Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Moniresistenssi resistenttien syöpäsolujen ovat vaikea hävittää varten tehottomuus tavanomaisten syöpälääkkeiden. Lisäksi pakenevat sytotoksiset vaikutukset kemoterapiaa, ne myös ohittaa pro-immunogeeninen aiheuttamia vaikutuksia syöpälääkkeiden: todellakin ne eivät ole hyvin tunnista isännän dendriittisolujen eivätkä saada aikaan kestävä kasvaimen vastaisen immuniteetin. Se ei ole vielä tutkittu, onko monilääkeresistenttejä soluilla on erilainen kyky aiheuttaa immunosuppression kuin chemosensitive niistä. Me käsitellyt aihetta ihmisen ja hiiren chemosensitive ja moniresistenttejä syöpäsoluja.

Tulokset

Huomasimme, että toiminta ja ilmentyminen indoleamine 2,3-dioksigenaasin 1 (IDO1), joka katalysoi muuntaminen tryptofaania osaksi immunosuppressiivisen metaboliitiksi kynurenine, oli korkeampi kaikissa moniresistentti solujen arviointi sekä IDO1 estäminen vähensi kasvua lääkkeille vastustuskykyisten kasvainten immunokompetenteilla eläimillä. Vuonna solunsalpaajaresistentti soluissa pohjapinta aktiivisuuden JAK1 /STAT1 ja JAK1 /STAT3 signalointi oli suurempi, STAT3 estäjä PIAS3 oli alassäädetty ja autokriinisen tuotanto STAT3-kohde ja IDO1-indusoijat sytokiinien IL-6, IL-4, IL 1β, IL-13, TNF-α ja CD40L, lisättiin. Häiriöitä JAK /STAT signalointi alensi IDO1 toimintaa ja käänsi kynurenine aiheuttama pro-immunosuppressiiviset vaikutukset, kuten paljasti palautettu leviämisen T-lymfosyyttien STAT-vaiennetaan solunsalpaajaresistentti soluissa.

Johtopäätökset

työ osoittaa, että monilääkeresistenttejä soluilla on voimakkaampi immunosuppressiivista asenne kuin chemosensitive soluja, koska konstitutiivisen aktivaation JAK /STAT /IDO1 akselilla, mikä johtaa kemo- ja immuunijärjestelmän-välttelevä. Häiritsevät tämän akselin voi merkittävästi parantaa tehokkuutta kemiallis-immunoterapian protokollien vastustuskykyisiä kasvaimia.

Citation: Campia I, Buondonno I Castella B, Rolando B, Kopecka J, Gazzano E, et ai. (2015) autokriini Sytokiini /JAK /STAT-Signaling indusoi kynurenine Synteesi monilääkeresistenssi- ihmisen syöpäsoluja. PLoS ONE 10 (5): e0126159. doi: 10,1371 /journal.pone.0126159

Academic Editor: Michael Platten Yliopistosairaalassa Heidelberg, Saksa

vastaanotettu: 27 lokakuu 2014; Hyväksytty: 29 maaliskuu 2015; Julkaistu: 08 toukokuu 2015

Copyright: © 2015 Campia et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat avustuksia Italian Association for Cancer Research (AIRC; myöntää MFAG 11475; www.airc.it), Italian Ministry of University ja Research ( ”Future in Research program” FIRB 2012 myöntää RBFR12SOQ1; www.istruzione.it). JK on kaveri Italian Foundation for Cancer Research (FIRC; www.fondazionefirc.it). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

saavuttaminen hyvä kemoterapia tehoa ja indusoi kestävä kasvaimen vastaisen immuunivasteen ovat tärkeimpiä haasteita chemoimmunotherapy. Chemoresistance, erityisesti samanaikainen vastustusta eri kemoterapeuttiset aineet tunnetaan monilääkeresistenssiin (MDR), on yksi suurimmista ongelmista kemoterapiaa [1]. MDR voi olla läsnä diagnoosi tai aiheuttama selektiivinen paine kemoterapiaa; se perustuu usein yli-ilmentyminen ATP: n sitoutuminen kasetin (ABC) kuljettajat vastuussa syöpälääke ulosvirtaus, kuten P-glykoproteiinin (Pgp), MDR liittyvät proteiinit (MRPs) ja rintasyöpä resistance protein (BCRP). Yhdessä ne pumpata sekä klassisia kemoterapia-aineiden (esim antrasykliinit, taksaanit, Vinka-alkaloidit, epipodofyllotoksiinit, topotekaani, metotreksaatti) ja uusia kohdistettuja lääkkeiden (esim imatinibi dasatinibia lapatinibi, gefitinibi, sorafenibi, erlotinibi), mikä rajoittaa niiden sytotoksisia vaikutuksia [2].

erityiset kemoterapia-aineiden, kuten antrasykliinit ja oksaliplatiini, aiheuttaa myös pro-immunogeenisiä vaikutuksia, indusoimalla translokaation solukalvon spesifisten ”syö minua” signaaleja, kuten chaperon kalretikuliini, joka laukaisee tuumorisolun fagosytoosin ja myöhemmin aktivoitumisen antitumor CD8

+ T-lymfosyytit [3]. Tämä mekanismi ei toimi soluissa yli-ilmentävät P-gp [4-6], jotka johtavat samalla kemo- ja immuuni-resistenttejä.

Lisäksi kasvainsolut voivat kiertää vastaanottavan immuunitutkimusohjelmasta tukahduttamalla toiminta vastaanottavan immuunijärjestelmä. Lukuisia mekanismeja välittävät kasvaimen aiheuttama immunosuppressio, mukaan lukien: muutokset kasvaimen pinta-antigeenit; vapautuminen immunosuppressiivisten sytokiinien kasvaimen mikroympäristössä; laajentaminen auttaja-T-2 lymfosyyttien, T-sääntelyyn (Treg-solut), myeloidinen peräisin suppressorisolut ja tyypin 2-kasvaimeen liittyvät makrofagit, jotka suosivat kasvaimen kasvua ja heikentää aktiivisuutta anti-kasvaimia, kuten auttaja-T-1 lymfosyyttien , CD8

+ T-lymfosyyttien tyypin 1 kasvaimen liittyy makrofagien, luonnollisten tappajasolujen [7].

yksi vahvimmista välittäjien kasvaimen aiheuttama immunosuppressio on kynureniini, tuote tryptofaanin hajoamista kautta tryptofaani dioxygenase (TDO) [8], ja indoliamiini-2,3-dioksigenaasin entsyymejä (IDO1 ja IDO2) [9], jotka on indusoitu interferoni γ (IFN-γ) [10, 11], typpioksidin (NO) [12 ] ja rauta [13]. Tryptofaani on välttämätön aminohappo leviämisen ja selviytymistä CD8

+ ja CD4

+ T-lymfosyytit; Lisäksi lisääntynyt kynurenine /tryptofaani-suhde vakavasti vaarantaa tehokkuutta isännän soluimmuniteetti, koska kynureniini estää aktivaation T-lymfosyyttien [7, 14]. IDO1 ilmaistaan ​​kasvainta infiltroivia dendriittisolujen [15] ja kasvaimen stroomasolujen [16], ja on todettu, konstitutiivisesti tai säädelty useissa tuumorisoluissa [14, 17]. Lisääntynyt seerumin kynurenine /tryptofaani-suhde on korreloi nopeamman etenemisen keuhkosyöpään [18] ja IDO positiivisuus Tuumorinäytteissä liittyy yleensä huono kliininen ennuste [19-21]. IDO1 yli-ilmentyminen tukee kasvaimen kasvua ja etenemistä keuhkosyövässä [22], mikä johtaa hypoteesin että kynurenine, lisäksi sen immunosuppressiiviset vaikutukset voivat suoraan parantaa kasvaimen kehitystä.

aiemmin osoitettu, että monilääkeresistenttejä solut ovat resistenttejä immunogeeninen kuolema liikennöi dendriittisolujen välittämä fagosytoosia [4-6]. Se ei ole tutkittu, onko monilääkeresistenttejä solut eroavat chemosensitive ne myös kyky indusoida immunosuppressio: olemme huomanneet, että monilääkeresistenttejä soluilla oli basaalisesti korkeammat tuotantokustannukset immunosuppressiivisen metaboliitin kynurenine kuin chemosensitive solut ja tutkimme molekyylitasolla tämän fenotyypin.

Materiaalit ja menetelmät

Kemikaalit

plasticware soluviljelmien oli Falcon (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Elektroforeesin reagenssit saatiin Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA). Ihmisen IFN-γ saatiin R pH säädettiin neutraaliksi NaOH: lla.

Solut

Ihmisen chemosensitive ei-pienisoluinen keuhkosyöpä, A549-solut hankittiin Instituto Zooprofilattico Sperimentale ”Bruno Umbertini” (Brescia, Italia). Ihmisen chemosensitive paksusuolen syövän HT29, ihmisen chemosensitive krooninen myelooinen leukemia K562-solut, ihmisen chemosensitive mesothelial Met5A soluihin ja hiiren konstitutiivisesti solunsalpaajaresistentti maitorauhasen JC solut olivat ATCC (Manassas, VA) Resistentti alalinjoja A549 /dx, HT29 /dx, K562 /dx tuotettiin laboratoriossamme viljelemällä edellä mainittuja vanhempien soluja alustassa, joka sisälsi kasvavia pitoisuuksia doksorubisiinin, käytetään MDR indusoija, kuten on raportoitu aiemmin [4]. Ihmisen konstitutiivisesti solunsalpaajaresistentti pahanlaatuinen mesoteliooma (HMM) solut kerättiin, kun ilmoitti kirjallinen suostumus potilaan, jonka biologinen Pankin pahanlaatuinen mesoteliooma (S. S. Antonio e Biagion Hospital, Alessandria, Italia), jossa histologiset luonnehdinta suoritettiin [23]. Kokeellinen protokolla (koodi: TASK3) hyväksyttiin 09.11.2011, jonka bioetiikkaneuvoston ( ”Comitato Etico Interaziendale”) on S. S. Antonio e Biagion Hospital, Alessandria, Italia. Soluja kasvatettiin vastaavaan elatusaineeseen, jota oli täydennetty 10% v /v naudan sikiön seerumia (FBS), 1% v /v penisilliini-streptomysiiniä, 1% v /v L-glutamiinia ja pidettiin kostutetussa atmosfäärissä 37 ° C ja 5% CO

2.

kynurenine mittaus

IDO aktiivisuus määritettiin mukaan [24], vähäisin muutoksin: 200 ui soluviljelysupernatantit lisättiin 100 ui 30% w /v trikloorietikkahappoa (TCA) ja inkuboitiin 30 min 50 ° C: ssa hydrolysoimiseksi N-formylkynurenine on kynureniini. Kun oli sentrifugoitu 10000 x g 10 min, 100 ui supernatanttia siirrettiin 96-kuoppaisen levyn, sekoitettiin 100 ui 2% w /v p-dimetyyliamino bentsaldehydiä 99,8% v /v etikkahappoa ja inkuboitiin 10 min huoneenlämpötilassa. Kynureniini havaittiin mittaamalla absorbanssi 490 nm: ssä, käyttämällä Synergy HT Multi-Detection Microplate Reader (BioTek, Winooski, VT). Absorbanssi pelkästään viljelyalustassa pidettiin tyhjä ja vähennettiin arvoista, jotka saatiin, kun läsnä on soluja. Tulokset ilmaistiin nmol kynurenine /mg solun proteiinien, mukaan titrauskäyrään aiemmin asetettu. Kynureniini tasot soluviljelmien supernatanteista mitattiin rinnakkain korkean paineen nestekromatografialla (HPLC), kuten on raportoitu [25], vähäisin muutoksin: 400 ui soluviljelysupernatanttia lisättiin 100 ul: aan 30% paino /tilavuus TCA: lla , inkuboitiin 30 min 50 ° C: ssa ja sentrifugoitiin 15000 x g: ssä 10 min. Kirkas supernatantti suodatettiin 0,45 pm PTFE suodattimet (Alltech, Nicholasville, KY) ja analysoitiin Agilent LC-järjestelmä (Palo Alto, CA), joissa on tyhjökaasunpoistin (G1322A), kvaternaaripumpulla (G1311A), manuaalinen-suutin (Rheodyne , Cotati, CA) ja useita aallonpituuden detektori (G1365A) integroitu HP1200 järjestelmässä. Tiedot hankittiin ja niitä käsitellään Agilent ChemStation ohjelmisto. Injektiotilavuus oli 20 ui. Agilent Eclipse XDB-C18-pylväs (125 mm x 4,0 mm, 5 nm) käytettiin analyysiin 30 ° C: ssa. Kromatografinen erotus toteutettiin käyttäen liikkuvaa faasia, joka koostui 15 mmol /l (pH 4,0) ja asetonitriiliä (90:10, v /v) virtausnopeudella 0,8 ml /min. Eluaattia tarkkailtiin 365 nm: ssä, viittaa vastaan ​​700 nm: n aallonpituudella. Kalibrointi näytteet valmistettiin lisäämällä kynurenine standardit (Sigma Chemical Co.) pitoisuutena, joka on 0,50-50 umol /L viljelyalustaan. Tulokset ilmaistiin nmol kynurenine /mg solun proteiineihin.

qRT-PCR: n ja PCR-taulukot

uutettiin kokonais-RNA ja käänteistranskriptoidaan käyttäen iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad Laboratories ). QRT-PCR suoritettiin iTaq Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad Laboratories). Sama cDNA valmistetta käytettiin määrittämään kiinnostuksen kohteena olevan geenin ja siivous-geenin

β-aktiini

. Alukesekvenssejä, suunniteltu qPrimerDepot ohjelmisto (https://primerdepot.nci.nih.gov/), olivat: sillä

IDO1

: 5’CAGGCAGATGTTTAGCAATGA -3 ’; 5’GATGAAGAAGTGGGCTTTGC -3 ’; for

β-aktiini

: 5’GCTATCCAGGCTGTGCTATC-3 ’; 5’TGTCACGCACGATTTCC-3 ’. Määrä

IDO1

mRNA oli normalisoitu verrattuna määrä

β-aktiini

mRNA, valitaan siivous-geenin, ja se ilmaistiin

IDO1

/

β- aktiini

suhde, käyttäen Bio-Rad-ohjelmisto Gene Expression kvantitointi (Bio-Rad Laboratories). PCR taulukot tehtiin 1 ug cDNA käyttämällä ihmisen JAK /STAT signalointireitin RT² Profiler PCR Array ja ihmisen IL-6 /STAT3 signalointireitin Plus RT² Profiler PCR Array (Qiagen, Hilden, Saksa), seuraten valmistajan ohjeita. Tietojen analysointi suoritettiin RT² Profiler PCR Array Data Analysis (Qiagen).

Western blotting

solut huuhdeltiin lyysipuskuri (125 mmol /L Tris-HCI, 750 mmol /l NaCl: a, 1% v /v NP40, 10% v /v glyserolia, 50 mmol /L MgCl

2, 5 mmol /l EDTA: a, 25 mmol /L NaF, 1 mmol /L NAvó

4 , 10 ug /ml leupeptiiniä, 10 ug /ml pepstatiinia, 10 ug /ml aprotiniinia, 1 mmol /l fenyylimetyylisulfonyylifluoridia, pH 7,5), sonikoitiin ja sentrifugoitiin 13000 x g: ssä 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa. 20 ug proteiineja solulysaateista tehtiin Western-blottaus ja koetettiin seuraavilla vasta-aineilla vastaan: IDO1 (kanin polyklonaalinen, laimennettu 1: 2000, AG-25A-0029, Adipogen, San Diego, CA); IDO2 (hiiren monoklonaalinen, laimennettu 1: 500, SAB3701447, Sigma Chemical Co.); TDO (kanin polyklonaalinen, laimennettu 1: 1000, SAB2102400, Sigma Chemical Co.); fosfo (Tyr 1022/1023) -JAK1 (kanin polyklonaalinen, laimennettu 1: 1000, # 3331, Cell Signaling Technology, Danvers, MA); JAK1 (kanin polyklonaalinen, laimennettu 1: 1000, # 3344, Cell Signaling Technology); fosfo (Tyr701) -STAT1 (kanin polyklonaalinen, laimennettu 1: 1000, # 9167, Cell Signaling Technology); STAT1 (hiiren monoklonaalinen, laimennettu 1: 1000, klooni 15H3, Thermo Scientific, Rockford, IL); fosfo (Tyr705) -STAT3 (kanin polyklonaalinen, laimennettu 1: 2000, # 9145, Cell Signaling Technology); STAT3 (hiiren monoklonaalinen, laimennettu 1: 5000, klooni 9D8, Thermo Scientific); Pgp (kanin polyklonaalinen, laimennettu 1: 250, sc-8313, Santa Cruz Biotechnology Inc.); MRP1 (hiiren monoklonaalinen, laimennettu 1: 100, ab32574, Abcam, Cambridge, UK); MRP2 (hiiren monoklonaalinen, laimennettu 1: 100, ab3373, Abcam); MRP3 (vuohen polyklonaalinen, laimennettu 1: 250, sc-5776, Santa Cruz Biotechnology Inc.); MRP4 (vuohen polyklonaalinen, laimennettu 1: 250, ab77184, Abcam); MRP5 (vuohen polyklonaalinen, laimennettu 1: 250, sc-5781, Santa Cruz Biotechnology Inc.); BCRP (kanin polyklonaalinen, laimennettu 1: 500, sc-25882, Santa Cruz Biotechnology Inc.); β-tubuliinia (hiiren monoklonaalinen, laimennettu 1: 500, sc-5274, Santa Cruz Biotechnology Inc.), mitä seurasi sekundäärinen peroksidaasiin konjugoitu vasta-aine (Bio-Rad Laboratories). Proteiinit havaittiin tehostetulla kemiluminesenssilla (Bio-Rad Laboratories). Nuclear uutteet valmistettiin kanssa Nuclear Extract Kit (Active motiivi, Rixensart, Belgia); 10 ug ydin- Proteiinit erotettiin SDS-PAGE: lla ja koetettiin seuraavilla vasta-aineilla vastaan: PIAS1 (kani monoklonaalinen, laimennettu 1: 1000, ab109388, Abcam); PIAS3 (kanin polyklonaalinen, laimennettu 1: 1000, ab22856, Abcam); fosfo (Tyr701) -STAT1; STAT1; fosfo (Tyr705) -STAT3; STAT3; TATA-sitovan proteiinin (TBP, kanin polyklonaalinen, laimennettu 1.500, sc-273, Santa Cruz Biotechnology Inc.). Poissulkemiseksi sytosolisten saastuminen tumauutteiden, olemme varmistaneet, että β-tubuliinin oli havaittavissa ydin- näytteiden (ei esitetty).

In vivo

tuumorikasvun

1 x 10

5 ihmisen A549, A549 /dx, HT29, HT29 /dx solujen 20 ui kasvatusliuosta, sekoitetaan 20 ui Cultrex BME (Trevigen, Gaithersburg, MD), istutettiin ihonalaisesti oikeaan kylkeen 6-8 viikkoa vanha nainen nude BALB /c-hiiriä, jotka sijaitsevat alle 12 tunnin valo /pimeä sykli, ruuan ja juomaveden edellyttäen

halun

. 1 x 10

5 hiiren solunsalpaajaresistentti JC soluja, syngeeninen BALB /c-hiiriä [26], istutettiin immunokompetenteilla eläimillä. Toisessa koejärjestelyssä, kun A549 /dx, HT29 /dx ja JC kasvaimet saavuttivat tilavuuden 100 mm

3, eläimet satunnaistettiin kahteen ryhmään: ”Control” ryhmä (käsitelty 100 ui suolaliuosta

per os

5 päivää /viikossa kolmen viikon ajan); ”Brassinin” ryhmä (hoidettiin 400 mg /kg IDO1 estäjän 5-Br-brassinin

per os

, 5 päivää /viikossa kolmen viikon ajan), kuten on kuvattu [27]. Sekä kokeellisissa että asetetaan, kasvaimen kasvua mitattiin päivittäin paksuus ja laskettiin yhtälön (PxL

2) /2, jossa L = kasvaimen pituus ja W = kasvaimen leveys. Hiiret uhrattiin päivänä 21 Koemenetelmät oli hyväksynyt bioetiikkaneuvoston ( ”Comitato Etico di Ateneo”) yliopiston Torino, Italia.

Sytokiinituotanto

sytokiinien mitattiin soluviljelmän supernatantista käyttäen seuraavia kaupallisia kittejä: Ihmisen interleukiini-6 (IL-6), Duo Set Development Kit (R tulokset ilmaistiin prosentteina elävien solujen verrattuna käsittelemättömiin soluihin.

nitriitti mittaus

taso nitriitin, vakaa johdannainen NO, että soluviljelysupernatanttia mitattiin Griessin menetelmällä [ ,,,0],29]. Tulokset ilmaistiin nmol nitriitti /mg solun proteiineihin.

Iron mittaus

100 x 10

6 solut pestiin PBS: llä, irrotettiin trypsiini /EDTA: lla, sentrifugoitiin 12000 x g: ssä 2 min, suspendoitiin uudelleen 1 ml: aan PBS: ää ja sonikoitiin. Solunsisäinen rauta mitattiin käyttämällä AAnalyst 200 Atomiabsorptiospektrometri (PerkinElmer). Tulokset ilmaistiin ng rauta /ml solususpensiota.

Tilastollinen

Kaikki tiedot tekstin ja luvut annetaan keskiarvoina ± SD. Tulokset analysoitiin yksisuuntaisella varianssianalyysillä (ANOVA).

p

0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

kynurenine synteesi on suurempi monilääkeresistenttejä soluissa ja moduloidaan 5-Br-brassinin, metyyli-DL-tryptofaania ja interferoni-γ

ensin analysoitiin kynurenine tuotannon paneelin chemosensitive ja monilääkeresistenttien syöpäsolujen, osoittaa eri mallia ABC kuljettajat (S1 Kuva): HT29, A549, K562, Met5A olivat ihmisen chemosensitive soluja; HT29 /dx, A549 /dx ja K562 /dx olivat malleja hankittujen MDR; HMM ja JC olivat ihmisen ja hiiren konstitutiivisesti solunsalpaajaresistentti soluja, tässä järjestyksessä. Usealle kestävät solulinjat oli korkeammat kynurenine tasot-havaittiin HPLC (S2 kuvassa) ja spektrofotometrinen määritys (kuvio 1A) -ja kohonnut IDO1 proteiinin verrattuna chemosensitive soluihin (kuvio 1 B). IDO2 havaittiin vaihtelevan määrinä chemosensitive ja solunsalpaajaresistentti soluja; TDO havaittiin kaikissa solulinjoissa analysoitiin, paitsi A549 /dx-soluissa (kuvio 1 B).

IDO1

mRNA johti myös suurempi monilääkeresistenttejä soluissa kuin chemosensitive ne (Kuva 1C).

Ihmisen chemosensitive keuhkosyöpään A549-soluja ja solunsalpaajaresistentti A549 /dx soluja, ihmisen chemosensitive paksusuolen syövän HT29 ja solunsalpaajaresistentti HT29 /dx soluja, ihmisen chemosensitive krooninen myelooinen leukemia K562-solut ja solunsalpaajaresistentti K562 /dx soluja, ihmisen chemosensitive mesothelial Met5A solut ja ihmisen solunsalpaajaresistentti pahanlaatuinen mesoteliooma HMM soluissa, hiiren solunsalpaajaresistentti maitorauhasen JC solut altistettiin seuraaviin tutkimuksiin. A. kynurenine tasot soluviljelmien supernatanteista mitattiin spektrofotometrisesti. Data esitetään keskiarvoina ± SD (n = 4). * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0.001: solunsalpaajaresistentti solut (MDR-positiivinen) verrattuna vastaavaan chemosensitive (MDR-negatiivinen) soluissa. B. Western blot-analyysi IDO1, IDO2 ja TDO ilme. Β-tubuliinia ilmentymistä käytettiin kontrollina yhtä proteiinia loading. Kuvio on 3 kokeen tulokset olivat samanlaiset. C. ekspressiotaso

IDO1

mRNA mitattiin qRT-PCR: llä. Data esitetään keskiarvoina ± SD (n = 4). * P 0,01, ** p 0.002: solunsalpaajaresistentti solut (MDR-positiivinen) verrattuna vastaavaan chemosensitive (MDR-negatiivinen) soluihin.

Human solunsalpaajaresistentti A549 /dx solua ja HT29 /dx solut kasvoivat nopeammin kuin chemosensitive A549 ja HT29 istutettu nude BALB /c-hiiriä (kuvio 2A). Hiiren solunsalpaajaresistentti JC soluilla oli korkein kasvuvauhti (kuvio 2A). Mielenkiintoista on, että IDO1 inhibiittori 5-Br-brassinin [27] ei ole kasvua estäviä A549 /dx ja HT29 /dx kasvaimia, istutettiin immuunipuutteisilla hiirillä, mutta se vähensi etenemistä JC kasvaimia, istutetaan immunokompetenteilla eläimillä (kuvio 2B ). Nämä tiedot viittaavat siihen, että IDO aktiivisuus voi tukea nopean kasvun solunsalpaajaresistentti kasvaimia immunokompetenteilla hosts.

. 1 x 10

5 ihmisen A549, A549 /dx, HT29, HT29 /dx soluja istutettiin ihonalaisesti 6-8 viikkoa vanha nainen nude BALB /c-hiiriä, 1 x 10

5 hiiren JC soluja istutettiin immunokompetenteilla BALB /c-hiirissä. Kasvaimen kasvua seurattiin päivittäin mittaamalla tulkilla. Tiedot esitetään keskiarvoina ± SD 10 hiirtä /ryhmä. * P 0,02, ** p 0,005, *** p 0,001: A549 /dx tai HT29 /dx soluja versus A549 tai HT29, vastaavana ajankohtina. B. Eläimet, joilla on A549 /DX, HT29 /DX, JC-kasvaimia satunnaistettiin kahteen ryhmään, kun kasvaimet saavuttivat tilavuuden 100 mm

3: ”Control” ryhmä (käsitelty 100 ui suolaliuosta

per os

5 päivää /viikossa kolmen viikon ajan, CTRL); ”Brassinin” ryhmä (hoidettiin 400 mg /kg IDO1 estäjän 5-Br-brassinin

per os

, 5 päivää /viikossa kolmen viikon ajan, BRA). Kasvaimen kasvua seurattiin päivittäin mittaamalla tulkilla. Tiedot esitetään keskiarvoina ± SD 6 hiirtä /ryhmä. ** P 0,005: BRA-ryhmä vs. CTRL-ryhmä, vastaavana ajankohtina.

tutkimme seuraavaksi syy eron kynurenine tuotannon välillä chemosensitive ja solunsalpaajaresistentti soluja. Yksinkertaisuuden vuoksi, olemme keskittyneet A549 ja A549 /dx soluja malleina chemosensitive ja monilääkeresistenssitiloja soluja, vastaavasti, koska näissä soluissa ero kynurenine tasoilla ja IDO1 ilme oli hyvin selvää. Koska HPLC-mittauksen ja spektrofotometrinen määritys antoi päällekkäin tulokset A549 ja A549 /dx-soluja (S2 kuvio ja kuvio 1A), käytimme jälkimmäinen määrityksessä luotettava menetelmä arvioida eroja kynurenine tasoilla näiden kahden solulinjojen.

analysoidaan, onko kynurenine vaihtelivat eri vastauksena kemoterapeuttisten-, johon monilääkeresistenttejä solut ovat insensitive-, että IDO1 aktivaattorit, kuten NO, rauta ja IFN-γ ja IDO1 inhibiittorit, kuten 5- Br-brassinin ja metyyli-DL-tryptofaania [30].

doksorubisiini, sisplatiini, gemsitabiini ja mitoksantroni, käytetään konsentraatioina, jotka alennetaan 50% elinkelpoisuuden herkkien A549-soluja vaikuttamatta elinkelpoisuutta resistenttien A549 /dx solut (S3A kuvio), ei muuttanut kynurenine tasot, jotka pysyivät merkitsevästi korkeampi A549 /dx soluissa kuin A549-soluja, joko ilman tai, kun läsnä on kemoterapeuttisten aineiden (S3B kuvio). Samoin NO luovuttajien S-nitrosoglutathione ja S-nitroso-N-acetylpenicillamine, mikä lisäsi tasoja NO chemosensitive ja monilääkeresistenttejä soluja (S4A kuvio), ei muuttanut kynurenine synteesi käsittelemättömiin soluihin verrattuna molemmissa solupopulaatioiden (S4b Kuva). Moduloimaan solunsisäisen rauta, käsittelimme A549 ja A549 /dx solujen solua läpäisevän rauta-vapauttava yhdiste FeNTA kanssa ja rautaa kelatoiva desferroxamine, jotka vastaavasti lisätä ja vähentää määrää solun rauta (S5a kuvio): uudelleen, ei FeNTA eikä desferroxamine vaihdellut kynurenine tuotanto (S5B kuvio).

IFN-γ lisäsi kynurenine tasoilla sekä chemosensitive ja monilääkeresistenttejä soluja, mutta niiden laajuudesta nousu oli suurempi A549 /dx-soluissa (kuvio 3A). Vaikutus IFN-γ, joka vähensi inhibiittorit metyyli-DL-tryptofaani ja 5-Br-brassinin (kuvio 3A), oli liittyy kasvu

IDO1

mRNA: ta (kuvio 3B) ja proteiini ( kuvio 3C). Myös tässä tapauksessa nousu aikaansaama IFN-γ oli huomattavampi A549 /dx kuin A549-soluja (kuvio 3B ja 3C), mikä viittaa siihen, että moniresistentti solut olivat reagoiva sytokiinin. Samanlaisia ​​vaikutuksia IFN-γ, metyyli-DL-tryptofaani ja 5-Br-brassinin havaittiin HT29 ja HT29 /dx soluja, K562 ja K562 /dx soluja, Met5A ja HMM-soluja (tietoja ei esitetty).

A549 ja A549 /dx soluja inkuboitiin 48 h tuoreessa väliaineessa (CTRL) tai väliaineessa, joka sisältää IDO1 inhibiittorit metyyli-DL-tryptofaania (1 mmol /l, mTrp) tai 5-Br-brassinin (100 umol /l, BRA), ja IDO1 indusoija IFN-γ (100 ng /ml, IFNy), yksinään tai yhdistelmänä. A. kynurenine tasot soluviljelmien supernatanteista mitattiin spektrofotometrisesti. Data esitetään keskiarvoina ± SD (n = 4). * P 0.01: versus A549 CTRL-solut; °°° p 0,001: versus A549 /dx CTRL;

◊◊ p 0,005: IFN-γ + mTrp-käsitelty, IFN-γ + BRA-käsiteltyjen A549 ja A549 /dx-soluja vastaan, joka vastaa käsiteltyjen solujen IFN-γ yksin. B. ekspressiotaso

IDO1

mRNA mitattiin qRT-PCR: llä. Data esitetään keskiarvoina ± SD (n = 4). *** P 0,001: versus A549 CTRL-solut; °°° p 0,001: versus A549 /dx CTRL soluja. C. Western blot-analyysi IDO1 ilmaisua. Β-tubuliinia ilmentymistä käytettiin kontrollina yhtä proteiinia loading. Kuvio on 3 kokeen tulokset olivat samanlaiset.

Moniresistenssi resistentit solut on suurempi aktiivisuus JAK /STAT signalointi ja lisääntynyt autokriininen tuotanto STAT3-riippuvainen sytokiinien kuin chemosensitive solujen

Koska IFN-γ aktivoi JAK /STAT1-3 signalointi [31], ja STAT1 ja STAT3 ovat tehokkaita transkription aktivaattorit

IDO1

geenin useimmissa nisäkässoluissa [32, 33], olemme analysoineet ekspressiotasot keskeisten geenien JAK /STAT-reitin suurikapasiteettisten PCR seulonta. Kuten on esitetty S1 taulukossa ja kuviossa 4A, A549 /dx solut eivät poikkea A549-solujen ilmentämiseen

JAK1-2-3

, mutta oli korkeampi ilmentyminen

STAT1

ja

STAT3

. Sopusoinnussa tämän suuntauksen, klassinen STAT1- ja STAT3-kohdegeenien (

A2M

,

BCL2L1

,

CDKN1A

,

CRP

,

CXCL9

,

FAS

,

IRF1

,

JUNB

,

MMP3

,

MYC

,

NOS2

,

SOCS1

) kasvoi-säännelty moniresistentti solut (S1 taulukko). Western-blottauksessa validointi, löysimme samalla tasolla koko JAK1 proteiinin kokosolulysaateista A549 ja A549 /dx-soluja, mutta korkeampi aktiivisen tyrosiini-fosforyloituu JAK1 on monilääkeresistenttien solujen (kuvio 4B). Määrät STAT1, fosfo (Tyr701) -STAT1, STAT3, fosfo (Tyr705) -STAT3 olivat myös korkeampi solunsalpaajaresistentti soluissa (kuvio 4B). MRNA taso STAT1 estäjän PIAS1 ollut merkitsevää eroa A549 ja A549 /dx soluja (S1 taulukko ja kuvio 4A), ja taso PIAS1 proteiini oli sama tumauutteiden (kuvio 4C). Sitä vastoin, ydin- määrä STAT3 inhibiittorin PIAS3 oli pienempi A549 /dx-soluissa (kuvio 4C); Tämä oli linjassa alemman tason

PIAS3

mRNA (S2 taulukko). Mielenkiintoista on, että STAT1, fosfo (Tyr701) -STAT1, STAT3, fosfo (Tyr705) -STAT3 olivat kaikki enemmän kulkeutua tumaan monilääkeresistenttien solujen (kuvio 4C). Tämä malli, joka johtuu todennäköisesti suurempi määrä ja fosforylaation STAT1 /STAT3 ja alempaan ilmaus PIAS3, sai meidät oletuksen, että STAT1- ja erityisesti STST3-kohdegeenien pitäisi olla ajan säännelty moniresistentti soluja.

. CDNA A549 ja A549 /dx solut analysoitiin PCR array spesifinen JAK /STAT signalointi, niiden tietojen perusteella Materiaalit ja menetelmät. Taitteen sääntely 83 geenit analysoitiin ilmaistuna logaritminen, on edustettuna kolorimetrisen mittakaavassa. Luku on keskiarvo 4 kokeiluja. B. Solut hajotettiin ja suoritettiin Western blot-analyysi fosfo (Tyr 1022/1023) -JAK1, JAK1, fosfo (Tyr701) -STAT1, STAT1, fosfo (Tyr705) -STAT3, STAT3. * P * P * P * P * P 0,05, ** p * P * P