Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Tässä tutkimuksessa tutkimme onko PKR proteiinin ekspressio korreloi mRNA-tasoja ja myös arvioitu molekyyli- biomarkkerit, jotka liittyvät PKR, kuten fosforyloituu PKR (p- PKR) ja fosforyloitu eIF2α (p-eIF2α).

Menetelmät ja havainnot

määritetään tasot PKR proteiinin ilmentymisen ja mRNA 36 tuoretta ensisijainen keuhkojen kasvain kudoksia käyttäen Western blot analyysiä ja todellinen -Time käänteiskopioijaentsyymin PCR (RT-PCR), vastaavasti. Käytimme kudossiruina immunohistokemiallista arviointia ilmentymisen p-PKR ja p-eIF2α proteiineja. Olemme osoittaneet, että PKR mRNA-tasot ovat korreloi merkitsevästi PKR proteiinin tasot (Spearmanin rho = 0,55,

p

0,001), mikä viittaa siihen, että PKR proteiini tasoilla Tuumorinäytteissä sääntelee PKR mRNA. Havaitsimme myös, että potilailla, joilla on korkea p-PKR tai p-eIF2α ilme oli huomattavasti pidempi elinajan mediaani kuin vähän tai ei lainkaan p-PKR tai p-eIF2α lauseke (

p

= 0,03 ja

p

= 0,032, vastaavasti). Arvioimme lisäksi ennustetekijöiden vaikutus yhdistetyn ilmentymisen p-PKR plus PKR ja p-eIF2α plus PKR ja havaitsi, että molemmat yhdistelmät olivat vahvoja itsenäisiä ennustetekijöitä merkkiaineita yleistä elossaololuku lavalla minä ja kaikki vaiheessa potilaat.

Johtopäätökset

havainnot viittaavat siihen, että PKR proteiinin ilmentyminen voi ohjata transkription tasolla. Yhdistetty ekspressiotasot PKR ja p-PKR tai p-eIF2α voi olla uusia merkkiaineita ennustamiseksi ennusteen potilaita, joilla on NSCLC.

Citation: Hän Y, Correa AM, Raso MG, Hofstetter WL, Fang B, Behrens C, et ai. (2011) The Role of PKR /eIF2α signalointireitin in prognoosi ei-pienisoluinen keuhkosyöpä. PLoS ONE 6 (11): e24855. doi: 10,1371 /journal.pone.0024855

Editor: John D. Minna, University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas, Yhdysvallat

vastaanotettu 25 maaliskuuta, 2011; Hyväksytty: 22 elokuu 2011; Julkaistu: 10 marraskuu 2011

Tämä on avoin-yhteys artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 public domain omistautumista.

Rahoitus: Tämä työ tukee osittain National Institutes of Health kautta MD Anderson Cancer Center Support Grant CA-016.672 – Lung Program, joka on erikoistunut ohjelma Research Excellence (SPORE) Grant CA-070907 (IW), ja R01 Grant CA-124591 (BF). Lisätukea tuli puolustusministeriön myöntää W81XWH-07-1-0306 (IW), National Natural Science Foundation of China (30600611, 81071912) (YH) ja ”1510 projekti” kolmannen Military Medical University of China (jotta YH), ja Homer Flower Gene Therapy Fund, Charles Rogers Gene Therapy Fund, Margaret Wiess Elkins Endaumentin Research Fund, Flora ja Stuart Mason Lung Cancer Research Fund, Phalan rintakehä Gene Therapy Fund, ja George P. Sweeney ruokatorven Research Fund (SS). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat lukenut lehden politiikan ja ovat seuraavat konflikteja. LY on työntekijä Ziren Research LLC. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

proteiinikinaasi (PKR) on interferonilla indusoitavissa seriini /treoniini-kinaasi, joka välittää proteiinisynteesiä, tiukasti säännelty prosessi, joka on kriittinen solujen lisääntymistä ja erilaistumista [1] – [3]. Lisääntynyt PKR ilmentyminen on osoitettu korreloivan paremmin ennusteiden pään ja kaulan alueen syöpä ja paksusuolen syöpä [2], [3], ja kertyvät todisteet osoittavat, että PKR voi toimia tuumorisuppressori leukemian ja muiden hematopoieettisten maligniteettien [4], [ ,,,0],5]. Sitovat joko kaksijuosteisen RNA (dsRNA) tai rakenteeltaan yksisäikeinen RNA: t voivat välittää PKR fosforylaatioon [6], [7]. Aktivoitu PKR fosforyloi sen hyvin dokumentoituja alavirrassa oleva kohde, alfa-alayksikkö proteiinisynteesin aloittamiseen tekijä eIF2 (eIF2α), mikä johtaa proteiinisynteesin inhibitio ja nostattamaan antiviraalisia ja antituumoriaktiivisuuksia [8], [9]. Sen lisäksi sen rooli translaatiota ohjaavia, PKR on ollut mukana viruslääkkeiden synnynnäisen immuniteetin, apoptoosin, solujen lisääntymistä, ja stressi signalointi [10]. Lisäksi PKR ilme ja autofosforylaation lisääntyneet useiden syöpätyyppien, kuten melanooma, paksusuolen syöpä, ja rintasyövän [11], [12]. Tulokset Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että on tärkeää fosforyloidun eIF2α (p-eIF2α) syövän hoidossa [10], [13], [14]: aktivointi PKR-eIF2a fosforylaatioreitti on välttämätöntä antiproliferatiivisia ja proapoptoottiset toiminnot tuumorisuppressorigeeniä [15].

Viime aikoina olemme havainneet, että alhainen ilmentyminen dsRNA-riippuvainen PKR oli merkitsevästi yhteydessä lyhyempi hengissä pienisoluista keuhkosyöpää, mikä viittaa siihen, että biologinen tehtävät PKR tai sen loppupään molekyylit voivat olla arvokkaita ennustavat tekijät NSCLC [1]. Tässä uudessa tutkimuksessa tavoitteenamme oli selvittää PKR proteiinin ilmentyminen liittyy sen mRNA-tasoja ja onko sen loppupään tavoitteita, kuten fosforyloituu PKR (p-PKR) ja p-eIF2a, ovat myös ennustettaessa NSCLC. Ensin määritellään PKR mRNA-tasoja ja proteiinin ilmentymistä tuore pakastettu NSCLC kudosta ja löysi positiivinen korrelaatio PKR proteiinin ilmentymistä ja mRNA-tasoja. Seuraavaksi käyttäen immunohistokemiallista värjäystä, tutkimme ilmaus p-PKR ja sen hyvin tunnettu loppupään molekyylin p-eIF2α arkistomuistiin kudoksessa microarray yksilöitä. Tuloksemme osoittavat, että p-PKR ja p-eIF2α ennustavat biomarkkerit NSCLC tuloksia ja että kun ilmentyminen PKR yhdistettiin ilmentymisen p-PKR tai p-eIF2α, vaikutus ennustaa potilaan eloonjäämistä parannettu.

tulokset

PKR proteiinin ilmentyminen korreloi mRNA

Sen tutkimiseksi, PKR proteiinin ilmentyminen liittyy mRNA, määritimme PKR ja p-PKR proteiinin ilmentymistä ja PKR mRNA tasot 36 tuoretta ensisijainen keuhkosyövän kudoksia käyttäen Western-blot-analyysi ja reaaliaikainen RT-PCR: llä, vastaavasti. Proteiinin ilmentyminen β-aktiini ja sen mRNA-tasot määritettiin myös ja käytettiin kontrolleina. Tulokset Western blotting analyysit osoittivat, että kasvain näytteet ilmaisivat eri PKR sekä proteiini- ja mRNA-tasot (kuvio 1A ja 1 B). Tilastollinen analyysi paljasti merkittävän korrelaation PKR proteiinin ilmentymisen ja sen mRNA-tasoja. (Spearmanin rho = 0,55,

p

0,001; kuvio 1C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että PKR geenin ilmentymistä voi aiheuttaa sekä taso vaihtelee PKR proteiinin ilmentymisen kasvaimissa.

. Western blot-analyysi PKR ja p-PKR proteiinin tuumorinäytteissä. Densitometristä analyysi suhde PKR tai PKR ß-aktiini on edustaa normalisoitu proteiinipitoisuuden. Kukin kaista vastaa kasvaimen näytteen yksittäisen potilaan. B. mRNA: n tasot vastaavat näytteet määritettiin käyttämällä kvantitatiivista tosiaikaista PCR: llä. Tasot β-aktiini-proteiinin ja sen mRNA: n samasta näytteestä käytettiin verrokkeina. C. sirontakuvaajaan PKR proteiinin ilmentymisen korreloi mRNA: n ilmentymisen (Spearmanin rho = 0,55,

p

0,001).

Korrelaatio p-PKR ja p-eIF2α proteiinin ilmentymisen NSCLC kasvaimet kanssa viittaavia tekijöitä

Koska biologisen toiminnan PKR liittyy läheisesti sen fosforylaatio, ja eIF2α fosforylaatio on tunnusmerkki PKR aktivointia, me seuraavaksi arvioitiin ilmaus p-PKR ja p-eIF2α proteiinien TMA yksilöt käyttävät immunohistokemiallista värjäystä. Taulukossa 1 on yhteenveto suhteet p-PKR tai p-eIF2α ilmaisun ja muita viittaavia tekijöitä. Korkea p-PKR ilmentyminen liittyy adenokarsinoomat alatyypin (

p

0,001). Ei havaittu mitään korrelaatiota välillä p-PKR ilmaisun ja sukupuoli sukupuoli, TNM tai tupakoinnista. Olemme myös löytäneet korrelaatiota p-eIF2α ilmaisun ja viittaavia tekijöitä. Edustavat kuvat immunohistokemiallisella värjäyksellä tulokset p-PKR ja p-eIF2α on esitetty kuviossa 2. p-PKR ja p-eIF2α ekspressoitiin sytoplasmassa tuumorisolujen.

High-ilmentävät tapauksissa (A ja C). Low-ilmentävät tapauksissa (B ja D). Expression of p-PKR ja p-eIF2α havaittiin sytoplasmassa.

Korrelaatio p-PKR ja p-eIF2α proteiinin ilmentyminen NSCLC kasvaimissa sairauteen tuloksia

edelleen arvioimiseksi, p-PKR tai p-eIF2α proteiinin ilmentyminen korreloi kliinisten tulosten potilailla, joilla on NSCLC, Kaplan-Meier-analyysi paljasti, että vaiheen I ja kaikissa vaiheissa, potilailla, joilla on suhteellisen kohonnut p-PKR oli merkitsevästi pidempi eloonjäämisen kuin ne, joilla on vain vähän tai no p-PKR ilmaisu (kuvio 3A ja 3C). Kaikille vaiheessa potilaille, mediaani elinaika oli 105 kuukautta potilailla, joilla on korkea p-PKR ilmaisun ja 51 kuukautta niille, joilla on vähän tai ei lainkaan p-PKR ilme. Merkittävä yhdistys myös havaittu korkean p-eIF2α proteiinin ilmentymisen ja elinajan pitenemiseen lavalla I ja kaikissa (kuva 3D ja 3F). Ei ole merkittävää yhteyttä ei havaittu korkean p-PKR tai korkean p-eIF2α proteiinin ilmentymisen ja elinajan pitenemiseen lavoilla II-IV (kuvio 3B ja 3E).

A-F. Kaplan-Meier-eloonjäämiskäyristä mukaan eroja (A, B, C) p-PKR ja (D, E, F) p-eIF2-α ilmentymisen potilailla, joilla on vaiheen I (A, D), vaiheet II-IV ( B, E) ja kaikki vaiheessa (C, F) NSCLC. Eloonjäämisluvut olivat merkittävästi huonompi potilailla, joilla on alhainen p-PKR tai p-eIF2α ilmaisun kuin ne, joilla on korkea p-PKR tai p-eIF2α lauseke (I vaihe:

p

= 0,01 ja

p

= 0,02; Kaikki vaiheet:

p

= 0,03 ja

p

= 0,03, vastaavasti).

Kun univariate analyysi, Coxin suhteellisen vaarat malli osoitti, että p-PKR ja p-eIF2α oli ennustetekijöiden merkitys (taulukko 2). Monimuuttuja-analyysissä, huomasimme, että p-PKR ja p-eIF2α ilmentyminen oli tilastollisesti merkitsevä pelastautumiskoulutukseen liittyvä (taulukko 2). Nämä tulokset osoittavat, että p-PKR ja p-eIF2α ilme ovat riippumattomia biomarkkerit potilaiden eloonjäämisen.

tarkasteltiin myös assosiaatioita ekspressiotasot PKR, p-PKR, ja p-eIF2α. Tuloksemme osoittivat, että p-PKR ilmentymisen merkittävästi korreloi p-eIF2a lauseke (Spearmanin rho = 0,48,

p

0,001). PKR ilme myös korreloi merkitsevästi ilmaus p-PKR (Spearmanin rho = 0,31,

p

= 0,004) ja p-eIF2α (Spearmanin rho = 0,45,

p

0,001). Arvioimme lisäksi ennustetekijöiden vaikutus yhdistetyn ilmentymisen p-PKR plus PKR ja p-eIF2α plus PKR ja havaitsi, että molemmat yhdistelmät olivat vahvoja itsenäisiä ennustetekijöitä merkkiaineita yleistä elossaololuku lavalla I (kuvio 4A ja 4B) ja kaikki vaiheessa potilaat (kuva 4C ja 4D). Kaikille vaiheessa potilaiden, joilla on korkea PKR ja korkean p-PKR ilme oli keskimääräinen elinaika 132 kuukautta, mikä oli merkitsevästi pidempi kuin potilailla, joilla on korkea PKR ja matala p-PKR lauseke (mediaanielinajassa, 80 kuukautta kuviossa 4C ). Potilaat, joilla on vähän tai ei lainkaan PKR ja p-PKR ilme oli huomattavasti lyhyempi elinajan mediaani (43 kuukautta kuviossa 4C). On ero tulokseen PKR (H) /p-PKR (H) vs PKR (L) /p-PKR (H) potilaat Kuva 4A. Meidän IHC pisteet alue on 0-300 varten PKR ja p-PKR. Nykyisissä tutkimuksessa käytämme mediaani cut-off (150 PKR ja 70 p-PKR). Kuviossa 4A, 106 I vaiheessa potilaat jaettiin neljään ryhmään, 43 potilailla, joilla on korkea PKR ja korkean p-PKR, 21 potilasta, joilla korkea PKR ja matala p-PKR ilme, 32 Potilaat, joilla on alhainen PKR ja p-PKR ilmaisun ja 10 potilasta, joilla alhainen PKR ja korkean p-PKR ilme. Näillä 10 potilaalla on p-PKR pisteet välillä 80-120, ovat hyvin lähellä mediaani cut-off pisteet (70), ja ne voivat myös kuulua pieni PKR alhaisen p-PKR ryhmä. Kaikille vaiheessa potilaiden, joilla on korkea PKR ja korkean p-eIF2α ilme oli keskimääräinen elinaika 132 kuukautta, mikä oli merkitsevästi pidempi kuin potilailla, joilla on korkea PKR plus pieni p-eIF2α lauseke (mediaanielinajassa, 80 kuukautta) ja ne, matalalla PKR plus korkea p-eIF2α lauseke (mediaanielinajassa, 47 kuukautta kuvio 4D). Lopuksi potilailla, joilla on vähän tai ei lainkaan ilmentymistä sekä PKR ja p-eIF2α oli merkitsevästi lyhyt elinajan mediaani (mediaanielinajassa, 35 kuukautta kuvio 4D).

A ja C Survival osuus oli merkitsevästi pienempi potilailla, joilla on alhainen PKR tai alhaisen p-PKR ilmaisun kuin ne, joilla on korkea PKR tai korkean p-PKR ilme lavalla I (A) ja kaikissa vaiheissa (C) (

p

= 0,001 ja

p

= 0,001, vastaavasti). B ja D. Survival oli myös merkitsevästi pienempi potilailla, joilla on alhainen PKR tai matala p-eIF2α ilmaisun kuin ne, joilla on korkea PKR tai korkean p-eIF2α ilme lavalla I (B) ja kaikissa vaiheissa (D) (

p

= 0,001 ja

p

= 0,001, tässä järjestyksessä).

keskustelu

tämän tutkimuksen tulokset osoittavat, että PKR mRNA arvot liittyvät PKR proteiiniin ilmentyminen ensisijainen NSCLC kasvaimia. Tulosten perusteella näyttää, että PKR proteiinin ilmentyminen voi ohjata transkription tasoa. Edelleen, meidän tiedot viittaavat siihen, että reaaliaikainen RT-PCR, herkkä menetelmä kvantitatiivisesti analysoimiseksi mRNA, voidaan käyttää määrittämään mRNA tasot biopsianäytteissä ja saattaa siksi olla hyödyllisiä ennustettaessa elossaololuku. Olemme myös havainneet, että potilailla, joilla on korkea p-PKR ilme oli huomattavasti pidempi mediaanielinajassa kuin vähän tai ei lainkaan p-PKR proteiinin ilmentymisen. Tulokset eri tutkimuksissa ihmisen maligniteettien ovat ehdottaneet, että korkea PKR ilmaus ilmaisee suotuisat ennusteeseen potilailla, joilla levyepiteelisyövän pään tai maksan [2], [16], mikä viittaa siihen, että PKR voi olla tärkeä rooli tukahduttamaan kasvaimen etenemistä ja vaikuttavat apoptoosin [17]. Olemme myös tutkineet PKR väyliä ja huomannut niiden olevan selvästi välttämätöntä apoptoosin joissakin syöpäsoluissa, mukaan lukien keuhkosyöpä, kun käytetään tiettyjä käsittelyjä, kuten melanooman erilaistumiseen liittyvän geeni 7 (

MDA7

), E2F-1 ja TNFa [18], [19]. Viime aikoina me ja muut osoittivat, että jotkut pienet yhdisteet voivat aiheuttaa PKR-riippuvaista apoptoosia sekä syöpäsoluissa ja hiiren alkion fibroblasteja [20], [21], mikä osoittaa, että moduloiva PKR toiminta voisi olla mielenkiintoinen lähestymistapa syövän hoidossa. Meidän havainto, että NSCLC kasvainsolut, jotka ilmentävät korkeaa p-PKR korreloi suotuisa ennuste on yhdenmukainen aiempien havaintojen PKR aktivaatio liittyy apoptoosin.

havainnot osoittivat myös, että potilaat, joilla on korkea ilmaus molemmat PKR ja p-PKR oli merkitsevästi pidempi eloonjäämisen kuin teki ne, joilla on muita yhdistelmiä ilmaisun tasoilla, mukaan lukien ne, positiivinen PKR ja negatiivisia p-PKR ja niitä negatiivisia sekä PKR ja p-PKR. Havaintomme, että 53% NSCLC tuumorinäytteet ilmentyy voimakkaasti PKR ja että 61% niistä erittäin ilmaistuna p-PKR [tuloksia ei ole esitetty] Nämä tulokset johtivat meidät spekuloida, että PKR ilmentymistä (eli PKR) ja PKR aktivointi (ts s -PKR) vaikuttavat eri ilmentymistä PKR aktivaattori tai PKR estäjä. Muut tutkijat ovat raportoineet, että toiminto PKR voidaan säädellä solun proteiinien joko positiivisesti (esimerkiksi MDA-7 /interleukiini-24 ja PKR-aktivoivan proteiinin [PACT]) tai negatiivisesti (esim p58IPK, nucleophosmin ja lämpösokkiproteiinit 90 ja 70) [18], [19]. Jatkossa tutkimuksissa pyrimme mitkä PKR aktivaattoreita ja inhibiittorit vaikuttavat PKR signalointireitille NSCLC kasvain näytteissä.

Havaitsimme, että kasvaimia korkean p-eIF2α ilme oli huomattavasti pidempi elinajan mediaani. Ylimääräisiä, olemme osoittaneet, että potilailla, joilla on korkea ilmaisuja sekä PKR ja p-eIF2α oli myös merkitsevästi pidempi eloonjäämisen kuin teki ne muilla yhdistelmillä ekspressiotasoja. Meidän havainto, että 47%: n kasvain näytteissä oli matala PKR ilmaisun ja 27% oli korkea p-eIF2α ilmaisua [tietoja ei ole esitetty]. Nämä tulokset viittaavat siihen, että eIF2α fosforylaatio tietyissä NSCLC kasvaimissa tapahtuu riippumaton PKR kautta. Lisäksi PKR, kolme erilaista eIF2α kinaaseja, jotka voivat fosforyloida eIF2α vastauksena eri stressiolosuhteissa on tunnistettu: Hemi-säännelty estäjä, homologilla

Saccharomyces cerevisiae

proteiinikinaasi yleinen ohjaus ei derepressible-2, ja RNA- riippuvainen-proteiini-kinaasi-like solulimakalvostoon (ER) kinaasi (PERK; tunnetaan myös haiman eIF2α kinaasi) [13].

Lopuksi todettakoon, että tiedot viittaavat siihen, että PKR /fosforyloidun PKR /fosforyloidun eIF2α signalointireitin on tärkeä rooli ennustetta ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC). PKR polku toimet voivat olla hyödyllisiä ennustettaessa NSCLC tuloksia, ja moduloiva PKR reitin toimintaan voisi olla potentiaalinen NSCLC hoitovaihtoehto.

Methods

Potilaille ja kudokset

NSCLC potilaat, jotka olivat voimakkaassa resektio ensisijaisen syövän The University of Texas MD Anderson Cancer Center vuodesta 2007 vuoteen 2008 käytettiin tätä tutkimusta saatavuuden mukaan. Potilaat suljettiin pois tutkimuksesta, jos he olivat aiemmin sädehoitoa tai kemoterapiaa syövän. Potilaat säädetty kirjallinen lupa käyttöön kudoksiin, ja hyväksyi tutkimuksen meidän Institutional Review Board (University of Texas, MD Anderson Cancer Center). Kun se on kirurgisesti resektoitiin kukin tuoretta kasvaimen välittömästi jaettu kahteen osaan; yksi oli välittömästi jäädytettiin ja varastoitiin nestemäisessä typessä proteiinin ja RNA: n uutto ja toinen kiinnitettiin formaliiniin ja upotettiin parafiiniin rutiini histopatologiselle ja diagnoosi. Kudokset on arviolta kasvainsolun pitoisuus on 70% tai enemmän käytettiin molekyyli- analyysejä. Sen lisäksi meidän potilaiden kudoksista, saimme 193 NSCLC Tissue mikrosiru (TMA) yksilöt (114 adenokarsinoomia, ja 74 levyepiteelikarsinoomien) vuosien 1997 ja 2001 välillä Lung Cancer erikoistunut ohjelma huippututkimuksen Tissue Bank MD Anderson Cancer Center (Houston , TX). Kaikki näytteet olivat histologisesti tutkittiin ja luokitellaan joko 2004 Maailman terveysjärjestön luokittelujärjestelmä [22]. Useimmissa tapauksissa yksityiskohtaiset kliiniset ja patologisten tiedot, mukaan lukien potilaiden demografiset tiedot, tupakointi historia, ja kokonaiselossaoloaika plus taudin TNM lavastus ja aika uusiutumiseen, oli saatavilla (taulukko 1).

Western Blot analyysi

Jäädytetyt kasvainten kudokset alun perin preparared olemalla pestiin kahdesti kylmällä PBS: llä. Noin 20 mg kudosta kustakin tuore näyte homogenisoitiin 0,5 ml: lla jääkylmää lyysipuskuria (1% NP40, 50 mM HEPES [pH 7,4], 150 mM NaCl, 1,5 mM MgCl

2, 100 mM NaF, 1 mM EGTA, 1 mM Na

3Vo

4, 10% glyserolia, ja 10 mM Na-pyrofosfaatti [Roche Applied Science]), joka sisältää vasta lisätyn proteaasin ja fosfaatti estäjä. Lysaatit sentrifugoitiin 14000 g mikrosentrifugissa 4 ° C: ssa 10 minuutin ajan, ja tuloksena supernatantit käytettiin kudosuutteista. Uutteet, joka vastaa 60 ug kokonaisproteiinia, erotettiin käyttämällä 10% SDS-polyakryyliamidigeelillä ja sitten siirrettiin nitroselluloosamembraaneille. Kalvot blokattiin TBS, joka sisälsi 5% rasvatonta kuivamaitoa ja tutkitaan sitten PBS, joka sisälsi 5% naudan seerumin. Seuraavia vasta-aineita käytettiin: kanin anti-PKR (K-17; Santa Cruz Biotechnology), kanin anti-p-PKR (pT446) (Epitomics), kanin anti-p-eIF2a (Epitomics) ja hiiren anti-β-aktiini (Sigma). Immunoreaktiivisia vyöhykkeet havaittiin ja kvantitoitiin käyttäen Li-Cor Odyssey infrapuna Imaging System.

Käänteinen transkriptio ja Reaaliaikainen Absolute Quantitative Reverse-transkriptio-polymeraasiketjureaktio (Real-Time AqRT-PCR) B

kokonais-RNA (1 ug) kustakin jäädytetty kliinisestä näytteestä uutettiin käyttämällä Trizol uutto (Invitrogen) ja käänteistranskriboitiin on 20 ul: n reaktiotilavuudessa käyttäen Taqman käänteistranskriptiotuotteiden reagenssit (Applied Biosystems) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. CDNA: t laimennettiin ja kvantitoitiin ilmentämiseen PKR käyttäen reaaliaikaista RT-PCR (SYBR Green I) (suoritetaan Ziren Research LLC, Irvine, CA). Yksi standardi on sisällytetty määrittää absoluuttisen suhde ilmentymisen kohde ja viite-geenin, kuten aiemmin on kuvattu [23]. Alukesekvenssit PKR olivat seuraavat: eteenpäin, 5′-TCTTCATGTATGTGACACTGC-3 ’, ja reverse 5′-CACACAGTCAAGGTCCTT AG-3’.

immunohistokemiallinen värjäys ja arviointi

käytetyt vasta-aineet Western blot -analyysiin käytettiin myös immunohistokemiallisella värjäyksellä. Formaliini-kiinnitetyille ja parafiiniin upotettujen kudosten histologia osat (5 um paksu) poistettiin parafiini, sammutettua ja kuumennettiin höyrystimen 10 min 10 mmol /l natriumsitraattia (pH 6,0) antigeenin haku. Peroksidaasi estettiin 3% H

2O

2 metanolissa huoneen lämpötilassa 15 min ajan, jonka jälkeen inkuboitiin 10% naudan seerumin albumiinia TBS-t: ssa 30 min. Objektilasit seuraavaksi inkuboitiin ensisijaisen vasta-aineen kanssa 1:100 laimennoksina 65 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Pesun jälkeen PBS: llä, levyt inkuboitiin biotiinilla leimatun sekundaarisen vasta-aineen kanssa 30 min. Lopuksi näytteitä inkuboitiin streptavidiini-peroksidaasin laimennus 1:40 30 min. Sitten näytteet värjättiin 0,05% 3 ’, 3-diaminobentsidiinitetrahydrokloridilla valmistettu 0,05 mol /l Tris-puskuria (pH 7,6), joka sisälsi 0,02% H

2O

2 ja sen jälkeen vastavärjättiin hematoksyliinillä. Positiivisena kontrollina, formaliinilla kiinnitetyt ja parafiiniin upotettu keuhkojen kudoksiin, joilla on normaali keuhkoputkien epiteelin käytettiin. Negatiivisena kontrollina, kudosnäytteet eivät inkuboitiin primaarisen vasta-aineen käytetty. Immunohistokemiallinen värjäys kvantifioitiin kaksi riippumatonta patologia (DRS. Raso Pataer), jossa neljän arvon intensiteetti pisteet kuvattu aiemmin [1].

Tilastollinen analyysi

Mediaani käytettiin cutoff pisteen p-PKR ja p-eIF2a. Biomarkkerit oli kaksijakoinen osaksi matala- ja korkean tason ryhmään seuraavasti: p-PKR: alhainen (score≤70), korkea (pisteet 70); ja p-eIF2a: alhainen (score≤150), korkea (pisteet 150). Vuonna univariate analyysi, itsenäinen näyte

t

ja

X

2

testejä käytettiin analysoimaan jatkuvasti ja kategorisen muuttujia, vastaavasti. Eloonjäämistä koska ajan funktiona laskettiin käyttäen Kaplan-Meier estimaattori. Log-rank-testiä käytettiin ryhmien väliset vertailut potilaiden elinaika. Coxin suhteellisten riskien mallia käytettiin laskemiseen vaikutuksen p-PKR ja p-eIF2a ilme elinaika oikaistuna tehty kliinisiä ja histopatologisia parametrit (ikä, sukupuoli, tupakointi ja kasvaimen histologisen alaryhmä. Kaksipuolisen testi oli testata samassa suhteessa ryhmien välillä kaksisuuntainen virhematriiseja. yleistetty estimointiyhtälölle lähestymistapaa käytettiin arvioitaessa erojen välineet datan. tilastollinen merkitsevyys asetettiin P 0,05.

Kiitokset

Kiitämme Markeda Wade toimituksellista. Kiitämme Denise M. Woods ja Lakshimi Kakarala niiden teknistä apua.