin ryhmässä, meidän tulokset osoittivat, että AS15 indusoi selvästi puolueellisia kohti Th1 profiilin, jolle on ominaista suurempi IFN-γ /IL-5 ja TNF-α /IL-5-suhteet verrattain että AS01, AS02 ja CpG. Tämä havainto liittyy suurempi IL-2 indusoi AS15 suhteellisen muille immunostimulantteja.

-hiiriä immunisoitiin päivinä 0, 14, 28 ja 42, joissa recMAGE-A3 (10 ug antigeeniä) yksin tai recMAGE-A3 muotoiltu eri Muutimmunostimulantit, ja uudelleen stimuloidaan

in vitro

by bacMAGE-A3. Sytokiinituotannossa mitattiin sytometria helmi array (CBA) 72 tunnin jälkeen viljelyn. Jokainen piste edustaa hiiri, ja baarit ovat geomeans. N, ei tehty.

Kun 4 immunisointia PBS: ää tai recMAGE-A3 muotoiltu eri immunostimulanteista, hiiret altistettiin subkutaanisesti TC1-MAGE-A3 kasvainsoluja ja

in vivo

kasvaimen kasvua seurattiin aikana 4 viikon ajan. Käsitellyillä hiirillä PBS, progressiivinen kasvu kasvainten havaittiin (kuvio 2). Eri tulokset havaittiin immunisoitujen hiirien recMAGE-A3, riippuen liittyvän immunostimulantti. Hiiriä ole suojattu kasvaimen kasvua, kun AS02 käytettiin ja olivat huonosti suojattu AS01 tai CpG. Kuitenkin kasvaimen kasvua valvottiin immunisoiduista hiiristä recMAGE-A3 + AS15. Ei ainoastaan ​​sen kasvaimen kokoa pienennetään tässä ryhmässä, mutta 3/5 hiiret olivat kasvaimettomia, kun tuumorit arvioitiin neljän viikon kuluttua kasvaimen haaste.

hiiriä (n = 5) immunisoitiin recMAGE-A3 ( 10 ug antigeeniä) valmistettu erilaisista immunostimulanttien ja altistettiin TC1-MAGE-A3 soluissa. Päivänä 84, keskivirheet keskimääräisen näkyvät ja hiirien lukumäärän jäljellä kasvaimettomina on kullekin ryhmälle. Päivänä 84: n, recMAGE-A3 + AS15 ryhmä todettiin erilainen kuin kaikki muut (p 0,01). Myös kasvaimen kasvu oli vähentynyt recMAGE-A3 + AS15 ryhmässä, verrattuna muihin ryhmiin (p 0,01).

erityispiirteenä kasvaimen vastainen vaste määritettiin osoittamalla, että hiiret immunisoitu recMAGE + AS15 eivät kyenneet poistamaan TC1, jotka on transfektoitu irrelevantilla antigeeni (TC1-Her2 /neu) injektoidaan samoissa olosuhteissa kuin TC1-MAGE-A3-soluja (tietoja ei esitetty). Havaitsimme myös, että AS15 täytyi olla läsnä jokaisessa injektio tehokkaasti stimuloida anti-MAGE-A3 immuniteetin (tuloksia ei ole esitetty).

Perustuen koko joukko tietoja verrataan eri Muutimmunostimulantit, valitsimme AS15 kaikille Seuraavissa kokeissa, joissa recMAGE-A3, koska se indusoi Th1-biasoitu immuunivaste ja oli tehokkain kasvua vastaan ​​MAGE-A3-ilmentäviä tuumorisoluja.

Immunisointi recMAGE-A3 + AS15 saa aikaan pitkän aikavälin Protection

tärkeä näkökohta sukupolven anti-kasvain immuunivasteen on induktio pitkän aikavälin immuuni muisti, joka pystyy tarjoamaan pitkäaikaisen suojan kasvaimen uusiutumista. Alustavissa kokeissa hiirillä, havaitsimme, että määrän lisääminen recMAGE-A3 + AS15 injektiot oli välttämätöntä paremmin suojata hiiriä kasvaimen haaste, mikä viittaa siihen, että se ylläpitää immuunivastetta toistuvia injektioita varten voidaan tarvita parantunut tehokkuus (tuloksia ei ole esitetty) .

perustaa ja arvioida, immunisaatio recMAGE-A3 + AS15 kykeni indusoimaan tällaista pitkäaikaista immuunimuisti ja onko vahvistimet olivat tarpeen (kuvio 3A). Tätä varten hiiret immunisoitiin päivinä 0 ja 14 joko PBS: ää tai recMAGE-A3 + AS15. Immunisointi recMAGE-A3 + AS15 indusoi IFN-γ-tuottavat antigeenispesifisen CD4

+ ja CD8

+ T-solut (kuvio 4). Altistuksen jälkeen, jossa TC1-MAGE-A3 kasvainsoluja, kaikki PBS-immunisoidut hiiret kehittäneet kasvaimen ja tapettiin, kun taas 52 60 recMAGE-A3 + AS15-immunisoiduissa hiirissä hylkäsi kasvaimen ja pysyi kasvaimen vapaa vähintään kaksi kuukautta ( Kuva 3A).

. Tutkimusasetelma ja otoskoko (CB6F1 hiiret) on eri vaiheet on esitetty. Immunisaatiot tehtiin 1 ug: lla antigeeniä. B. Toisen kasvain haaste, kasvaimen kasvua seurattiin 46 päivän ajan. Lopussa kokeen (päivä 319), keskivirheet keskiarvo on esitetty, ja useita kasvain-hiirien on osoitettu kullekin ryhmälle.

CB6F1 hiiriä käsiteltiin, kuten on esitetty kuviossa 3A . Lyhyesti, hiiret olivat kasvaimeen haastoi kahden immunisointia recMAGE-A3 + AS15 tai PBS (ohjaus 1). Hiiret MAGE-A3 + AS15 ryhmä jäljellä kasvaimettomina saivat joko PBS vahvistimet tai recMAGE-A3 + AS15 vahvistimet. Uusi kontrolliryhmä sai PBS (Control 2). Verinäytteet otettiin päivänä 21 (7 päivää toisen immunisaation) ja päivänä 166 (7 päivää ensimmäisen booster injektio). Verinäytteet yhdistettiin ja määrät MAGE-A3-specific IFN γ tuottavien CD4

+ ja CD8

+ T-solut määritettiin solunsisäisten värjäys ja virtaussytometria. Tiedot ilmoitetaan prosentteina koko CD4

+ ja CD8

+ T-solujen vähentämisen jälkeen ohjaus väliaineen arvot, jotka edustivat noin 0,02% mitattaessa CD4

+ T-soluja ja 0,1% mitattaessa CD8

+ T-soluja, vastaavasti; jokainen piste on pooli 3 näytettä päivänä 21 ja jokainen piste on pooli 5 näytettä päivänä 166. *** = p 0,001.

Tässä vaiheessa 50 52 kasvain vapaa-hiiret jaettiin satunnaisesti kahteen ryhmään. Yksi ryhmä sai PBS: ää ja toinen ryhmä recMAGE-A3 + AS15. Immuunivasteet arvioitiin päivänä 166 7 päivän kuluttua ensimmäisestä booster. Ryhmässä saatuaan PBS booster, CD4

+ ja CD8

+ T-soluvasteiden päivänä 166 (5 kuukauden kuluttua ensimmäisestä kaksi immunisointia recMAGE-A3 + AS15) olivat pienemmät kuin vasteet päivänä 21 (yksi viikko sen jälkeen, kun kaksi ensimmäistä immunisointia recMAGE-A3 + AS15) (kuvio 4). Tämä kuvaa lasku immuunivastetta ajan. Sen sijaan yhden recMAGE-A3 + AS15 tehosterokotus on riittävä nostamaan tasoa sytokiiniä tuottavien CD4

+ T-soluja jopa vähintään mitatut päivänä 21. Lisäksi tasot CD8

+ T-solut kasvoivat jopa 5-kertainen verrattuna tasot mitattiin viikon kuluttua kaksi ensimmäistä immunisaatiota (kuvio 4) ja MAGE-A3-CD8

+ T-solut tuottavat IFN-γ edustaa jopa 20%: CD8

+ T-solu-allas.

neljän kuukausittain vahvistimet, 50 hiiret olivat kasvaimen kyseenalaiseksi. Tässä vaiheessa, kolmasosa ryhmä 10 hiirestä, jotka saivat vain PBS: ää lisättiin kontrollina kasvaimen kasvua. Ei IFN-γ tuottavat antigeenispesifisen CD4

+ ja CD8

+ T-soluja havaittiin tässä kontrolliryhmässä.

ryhmässä, joka sai vahvistimet PBS: ää, vain pieniä määriä IFN- γ tuottavat antigeenispesifisen CD4

+ T-soluja havaittiin (jäljellä olevien kahden ensimmäisen MAGE-A3 + AS15 annettu injektio 9 kuukautta aikaisemmin). Kuitenkin 19 näistä 25 hiiret pysyivät kasvaimettomina altistuksen jälkeen, mikä osoittaa, että pitkäaikainen immuunimuisti oli esitetty, ja että hiiret edelleen suojattuja lähes vuoden kuluttua viimeisen immunisoinnin. Ryhmässä hiirten kasvatti kuukausittain recMAGE-A3 + AS15 kaikki 25 hiiret pysyivät kasvaimettomina (kuvio 3B). Nämä tiedot viittaavat siihen, että oli eduksi antaa tehosteinjektioita, joissa recMAGE-A3 + AS15, vaikka pitkäaikaisen ja tehokkaan immuunivasteen indusoitiin ensimmäisen immunisaation osalta.

Myöhemmin pitkäaikaisen kokeen, olemme todenneet, että AS15 on tarpeen kussakin booster optimaalisesti eläinten suojelemiseksi vastaan ​​kasvaimen kasvua (tietoja ei esitetty).

CD4

+ T Cells, NK solut, IFN-γ: n ja MHC-luokan II ovat Cell alapopulaatioiden ja Molecular efektibokseille Mukana recMAGE-A3 + AS15 aiheuttama kasvain Protection

pyritään tunnistamaan solujen tai efektorimekanismeja, jotka saattavat olla vastuussa suojaa kasvaimen sarjan kokeita tehtiin hiiret joko KO tai köyhdytetty spesifisten solutyyppien. Eri ryhmät hiirissä sai kaksi tai neljä immunisoinnin recMAGE-A3 + AS15 on kahden viikon välein, ennen kuin ne altistettiin TC1-MAGE-A3-soluja. Kuten kuviossa 5 on esitetty, B-solu-KO, MHC-luokka I-KO ja perforiini-KO-hiiret pysyivät suojattu recMAGE-A3 + AS15 immunisointia. Sen sijaan kasvaimen suojelua vaikutti NK ja CD4

+ T-solu-köyhdytettyä hiiret ja IFN-γ-KO ja MHC-luokan II-KO hiirillä. Nämä tulokset tunnistettu CD4

+ T-solujen ja NK-solujen keskeisinä solupopulaatioiden kasvainta mekanismi. IFN-γ myös määritetty kriittiseksi molekyyli efektori. Vaikka tarkkaa lähde IFN-γ ei tunneta, se edelleen korostaa indusoi Th1-esijännitetty anti-kasvain immuunivasteen.

solun Depleetiokokeita ohjaus isoptypes (Ig) samanlainen käytetty vasta-aine heikentävistä T-solun tai NK-soluja käytettiin. Lukumäärä eläintä ryhmää kohti on ilmoitettu kunkin kaavion otsikko. Punainen nuoli osoittaa tuumorin haaste. Viimeisessä ajankohtana, keskivirheet keskimääräisen näkyvät ja määrä kasvaimettomina hiiret on tarkoitettu jokaiselle ryhmälle. Keskimääräinen kasvaimen kokoa kussakin ryhmässä tilastollisesti verrattiin kuin recMAGE-A3 + AS15 ryhmä viimeisenä ajankohtana (* = p 0,01; ** = p 0,001; NS = ei merkitsevä).

Tumor Growth Inhibition Riippuu osuus MAGE-A3-ilmentävät solut kasvaimessa

Expression MAGE antigeenejä ei välttämättä homogeeninen kasvain, joka osoittaa polttoväli värjäytymistä immuunihistokemiallisessa [14], luultavasti siksi ei kaikki ilmentävät MAGE-A3 samanaikaisesti ja samalla tasolla. Koska tämä ilmiö on määrä vaikuttaa tehoon recMAGE-A3 + AS15 immunisointiin, arvioimme onko recMAGE-A3 + AS15 kykeni suojaamaan hiiriä kasvain, joka ei ole valmistettu 100% MAGE-A3-ilmentäviä soluja.

immunisoinnin jälkeen PBS: llä tai recMAGE-A3 + AS15, hiiret altistettiin eri suhteissa TC1 vanhempien kasvaimia ja TC1-MAGE-A3-ilmentäviä soluja (0-10-50-90 ja 100%) (kuvio 6). Tulokset osoittivat, että kaikki kasvaimen sekoitukset kasvoi tasaisesti hiirissä lumeimmunisoitua PBS: llä. Samoin kasvua MAGE-A3-negatiivinen kasvain ei vaikuttanut recMAGE-A3 + AS15 immunisaatio. Sen sijaan, recMAGE-A3 + AS15 immunisaatio suojaa kasvaimen kasvun aikana 25 päivää kasvaimen haaste jopa silloin, kun ainoastaan ​​10% TC1-soluista ilmensi MAGE-A3. Sama koskee, kun 50% soluista, ja sen jälkeen, ilmaistuna MAGE-A3. Kuitenkin, kun taas kaikki hiiret altistettiin 100% MAGE-A3-ilmentävien solujen pysyi kasvaimettomina jopa 57 päivää altistuksen jälkeen, pahenemisvaiheita havaittiin hiirissä kasvaimia, jotka sisälsivät MAGE-A3-negatiivisia soluja. Intensiteetti ilmiö oli riippuvainen prosenttiosuus MAGE-A3-negatiivisia soluja haastava kasvain. Ryhmässä altistettiin 90%: MAGE-A3-ilmentäviä soluja, 2/9 hiiret osoittivat uusiutumisen. Keskimääräinen kasvaimen koko tässä ryhmässä ei ollut tilastollisesti erilainen kuin ryhmässä, joka sai 100% MAGE-A3-ilmentävien TC1 soluissa. Sitä vastoin ryhmässä altistettiin 50%: MAGE-A3-ilmentäviä soluja, 6/9 hiiristä oli uusiutunut päivänä 112, ja ryhmässä altistettiin 10%: MAGE-A3-ilmentäviä soluja, pahenemisvaiheita havaittiin 7 /9 hiiret päivänä 112. keskimääräinen kasvaimen kokoa näissä ryhmissä oli tilastollisesti erilainen kuin ryhmässä, joka sai 100% MAGE-A3-ilmentävien TC1 soluja, joilla on korkein keskimääräinen kasvaimen koon kaikkien uusiutunut eläimiä havaittiin hiirissä 10% MAGE-A3-ilmentäviä soluja.

immunisoitujen hiirten recMAGE-A3 + AS15 (1 ug antigeeniä) seurattiin jopa päivän 112. päivää 77 ja 112, keskivirheet keskimääräisen on esitetty, ja määrä kasvain-hiirien on osoitettu kullekin ryhmälle. Tilastollinen vertailut kasvaimen keskimääräinen koko kunkin ryhmän että TC1-MAGE-A3 (100%) ryhmässä päivinä 77 ja 112 on esitetty (* = p 0,01; ** = p 0,001; NS = ei merkitsevä). Punainen nuoli: päivä haaste.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa, arvioimme mahdollisuuksia recMAGE-A3 muotoiltu eri immunostimulanteista. Sekä aiheuttama immuunivasteita ja niiden kykyä estää kasvaimen kasvua analysoitiin. Toiminnallisesta kokeissa, anti-kasvain potentiaali MAGE-A3 immunisoinnit arvioitiin profylaktisena asetus ei ollut kasvainta kantavien hiirten sijaan terapeuttinen ympäristössä, jotta paremmin jäljitellä kliinisestä tilasta adjuvanttihoitona syöpäpotilaille. Itse asiassa Adjuvanttihoidon potilaat ensimmäinen leikkaukseen, ja pidetään vapaa kasvain, kun he saavat Immunisoitaessa. Vaikka hiiri malleja ei kuvasta täysin ihmisen tilannetta, mikä johtuu osittain luontaiset erot kahden immuunijärjestelmä [15] ja koska hiiret eivät ole pohjustettu alkutuottajan kasvain, injektio TC1-MAGE-A3 solut valittiin kasvain malli luonnehtia vaikutus immuunivasteita, jotka on indusoitu recMAGE-A3-immunisointi. Tämän mallin eri immunostimulantteihin voitaisiin arvioida ja ainakin osa mekanismeja kasvainta voitaisiin purkaa.

Ensimmäinen ja toistettavissa havainto oli, että injektio recMAGE-A3 yksinään ei indusoinut suojaavaa immuunivastetta , recMAGE-A3 on heikosti immunogeeninen itsestään.