Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Ihmisen sulfataasi 1 (HSulf-1) on hepariini hajottavaa endosulfatase että desulfates solun pinnan heparaanisulfaattiproteoglykaanit (HSPGs) in soluväliaineen ja negatiivisesti moduloi hepariinia sitovat kasvutekijän ja sytokiinien signalointia solujen lisääntymisen. Mutta HSulf-1-toiminto on monimutkaisempi, ja sen molekyylitason mekanismia ei ole tunnettu.

Keskeiset havainnot

tutkimiseksi edelleen toimintojen HSulf-1-geenin säätelyssä endoteelikasvutekijä reseptorin (VEGFR) signalointi, sarja ilmentävät HSulf-1, HSulf-1 pieni hiusneula-RNA (shRNA) ja VEGFR-2 shRNA luotiin. HSulf-1 re-ilmentyminen voisi downregualte VEGFR-2 fosforylaation ja syöpäsolun lisääntymistä sekä munasarja- ja maksan syöpäsolun linjat. Knockdovvn HSulf-1 ilmentymisen HSulf-1 shRNA parannettu elpyminen korkeita fosforyloidun VEGFR-2, ja knockdovvn VEGFR-2: n ilmentymisen VEGFR-2 shRNA inhiboivat aktiivisuutta syöpäsolujen

in vitro

jossain määrin. Ihmisen syövässä nude-hiirissä, kasvaimen kasvu estyi merkittävästi injektioiden jälkeen adenovirusta, joka ekspressoi HSulf-1, jossa kasvaimen inhibitiota hinnat 46,19% ja 49,56% munasarjojen ja maksan kasvainten mallit, vastaavasti. HSulf-1 ilmentymisen vähensi merkittävästi kasvainten mikroverisuonitiheys.

Johtopäätökset

Tulokset osoittivat, että HSulf-1 re-ilmentymisen sekä munasarja- ja maksan syöpäsoluja indusoi tuumorin vastaista tehokkuutta vaimentamalla fosforylaatio VEGFR- 2 ja tukahduttaa angiogeneesiä. Siksi HSulf-1-välitteisen kasvunestotesteissä ja angiogeneesiä torjuvina voisi olla järkevä lähestymistapa syövän hoidossa.

Citation: Ji W, Yang J, Wang D, Cao L, Tan W Qian H, et al. (2011) HSulf-1 Gene Näytteillä Syövän Tehoa kautta Negatiivisesti Regulating VEGFR-2: n signaloinnin ihmisen syövissä. PLoS ONE 6 (8): e23274. doi: 10,1371 /journal.pone.0023274

Toimittaja: S. K. Batra, University of Nebraska Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 13 huhtikuu 2011; Hyväksytty: 11 heinäkuu 2011; Julkaistu: 10 elokuu 2011

Copyright: © 2011 Ji et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ rahoittivat National Natural Tiedesäätiö of China (81071866, 30872998). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

heparaanisulfaattiproteoglykaanit (HSPGs) on soluväliaineen ovat tärkeitä ainesosia säätelemiseksi hepariinia sitovat kasvutekijä signalointia, kuten fibroblastikasvutekijä (FGF), epidermaalinen kasvutekijä (EGF) ja hepatosyyttikasvutekijä (HGF) [1], [2]. Sulfaatio

N

-acetylglucosamine jäämiä HSPGs on kriittinen välistä vuorovaikutusta näiden tekijä ligandien ja niiden reseptorityrosiinikinaasit on solun pinnalla [3]. Ihmisen sulfataasi 1 (HSulf-1) on tunnettu siitä, olla hepariini hajottavaa endosulfatase, jonka tehtävänä on sulfaattiryhmiä solun pinnan HSPGs ja moduloivat negatiivisesti kasvutekijän ja sytokiinin signaloinnin [4]. HSulf-1-proteiini ilmentyy laajalti normaalissa kudoksessa, mutta inaktivoituu suurin erilaisten ihmisen syöpien, esimerkiksi munasarja-, rinta-, haima-, munuais-, maksa-, pään ja kaulan levyepiteelikarsinoomat [5] – [7]. Menetys Heterotsygotian, metylaatio DNA CpG-saarekkeiden ja histonimodifikaation mahdollisesti ovat tärkeimmät syyt HSulf-1 inaktivaation ihmisen syövissä [8], [9]. Variantti maksan ydin tekijä 1 (vHNF1), jota koodaa transkriptiotekijä 2-geenin (TCF2, HNF1beta), on myös raportoitu säädellä negatiivisesti HSulf-1 ilmentymisen munasarjasyöpä [10]. Re-ilmentyminen HSulf-1 syöpäsoluissa tehokkaasti johtaa laskua solujen lisääntymisen sekä kasvua herkkyys kemoterapian aiheuttaman apoptoosin [11]. Siksi raportoitu tiedot osoittivat, että HSulf-1 toimii normaalisti negatiivisena säätelijänä solujen lisääntymisen, se voi olla tärkeä rooli syövän hoidossa.

tutkimiseksi säätelevän roolin HSulf-1 in hepariinia sitovat kasvu tekijä signalointia ihmisen syövissä, aiemmissa tutkimuksissa havaittiin, että HSulf-1 ekspressio voidaan heikentää cascade fosforylaatiota sarjan kinaasien, mukaan lukien kasvutekijän reseptorin (EGFR), solunulkoisen signaalin säädelty kinaasi (ERK), mitogeeni-aktivoitu proteiinikinaasi kinaasin ( MEK), seriini /treoniini-kinaasi (AKT) käsittelyn jälkeen eksogeenisesti lisätty kasvutekijöitä, ja sen jälkeen inaktivaation alavirran signalointireittien [6], [11], [12]. HSulf-1 on mukana myös inhibitio autokriininen-välitteisen fosforylaation EGFR-ERK rintasyöpäsoluissa aiheuttama seerumistarvaatio, ja inhibitio autokriininen EGFR-ERK signaloinnin HSulf-1: vähentyneeseen ekspressioon sykliini D1, joka on vähentynyt S-vaiheessa osa ja lisääntynyt G2-M-fraktiota, ja lopulta johtaa estoon solun eloonjäämisen rintasyöpäsoluissa [7]. Näin ollen menetys HSulf-1 syövät ja syövän solulinjat liittyy säätelyä kasvutekijän signaloinnin parannettu kinaasin fosforylaation, ja fosforylaation ja aktivaation reseptorityrosiinikinaasien ovat sekaantuneet edistää syövän synnyssä ja syövän kehittyminen.

Lisäksi, verisuonten endoteelin kasvutekijän (VEGF) ja VEGF-reseptori (VEGFR) ovat mukana HSulf-1-välitteisen syöpäsoluja tukahduttavan [6]. Siksi oletetaan, että HSulf-1 voi aiheuttaa syöpää ehkäisevistä tehoa estämällä angiogeneesiä useimmissa ihmisen syövissä. VEGFR perhe sisältää kolme jäsentä, VEGFR-1 (Flt-1), VEGFR-2 (KDR /Flk-1) ja VEGFR-3 (Flt-4), jotka ovat transmembraani- tyrosiinikinaasireseptorit, jotka säätelevät muodostumista verta ja imusuonten aluksia. Näistä kolmesta reseptoreihin, VEGFR-2 on yleisesti tunnustettu olevan pääasiallinen välittävän VEGF: n indusoiman vasteen, joka suoraan säätelee kasvaimen angiogeneesiä [13]. Tässä tutkimuksessa rakentamalla eri vektorit kantavat HSulf-1-geeni, HSulf-1 pieni hiusneula-RNA (shRNA) tai VEGFR-2 shRNA, me esittänyt todisteita osoittamaan, että HSulf-1 re-ilmentymisen osoitti negatiivinen vaikutus solujen kasvuun by vähen- tämisessä VEGFR-2 signalointi sekä munasarjasyöpään ja maksasyövän solulinjoja. Antituumorivaikutuksen tehoa HSulf-1 myös validoitu munasarja- ja maksasyöpä nude-hiirissä.

Tulokset

inaktivoituminen HSulf-1 on yhteinen molekyyli tapahtuma useimmissa ihmisen syövissä ja käsittää in VEGFR-2 signalointi

HSulf-1-proteiini ilmentyy laajalti normaalin kudoksen ja toimintoja moduloivat negatiivisesti kasvutekijä signalointia. Osoittamaan inaktivaatiomenetelmät useimmissa eri ihmisen syövissä, tutkimme HSulf-1 ilmentymisen monenlaisissa ihmisen syövän yksilöitä immunohistokemiallisesti. Epiteelisoluissa normaalien kudosten, HSulf-1 oli positiivinen positiivinen nopeudella 100,0%. Mutta niiden vastaavat syövät, HSulf-1expression tukahdutettiin ilmeisesti. Positiivinen hinnat HSulf-1 oli 23,1% (6/26), 16,7% (2/12), 31,8% (7/22), 11,1% (1/9), 44,4% (8/18) hepatosellulaaristen, rinta-, maha-, munuais- ja paksusuolen syövät, tässä järjestyksessä (Kuva. 1A).

(A) näytteet, mukaan lukien erilaisia ​​syöpiä ja niiden viereisten normaaleissa kudoksissa, fiksoitiin 10% neutraalissa formaldehydiä 6 tuntia, paraffiini- upotettu, ja viipaloitu 5 pm paksu osasta HSulf-1 immunohistokemia. Hepatosellulaarisia karsinooma (HCC) solut olivat negatiivisia HSulf-1 ilmentymisen, joka ympäröi HSulf-1-positiivisten maksasoluja. Rintasyöpä, mahasyöpä ja munuaisten selvää karsinooman solut olivat kaikki negatiivisia, ja paksusuolen syövän solut olivat positiivisia HSulf-1 ilmentymisen; alkuperäinen suurennos x 200 (ylempi paneeli). HSulf-1-positiivisten solujen prosenttiosuuksia kaikissa näytteet laskettiin 5 suuritehoisia kentät (alkuperäinen suurennos x 400) mikroskoopilla, ja osoitti histogrammit (alempi paneeli); * P 0,05; ** P 0,01. (B) Expression of VEGFR-2, kuten t-VEGFR2 ja p-VEGFR2 26 tapauksessa HCC havaittiin immunohistokemiallisesti; alkuperäinen suurennos x 400 (vasen paneeli). Positiivinen solujen prosenttiosuuksien 6 HSulf-1-positiivisia ja 20 HSulf-1-negatiivinen HCC laskettiin 5 suuritehoisia kentät (alkuperäinen suurennos x 400) mikroskoopilla, ja osoitti histogrammit (oikea paneeli); * P 0,05.

ilmeistä vaikutusta HSulf-1 on vähentää kaskadin fosforylaatiota sarjan reseptorityrosiinikinaasien, joka on osoitettu VEGF: n ja VEGFR merkinanto [6]. Siksi tutkitaan ilmentymistä koko VEGFR-2 (t-VEGFR2) ja fosforyloitu VEGFR-2 Tyr1175 (p-VEGFR2

Tyr1175) kasvaimen yksilöt (Fig. 1 B). Niistä 26 tapausta Maksasolusyövän, on ilmeinen väheneminen p-VEGFR2

Tyr1175 tasolla HSulf-1-positiivisten maksasyövän kuin että HSulf-1-negatiivinen maksasyövän (P 0,05), mutta ei eroa t-VEGFR2 ilmaisun välillä (P 0,05).

Adenovirusvälitteinen HSulf-1 re-ilmentymisen downregulates fosforylaation VEGFR-2 syöpäsoluissa

Voit testata infektio tehokkuutta adenovirus, BEL-7404 syövän solut infektoitiin ohjaus- adenovirus Ad5-EGFP kuljettaa reportterigeenin tehostetun vihreän fluoresoivan proteiinin (EGFP), ja havaittiin neljäkymmentäkahdeksan tuntia infektion jälkeen fluoresenssimikroskoopilla. Prosenttiosuudet EGFP-positiiviset solut olivat 42,67 ± 12,25% ja 86,33 ± 26,48%: iin infektiomultiplisiteettiarvoilla (MOI) 5 ja 10 pfu /solu, vastaavasti (Fig. 2A).

(A) Bel- 7404-solut infektoitiin ohjaus- adenovirus Ad5-EGFP on mÕIS 5 ja 10 pfu /solu, ja prosenttiosuudet EGFP-positiivisia soluja havaittiin fluoresenssimikroskoopilla, alkuperäinen suurennos x 400. (B) RT-PCR: ää käytettiin tunnistamaan HSulf-1 ilmentymisen välittämä adenovirus Ad5-hSulf1. 1, solut infektoitiin Ad5-hSulf1 MOI 10 pfu /solu; 2, solut infektoitiin Ad5-hSulf1 MOI 10 pfu /solu ja transfektoitiin HSulf-1 shRNA vektori konsentraatiossa 20 ug /10

5-solut; 3, Vanhempien soluja. (C) Expression of HSulf-1, t-VEGFR2 ja p-VEGFR2

Tyr1175 tunnistettiin Western blot. Glyseraldehydi fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) käytettiin latauskontrollina. Densitometrinen analyysi suoritettiin osoittamaan ilmentymisen tasot p-VEGFR2

Tyr1175 syöpäsoluissa, normalisoitu kanssa GAPDH tiheys. Pylväät ovat keskiarvo kolmesta erillisestä analyysit; baaria = SD; ** P 0,01.

vanhempien syöpäsolulinjoilla, SKOV3 ja BEL-7404, olivat negatiivisia HSulf-1 ilme. 48 tunnin kuluttua infektion jälkeen Ad5-hSulf1 MOI 10 pfu /solu, syöpäsolut olivat positiivisia HSulf-1, ja HSulf-1 shRNA voisi downregulate HSulf-1 ilmentymisen tason (Fig. 2B). Koska HSulf-1-geeni voidaan vähentää fosforylaation kinaasien mukana monissa kasvutekijän signalointireittien, tutkimme ekspressiotasot t-VEGFR2 ja p-VEGFR2

Tyr1175. Verrattuna vanhempien syöpäsoluja, taso t-VEGFR2 pysyi mitään muutosta Ad5-hSulf1 infektoiduissa soluissa. Kuitenkin taso p-VEGFR2

Tyr1175 oli selvä väheneminen infektion jälkeen Ad5-hSulf1. Kun HSulf-1 shRNA transfektoitiin Ad5-hSulf1 tartunnan syöpäsoluja, HSulf-1-ekspressio uudelleen inhiboi, ja sisältö p-VEGFR2

Tyr1175 talteen lähes normaalia tasoa (Fig. 2C).

Adenovirusvälitteinen HSulf-1 uudelleenaktivointi estää syöpäsolujen proliferaatiota

Koska menetys HSulf-1 on yhteinen molekyyli tapahtuma useimmissa ihmisen syövissä, me uudelleen HSulf-1 ekspression infektion adenoviruksen kuljettavat HSulf-1-geenin eri syöpäsolulinjoissa ja tutkittiin solujen lisääntymistä. Kontrolliin verrattuna adenovirus Ad5-EGFP, Ad5-hSulf1 aiheutti selvää inhibition vaikutusta syöpäsolujen proliferaatioon MOI-riippuvaisella tavalla. Kun MOI oli yli 20 pfu /solu, solun elinkykyisyys laski alle 50%: Ad5-hSulf1 tartunnan syöpäsoluja, kun taas solujen elinkelpoisuus oli enemmän kuin 80% Ad5-EGFP tartunnan syöpäsolujen (Fig. 3A).

(A) SKOV3 ja BEL-7404 syövän solut infektoitiin Ad5-hSulf1 eri mÕIS. Ad5-EGFP: tä käytettiin kontrollina adenovirus. (B) SKOV3 ja BEL-7404 syövän solut transfektoitiin VEGFR-2 shRNA vektori, pitoisuus 20 ug /kuoppa. Neljäkymmentä kahdeksan tuntia transfektion jälkeen, VEGFR-2: n ilmentymisen havaittiin Western-blottauksella ja solujen elinkelpoisuus havaittiin MTT-määrityksellä. Negatiivinen kontrolli shRNA (Ctrl-shRNA) käytettiin negatiivisena kontrollina; * P 0,05; ** P 0,01. (C) BEL-7404 syövän solut infektoitiin Ad5-hSulf1 MOI 10 pfu /ml, ja sitten transfektoitiin VEGFR-2 shRNA vektori, pitoisuus 20 ug /10

5-soluja, sitten VEGFR-2: n ilmentymisen ja solujen elinkelpoisuus havaittiin. BEL-7404 vanhempien soluja käytettiin edustamaan enimmäismäärä solujen kasvun tuottamiseksi prosenttia elinkelpoisuuden; * P 0,05; ** P 0,01.

Syöpäsolut viljeltiin 96-kuoppalevyillä transfektoitiin vektoreilla, jotka sisältävät VEGFR-2 shRNA ja negatiivinen kontrolli shRNA pitoisuus 20 ug /kuoppa. Ekspression VEGFR-2 tutkittiin Western-blottauksella, ja solujen elinkyky mitattiin 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidia (MTT). Verrattuna negatiivinen kontrolli shRNA, VEGFR-2 shRNA esti VEGFR-2: n ilmentymisen ja laski solujen elinkelpoisuuden jonkin verran (Fig. 3B). Sen osoittamiseksi, jos VEGFR-2 pudotus olosuhteissa HSulf-1 yli-ilmentymisen on sama vaikutus solujen elinkelpoisuuteen, BEL-7404 syöpäsoluihin, jotka infektoitiin Ad5-hSulf1 MOI 10 pfu /solu, transfektoitiin VEGFR-2 shRNA vektori pitoisuutena 20 ug /10

5 solujen pudotus ilmentymisen VEGFR-2 (Fig. S1), tulokset osoittivat, että BEL-7404 solujen elinkelpoisuus transfektion jälkeen VEGFR-2 shRNA edelleen vähentynyt yhteydessä HSulf-1 vaikutuksen (Fig. 3C).

Adenovirusvälitteinen HSulf-1 geeniterapian osoittaa voimakas tuumorin vastaista tehokkuutta mukaan angiogeneesiä torjuvina ihmisen syövässä nude-hiirissä

uudelleenaktivointi hSulf- 1 toiminto syöpäsoluissa voi inaktivoida loppupään kasvutekijä signalointireittien, siis HSulf-1 on uusi kohde syövän geeniterapiassa. Täten, rakensimme adenovirusvektori ekspressoi villityypin HSulf-1-geenin, Ad5-hSulf1. Sen antituumorivaikutuksen teho validoitu sekä munasarja- ja maksasolusyövän nude-hiirissä (Fig. 4A). Sen jälkeen kasvaimensisäistä injektioita viruksia yhteensä annoksella 10

9 pfu per hiiri, tukahduttaminen kasvaimen kasvua Ad5-hSulf1 hoidettu ryhmä oli tehokkaampi, jossa kasvaimen esto hinnat 46.19% ja 49.56% vuonna SKOV3 ja Bel- 7404 mallit, vastaavasti verrattuna tyhjä kontrolliryhmään (P 0,01). Ei ollut eroa negatiivisen virus kontrolliryhmässä ja tyhjän kontrolliryhmän (P 0,05).

(A) SKOV3 ja BEL-7404 malleja, 5 hiirtä ryhmässä, vaimennusvaikutus Ad5-hSulf1 kasvaimen kasvu analysoitiin verrattuna kontrolliryhmään tai negatiivinen adenovirus Ad5-EGFP ryhmä; Mustia X-akselilla esitetään aika olevia adenoviruksen injektiot; ** P 0,01. (B) patologinen tutkimus SKOV3 ksenograftikasvaimissa. Vertailu kasvaimen paino SKOV3 malleissa (vasen paneeli); Bar = 1 cm; ** P 0,01 verrattuna kontrolliryhmään tai Ad5-EGFP ryhmiä. Hematoksyliinillä ja eosiinilla värjäys (HE) ja immunohistokemiallinen tutkimukset, positiivinen solu prosenttiosuus HSulf-1 mikroverisuonitiheys (MVD) count leimattiin CD31-vasta-aineen määrä määritettiin 5 suuritehoisia kentät (alkuperäinen suurennos x 400) mikroskoopilla. Injektioiden jälkeen Ad5-hSulf1, kasvainsolut olivat positiivisia HSulf-1 ilmentymisen sytoplasmassa. Niinpä lasken MVD laski selvästi, verrattiin kontrolliryhmän. (C, D) yhteenlaskettu VEGFR-2 ja fosforyloitua VEGFR-2 (C), ja koko AKT ja fosforyloidun AKT (D) tunnistettiin Western blottauksella (vasen paneeli) ja immunohistokemia (oikea paneeli) Ad5-hSulf1 käsitelty SKOV3 ksenografti kasvaimet, kontrolliin verrattuna ja Ad5-EGFP ryhmiä.

lopussa seurantajakso, hiirillä, joilla on SKOV3 ksenograftit tapettiin ja tuumorit poistettiin ja punnittiin. Kasvaimen painot Ad5-hSulf1 ryhmä oli alempi kuin muissa ryhmissä (Fig. 4B, vasen paneeli). Parafiini-sulautettujen kasvaimen leikkeet tutkittiin immunohistokemiallisesti. Vuonna tyhjä kontrolliryhmässä, syöpäsolut olivat negatiivisia HSulf-1 ilme. Mutta Ad5-hSulf1 ryhmä, syöpäsolut uudelleen ilmaistaan ​​HSulf-1-proteiinia. Kvantitatiivinen analyysi mikroverisuonitiheys (MVD) suoritettiin CD31 immunohistokemiallisesti. MVDS kasvaimen kudokset 24,67 ± 6,51 ja 52,33 ± 12,34 Ad5-hSulf1 ja kontrolliryhmää, vastaavasti (Fig. 4B, oikea paneeli). Oli merkittävä ero niiden välillä (P 0,05).

Kuten HSulf-1-geeni saa aikaan laajan säätelijänä useita eri reittejä pitkin estämällä fosforylaation solunsisäisten tyrosiinikinaasien, joka voi olla kriittinen kasvainsolujen proliferaatiota ja tuumoriangiogeneesissa, siksi tarkasteltiin ilmentymisen loppupään proteiineja, mukaan lukien VEGFR-2 ja seriini /treoniini-kinaasi (AKT) ksenograftikasvaimissa. Tulokset osoittivat, että ilmentyminen p-VEGFR2

Tyr1175 ja fosforyloidun AKT päälle Thr308 (p-AKT

Thr308) säädeltiin vähentävästi Ad5-hSulf1 ryhmä tutki Western blotting ja immunohistokemia (Fig. 4C, D).

keskustelu

sulfaatioon solun pinnan HSPGs ajatellaan olevan tärkeä rooli säätelyssä hepariinia sitovat kasvutekijän signalointia soluväliaineen [14], [15]. HSulf-1-proteiini on arylsulphatase toimintaa entsyymi, joka voi säädellä negatiivisesti sulfatointi tila HSPGs [16]. Vahvaa näyttöä osoittivat, että HSulf-1 normaalisti toimii sulfaattiryhmiä solun pinnan HSPGs ja downregulate reseptori tyrosiinikinaasin signalointi tehokkaasti kumota solujen kasvua ja selviytymistä [4], [17]. Tämä prosessi lähettää erillisen osan inhibitioon pahanlaatuisen muutoksen ja syöpäsolujen kasvua [18], [19]. Näin ollen, HSulf-1 pidetään kasvainsuppressorigeenin. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että HSulf-1 inaktivoidaan useimmissa ihmisen syövissä joko geneettisiä mekanismeja, kuten poisto ja mutaation, tai epigeneettiset mekanismit, kuten DNA: n metylaation ja histonien deasetylaatiolla [12], [20], [21]. Olemme myös osoittaneet immunohistokemiallisesti että HSulf-1 ekspressio vaimentua 87 tapauksessa kliinisistä näytteistä myös maksasoluihin, rinta-, maha-, munuais- ja paksusuolen syöpiin, verrattuna niiden viereisten normaaleissa kudoksissa. Johtuen syistä, jotka HSulf-1 on monimutkainen toimintoja, ja sen molekyylitason mekanismia ei ole tunnettu vielä, näissä tutkimuksissa testasimme jos HSulf-1-estoa VEGFR signalointi liittyy kasvunestotesteissä ja angiogeneesiä torjuvina syövissä.

sekä ensisijainen vaurioista ja etäpesäkkeitä on kehitettävä uusi verisuoni tarjontaa tukemiseksi syöpäsolun laajentamista ja levittämistä. Useimmat syöpäsolut voivat ilmaista sekä VEGF-ligandiin ja VEGFR jotka toimivat autokriini silmukan suoraan stimuloida kasvaimen angiogeneesissä [22]. Angiogeneesi on nopeutta rajoittava vaihe syövän kasvua, etenemisen ja etäpesäkkeiden. VEGF on kriittinen välittäjänä angiogeneesin, joka on hyvin tasapainoisesti ilmaistu useimmissa kudoksissa ja solutyypeissä, mutta erittäin säädelty kasvaimissa [23]. VEGF: n sitoutuminen sen reseptoriin johtaa reseptoriin autofosforylaatio ja myöhemmin aktivoinnin sarjan tyrosiinikinaasien, aktivoi useita loppupään proteiineja, jotka pelata toiminnallisia rooleja solujen eloonjäämistä, solujen lisääntymistä, verisuonten läpäisevyyttä ja stabilointi uusien verisuonten [24] – [ ,,,0],26]. Siksi fosfory- aktivaatiota VEGFR on tärkeä prosessi säätelyssä syövän kasvua. Koska HSulf-1 katalysoi desulfatoinnilla on HSPGs, joten se vaikuttaa sitova kyky hepariinia sitovat tekijät niiden reseptoreihin EGFR, ERK1 /2, MEK, PI3K /AKT signalointireittien, ja painaa fosforylaation ja aktivaation reseptorityrosiinikinaasien . Nämä signalointipolkujen olivat mukana angiogeenisen prosessin [27] – [29]. Erittäin sulfatoitu HSPGs voimistaa vuorovaikutusta VEGF ja VEGFR-2, sitten fosforyloivat ja aktivoida VEGFR-2. Tässä prosessissa, VEGF: n ilmentymistä ja VEGFR-2 ei ehkä vaikuta sulfaation tai desulfatoinnilla on HSPGs [30]. Havaittiin, että parannus VEGFR-2 fosforylaatio Tyr1175 tiedettiin olevan olennaista VEGF-riippuvaisen MAPK signaloinnin ja angiogeneesiä [31]. Voit tarkistaa negatiivinen vaikutus HSulf-1 syöpää angiogeneesiin, me tuotetaan adenovirus ilmentävät HSulf-1. Adenovirusvälitteinen HSulf-1 ilmentymisen paitsi downregualted tasot fosforyloitua VEGFR-2, mutta myös inhiboivat syöpäsolujen sekä munasarja- ja maksan syöpäsolun linjat. Knockdovvn HSulf-1 ilmentymisen HSulf-1 shRNA vektorin parannettu elpyminen korkeita fosforyloidun VEGFR-2, joka osoittaa, että HSulf-1 säätelee fosforylaatio ja aktivaatio VEGFR-2. Kuitenkin esto syöpäsolujen lisääntymistä

in vitro

by HSulf-1 re-ilmentyminen saattaa olla lähinnä desulfatoinnilla on HSPGs ja inactivition monien kasvutekijän signalointireittejä. Kuitenkin, kun käytimme VEGFR-2 shRNA vaientaa ilmentymisen VEGFR-2 munasarjojen ja maksan syöpäsoluja, solujen elinkykyisyys laski jonkin verran, mikä osoittaa, että VEGFR-2 signalointi osallistuu säätelyyn syöpäsolujen lisääntymistä, ja antiproliferatiivista vaikutusta vaikutus HSulf-1 syöpäsolujen johtuu osittain inhibition VEGFR-2-signalointia. Kun BEL-7404 syövän solut infektoitiin Ad5-hSulf1 uudelleen ilmaista HSulf-1 ja sen jälkeen transfektoitiin VEGFR-2 shRNA hiljentää VEGFR-2: n ilmentymisen, solujen elinkelpoisuus väheni edelleen, juuri osoittaa, että on olemassa toinen mekanismi, joka osallistuu VEGFR-2 aktivointi ja syöpäsolujen proliferaation yhteydessä HSulf-1 vaikutus.

vaikutuksen arvioimiseksi HSulf-1 kasvaimen kasvua, käsittelimme ihmisen syövän nude-hiirissä, joilla adenovirusta, joka ekspressoi HSulf-1. Tulokset havaittiin, että kasvaimen kasvu estyi hoidon jälkeen. Kasvain inhibiitionopeudet olivat 46,19% ja 49,56% munasarjojen ja hepatosellulaaristen kasvainmuodosta, vastaavasti. Re-ilmentyminen HSulf-1 johti downregulation fosforyloidun VEGFR-2 ja fosforyloidun AKT, sitten merkittävästi vähentää kasvaimen mikroverisuonitiheys, mikä osoittaa, että HSulf-1-ekspressio liittyy angiogeneesiä torjuvina.

Ratkaisevasti, HSulf-1 on sulfataasi että toiminnot sulfaattiryhmiä solun pinnan HSPGs. Se voi estää alavirran kinaasin fosforylaatiota, jolla on laaja ja säädellä negatiivisesti reseptorityrosiinikinaasin signalointia. Tämä tutkimus antoi vakuuttavaa näyttöä siitä, että HSulf-1 re-ilmentymisen sekä munasarja- ja maksan syöpäsoluja vaimentaa fosforylaatiota VEGFR-2, sitten tukahduttaa syöpäsolujen lisääntymistä ja angiogeneesin, lopulta aiheuttaa tuumorin vastaista tehokkuutta. Siksi meidän tiedot osoittivat, että HSulf-1-välitteisen kasvunestotesteissä ja angiogeneesiä torjuvina voisi olla järkevä lähestymistapa syövän hoidossa.

Materiaalit ja menetelmät

Tutkimukset of HSulf-1 ja VEGFR-2: n ilmentymisen kliinisissä syöpä yksilöt

Expression of HSulf-1 havaittiin immunohistokemia 87 tapauksissa kliinisen syövän yksilöihin, mukaan lukien 26 maksasolukarsinoomat, 12 rintasyöpiä, 22 syöpien, 9 munuaisten syövät, 18 paksusuolen syövät, ja niiden vieressä normaali kudoksiin. VEGFR-2, mukaan lukien t-VEGFR2 ja p-VEGFR2

Tyr1175, havaittiin myös 26 maksasolukarsinoomat immunohistokemiallisesti. Näytteet kiinnitettiin 10% neutraaliin formaldehydiä 6 tuntia, parafinoidut, ja viipaloitu 5 pm paksu osiot immuunihistokemiallisesti kanin anti-HSulf-1 vasta-aineella (Abcam sis., Cambridge, MA), kaniinin anti- VEGFR-2-vasta-aine ja kanin anti-Phospho-VEGFR2

Tyr1175 vasta-ainetta (Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA). Hyväksynnän käyttää kliinisten näytteiden antoivat Research eettinen komitea, toinen Military Medical University, ja olemme saaneet kirjallisen suostumus kaikilta osanottajat mukana tutkimuksessa.

valmistaminen vektorit ja adenovirukset

plasmidi pcDNA3.1-hSulf1 sisälsi täysipituisen HSulf-1 cDNA: n ja vektorin pSUPER.retro.puro sisälsi HSulf-1 shRNA (19 oligonukleotidiparin kohdistaminen HSulf-1-cDNA asemissa 294-312: GTATGTGCACAATCACAAT) ystävällisesti lahjakas alkaen Viji Shridhar (Department of Experimental Pathology, Mayo Clinic Cancer Center, Rochester, MN). Vektori pGenesil-1,1, joka sisältää VEGFR-2 shRNA (19 oligonukleotidiparin kohdistaminen VEGFR-2: n cDNA asemissa 525-543: CAGAATTTCCTGGGACAGC) tai negatiivinen kontrolli shRNA (19 oligonukleotidiparin: gacttcataaggcgcatgc) hankittiin Wuhan Genesil Biotechnology Co., Ltd. (Wuhan, Kiina).

rekombinoitua adenovirusvektori, pcDNA3.1-hSulf1 käytettiin monistamaan HSulf-1-cDNA: lla alukkeilla P1 (5′-cgggatccaccatgaagtattcttgc-3 ’) ja P2 (5’- gcgtcgacttaaccttcccatccatcccataac-3 ’). PCR-tuote digestoitiin BamHI: llä ja Sall: llä, insertoitiin sitten adenoviruksen plasmidiin pDC315 (Microbix Biosystems, Ontario, Kanada) tuottaa pDC315-hSulf1. Plasmidit pDC315-hSulf1 ja pDC315-EGFP transfektoitiin vastaavasti, HEK293-soluihin (Microbix Biosystems, Ontario, Kanada) käyttäen PolyFect Transfection Reagent (QIAGEN Inc., Valencia, CA) yhdessä adenoviruksen pakkaus plasmidi pBHGloxdelE13cre (Microbix Biosystems, Ontario, Canada). Jälkeen homologisen rekombinaation HEK293-soluissa, saimme adenovirukset nimettiin Ad5-hSulf1 ja Ad5-EGFP. Ad5-EGFP käytettiin viruksen valvonta. Kaikki adenoviruksia monistettiin HEK293-soluissa ja puhdistettiin erittäin sentrifugoimalla cesiumkloridia (CsCl) kaltevuudet. Viruksen tiitterit havaittiin kanssa Tissue Culture Infectious Dose 50 (TCID50) menetelmää [32] perustetun Qbigene Inc. (IIIkich, Ranska), ja osoitti sillä rutto muodostavaa yksikköä millilitrassa (pfu /ml).

Soluviljely ja transfektantit

munasarjasyövän solulinja SKOV3 (American Type Culture Collection, Manassas, VA), hepatosellulaaristen karsinoomasolulinja BEL-7404 (Institute of Cell Biology, Kiinan tiedeakatemia, Shanghai, Kiina ) viljeltiin median mukaan tarjoajien suosituksiin. Kun solut olivat logaritmisessa vaiheessa, ne infektoitiin adenovirukset (Ad5-hSulf1 tai Ad5-EGFP) on Mõis 0,5, 1, 5, 10, 20, 50, 100 pfu /solu, ja kerättiin 48 h infektion jälkeen. Virus-infektoitujen solujen ja niiden vanhempien solut transfektoitiin HSulf-1 shRNA ja VEGFR-2 shRNA vektoreita käyttäen PolyFect Transfection Reagent (QIAGEN Inc., Valencia, CA) mukaan palveluntarjoajan protokollaa. Kaksikymmentäneljä tuntia myöhemmin, puromysiiniä (3 pg /ml) tai G418: aa (400 ug /ml) lisättiin valita HSulf-1 shRNA transfektanttien tai VEGFR-2 shRNA transfektantit, vastaavasti. Sen jälkeen yhtäjaksoisesti viljeltiin 24 tuntia, solut kerättiin ja hiljaisuus kohdegeenin ilmentymistä testattiin.

In vitro

tarkastelu kiinnekohta tekijän ilmentymisen

Syöpäsolut, mukaan lukien vanhempien, virus-tartunnan ja shRNA transfektoituja soluja, kerättiin 48 tuntia infektion jälkeen tai transfektion. Kokonais-RNA uutettiin 10

5-solujen TRIZOL-reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA), ja niitä käytettiin monistamaan HSulf-1 ilmentymisen RT-PCR (RT-PCR), jossa alukkeet P3 (5′-ccaccttcatcaatgcctt -3 ’) ja P4 (5’ccttgaccagtccaaactgc-3′). Monistetut fragmentit olivat 762 bp. Glyseraldehydi fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH), monistettiin alukkeilla P5 (5’-accacagtccatgccatcac-3 ’) ja P6 (5′-tccaccaccctgttgcttgta-3’), kuten sisempi ohjaus. Yhteensä proteiini uutettiin 10

5-solujen M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent (Pierce, Rockford, IL) ja tutkittiin western-blottauksella, kuten on aiemmin kuvattu [33], jossa on esitetty ensisijaisen vasta-aineet, mukaan lukien kanin anti-VEGFR -2 ja kanin anti-Phospho-VEGFR-2

Tyr1175 (Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA).

Solun elinkelpoisuus MTT: llä

vanhempien, virus- tartunnan saaneiden ja shRNA transfektoidut solut laimennettiin pitoisuuteen 10

5 solua /ml, ja maljataan tiheydellä 100 ul /kuoppa 96-kuoppaisille levyille. Solujen elinkelpoisuus mitattiin MTT-määrityksellä käyttäen Cell Proliferation Kit I (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN), kuten edellä on kuvattu [34]. Keskimääräinen absorbanssi jokaisesta näytteestä tutkittiin mikrolevylukijalla (Model 550, BIO-RAD Laboratories, Tokio, Japani), aallonpituudella 570 nm, jossa viitataan aallonpituudella 655 nm.

eläinmallit ja

in vivo

kokeita

SKOV3 ja BEL-7404-soluja ihon alle ruiskutetaan oikean kylkiin BALB /c (nu /nu) hiirissä (Shanghai Experimental Animal Center, Kiina Academy of Sciences, Shanghai, Kiina) 10

7 solua hiirtä kohti, perustaa ksenograftit. Kolme viikkoa myöhemmin hiiret erotettiin satunnaisesti 3 ryhmään: Ad5-hSulf1, Ad5-EGFP ja kontrolliryhmää, 5 hiirtä ryhmää kohden. Hiiret Ad5-hSulf1 ja Ad5-EGFP ryhmät saivat 5 kasvaimensisäisiä injektiota, yksi injektio joka toinen päivä, yhteensä annoksella 10

9 pfu viruksia hiirtä kohti. Hiiret kontrolliryhmässä annettiin sama tilavuus viruksen säilyvyyden liuosta (10 mmol /L Tris-HCI, pH 8,0, 2 mmol /L MgCl

2, 4% sakkaroosi). Kasvaimen koko mitattiin säännöllisesti, ja kasvaimen tilavuus arvioitiin kaavalla ”

×

b

2 x 0,5″, jossa

ja

b

edustavat maksimaalinen ja minimaalinen halkaisijat. Hiiret lopetettiin lopussa seurantajakso, ja tuumorit poistettiin, punnittiin ja kiinnitettiin 10% neutraaliin formaldehydiä 6 tuntia. Parafiini-sulautettujen peräkkäisen leikattiin tutkia ilmentymistä HSulf-1, t-VEGFR2 p-VEGFR2

Tyr1175 ja t-AKT, p-AKT

Thr308 immunohistokemialla ja Western blot. Kaniinin anti-fosfo- AKT

Thr308 ostettiin Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). MVD-arvo kasvainkudoksissa suoritettiin CD31 immunohistokemiallisesti käyttämällä rotan anti-hiiri-CD31 monoklonaalinen vasta-aine (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA). Positiivinen solujen prosenttiosuudet ja MVD arvo kasvaimet laskettiin 5 random suuritehoisia kentät (alkuperäinen suurennos x 400) mikroskoopilla, ja näytetään keskimääräisenä ± keskihajonta (SD) [35].