Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Technologies perustuu DNA mikrosiruja on potentiaalia antaa yksityiskohtaisia tietoja genomista poikkeamia kasvainsoluissa. Käytännössä suurin este havaitsemiseksi kvantitatiivisesti poikkeavuuksien heterogeenisyys kliinisen kasvainkudoksen. Koska kasvainkudoksessa poikkeuksetta sisältää geneettisesti normaaleja stroomasolut, tämä voi johtaa epäonnistumiseen havaita poikkeamia kasvainsolut.

Keskeiset löytäminen

Käyttämällä SNP array tietoja 44 ei-pienisoluinen keuhkosyöpä näytteet olemme kehittäneet bioinformatiikan algoritmi, joka tarkasti malleja fraktiot normaalien ja tuumorisolujen kliinisissä tuumorinäytteissä. Osuus normaalien solujen yhdessä SNP array tietoja voidaan käyttää havaitsemaan ja määrällisesti kopioluvun neutraali menettämisestä Heterotsygoottisuuden (CNNLOH) kasvainsoluissa sekä raakaöljyn kasvainkudoksessa ja näytteissä rikastettiin kasvainsolujen laserilla talteenotto mikrodissektion.

Johtopäätös

genominlaajuiset kvantitatiivinen analyysi CNNLOH käyttäen CNNLOH kvantisointi menetelmä auttaa tunnistamaan toistuvat poikkeavuuksien edistää kasvainten kehittymistä kliinisen kasvain näytteissä. Lisäksi, SNP-array perustuva analyysi CNNLOH voi tulla tärkeää havaita poikkeamia, joita voidaan käyttää diagnostisia ja prognostisia varten.

Citation: Göransson H, Edlund K, Rydåker M, Rasmussen M, Winquistin J, Ekman S, et ai. (2009) kvantifiointi Normaali Cell jae ja Kopioi numero Neutraali LOH in Clinical Keuhkosyöpä näytteitä SNP Array Data. PLoS ONE 4 (6): e6057. doi: 10,1371 /journal.pone.0006057

Editor: Jörg Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Saksa

vastaanotettu: 18 helmikuu 2009; Hyväksytty: 5 kesäkuu 2009; Julkaistu: 26 kesäkuu 2009

Copyright: © 2009 Göransson et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus oli osa avoimen tutkimusyhteistyötä tuetaan ja osittain rahoittama AstraZeneca, Alderley Park, UK. Teos tukivat myös lääketieteellisen tiedekunnan ja apteekki (Uppsalan yliopisto), Uppsalan yliopisto Hopsital, Akademiska Laboratory, Beijer säätiö, Wallenberg Consortium Pohjois ja Swegene. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, eikä päätös julkaista käsikirjoituksen. Andrew P. Thomas, joka on vanhempi tutkija AstraZeneca osallistui tarkistamiseen henkisen sisällön.

Kilpailevat edut: Tällä toinen kirjoittaja Andrew P. Thomas työskentelee AstraZeneca. Anders Isaksson ja Andrew P. Thomas pitää varastossa Astra Zeneca.

Johdanto

bioinformatiikka- algoritmeja on kehitetty käyttämään SNP array tietoja tunnistamaan genomista poikkeavuuksien kuten DNA kopioluvun muutoksia ja menettämisestä -heterozygosity (LOH), eli osuuksilla DNA yksinomaan homotsygoottista markkereita [1] – [8]. Kuitenkin yksi merkittävä haittapuoli näistä menetelmistä on, että geneettinen heterogeenisyys Tuumorinäytteissä aiheuttama seos syövän ja stroomasolujen, usein ei oteta huomioon. Tämän seurauksena aberraatioita usein ei havaita näytteissä oli suuri määrä geneettisesti normaalien solujen. Tämä saattaa osittain selittää, miksi huolimatta kertyminen suuria määriä genomista tietoa, kliinistä vaikutusta tällaisten analyysien diagnoosia varten on vielä pieni. Tuumorikudos edustaa seosta kasvaimen ja ei-kasvainsoluja, ts tulehdussolujen, strooman fibroblasteja ja solujen veren- ja imusuonten [9]. Osa normaaleja soluja usein suurempi osa kasvainsolujen potilaan tallennettuja näytteitä biopankeista (kuvio 1A). Tämä näyte heterogeenisyys vakavasti vaikuttaa kopiomäärä analyysi. Parhaan tietomme ei ole arvioita siitä, miten havaitsemisen herkkyyttä genomista poikkeavuuksien riippuu osuus normaalien solujen kliinisissä kasvain näytteissä. Yksi syy voi olla vaikea arvioida kasvaimen vs. normaali solusuhteen histologisesti mikroskopian heterogeeninen Tuumorinäytteissä jossa on vaihteleva määrä normaalien solujen eri puolilla näytteen. Lisäksi on puute yksimielisyys miten kasvainsolun pitoisuus kiinteässä syöpä olisi arvioitava ja selityksin. Siten suorituskyky nykyisen biomarkkerit perimän poikkeamia kliinisissä Tuumorinäytteissä on usein epävarmaa.

A) hematoksyliini-eosiinilla värjätään jäädytetty osan edustavan NSCLC tapaus analysoitu tässä tutkimuksessa (alkuperäinen suurennos 40 x) . Tuumorinäyte koostuu seoksesta, kasvainsolujen valkoinen nuoli, strooman kanssa verisuonen musta nuoli, tulehdussolujen, eli lymfosyytit punainen nuoli, ja jäljellä oleva keuhkojen alveoliin on täytetty makrofagien vihreä nuoli. B) poistaminen LOH. Normaalit solut on merkitty soikea solun muoto. Poistettu alue kasvainsoluissa (suorakulmainen solun muoto) on merkitty valkoiset ympyrät. Kaavamaisen kromosomiparia vain informatiivinen markkereita A mustaa ja B punaisen chromosme. Alla kukin kromosomi genotyypin alueella poisto on merkitty. Solut eri kopiomäärä genotyypit leimataan N

normaali, T

2 N, T

1N, ja T

0N. N osoittaa, että solu on normaali ja T, että SIS: tä kasvainsolu. Indeksit varten kasvainsolujen osoittavat DNA-pitoisuuden alueella on deletoitu. Koska nämä ovat kaikki solutyypit näytteessä suhteissa summa on yksi. C) Kopioi neutraali LOH. Tällöin kasvainsolujen kaikilla on 2N DNA-pitoisuus. Kuitenkin jotkut kasvainsolut ovat homotsygoottisia (tässä tapauksessa BB) alueen kohteisiin (T

Hom) ja toinen tyyppi on heterotsygoottinen AB (T

het). Summa jakeet solujen vastaa yhtä.

Äskettäin kehitetty työkalu otetaan näyte heterogeenisuus huomioon tunnistamiseksi kopioluvun valtioiden [10]. Se on suunniteltu tutkimuksissa pariksi näytteitä (kasvain ja normaali). Käytännössä kuitenkin, pariksi näytteet eivät ole useinkaan käytettävissä suuremmille potilasaineistoihin.

Toisessa tutkimuksessa Nancarrow et al visualisoida odotetaan jakautuvan alleelifrekvenssit riippuen vaihteleva määrä normaalien solujen kasvaimen näytteen simulaatioiden [11 ].

Toinen lupaava analyyttinen väline, AsCNAR, pystyy tunnistamaan LOH vaikka toinen kahdesta sekoitettu solulinjoista on läsnä ainoastaan ​​suhteessa noin 20% [12]. Äskettäin Assie et al kuvattu algoritmi, joka ottaa kasvain heterogeenisuus huomioon tunnistamisessa genomista poikkeamat näytteitä 40-75% syöpäsoluja [13].

Tutkimukset osoittavat, että kopiomäärä neutraali LOH voi olla mekanismi inaktivoitumisen kasvainten synnyssä [14]. Useat tutkimukset ja omat tiedot viittaavat siihen, että CNNLOH on yleisempää kuin aiemmin on ajateltu [15], [16]. Yhdessä tämä viittaa siihen, että CNNLOH voivat olla tärkeitä määritettäessä tiettyjen syöpä fenotyyppejä. Analysoida CNNLOH on genomin laajuisesti kasvainsoluissa heterogeenisissä näytteissä keskityimme 1) kehittää algoritmi määrittää osuus normaalien solujen näytteessä ja 2) määrittää CNNLOH koko genomin kasvainsoluissa. Tällainen kvantitatiivinen analyysi on potentiaalia tulla tärkeä työkalu molekyyli- syövän diagnostiikassa.

Tulokset

Strategia kvantifiointi CNNLOH heterogeenisissä Tuumorinäytteissä

kvantitoimiseksi CNNLOH heterogeenisessa tuumorinäytteistä alleeli-spesifisen signaalin panoksen eri tyyppisiä soluja on estimoitava. Kuvio 1 esittää tyypillistä solujen seoksesta jääleikkeille ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) kasvaimen näyte ja antaa kaavamaisen esityksen eri tyyppisiä soluja ja genotyyppien, jotka voivat olla läsnä, jos genominen deleetio tai CNNLOH. Muut genomista aberraatioita, mukaan lukien ne, jotka aiheuttavat korkeampia ploidian poikkeamia, voi myös esiintyä samassa lokuksessa kuin deleetion tai CNNLOH, mikä vaikeuttaa edelleen kuvan. Kuitenkin todennäköisyys tällaisten tapahtumien voidaan odottaa olevan vähäinen ja tässä tutkimuksessa ne on oletetaan olevan vähäinen verrattuna vaikutuksiin poistot ja CNNLOH.

osa normaaleja soluja voidaan tietyntyyppisille kasvaimet mitataan suoraviivaisella tavalla. Hematologisissa tuumorien osa normaaleja soluja voidaan mitata käyttämällä virtaussytometrialla käyttämällä informatiivinen pinnan markkereita. Kuitenkin, yhden solun suspensiot virtaussytometriaa on vaikea saada kiinteitä kasvaimia. Vaihtoehtoisesti automaattisesti tai manuaalisesti tunnistaa normaalit solut laskemalla ne

in situ

perustuu molekyylimarkkereina tai morfologiaa voidaan käyttää. Nämä menetelmät edellyttävät kehittynyttä kuvantamismenetelmiä tai aikaa vievää työtä koulutettu histopathologist. Tässä tutkimuksessa käytämme signaalin intensiteetin kahdesta SNP alleelien arvioida osa normaaleja soluja ja käyttävät näitä tietoja arvioida osuus kasvainsolujen CNNLOH.

kvantifiointi osuus normaalien solujen SNP genotyypitys array data

näytteissä, joissa osuus normaalien solujen on vaikea saada muilla keinoin, ryhdyimme arvioida osa normaaleja soluja SNP tietoja vain. Kuten on esitetty kuviossa. 1B osa soluista 2N DNA (C

2 N) alueilla, joilla on deleetioita on summa normaalien solujen (N

normaali) ja kasvaimen solut 2N DNA (T

2 N). Perusta CNNLOH kvantisointi tapa on käyttää alleelispesifinen signaalien A ja B kunkin lokuksen saada kokeellisen Allele B taajuuden (ABF), sellaisena kuin normalisoitu suhde B /(A + B), katso menetelmät. Johdettu ja graafinen ovat saatavilla muualla [17]. ABfs heterotsygoottisten informatiivinen merkkiaineiden monimutkaisissa Tuumorinäytteissä riippuvat kopiomäärä ja solukoostumuksesta näytteen. Ensimmäisessä vaiheessa ryhdyimme tunnistamaan osuutta C

2 N soluihin vertaamalla kokeellista ABfs ikkunassa peräkkäisiä SNP alueilla, joilla on mono-alleelinen poistot simuloitu data. Simuloinnit ottaa tekijät huomioon kuten keskiarvo Heterotsygoottisuuden, tuumorisolun kopiomäärä, kokeellisia vaihtelua ja koostumus Diploidisoluista ja syöpäsoluja. Kuvio 2 havainnollistaa, miten histogrammit havaittujen ABfs verrataan simuloituja histogrammit vaihtelevalla jakeet C

2 N Eukleideen etäisyyden. Histogrammi on pienin etäisyys havaittu histogrammin tunnistaa vastaavan C

2 N (kts. 2 ja menetelmät).

Kaksi esimerkkiä havaittujen ABF arvojen pitkin kromosomeja. Windows vähintään 140 peräkkäistä SNP markkereita käytetään keräämään alleelispesifinen tietoja pitkin kromosomi. ABF arvot kussakin ikkunassa on kuvattu havaitussa histogrammin. Seuraavassa vaiheessa havaittu histogrammin verrataan satoja simuloitu histogrammit, jossa osa heterotsygoottinen solujen on vaihdellut. Simuloitu histogrammin lyhin Euclidean etäisyys havaittu histogrammin yksilöidään todennäköisin osuus heterotsygoottinen solujen näytteessä (X%). Vertailu histogrammien käytetään sekä arvio osuus Diploidisoluista (C

2 N) alueilla, joissa kasvainsolujen on poistettu ja osuus heterotsygoottista soluja (C

het) in genomialuetta 2N syöpäsoluja. C

2 N ja C

het myöhemmin käyttää arvioimiseen osa normaalien solujen ja kvantifiointiin CNNLOH.

N

normaali ei saada suoraan arvion C

2 N. Koska normaalit solut voidaan olettaa olevan kaksi kutakin autosomi osuutensa ABF odotetaan olevan yhtä suuri kaikille autosomeiksi, kun taas lisärahoitusosuus T

2 N solut voivat vaihdella kasvain heterogeenisyys kunkin kromosomi . Niinpä näytteitä, jos kopioluku menetys havaitaan useaan kromosomien alimman arvion C

2 N varten kromosomissa on pienin panos 2N syöpäsoluja. Monissa tapauksissa, joissa poisto on aiheuttanut leviämisen etu osuudesta pienin C

2 N 2n kasvainsolut ovat ajan lähellä nollaa. Siksi tapauksissa, joissa tietoja useista kromosomeista on saatavilla, se voi olla perusteltua arvioida N

normaaleiksi pienin C

2 N.

validointi SNP array perustuu arvioihin verrattuna manuaaliseen laskenta normaalien solujen

menetelmää soveltaen 60 ei-pienisoluinen keuhkosyöpä näytteitä (katso menetelmä). Neljäkymmentä-neljä kuusikymmentä näytteistä (73%) täytti mielivaltaisin perustein, että vähintään kaksi aluetta kahdessa eri kromosomeissa vaihtelivat korkeintaan 5% niiden C

2 N arvioita ja joita voitaisiin käyttää antamaan arvio N

normaali (katso menetelmät). Kriteerit on asetettu ottamaan huomioon mahdolliset vaikutukset konstitutiivisen alleeliset kuvioita muistuttavia CNNLOH. Suurin osa 16 tapausta, joista ei arviota voitiin saada ei ollut kaksi poistoja.

Jotta vahvistaa arvioiden normaalin solun osa perustuu SNP dataa, satunnainen osajoukko 60 NSCLC näytteet olivat valitaan huolellisesti ja laaja mikroskooppisia laskenta normaalien ja tuumorisolujen jääleikkeille (katso menetelmät). Seitsemän näistä tapauksista päällekkäinen 44 tapausta, joissa N

normaali voitaisiin arvioida, Taulukko 1 esittää arvioita osa normaalien solujen saadaan käyttämällä SNP array tietojen ja manuaalinen laskenta perustuu morfologiaan näissä näytteissä. On hyvä sopimus saatujen tulosten välillä kahdella eri menetelmällä, mikä osoittaa, että SNP perustuva menetelmä antaa tarkkoja tietoja osa normaalien solujen Tuumorinäytteissä.

kvantitointi kopioluvun neutraali LOH keuhkossa syöpänäytteissä

on tarpeen määrittää osa normaaleja soluja läsnä kasvaimen näytteestä ennen tietojen SNP erilaisia ​​analyysi voidaan arvioida, mikä osa kasvainsoluista 2N DNA, joka on LOH eli CNNLOH. CNNLOH = T

hom /(T

hom + T

het). (Ks. 1 B). Tässä tapauksessa se on heterotsygoottinen kasvainsolut T

het että yhdessä normaalien solujen muuttavat alleelityypitys B taajuus homotsygoottinen kasvainsolujen kanssa LOH. Sillä CNNLOH alleelispesifisistä B taajuus informatiivinen markkereita riippuu heterotsygoottista soluissa C

het. Simuloitu histogrammit ottaen vaihtelevia jakeet heterotsygoottista soluja huomioon verrattiin histogrammit perustuvan ABF arvoihin liikkuvasta ikkuna, jossa on kiinteä määrä markkereita (kts. 2 ja menetelmät). Simuloitu Histogrammi muistuttaa eniten havaitun histogrammin, jonka tunnuksena vastaava osa heterotsygoottista soluja, C

het. Jos osa normaalien solujen N

normaali tunnetaan, CNNLOH voidaan laskea, koska 1 = N

normaali + T

hom + T

het. Osoittaakseen arvo CNNLOH kvantisointi menetelmän haimme sen joukko NSCLC näytteistä (katso menetelmät). Genominlaajuisten kvantitatiivisia mittauksia CNNLOH on esitetty kuvassa. 3. Voidaan todeta, että on olemassa toistuvia alueita, joilla on suuri astetta kopioluvun neutraali LOH. Yksi esimerkki kromosomissa 11 on esitetty kuviossa. 3. Tulevaisuudessa keskitytään selvittämiseen tärkeydestä kopioluvun neutraalin LOH tällaisilla alueilla varten kasvainten kehittymiseen. Vertailun CNNLOH analysoitiin myös 60 normaalissa vertailunäytteen (kts. S1).

A) kvantitatiivista tietoa kasvaimen LOH vaihtelee musta 0% punaiseksi 100% varten 22 autosomeiksi 43 ei-pienisoluinen keuhkosyövän näytteestä joka edustaa yhden rivin. Poistot on merkitty vihreät ja monistukset sinisellä. Alueet, joissa yli 10% näytteistä normaalissa referenssisarjassa oli CNNLOH yli 0,5 poistettiin juoni (katso menetelmät). Musta nuoli osoittaa esimerkki kromosomi 11, jossa on korkeampi taajuus kopioluvun neutraalin LOH (52%) kuin suurinta taajuutta 10% normaalissa referenssisarjassa.

kvantifiointi CNNLOH – vertailu FISH ja SNP tietojen

jotta tutkia tarkkuutta kvantifiointia CNNLOH halusimme verrata tuloksia, jotka saatiin itsenäisen menetelmällä. Gunnarsson et al ovat mitanneet pienet deleetiot 13q14 kasvainsolun valmisteiden kroonista lymfaattista leukemiaa (KLL) fluoresenssi in situ hybridisaatio (FISH) [18]. Kahdessa tapauksessa kasvainsoluissa oli hankkinut kaksi kappaletta kromosomi 13, jossa on sisäinen 13q14 poisto. Siten näissä tapauksissa osuus CLL-solujen kanssa nollan ja yhden FISH signaali edustaa homotsygoottinen ja heterotsygoottinen kasvainsoluja vastaavasti. Arvio CNNLOH kromosomissa 13 ulkopuolelle poistetun alueen 13q14 voidaan saada solujen osuus nolla signaalin 13q14 jaettuna summa mittasuhteet nolla ja yksi signaali. Johtuen liian vähän alueiden deleetioiden osuus normaalien solujen ei voitu saada SNP tiedot. Sen sijaan virtaussytometria tietoja Gunnarsson et al 2008 toimitti tiedot. Näin ollen, osuus normaalien solujen virtaussytometrialla ja SNP array tietoja kahta näytettä käytettiin määrittämään CNNLOH. Taulukossa 2 on esitetty arvioita CNNLOH saatu kahdella menetelmällä. Voidaan todeta, että vain arvioita poiketa 4 ja 6% kahdessa näytteessä, mikä osoittaa, että mittaus CNNLOH on tarkka.

kvantifiointi CNNLOH on vankka vaihteluista näytteen puhtaus

tärkeä edellytys kvantifiointiin CNNLOH on, että menetelmä olisi kestävä ja ei vaikuttanut osa normaalien solujen näytteessä. Jotta voidaan testata suorituskykyä algoritmia vaihteli osa normaalia solujen kasvaimen näytteestä rikastamiseksi kasvainsoluja. Viidessä tapauksessa 6 000-10 000 kasvainsolut valittiin laserilla mikrodissektion (katso menetelmät). Standard Affymetrix SNP erilaisia ​​analyysi suoritettiin DNA näistä kasvaimen sisältävien valmisteiden. Osa normaalien solujen ja kasvaimen LOH kopio määrä neutraalia alueet kvantitoitiin ja tuloksia verrattiin tuloksiin raakaa tuumorinäytteessä (Fig. 4). Mittaukset on CNNLOH raa’assa näytteiden näyttävät olevan erittäin yhdenmukaisia ​​vuonna mikropaloitelluista näytteissä. Jotta määrällisesti suorituskyvyn CNNLOH tunnistus päätimme laskea määrän kromosomisegmentit kuvassa. 4, joka oli kasvain LOH korkeampi kuin mielivaltaisesti kynnys, tässä tapauksessa 0,5 molemmissa näytteissä. Tämä menettely antaa karkean arvion kyky havaita CNNLOH. Taulukossa 3 esitetään suhde segmenttien lukumäärä, jotka havaittiin mikropaloitelluista näytteessä verrattuna koko näytteen. Suhde on lähellä yhtä kaikille näytteille, mikä osoittaa, että suunnilleen samat numerot segmenttien havaitaan riippumatta osa normaaleja soluja, jotka vaihtelivat välillä 1% ja 26%. Voidaan väittää, että osa normaalien solujen on niin pieni, että se on vaikea havaita mitään eroa paria näytteitä. Kuitenkin opiskelu luotettavuutta kopiomäärä havaitseminen voidaan todeta, että kolme paria näytettä (13A, 296A ja 319A) oli dramaattinen väheneminen (jopa 122-kertaisesti) segmenttien lukumäärän havaitaan pitäen kopioluvun poikkeavuuksia koko näyte (katso taulukko 3). Yhteenvetona analyysi CNNLOH näyttää olevan vankka, kun kopioluku tunnistus voidaan suuresti vaikuttaa jopa osuus normaalien solujen välillä 1-26%, joka on vaatimaton monenlaisille kliinisten kasvainten yksilöitä.

Viisi kasvainnäytteet 13A, 234A, 296A, 319A ja 367A analysoitiin kasvaimen LOH käyttäen molempia DNA tuore osien koko kasvain ja laser microdissected osista tuumorisektioiden rikastettua kasvain sisältöä. Aste kasvain LOH on tarkoitettu 200 kb chromosmal segmenttien väri vaihtelee mustasta (0%) tummanpunaista (100%) pitkin 22 autosomeiksi. Segmentit kanssa kopioluku aberraatioita on merkitty poistoja (vihreä) ja monistumiset (sininen). Huomaa laajentuneessa osassa 7. kromosomissa että CNNLOH mittaukset ovat approxiamately samanarvoisia paria kokonaisia ​​ja mikropaloitelluista kasvainnäytteissä.

Suorituskyky CNNLOH havaitsemisen simuloitu data seosten normaalin ja kasvaimen solut

CNNLOH kvantisointi menetelmä esitetään tässä voidaan tunnistaa CNNLOH ja määrittää, mikä osa kasvainsoluista, jotka on CNNLOH. Menetelmä näyttää olevan vahva vaihteluihin kasvainsolun sisällön kliinisistä näytteistä. Kuitenkin olisi myös kiinnostavaa verrata sen toimintaa muita menetelmiä. Tätä varten SNP array kerättiin kasvainsoluja mikropaloitelluista keuhkosyöpä näytteestä ja keuhkosyöpä kudoksen ulkopuolella kasvaimen samasta potilaasta. Näiden tietojen perusteella olemme simuloitu data seoksista normaalien ja tuumorisolujen. Jotta voidaan mitata suorituskykyään herkkyys ja käytimme LOH havaita pariksi analyysi kasvaimen näytteen ja sen normaalin hallinnan käyttämällä dChip kopioluvun 2 -alueilla kultakantaan määriteltyä CNNLOH. Halusimme vertailla CNNLOH kvantisointi menetelmää muihin menetelmiin käyttämällä myös alleeli-tietoja. Nämä menetelmät on osoitettu parempia genotyyppi-menetelmiä [13]. AsCNAR on yksi tällainen menetelmä, mutta nykyisin käytettävissä täytäntöönpano ei ole riittävän joustava käyttää tämäntyyppistä simuloidun datan. On toisaalta somatics menetelmä on suunniteltu datan Illumina SNP alusta, mutta voidaan sovittaa analysoimaan simuloitu tiedot perustuvat tietoihin Affymetrix alustalla. Siksi päätimme vertailla suorituskykyä CNNLOH kvantisointi menetelmää somatics (katso Menetelmät lisätietoja). Herkkyys ja spesifisyys menetelmiä eri pitoisuuksissa normaalien ja tuumorisolujen on esitetty kuvassa 5AB. Voidaan todeta, että CNNLOH kvantisointi on terävä herkkyyden lisääntyminen, yli 40% tuumorisoluja, joka johtuu siitä, että kynnys CNNLOH kutsuvan, joka vastaa murto-osa 35%: kasvainsoluja. CNNLOH kvantisointi on suurempi herkkyys on noin 90% verrattuna 60% ja somatics jakeet kasvaimen suurempi kuin noin 50% (ks. 5A). Spesifisyys on yleensä suurempi CNNLOH kvantisointi verrattuna somatics (ks. 5B). Herkkyys somatics oli pienempi kuin mitä on aiemmin raportoitu perustuvaan tietojen SNP array tietoja Illumina alustan [13]. Oletimme, että somatics algoritmi suorittaa eri tietojen tuottamat kaksi tasoa. Vuonna Gunnarsson et al sama DNA valmisteiden CLL kasvaimia analysoitiin molemmin 250K matriisia Affymetrix ja 317K matriisia Illumina [18]. Analysoimme molemmat aineistoja 9 CLL kasvaimista somatics ja totesi, että algoritmi tunnistaa enemmän CNNLOH käyttäen Affymetrix tiedot. Suhde ja pituus havaittujen CNNLOH alueille Affymetrix tietoja verrataan Illumina tietoja alue 1,9-36 (katso taulukko S1). Nämä ylimääräiset alueet CNNLOH avulla kuvatut Affymetrix data voi pitkälti olla vääriä positiivisia johtuen suuremmasta kokeellista kohinaa. Tällainen suuri määrä vääriä positiivisia olisi sopusoinnussa alhainen herkkyys somatics havaitsemista CNNLOH simuloidussa tiedot perustuvat Affymetrix tietoihin (ks. 5A).

Data vastaa vaihtelevia jakeet normaalin ja kasvaimen solut simuloitiin käyttäen tietoja normaaleista soluista ja mikropaloitelluista kasvainsoluja samasta keuhkosyöpä kasvain. Suorituskyky kaksi algoritmeja arvioitiin herkkyys (A) ja spesifisyys (B) verrattuna CNNLOH havaita dChip on pariksi analyysi SNP array tietojen normaalin ja kasvaimen soluihin.

Methods

Ethics selvitys

Tämä tutkimus suoritettiin periaatteiden mukaisesti ilmaistu Helsingin julistuksen ja hyväksyi alueellisen eettisen tarkastelun aluksella Uppsala (viitenumero 2006/325). Tarve hakea yksittäisiä suostumuksen kutakin potilasta luopunut eettisen arvioinnin aluksella, koska suurin osa potilaista tutkimuksen väestöstä ( 90%) oli kuollut alussa hankkeen, tutkimuksen tulokset eivät merkitse mitään lääketieteellisiä riskejä , ja tuloksia ei muuta tietoja potilaille, heidän perheensä tai muutoksen hallinnan. Menettely on täysin samaa mieltä Ruotsin Ethical Review Act.

Tuumorinäytteet histologinen arviointi kasvainsolun sisällön ja DNA: n valmistus

tuore ihmisen NSCLCs saatiin Uppsalan Fresh Tissue Biopankkiverkosto ja mukaisesti käytetyt Ruotsin biopankissa lainsäädäntöä. Kasvain näytteet olivat peräisin potilaita kohortin määritelty, että ne oli rekisteröity Uppsala /Örebro keuhkosyöpä rekisterin olevan NSCLC, oli jäädytetty kudos näytteen kudospankki ja todettiin eläessään. Asia tila todennettiin histopatologisia tarkastelu ja tutkiminen potilastiedot. Hematoksiliini-eosiini värjättyä kryoleikkeet (4 pm) valmistettiin jäädytetty lokakuu upotettu kasvainkudoksen lohkot ja tarkistetaan mikroskooppisesti kirurgisella patologi. Kuusikymmentä tapaukset, joiden arvioitu kasvainsolun pitoisuus yli 50% oli mukana tutkimuksessa. Jotta joissakin näistä näytteistä (taulukko 1) teimme huolellista manuaalista laskentaa kasvain ja normaalien solujen valomikroskoopilla käyttämällä verkkoja suurtehoisissa suurennuksen kentät (HPF). Vähintään 2000 solua laskettiin 5-10 eri alueilla jääleike koon ja heterogeenisuus kasvaimen näytteestä. Kunkin näytteen genomista DNA: ta uutettiin 5-10 jäädytetyt kudosleikkeet (10 pm) käyttäen QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen) mukaisesti valmistajan protokollan.

Laser Capture Microdissecion keuhkosyövän näytteiden

mikrodissektiomenetelmiä suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu, joissa on vähäisiä muutoksia [19]. 5 keuhkosyöpä näytettä, 12 um jääleikkeet valmistettiin, siirrettiin PALM kalvoon pinnoitettu lasi dioja, ja säilytettiin -80 ° C: ssa. Välittömästi ennen mikropreparoinnilla osat sulatettiin ja värjättiin hematoksyliinillä 2 minuuttia, jota seurasi kiinnittäminen sinkin fiksatiiviin 1 minuutti ja kuivuminen 1 minuutin 70% ja 95% vastaavasti etanolissa. Hyödyntämällä PALM Laser-Microbeam System, valitut kasvain alueita sisältäviä 6000-10000 solut microdissected ja siirrettiin avulla laser puls 15 ui DNA uuttopuskuria ATL (Qiagen) korkki on mikrofugiputkessa. DNA: n eristys suoritettiin sitten käyttämällä QIAamp DNA Micro Kit mukaan valmistajan protokollan (Qiagen).

Analyysi Affymetrix 250K SNP arrays

Array kokeet suoritettiin standardin protokollia Affymetrix GeneChip- ® Mapping 250K pakat (Gene Chip Mapping 500K Pitoisuus Manual (P /N 701930 Rev2.), Affymetrix Inc., Santa Clara, CA). Lyhyesti, kokonais-genomi-DNA pilkottiin restriktioentsyymillä (

nsP1

), ligoidaan sopivaan adapteri entsyymin, ja alistettiin PCR-monistus käyttäen yhtä aluketta. Sulattamisen jälkeen DNaasi I PCR-tuotteet, jotka on leimattu biotinyloidun nukleotidianalogi käyttämällä terminaalista deoksinukleotidyylitransferaasia ja hybridisoitiin microarray. Hybridisoitui koettimet vangiksi streptavidiini-fykoerytriinilla konjugaatteja ja lopuksi taulukot skannattiin. Laadunvalvonta QC, genotyyppi kutsuvan ja kopioluvun analyysit tehtiin Affymetrix GeneChip® genotyypin Analysis Software (GTYPE) 4.1. Dynamic Model (DM) algoritmia käytetään suorittamaan yhden näytteen QC. Laatukriteeristöä määritys 250K on Call Hinta 93% algoritmilla oletusarvot. Myöhemmät kopioluku analyysi suoritettiin käyttäen Hidden Markov Model saatavilla Copy Number Analysis Tool (CNAT) 4.0.1 seuraavin parametriasetukset: Transition decay 5 Mb, mediaani normalisointi ja 0,3 Mb tasoitus tekijä. Viittaus joukko käytetty koostui 96 CEU näytteitä HapMap hanke (www.hapmap.org/downloads/raw_data/affy500k/).

kvantifiointi osa normaalien solujen

Ensimmäisessä vaiheessa genomialuetta päätellä sisältävän mono-alleelinen deleetiot, tunnistettiin käyttämällä Affymetrix Software CNA 4.0.1, kuten edellä on kuvattu. Sen arvioimiseksi osa soluista 2N genomista sisältöä, C

2 N, alleelispesifinen tietoja käytettiin. Affymetrix SNP raakadataa normalisoitui ohjelmistossa dChipSNP käyttäen mallipohjainen ilmaisun menetelmä ja taustan vähentäminen, jossa käytetään epäsuhta antureista (PM /MM erotus) [6]. Normalisoitu signaaleja käytettiin sitten laskea alleeliset intensiteettisuhteet R

i kullekin SNP (R

i = B /(A + B)). Ottaa huomioon, että sama määrä A- ja B-alleelit voivat tuottaa erilaisia ​​signaaleja määrityksessä alleelinen suhteet normalisoitiin alleeli B taajuudet (ABF) tietylle SNP locus tietyssä näytteessä interpoloi tunnetuista alleelifrekvenssien kolmen genotyyppien (0, 0,5 ja 1,0), koska johdettu ja graafisesti Peiffer

et al

2006 [17]. Lyhyesti ABF tietylle SNP

i

laskettiin seuraavasti: missä R

i on alleelinen voimakkuus suhde ja m

AA, AB, BB ovat keskiarvo alleeliset intensiteetti suhteet viittaus väestö, tietylle SNP. Viittaus sarja oli sama kuin kuvattiin kopioluvun analyysiä edellä. Vain SNP jossa AB puhelu oli läsnä vertailupopulaation käytettiin. SNP-kohtien, joissa ei ole homotsygoottisia puhelut olivat käytettävissä, keskimääräinen AA tai BB signaalin kaikkien SNP näytteet perusjoukon sijasta.

histogrammi alleelispesifinen Allele B taajuus tietoja markkereita jokaisessa autosomi kopio numero menetys laskettiin. Havaitut Histogrammi verrattiin simuloituja histogrammeja vaihteleviin jakeet C

2 N. C

2 N Samanlaisimman histogrammi on yksi todennäköisimmin ovat johtaneet havaittujen tietojen (ks. 2). Simuloinnit kuvaavat vaihtelu ABF vaihtelun vuoksi signaalit A ja B alleelit piirtämällä A ja B signaalit normaalijakaumat arvioitiin alueilta kopio numero 2. keskiarvo ja varianssi jakaumat olivat (0, 0,015) alleelin A (0,995, 0,015) alleelin B. keskimääräinen aste heterotsygoottisuuden arvioitiin kopiomäärä 2 alueilla 36,7%. Simuloitu ABF-arvot laskettiin summana simuloitu alleelityypitys B signaalien summa jaettuna alleelin A ja B signaalit soluista säveltää virtuaalinen näyte. Esimerkiksi kun simuloidaan näytteitä, joilla on korkeampi jakeet 2N solujen osuus simuloidun solujen sekä A että B-signaalit on myös lisääntynyt. Jos haluat säilyttää keskimääräinen aste Heterotsygoottisuuden ja saada stabiileja histogrammeja ne perustuivat ABF arvot pariton määrä 14 848 simuloitu SNP loci (katso tarkempi kuvaus valinnan asetuksia teksti S1). Valitsemalla toinen on riittävän suuri määrä simuloituja lokusten tuottaisi hyvin samankaltainen histogrammit. Histogrammit normalisoitiin pinta-alayksikköä edustamaan odotettu malli jokaiselle 200 vaiheet, jotka vaihtelivat osa C

2N solujen välillä 0 ja 67%. Pienin Euklidinen etäisyys havaitut histogrammi ja histogrammit vaihtelevalla C

2 N tunnistettu osa todennäköisimmin ovat johtaneet havaittua alleelityypitys B taajuuskuviota.