Krooninen sairaus

tiivistelmä

entsyymi 5α-reduktaasi, joka muuttaa testosteronin dihydrotestosteroniksi (DHT), suorittaa keskeiset toiminnot androgeenireseptorin (AR) signalointireitin. Kolme isoentsyymien 5α-reduktaasin mennessä tunnistetut koodaavat eri geenit:

SRD5A1

,

SRD5A2

, ja

SRD5A3

. Tässä tutkimuksessa selvitettiin mekanismit androgen sääntely 5α-reduktaasin isoentsyymi ilmentymistä ihmisen eturauhasen soluissa. Huomasimme, että androgeenireseptorin säätelee mRNA taso 5α-reduktaasi-isoentsyymejä on solutyyppispesifiselle tavalla, että sääntelyn tapahtuu transkription tasolla, ja että AR on tarpeen tämän asetuksen. Lisäksi tulokset viittaavat siihen, että AR rekrytoimista kielteinen androgeenireseptorin vaste-elementin (Näre) on promoottori

SRD5A3 in vivo

ja sitoutuu suoraan Näre

in vitro

. Eri ekspressiotasoja 5α-reduktaasin isoentsyymien voi antaa vastauksen tai resistenssin 5α-reduktaasin estäjät ja voi siten olla merkitystä eturauhasen syövän ehkäisyyn.

Citation: Li J, Ding Z, Wang Z, Lu JF, maity SN, Navone NM, et ai. (2011) n androgeenisäätely 5α-reduktaasin isoentsyymien in Eturauhassyöpä: vaikutukset eturauhassyövän ehkäisyn. PLoS ONE 6 (12): e28840. doi: 10,1371 /journal.pone.0028840

Editor: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 16, 2011; Hyväksytty: 16 marraskuu 2011; Julkaistu: 14 joulukuu 2011

Copyright: © 2011 Li et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus rahoittivat Eturauhassyöpä Research Program MD Anderson Cancer Center ja tukee osittain National Institutes of Health kautta MD Anderson Cancer Center Support Grant, CA016672. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

monivuotisen, monivaiheinen prosessi eturauhasen syövän synnyn ja sen pitkä latenssiaika tehdä eturauhassyövän erinomaisesti kemopreventiossa [1]. Androgeenireseptorin (AR) signalointireitin, joka on välttämätön eturauhasen kehityksen ja normaali toiminta, on myös keskeinen eturauhasen syövän synnyssä ja etenemiseen [2], [3]. Avain entsyymi AR signalointi, 5α-reduktaasi, muuttaa testosteronin tehokkaammaksi androgeeniksi dihydrotestosteroni (DHT) [4]. Vaikka testosteroni voi sitoutua ja aktivoida AR, DHT sitoutuu sen dissosiaationopeus kolme kertaa hitaampi kuin testosteroni [5], [6].

kolme isoentsyymien 5α-reduktaasin, joita koodaavat eri geenit (

SRD5A1

,

SRD5A2

, ja

SRD5A3

), on tunnistettu. Immunohistokemiallista ja polymeraasiketjureaktio (PCR) analyysit ihmisen eturauhasen kudosten viittaavat siihen, että SRD5A1 ja SRD5A2 tasot muuttuvat eturauhassyövän kehittymistä ja etenemistä [7], [8], [9].

In vitro

tutkimukset ovat vahvistaneet 5α-reduktaasin aktiivisuus enemmän-äskettäin tunnistettu SRD5A3 [10], joka oli yli-ilmentynyt hormoni tulenkestävät eturauhassyöpäkudoksille [10], [11]. Knockdovvn

SRD5A3

ilmaisu vähensi myös kasvun ja kannattavuuden eturauhassyöpäsolujen [10]. Käyttämällä monoklonaalista vasta-ainetta, Godoy et al. edelleen kohonneen tason SRD5A3 proteiinin eturauhassyöpä verrattuna eturauhasen hyvänlaatuisen kudoksiin [12]. Nämä havainnot ehdotti, että SRD5A3 saattavat edistää eturauhassyövän etenemiseen. Se on myös äskettäin raportoitu, että SRD5A3 voi olla tärkeä rooli proteiinin glykosylaatio [13]. Mutaatiot

SRD5A3

aiheuttaa synnynnäisiä sairauksia [13], [14] ja Kahrizi oireyhtymä [15].

Kaksi 5α-reduktaasin estäjien on testattu kliinisesti. Finasteridi estää spesifisesti SRD5A2 toimintaa [16], ja dutasteridin estää että sekä SRD5A1 ja SRD5A2 [17]. Eturauhasen syövän ehkäisemisen Trial (PCPT) saatu myönteisiä tuloksia: finasteridi vähensi ilmaantuvuus eturauhassyövän 25%, vaikka mahdolliset vaikutukset korkealaatuisesta kasvaimia koskevat [18]. Vastaavasti vähennys Dutasteridia Eturauhassyöpä Events (vähennä) tutkimus osoitti, että dutasteridi vähensi eturauhassyövän 23% miehillä riski on suuri ja ei paljastanut mitään tilastollisesti merkittävää kasvua korkealaatuisesta kasvaimen dutasteridia saaneista miehiä [19] , [20].

kolme tekijää voidaan antaa vastaus tai vastustuskykyä 5a-reduktaasin estäjät. Ensinnäkin, vasteen tai vastus voi johtua läsnäolosta eri isoentsyymien [21]. Toiseksi erot herkkyyttä voidaan myönnetyn

SRD5A2

genotyypin variantteja [22]; Makridakis et ai. [23] osoitti

in vitro

että

SRD5A2

versioiden erilaiset affiniteetit finasteridia. Kolmanneksi, eri ilmentymistasojen 5α-reduktaasin isoentsyymien voitaisiin edistää sekä herkkyys ja kestävyys. Toisin androgeeniablaatio, mikä vähentää eturauhasen testosteronin ja DHT, inhibitio 5α-reduktaasin aktiivisuus laskee DHT mutta lisää testosteronia [24], [25], [26]. Koska 5α-reduktaasin estäjät muuttaa testosteronin-to-DHT-suhde ja koska kriittinen rooli 5α-reduktaasin AR signalointia eri 5α-reduktaasi ekspressiotasot voivat antaa vihjeitä vastaus ja kestävyys 5a-reduktaasin estäjien eturauhassyövän ehkäisyyn .

Androgeenit voivat vaikuttaa ilmaus

SRD5A1

ja

SRD5A2

eri kudoksissa ja solutyypeissä. Rotilla ventraalisessa eturauhanen, positiivinen säätely

SRD5A2

androgeenien on raportoitu [27] ja rotan kivesten negatiivisen säätelyn

SRD5A1

[28]. Androgeeniablaatio vähensivät immunovärjäykseen 5α-reduktaasin [29].

SRD5A1

ja

SRD5A2

säännellään myös testosteronin ja DHT T- ja B-imusolujen [30] ja rotan maksassa ja aivoissa [31], [32], [33], [ ,,,0],34]. Kuitenkin miten 5α-reduktaasi ilmentymistä säädellään ihmisen eturauhasen soluissa ei ole laajasti tutkittu.

Ensisijainen Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli siten arvioida androgeenin sääntelyä 5α-reduktaasi-isoentsyymejä ihmisen eturauhasen soluissa. Tutkimme lisäksi, onko säätelyvaikutukset androgeenien on 5α-reduktaasien välittyvät AR ja onko suora vuorovaikutus välillä

cis

sääntelyvälineitä elementtejä 5α-reduktaasi-isoentsyymejä ja AR.

Tuloksemme osoittivat solutyyppispesifiselle androgeenin sääntely isoentsyymien joka välittää AR. Tietääksemme tämä on ensimmäinen osoitus siitä, että AR voi sitoutua suoraan negatiiviseen androgeenireseptorin vaste-elementti (Näre) on

SRD5A3

promoottori LNCaP eturauhasen syöpäsoluja. Meidän havainnot voi olla kliinistä merkitystä tunnistamiseksi miehille, joiden tauti voi hyötyä 5α-reduktaasin estäjät.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja kulttuureissa

PWR-1E, LNCaP, ja Vcap-solut saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA); BPH-1-GFP, BPH-1-AR, ja C4-2B4 solut olivat lahja Dr. Sue-Hwa Lin (University of Texas MD Anderson Cancer Center, Houston, TX); ja LAPC-4-solut ystävällisesti toimitti tri Robert Reiter (University of California, Los Angeles, CA).

PWR-1E-soluja ylläpidettiin seerumittomassa keratinosyyttien väliaineessa (Invitrogen, Life Technologies Corp., Carlsbad, CA), jota oli täydennetty 50 ug /ml naudan aivolisäkeuutetta, 5% L-glutamiinia, ja 5 ng /ml epidermaalista kasvutekijää. LNCaP, C4-2B4, BPH-1-GFP, ja BPH-1-AR-soluja ylläpidettiin RPMI-1640-väliaineessa, jossa oli 10% naudan sikiön seerumia (FBS) ja 1% penisilliiniä ja streptomysiiniä (P /S). LAPC-4-soluja ylläpidettiin Iscoven modifioidussa Dulbeccon väliaineessa (Invitrogen), jota oli täydennetty 5% FBS: ää ja 1% P /S. Vcap soluja ylläpidettiin Dulbeccon modifioidussa Eagle-kasvualustassa, jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja 1% P /S. Kaikkia viljelmiä säilytettiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmassa 5% CO

2. Solulinjoja tilitetyistä MD Anderson Ominaista Cell Line Core by STR DNA-sormenjälkien avulla AmpFℓSTR Identifiler Kit (Applied Biosystems, Life Technologies Corp., Carlsbad, CA). STR profiilit verrattiin tunnettuihin ATCC sormenjäljet, että Cell Line Integrated Molecular Authentication Tietokantaversio 0.1.200808 (https://bioinformatics.istge.it/clima/) [35], sekä MD Andersonin sormenjälkitietokanta. STR-profiilit PWR-1E, LNCaP, C4-2B4, ja VCAP solut Hyväksytty tunnettua DNA sormenjäljet; nämä BPH-1-AR ja LAPC-4-soluja oli ainutlaatuinen.

Quantitative käänteisen transkription PCR: llä (qRT-PCR) B

Kokonais-RNA uutettiin kustakin solulinjasta käyttäen RNeasy Plus mini (Qiagen Inc., Valencia, CA) valmistajan protokollaa. qRT-PCR suoritettiin käyttäen TaqMan-One-Step RT-PCR -pakkausta (Applied Biosystems, Life Technologies Corp.), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, qRT-PCR-asetus kustakin reaktiosta oli 48 ° C: ssa 30 minuutin ajan, 95 ° C: ssa 10 minuuttia, ja 42 sykliä 95 ° C 15 sekuntia ja 60 ° C: ssa 1 minuutti. Ihmisen β-aktiini käytettiin endogeenisen ohjaus kussakin reaktiossa. Primer ja koettimia

SRD5A1

,

SRD5A2

, ja

SRD5A3

geenit olivat myös Applied Biosystems.

Androgeenien hoito

Testosteroni ja DHT hankittiin yhtiöltä Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). R1881, synteettinen androgeeni, oli ystävällisesti toimittanut Dr. Sue-Hwa Lin. Solut ympättiin 12-kuoppalevyille ja niiden säännöllinen kasvualustaan. Jälkeen seerumistarvaatio yön yli, solut altistettiin etanolia (kontrolli) tai 1 nM, 10 nM tai 100 nM androgen. Sen jälkeen, kun 24-tunnin ja 48 tunnin inkuboinnin jälkeen solut otettiin talteen ja RNA uutettiin qRT-PCR-analyysiin.

aktinomysiini D-käsittely

BPH-1-AR, LNCaP, ja PWR-1E-soluja käsiteltiin dimetyylisulfoksidin (DMSO; kontrolli) tai 1 ug /ml tai 5 ug /ml aktinomysiini D: ssa 30 minuutin ajan, minkä jälkeen etanolia (kontrolli) tai 10 nM DHT. 24 tunnin inkubaation jälkeen solut otettiin talteen ja kokonais-RNA.

Transfektio Sirna (siRNA) B

kaataa AR ilme, jaoimme LNCaP-solujen 12-kuoppalevyillä, seerumia niitä yön yli, ja sitten transfektoidaan ne 20 nM AR siRNA tai ohjata siRNA käyttämällä DharmaFECT 1 (Dhamarcon, Inc., Thermo Fisher Scientific, Lafayette, CO). Inkubaation jälkeen yön yli, solut altistettiin etanolia (kontrolli) tai 2 nM DHT. AR siRNA ja ohjaus siRNA saatiin Dhamarcon.

Western blot-analyysi

24 tunnin inkubaation siRNA, solut otettiin talteen ja sentrifugoitiin 5000 rpm 5 minuuttia. Solupelletit suspendoitiin uudelleen RIPA-puskuriin (Boston Bioproducts, Inc., Ashland, MA) ja proteaasi-inhibiittori (Roche, Mannheim, Saksa), inkuboitiin 20 minuutin ajan silloin tällöin vortex sekoittamalla, ja sitten sentrifugoitiin 14000 rpm 10 minuuttia. Supernatantti dekantoitiin ja säästettiin Western blottauksella. Koko proteiini-uuttomenettely suoritettiin 4 ° C: ssa, ja proteiinikonsentraatio mitattiin käyttäen BCA-määritystä (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA). Supernatantti keitettiin 5 minuutin ajan, ladattiin polyakryyliamidigeelillä, juosta, ja siirrettiin PVDF-membraanille, jota sitten estettiin TBST (TBS 0,2% Tween 20) + 5% maitoa 1 tunnin ajan ennen kuin tutkittiin anti-AR vasta-ainetta (Dako North America, Inc., Carpinteria, CA) estopuskurissa yön yli 4 ° C: ssa, jonka jälkeen inkuboitiin huoneenlämmössä 1 tunti sekundaarisen piparjuuriperoksidaasi-konjugoidulla anti-hiiri-vasta-aine. Detection suoritettiin käyttämällä elektrokemiluminesenssin (Amersham, GE Healthcare Bio-Sciences Corp., Piscataway, NJ).

lusiferaasianalyysissä

SRD5A3

promoottori (-1027 /+ 155 bp) kloonattiin pGL2 perusvektoriin (Promega Corp., Madison, WI), on Xhol- ja MluI, samoin kuin muita deleetiorakenteita. LNCaP-solut transfektoitiin Näiden rakenteiden käyttämällä Fugene 6-reagenssia (Roche) tai Lipofectamine 2000 (Invitrogen).

testaamiseksi AR-riippuvaisia ​​tukahduttaminen kyky SRD5A3, myös lisätty sen promoottori (-191 /-72 ep) osaksi pGL3-4ARE-E4-luc-konstrukti on Pstl- ja Xhol. LNCaP-solut transfektoitiin ja sitten kasvatettiin poissa ja läsnä ollessa DHT: ssa 24 tuntia.

dual-Lusiferaasimääritys suoritettiin mukainen Promega protokollan. Lusiferaasi suhde saadaan jakamalla lusiferaasiaktiivisuutta

Renillaa

aktiivisuutta.

mutageneesi

Mutaatiot tehtiin Näre alueella

SRD5A3

promoottori käyttämällä QuickChange II XL kohdennetun mutageneesin kittiä (Stratagene, Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Sekvenssi CTGTTTTGCGTCT mutatoitiin ATTTTTTTATTAT in yhteydessä pGL3-4ARE-E4-luc-konstruktin.

elektroforeettisen liikkuvuuden-shift (EMSA) B

AR: n sitoutuminen kaksijuosteista oligoja arvioitiin LNCaP solujen tuman otteet suorittamalla EMSA kanssa LightShift kit (kaikki sarjat EMSA olivat Thermo Scientific) mukaan valmistajan ohjeiden. Tumaproteiiniuutteet eristettiin LNCaP-soluja, ja proteiinin pitoisuudet määritettiin käyttäen BCA-proteiinimäärityksellä kit. Oligoja tarkoituksena on kattaa -191 /-91 alueen

SRD5A3

promoottori ja merkitty käyttämällä biotiini 3′-päähän DNA -leimauskitillä mukaan valmistajan ohjeiden. AR sitova Kaksijuosteisiin oligoja arvioitiin LNCaP solujen tuman otteet EMSA käyttämällä LightShift kit mukaan valmistajan ohjeiden. Tunnisteeton oligot käytettiin EMSA yhtenä valvontaa. Biotiini-leimattu DNA havaittiin nailonfiltterillä käyttäen kemiluminesenssi nukleiinihapon havaitseminen moduuli kit.

Kromatiini immunosaostuksella (ChIP) määritys

LNCaP-soluja viljeltiin niin läsnä ja poissa ollessa 100 nM DHT, ja siru suoritettiin käyttäen reagenssipakkausta Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA), valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, soluja käsiteltiin 37% formaldehydiä rajat linkin proteiinien DNA: ta. Silloitettu chromatin pilkottiin micrococcal nukleaasilla pituus 150-900 bp, ja ydin- kalvot rikottiin sonikoimalla. AR-spesifisiä vasta-aineita (Dako) käytettiin saostamiseksi lyhyt kromatiinin fragmentit, jotka sitten pestiin ja eluoitiin. Proteiini-DNA ristisidosten peruttiin ja DNA puhdistettiin edelleen käyttämällä spin sarakkeita jokaisessa PCR-reaktiossa. Forward-aluketta varten Nare oli CTGTTTTGCGTCTTTGCTTCTG, ja reverse-aluke oli GAGGTCCTTGGTCCTGGTC, joka monistaa 120 bp: n tuotteen.

ksenograftimalleissa

RNA MDA PCa 183, MDA PCa 144, MDA Eturauhassyövän 146, ja MDA PCa 155 ksenograftimalleja luovutti ystävällisesti Dr. Sankar N. maity ja tri Nora M. Navone. MDA PCa 183 ksenografti oli peräisin androgeeniriippuvaisissa eturauhasen syöpä, kun taas toiset olivat peräisin AR-negatiivinen kastraatiotason kestävä eturauhasen karsinoomien kanssa pienisoluinen prostatakarsinoomassa (SCPC) morfologia.

kvantifiointi suhteellinen mRNA taso ksenografti

SRD5A3

ja eturauhasen antigeenin (

PSA

) tehtiin käyttämällä qRT-PCR SYBR Green (Applied Biosystems, Inc.). qRT-PCR suoritettiin, kuten on kuvattu [36]. Alukesekvenssit olivat seuraavat: SRD5A3: eteenpäin, 5′-TCCAAGCTGGCTTCATGGTT-3 ’sijaitsevat eksonin 2 ja taaksepäin, 5′-CACTCGAAGAGTCTTCGTAA-3′ joka sijaitsee eksonissa 3; PSA: eteenpäin, 5’-GAGAGCTGTGTCACCATGTG-3 ’sijaitsevat eksonin 1 ja taaksepäin, 5′-CACAATCCGAGACAGGATGA-3’ joka sijaitsee eksonissa 2.

Tilastollinen analyysi

Data esitetään keskiarvoina ± SD. Kaksipuolinen

t

kokeita vertailussa keinoin androgen-käsiteltyjen ja kontrollit. Merkitys asetettiin ap arvoon 0,05.

Tulokset

Kaikki kolme 5α-reduktaasi-isoentsyymejä ovat läsnä testatussa ihmisen eturauhasen solulinjoissa, vaihtelevalla ilme kuvioita

Tunnistaa hyvä malli järjestelmien tutkimiseen toimintojen 5α-reduktaasi-isoentsyymejä, arvioimme mRNA tasot 5α-reduktaasi-isoentsyymejä eri eturauhasen solulinjoissa, mukaan lukien PWR-1E ikuisti normaalit eturauhasen epiteelisolujen; BPH-1-AR eturauhasen hyvänlaatuisen liikakasvun (BPH) soluja, jotka ilmentävät stabiilisti AR; LAPC-4 ja LNCaP androgeenista herkkien syöpäsolujen; ja C4-2B4 androgeenista riippumaton soluja. PWR1-E, BPH-1-AR ja LAPC-4-solut ilmentävät villityyppistä AR, kun taas LNCaP ja C4-2B4 solut ilmentävät mutantti AR, T877A. (Ominaisuudet näistä solulinjoista, mukaan luettuina niiden lähde, androgen herkkyys, ja AR-ilmentymisen tilan, on esitetty yhteenvetona taulukossa S1). Kuten kuvio 1 esittää, mRNA: n kaikkien kolmen 5α-reduktaasin isoentsyymien havaittiin qRT-PCR-analyysi kustakin solulinjasta, joka osoittaa, että kaikki kolme on ilmaistu näissä solulinjoissa. Kuitenkin mRNA-tasolla kunkin isoentsyymin vaihteli solulinjojen, ja kukin isoentsyymin oli erottuva ilmentymiskuvio.

Graafiset esitykset kuvaavat suhteellista mRNA tasot

SRD5A1

,

SRD5A2

, ja

SRD5A3

isoentsyymejä in PWR-1E, BPH-1-AR, LAPC-4, LNCaP ja C4-2B4 solujen määritetty qRT-PCR-analyysiin.

5α-reduktaasin mRNA-tasot säätelevät androgeenien solutyypissä-spesifisellä tavalla

Sen testaamiseksi, onko mRNA: n taso 5α-reduktaasin säädellään androgeenien, käsittelimme LNCaP-soluja joko etanolia (eli ajoneuvon vain) tai testosteronin tai DHT eri pitoisuuksina (1, 10, ja 100 nM). Normaalin plasman testosteronin miehillä vaihtelee 350-1050 ng /dl (12,1-36,4 nM) [37], ja kastraatiotason testosteronin on alle 50 ng /dl (1,73 nM) [38]. Plasman DHT on noin 1/10 testosteronipitoisuus [39], [40]. Siten käsittelimme soluja pitoisuudet androgeenien jotka ovat lähellä kastraatiotasolle, fysiologinen ja superphysiologic tasolla. Meidän qRT-PCR-analyysi osoitti, että DHT-hoito johti tehostettuun

SRD5A1

mRNA, kun se johti alentuneesta

SRD5A2

ja

SRD5A3

mRNA LNCaP eturauhasen syöpäsolut (Fig. 2A).

A, LNCaP-soluja käsiteltiin etanolilla (ajoneuvon vain) tai eri pitoisuudet DHT (1 nM, 10 nM, 100 nM) 24 ja 48 tunnin ajan. PWR-1E (B), BPH-1-AR (C), LAPC-4 (D), ja C4-2B4 (E) Soluja käsiteltiin samalla tavalla, mutta vain 24 tunnin ajan. MRNA-tasot on

SRD5A1

,

SRD5A2

, ja

SRD5A3

kaikki solulinjat kvantifioitiin qRT-PCR: llä. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001; 2-puolinen

t

testiä.

Testasimme myös vaikutus DHT muita solulinjoja. DHT ei vaikuttanut mRNA tasoon 5α-reduktaasin PWR-1E-soluissa (kuvio. 2B), kun taas BPH-1-AR-soluissa, DHT lisäsi mRNA-tasoja kaikkien kolmen isoentsyymien (Fig. 2C). LAPC-4-soluja, jotka ilmentävät villityyppistä AR, DHT sääteli SRD5A1 ilmentymistä vaikuttamatta SRD5A2 ja SRD5A3 ilmentymistä (Fig. 2D). Ja androgeenista riippumattoman C4-2B4 eturauhassyövän solut, DHT säänneltyjen 5α-reduktaasin ilmaus samalla sen sääntelyn LNCaP, mutta vähemmässä määrin (kuvio. 2E).

oli mielenkiintoista, että DHT säätelee mRNA taso

SRD5A3

on solutyyppispesifiselle tavalla toteamuksen emme ole nähneet raportoitu aikaisemmin. Sen arvioimiseksi, onko tämä tapahtuu vain LNCaP tai LNCaP-solulinjat, me käsiteltiin samalla tavalla Vcap soluja, jotka ovat peräisin ksenografti luumetastaasipotilailla ihmisen eturauhasen syöpä. DHT myös alassäädetty mRNA taso

SRD5A3

vuonna VCAP soluissa (kuvio S1), mikä osoittaa, että androgeeni-negatiivisen säätelyn

SRD5A3

ei ole spesifinen LNCaP tai LNCaP solulinjat.

Testosteroni ja R1881 oli samankaltaisia ​​vaikutuksia kuin DHT ilmentymisen 5α-reduktaasin kaikissa testatuissa solulinjoissa (kuviot S2 ja S3). Tuloksemme osoittavat täten, että androgeenien säätelevät mRNA taso 5α-reduktaasi-isoentsyymejä on solutyyppispesifiseen tavalla.

asetukseen 5α-reduktaasin mRNA-tasolla tapahtuu läpi transkription

Androgeenit voivat säädellä 5α- reduktaasia ilme ohjaamalla 5α-reduktaasin transkription tai vaikuttamalla mRNA vakautta. Mekanismin ymmärtämiseksi taustalla sääntelyn 5α-reduktaasin by androgeenit, käsittelimme BPH-1-AR-solujen aktinomysiini D, transkriptio estäjä. Kuten tulokset osoittavat qRT-PCR-analyysi kuviossa 3, DHT indusoi lisääntyneen ekspression kaikissa kolmessa 5α-reduktaasin isoentsyymien suhteessa, että etanolin (ajoneuvo) valvonta BPH-1-AR-soluissa. Kuitenkin mRNA-tasolla ja 5α-reduktaasin ei muutu DHT hoitoon, kun soluja käsiteltiin myös aktinomysiini D: 1 ug /ml ja 5 ug /ml pitoisuuksina (Fig. 3A). Nämä tulokset osoittavat, että säätely ylöspäin 5α-reduktaasin ilmentyminen androgeenien on herkkä aktinomysiini D-käsittely, mikä viittaa siihen, että androgeenien säätelevät transkription 5α-reduktaasin.

BPH-1-AR (A) ja LNCaP ( B), ja PWR-1E (C) soluja käsiteltiin 30 minuutin ajan DMSO (ajoneuvon vain kontrolli) tai aktinomysiini D: 1 ug /ml ja 5 ug /ml pitoisuuksia. Hoito joko etanolilla (ajoneuvo vain) tai 10 nM DHT tai testosteronin seurasi. Kvantitoimme mRNA tasot

SRD5A1

,

SRD5A2

, ja

SRD5A3

by qRT-PCR.

Samalla tavalla, kun LNCaP-soluja käsitelty aktinomysiini D, testosteroni ei lisännyt merkittävästi

SRD5A1

tai lasku

SRD5A2

ja

SRD5A3

mRNA (Fig. 3B). Negatiivisena kontrollina, myös käsitelty PWR-1E solujen aktinomysiini D, jonka jälkeen DHT käsittely (Fig. 3C). Siinä tapauksessa, että DMSO-vasta-ohjaus, DHT ei vaikuttanut mRNA: n taso

SRD5A1

,

SRD5A2

, tai

SRD5A3

. Aktinomysiini D hoidon DHT ei merkittävästi muuttanut mRNA tasolla näiden geenien joko.

asetukseen 5α-reduktaasin mRNA tasolla androgeenien on AR riippuvainen

Käyttämällä Western blotting, me todentaa ilmentymistä AR kussakin tutkituista solulinjojen verrattuna, että AR-negatiivinen BPH-1-GFP-soluissa (kuvio. 4A).

A, AR-proteiinin taso kunkin eturauhasen solulinja oli analysoitiin Western-blottauksella. BPH-1-GFP-soluja käytettiin negatiivisena kontrollina AR ekspressiota. B, AR-proteiinin taso analysoitiin Western-blottauksella ja LNCaP-soluja (vasemmalla), jossa on kolme ohjaus ja kaksi AR siRNA hoitoja. AR mRNA taso analysoitiin qRT-PCR PWR-1E soluja (oikealla), myös kolme ohjaus ja kaksi AR siRNA hoitoja. C, LNCaP ja PWR-1E solut käsiteltiin kontrolli siRNA: t ja AR siRNA ja sitten käsiteltiin 2 nM DHT. Mittasimme mRNA tasot

SRD5A1

,

SRD5A2

, ja

SRD5A3

käyttämällä qRT-PCR ja normalisoitu arvot P-aktiini. Muutokset mRNA-tasojen kanssa DHT hoidossa näytetään suhteessa tasot soluissa vehikkeliä vain.

Voit selvittää AR tarvitaan välittävän sääntelyä 5α-reduktaasin ilmentymisen androgeenien, teimme Western blottaus ja qRT-PCR-analyysi jälkeen hoitoon LNCaP ja PWR-1E soluja AR siRNA: t ja sitten 2 nM DHT. Western blotting ja qRT-PCR vahvisti tehokas knockdovvn AR ilmentymisen AR siRNA: t (Fig. 4B). qRT-PCR osoitti, että ohjaus siRNA: t eivät merkittävästi muuttanut sen vaikutusta DHT 5α-reduktaasipitoisuuden LNCaP-soluissa (kuvio. 4C, ylhäällä). DHT hoito yksinään lisännyt

SRD5A1

mRNA mutta laski

SRD5A2

ja

SRD5A3

mRNA (Fig. 4C, ylhäällä). Sen sijaan 5α-reduktaasi tasot LNCaP käsitelty AR siRNA ei muuttunut vastauksena hoidon DHT (Fig. 4C, ylhäällä). Kun käsitelty LAPC-4-soluja samalla tavalla,

SRD5A1

mRNA lisääntyi samoin DHT tai testosteronin hoito yksinään, mutta ei silloin, kun soluja käsiteltiin myös AR siRNA (kuva S4). Kun käsittelimme PWR-1E soluissa samalla tavalla, DHT ei vaikuttanut mRNA tasoon 5α-reduktaasin PWR-1E soluja, olipa niitä käsiteltiin ohjaus siRNA tai AR siRNA (Fig. 4C, alhaalla).

Yhteenvetona nämä tulokset osoittavat, että sääntely 5α-reduktaasin by androgeenit on AR riippuvainen.

SRD5A3

promoottori sisältää Näre

Osoitimme androgeenin säätelee transkriptiota 5α-reduktaasin ja AR on tarpeen välittää tämän transkription säätelyyn. AR suoraan sitoutuu ARE ja säätelee transkriptiota AR kohdistetun geenejä. Siten, tutkimme AR voi suoraan säädellä transkription 5α-reduktaasin. Olemme kloonattu promoottorialueen

SRD5A3

(-1027-155 bp) osaksi pGL2-basic vector. LNCaP-soluja, tämä rakenne ohjaa lusiferaasin ilmentymistä, ja kun ne käsiteltiin 100 nM DHT, 75%: n vähennys lusiferaasin aktiivisuuden tulokset (Fig. 5A). Tämä on samanlainen kuin vaste endogeenisen

SRD5A3

androgeenin hoitoon LNCaP-soluissa. Siten ARE voi sijaita tähän 1-kb promoottorialueen

SRD5A3

.

, poisto analyysi

SRD5A3

promoottori kaventamaan sijainnin nARE- sisältävät alueella. LNCaP-solut transfektoitiin lusiferaasin konstrukteja, jotka sisältävät deleetion sarja

SRD5A3

promoottorin ja sitten käsiteltiin etanolilla (ajoneuvon vain, -DHT: tä) tai 100 nM DHT (+ DHT) 24 tuntia. Sitten solut otettiin talteen, ja niiden lysaatteja käytettiin lusiferaasimääritystä. B,

SRD5A3

on Näre. LNCaP-solut transfektoitiin pGL3-4ARE-E4 rakentaa ja ilman insertion

SRD5A3

promoottori (-191 /-72 bp) sekvenssin molemmissa suunnissa tai insertio

SRD5A1

promoottorin fragmentti (-1601 /-1501 bp). Soluja käsiteltiin etanolilla (ajoneuvon vain) tai 100 nM DHT: ssa 24 tuntia, ja sitten korjataan lusiferaasimääritystä. C, Mutaatiot Näre poisti sen estävää vaikutusta. LNCaP-solut transfektoitiin pGL3-4ARE-E4 rakentaa ja ilman insertoimalla

SRD5A3

promoottori (-191 /-72 bp) tai insertio mutatoidun

SRD5A3

promoottori (-191 /-72 ep) ja sen jälkeen niille DHT hoitoon ja lusiferaasimääritystä.

tunnistamiseksi oletetun OVAT teimme joukon deleetiorakenteita

SRD5A3

promoottorialue; konstruktit säilytti reagointikykyä androgeenireseptorin hoitoa kunnes -191 /-91 bps poistettiin, mikä viittaa siihen, että oletetun ARE sijaitsee tällä alueella (kuvio. 5A).

edelleen arvioimista, onko tämä alue todellakin sisältää Näre , lisäsimme alueella -191 /-72 bp välillä 4ARE ja E4 ytimen promoottori pGL3-4ARE-E4-luc-konstrukti [41], transfektoidaan LNCaP-solujen kanssa, ja käsitellään sitten solut DHT. PGL3-4ARE-E4-luc rakenne sisältää neljä tandem ARE on

PSA

geeni ja E4 ytimen promoottori [41]. Kuten kuviossa 5B on esitetty, DHT indusoi noin 24-kertainen nousu lusiferaasin aktiivisuuden pGL3-4ARE-E4-luc-konstrukti. Kun -191 /-72-bp alueella

SRD5A3

promoottori väliin 4ARE ja E4, lusiferaasiaktiivisuus lisääntyi vain 3- 6-kertainen DHT hoito, viittaa siihen, että tämä alue sisältää Nare. Kun 101 bp: n alue on johdettu

SRD5A1

promoottori (-1601 /-1501 bp) samalla väliin 4ARE ja E4 kontrollina, DHT hoito edelleen indusoi 26-kertainen lusiferaasiaktiivisuus. Lisäksi mutaatiot -191 /-72-emäsparin alueella

SRD5A3

poisti tukahduttavaa kyky (Fig. 5C). Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että

SRD5A3

on funktionaalinen Näre sen promoottori.

AR rekrytoimista Näre sisältävä alue

SRD5A3

sen tutkimiseksi, AR rekrytoimista edistäjä

SRD5A3 in vivo

teimme sirun avulla genomista DNA-osia LNCaP (150-900 emäsparia, Fig. 6A) alukkeilla nimenomaan suunnattu Näre alueella

SRD5A3

. Kuten on esitetty PCR, AR on rikastettu Nare alueella, kun solut kasvoivat läsnä ollessa DHT (Fig. 6B). Normaalin hiiren immunoglobuliini G (negatiivisena kontrollina) käytettiin myös immunosaostuksella LNCaP genomista DNA: ta; immunoglobuliini G ei vedä alas mitään AR-liittyvä DNA-sekvenssit

SRD5A3

promoottori (Fig. 6B). Nämä tulokset viittaavat siihen, että AR rekrytoimista Näre alue edistäjä

SRD5A3

.

, agaroosigeelielektroforeesi pilkottu kromatiinin LNCaP soluja kasvatettiin ilman ja läsnä oli 100 nM DHT. DNA-fragmentit vaihtelevat yleensä välillä 150 ja 900 bp. B, Mädätetty kromatiinin LNCaP-soluja kasvatettiin ilman ja läsnä oli 100 nM DHT käytettiin immunosaostuskokeesta anti-AR-vasta-aine tai normaalin hiiren immunoglobuliini G. Sen jälkeen, proteiini-DNA ristisidoksia on päinvastainen, ja puhdistettu DNA käytettiin PCR-reaktioissa alukkeilla reunustavat Näre alueella. C, kolme oligo- alukkeet suunniteltiin kattamaan -191 /-91 ep alue edistäjä

SRD5A3

. D, AR sitoutuu Näre on

SRD5A3

. Kolmen (biotiinileimatuilla) oligo koettimia inkuboitiin LNCaP solujen tuman uutetta, jossa LNCaP solu tumauutteesta plus merkitsemätön oligo- koettimia, tai LNCaP solu tumauutteesta plus AR-spesifistä vasta-ainetta.

Määritä onko AR voi suoraan vuorovaikutuksessa Näre on

SRD5A3

, suoritimme EMSA kolme oligo antureista, kukin 40 emäsparin, kattamaan -191 /-91-emäsparin alueella

SRD5A3

promoottori (Fig. 6C). Vain koetin 1 osoittivat liikkuvuuden siirtymän (Fig. 6D). Sen vahvistamiseksi, että tämä liikkuvuus muutos on nimenomaan AR, lisäsimme anti-AR-vasta-aineiden reaktioihin; koetin 1 osoitti edelleen liikkuvuuden siirtymän (Fig. 6D). Vaikka merkitsemätön villityypin koetin 1 pystyi kilpailemaan leimattu koetin 1 AR sitova EMSA, se menetti että kyky kun teimme mutaatioita koetin 1 sekvenssi (kuva S5).

Nämä tulokset osoittivat, että koetin 1 sisältää Näre ja että AR suoraan sitoutuu tällä alueella

in vitro

.

SRD5A1

ja

SRD5A2

, myös toteutettiin promoottori analyysi ja siru, mutta emme havaitse ARE alueen tai suoraan AR sitova niiden proksimaaliseen promoottorialueille. Regulational mekanismia niiden ilme on edelleen tutkittavana.

SRD5A3

mRNA kasvaa AR-negatiivinen SCPC ksenograftimallia

Huomioituaan androgeenisäädellyn negatiivisen säätelyn

SRD5A3

testatussa solulinjoissa, olimme kiinnostuneita tutkii onko tämä AR-riippuvaisia ​​sääntely esiintyy myös

in vivo

. Siksi tutkimme mRNA taso

SRD5A3

eri ksenograftimalleissa, kuten MDA PCa 183, AR-ilmentävien androgeeniriippuvaisissa eturauhassyöpäksenograftista, ja kolme AR-negatiivinen androgeenista riippumaton SCPC ksenografteissa, MDA PCa 144 , MDA PCa 146, ja MDA PCa 155. qRT-PCR, havaitsimme huomattavan korkeampi mRNA tasolla

PSA

että MDA PCa 183 ksenograftin kuin toiset (Fig. 7, ylhäällä), joka on sopusoinnussa AR tilan näistä solulinjoista.