Krooninen sairaus

tiivistelmä

Useat epidemiologiset tutkimukset ovat korreloivat käytön steroideihin kuulumattomien tulehduskipulääkkeiden (NSAID) vähäisempi riski munasarjasyöpä, kaikkein vaarallisin gynekologinen syöpä, diagnosoidaan yleensä loppuvaiheissa tauti. Olemme aiemmin todettu, että pro-apoptoottinen sytokiini melanoomaan erilaistumiseen liittyvän geeni-7 /interleukiini-24 (

MDA

-7 /IL-24) on tärkeä välittäjäaine NSAID-indusoidun apoptoosin eturauhas-, rinta-, munuais- ja mahasyöpä soluja. Tässä raportissa arvioitiin erilaisia ​​rakenteeltaan erilainen NSAID niiden tehot apoptoosin ja

MDA

-7 /IL-24 ilmentyminen munasarjasyöpäsoluja. Vaikka useat NSAID aiheuttaman apoptoosin, sulindaakkisulfidilla ja diklofenaakki voimakkaimmin aiheuttaman apoptoosin ja vähensi kasvainten kasvua. Näiden yhdistelmä aineiden tulokset on synergistinen vaikutus. Lisäksi

MDA

-7 /IL-24 induktio NSAID on välttämätön ohjelmoidun solukuoleman, koska esto

MDA

-7 /IL-24 Sirna kumoaa apoptoosin.

MDA

-7 /IL-24 aktivoituminen johtaa säätelyä kasvun pysähtymisen ja DNA-vaurioita indusoituva (GADD) 45 α ja γ ja JNK aktivointi. NF-KB-perheen transkriptiotekijöiden on liitetty munasarjasyövän kehittämiseen. Olemme aiemmin perustettu NF-KB /IKB signalointi olennaisena askeleena solun eloonjäämisen syöpäsoluissa ja arveltu, että kohdistaminen NF-KB voi voimistaa NSAID-välitteisen apoptoosin induktio munasarjasyöpäsoluja. Todellakin, yhdistämällä NSAID hoito NF-KB-inhibiittorit johti tehostetun apoptoosin. Tuloksemme osoittavat, että NF-KB yhdistettynä aktivointi

MDA

-7 /IL-24 ilmentyminen voi johtaa uuteen kombinatorinen hoito munasarjasyöpä.

Citation: Zerbini LF, Tamura RE, Correa RG, Czibere A, Cordeiro J, Bhasin M, et al. (2011) Kombinatoriset vaikutus steroideihin tulehduskipulääkkeitä ja NF-KB-inhibiittorit munasarjasyövässä Therapy. PLoS ONE 6 (9): e24285. doi: 10,1371 /journal.pone.0024285

Editor: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., Yhdysvallat

vastaanotettu: 12 huhtikuu 2011; Hyväksytty: 05 elokuu 2011; Julkaistu: 12 syyskuu 2011

Copyright: © 2011 Zerbini et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: RET on saajana ICGEB post doc apurahan. Tämä tutkimus tukivat National Institutes of Health myöntää 1R01 CA85467, P50 CA090381, P50 CA105009 ja Hershey Foundation (TAL), NIH avustukset 1R01 CA097318, 1R01 CA127641, P01 CA104177, Samuel Waxman Cancer Research Foundation (PBF) ja Yhdysvaltain puolustusministeriön avustukset PC051217 ja OC0060439 (LFZ). DS on Harrison Scholar in Cancer Research ja Blick Scholariin VCU Massey Cancer Center ja VCU School of Medicine. PBF pitää Thelma Newmeyer Corman Chair in Cancer Research in VCU Massey Cancer Center ja on SWCRF tutkija. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Munasarjasyöpä edustaa kaikkein vaarallisin gynekologinen syöpä ja 5

th johtava syy naisten kuolemaan liittyvät syöpään Yhdysvalloissa [1]. Myöhäinen diagnoosi on yksi tärkeimmistä esteistä hoitoon munasarjasyöpä, sillä lähes 70% naisista esiintyy pitkälle edenneessä sairauden diagnoosin [2]. Useat epidemiologiset tutkimukset ovat osoittaneet, että tulehduskipulääkkeiden käyttöön kliinisesti merkittävinä pitoisuuksina vähentää peräsuolen [3], rintojen [4] ja munasarjasyöpä riskit [5], [6], [7], vaikka kiista on edelleen [8], [9 ]. Yksi tärkeä tavoite NSAID toiminta on syklo (COX), jotka ovat vastuussa muuntaminen arakidonihapon happojen prostaglandiinien ja käyttää erilaisia ​​mekanismeja. Kaksi COX-geenit, COX-1 ja COX-2, ovat lähes identtiset; kuitenkin yksi olennainen ero on se, että COX-1 ekspressio on konstitutiivista, kun taas COX-2: n ilmentymisen indusoivat kasvutekijöiden ja tulehdusta edistävät [10]. NSAID on tyypillisesti luokiteltu erityiseksi COX-2-estäjät tai ei-spesifisiä COX-inhibiittorit. Munasarjasyövän COX-1, mutta ei COX-2 on havaittu olevan yli-ilmentyneen [11], [12], kuitenkin muut tutkimukset todettu, että COX-2 on myös ylösajettu [13], [14]. Korkean COX-1 ilmentymisen munasarjasyöpää vahvasti korreloi korkea endoteelikasvutekijä (VEGF) [15], [16], [17] ja tulehduskipulääkkeiden estää VEGF tuotantoa munasarjasyövän solulinjoissa [12], [18] osoittaa, että COX-1 voi säädellä VEGF ilme. Angiogeneesi ja VEGF ilmaisun ovat sekaantuneet vesivatsanes- muodostumiseen [19] ja etäpesäke munasarjasyövän [20], kun taas sen estäminen estää askites muodostumisen ja estää levitetään syövän kasvua [21].

edellinen tutkimus osoittaa, että NSAID myös aiheuttaa apoptoosin syöpäsoluissa indusoimalla

MDA

-7 /IL-24 ilmentyminen [22], joka parantaa ilmentymistä kaksi jäsentä kasvun pysähtymisen ja DNA-Damage 45 (GADD45) perhe [23]. GADD45 geeniperheen koodaa kolme rakenteellisesti erittäin luovan kasvun arrest- ja DNA-vaurioita-indusoituvia proteiineja, GADD45 α, β ja γ osansa G2 /M tarkastuspiste vastauksena DNA vaurioita [24]. Normaaleissa fysiologisissa olosuhteissa,

MDA

-7 /IL-24 ilmentyy soluissa immuunijärjestelmää ja normaali melanosyyttien [25]. Korkea

MDA

-7 /IL-24 on osoitettu erityisesti indusoivat apoptoosin syöpäsoluissa, ja siksi

MDA

-7 /IL-24 on tarkoitettu niin ”maaginen luoti” [26], [27]. Lisäksi useat tutkimukset osoittivat, että yli-ilmentyminen

MDA

-7 /IL-24 rekombinantti adenovirus aiheuttaa syöpäsolujen apoptoosin ja terapeuttisia etuja munasarjasyöpä [28], [29].

NF-KB /IKB signalointi on toinen polku, joka on ollut mukana lääkeresistenssin ja eloonjäämisen munasarjasyövän [30], [31]. NF-KB /IKB -systeemi nousemassa avainasemassa kasvainten synnyssä, invaasiota ja etäpesäkkeiden eri syöpiä [30], [31] ja on kriittinen vaihe syöpäsoluja paeta ohjelmoitua solukuolemaa [32]. Lisäksi vastus syöpäsolujen kemoterapeuttisten aineiden on liittynyt säätelemättömään NF-KB: n aktivaation [33]. Lisäksi olemme osoittaneet, että esto konstitutiivisesti aktiivisen NF-KB mukaan adenoviruksen ilmaus IKB indusoi apoptoosia syöpäsolujen ja estää kasvainten muodostumista SCID-hiirissä [34].

Tässä raportissa vertasimme laaja joukko tulehduskipulääkkeiden niiden tehot apoptoosin munasarjasyöpä soluja. Koska meidän edellinen tutkimus osoitti rooli

MDA

-7 /IL-24 in NSAID-välitteisen solukuoleman, myös arvioitava, ovatko apoptoosin induktion tulehduskipulääkkeiden johtuu induktion

MDA

-7 /IL-24 ilmentyminen. Viral toimitus

MDA

-7 /IL-24 on tällä hetkellä kliinisissä tutkimuksissa käytetty erilaisiin syöpiin [27]. Tunnistaminen lääkkeitä, jotka ovat tehokkaimpia

MDA

-7 /IL-24 induktio voi tarjota vaihtoehdon viraalisia hyödyntämiseksi antineoplastisia vaikutuksia

MDA

-7 /IL-24 . Meillä on myös arveltu, että yhdistämällä NSAID estäjien NF-KB-reitin voi voimistaa NSAID vastaan ​​munasarjasyöpä. Olemme siksi, testattiin farmakologiset inhibiittorit NF-KB-reitin niiden kykyä indusoida apoptoosia munasarjasyöpäsoluja. Tässä osoitamme, että sulindaakkisulfidilla ja diklofenaakki ovat voimakkaimpia NSAID indusoivien munasarjasyöpä apoptoosin kautta

MDA

-7 /IL-24 ilmentyminen ja myös vähentää kasvaimen kasvua

in vivo

.

MDA

-7 /IL-24 ilmentyminen johtaa GADD45α ja γ säätelyä ja JNK-kinaasin aktivaation. Useat farmakologiset NF-KB-inhibiittorit indusoivat myös apoptoosia munasarjasyöpäsoluja ja yhdistettynä NSAID voimistavat apoptoottista vaikutusta NSAID.

Tulokset

NSAID indusoivat

MDA

-7 /IL-24 ja apoptoosin munasarjasyöpäsoluja

laaja paneeli tulehduskipulääkkeiden testattiin kykynsä apoptoosin ja

mda-

7 /IL-24-geenin ilmentyminen neljässä munasarjan syöpäsolulinjoissa, SKOV-3, CAOV-3, SW626 ja 36m2. Pitoisuudet kaikkien tulehduskipulääkkeiden huumeita Tässä tutkimuksessa käytetyt valittiin verrattavissa saavutettavissa fysiologisia pitoisuuksia plasmassa [35] – [49]. Apoptoosi mitattiin 24 tuntia käsittelyn jälkeen SKOV-3, CAOV-3, SW626 ja 36m2 munasarjasyöpäsoluja tämän joukon tulehduskipulääkkeiden, paljastaen että erilaisia, mutta eivät kaikki tulehduskipulääkkeiden aiheuttaman apoptoosin (kuva 1a ja S1a). Tasaisen vahva indusoijien apoptoosin kaikissa neljässä-solulinjoissa mukana sulindaakkisulfidi, diklofenaakki, Ebselen ja naprokseeni verrattuna liuottimen valvontaa. Tulehduskipulääkkeiden johtanut merkittävään apoptoosin induktioon osajoukko munasarjasyövän solulinjoissa kuten sulindaakkisulfoni, Parasetamoli, aspiriini ja flurbiprofeeni taas käsittely NS-398, Ibuprofeeni, Finasteridi, flufenaamihappo ja Meloksikaami aiheutti ainoastaan ​​marginaalinen tai ei apoptoosin ( Kuva 1a ja S1a).

SKOV-3 solulinja hoidon jälkeen 5 mM aspiriini, 200 uM ibuprofeeni, 1 mM Parasetamoli, 200 uM naprokseeni, 200pM NS-398, 200 uM diklofenaakki, 50 uM Finasteride, 200 uM flufenaamihappo, 40 uM meloksikaami, 50pM Ebselen, 20 nM flurbiprofeeni, 50 uM sulindaakkisulfidilla ja 50 uM sulindaakkisulfonin tai DMSO kontrollina. (A) Apoptosis määritys munasarjasyöpäsoluja jälkeen NSAID-hoitoa. Tiedot tarkoittaa ± S.D. kolminkertaisten itsenäisen kokeen kullekin käsittelylle. (B) annos-riippuvainen apoptoosin tulehduskipulääkkeiden munasarjasyöpäsoluja. Apoptoosimäärityksessä ja SW626 munasarjasyöpäsoluja. Soluja käsiteltiin 50, 25, 10 ja 5 uM sulindaakkisulfidin; 200, 100, 40 ja 20 uM diklofenaakki; 200, 100, 40 ja 20 uM naprokseeni ja 50, 25, 10 ja 5 uM Ebselenin tai DMSO. Apoptoosi mitattiin 24 tunnin kuluttua altistuksesta. Tiedot tarkoittaa ± S.D. kolminkertaisten itsenäisen kokeen kullekin käsittelylle. (C) Reaaliaikainen PCR-analyysi

MDA

-7 /IL-24 ilmentyminen SKOV-3-soluissa 24 tunnin kuluttua hoidon eri tulehduskipulääkkeitä. Jokainen näyte normalisoitu hGAPDH. (D) Apoptosis määritystä CAOV-3 munasarjasyöpäsoluja jälkeen NSAID-hoitoa tai DMSO ja infektio lentiviruksen koodaus

MDA

-7 /IL-24 siRNA dupleksit. Tiedot tarkoittaa ± S.D. kolminkertaisten riippumaton tartunnan kunkin vektorin jokaisen hoidon.

Kunkin neljän parhaiten yhteen indusoijia apoptoosin määritimme pienin annos, joka edelleen indusoi ohjelmoidun solukuoleman munasarjasyöpä soluja. Pitoisuuksien valitun NSAID testattiin 2, 5 ja 10 kertaa pienempiä pitoisuuksia kuin fysiologisesti saavutettavissa annokset, joita käytetään kokeissa kuva 1a ja S1a. Apoptoosi mitattiin munasarjasyöpäsoluja 24 tuntia käsittelyn jälkeen eri annoksilla neljän tulehduskipulääkkeitä. Tuloksemme osoittavat, että sulindaakkisulfidi, diklofenaakki ja naprokseeni pitoisuudet jopa 5 kertaa pienempi annos silti tehokkaasti apoptoosin, kun taas Ebselen voidaan vähentää vain 2-kertainen (kuva 1b).

Koska meillä aiempien havaintojen muuntyyppisissä syövän me selvitettävä, apoptoosin induktion tulehduskipulääkkeiden korreloi

MDA

-7 /IL-24 induktio. Mittasimme mRNA ekspressiotasot

mda-

7 /IL-24-mRNA vastauksena eri tulehduskipulääkkeiden SKOV-3-soluista reaaliaikainen PCR-analyysi osoittavat tiedot

mda-

7 /IL-24 (enintään 12-kertainen induktio) ilmentyminen on yleisesti aiheuttama tulehduskipulääkkeiden jotka edistävät apoptoosia munasarjasyöpäsoluja (kuva 1c). Nämä tulokset tukevat myös kahdessa muussa munasarjasyövän solulinjoissa. In CAOV-3 ja SW626 munasarjasyövän solulinjoissa

mda-

7 /IL-24 on myös voimakkaasti indusoi (enintään 77-kertainen induktio CAOV-3-solut) (kuvio S1B). NSAID: t, jotka parantavat vahvasti apoptoosia, kuten sulindaakkisulfidi, naprokseeni, ebseleeni, ja diklofenaakki (kuvio 1 a) merkittävästi indusoi

MDA

7 /IL-24 ilmentyminen (kuvio 1c), kun taas NSAID: t, jotka vain marginaalisesti indusoi apoptoosia (kuvio 1a ) ei merkittävästi parantaa

MDA

-7 /IL-24 ilmentyminen paitsi ibuprofeeni joka indusoi

MDA

-7 /IL-24, mutta ei aiheuttanut apoptoosia (kuvio 1 c).

ja muut ovat osoittaneet, että yli-ilmentyminen

MDA

-7 /IL-24-infektion jälkeen adenoviruksen kuljettavat

MDA

-7 /IL-24-geenin indusoi apoptoosia ja estää soluproliferaatiota syöpäsoluissa [50], [51]. Sen arvioimiseksi, onko induktion apoptoosin syöpäsoluissa Tulehduskipulääkkeet riippuu

MDA

-7 /IL-24 voimistumista, teimme kokeiluja lentiviruksesta koodaa siRNA vastaan ​​

MDA

-7 /IL-24, joka oli aiemmin tuotettu ryhmämme [23]. Infektio SKOV-3-solujen kanssa

MDA

-7 /IL-24 siRNA lentivirus vähennetään indusoiman apoptoosin tulehduskipulääkkeiden 40-70% suhteessa kontrolliin lentivirukselle (kuvio 1 d), mikä tukee käsitystä, että NSAID- välittämää apoptoosia on ainakin osittain riippuvainen

MDA

-7 /IL-24 induktio. Samat tulokset havaittiin CAOV-3-soluja (tietoja ei esitetty).

synergistisiä vaikutuksia NSAID-yhdistelmä

Käyttäen pienintä annosta kunkin NSAID, joka vaikuttaa apoptoosia munasarjasyövän soluja (kuvio 1b ), me analysoidaan järjestelmällisesti apoptoosin upon yhdistämällä pieniä annoksia tulehduskipulääkkeitä. Paneeli tulehduskipulääkkeiden lukien diklofenaakki, sulindaakkisulfidi, naprokseeni ja Ebselen testattiin kykynsä apoptoosin yksin ja yhdistelmänä. SKOV-3 munasarjasyövän soluja käsiteltiin 10 uM sulindaakkisulfidi, 40 uM diklofenaakki, 25 uM Ebselen tai 40 uM naprokseeni ja niiden yhdistelmät. Apoptoosi mitattiin 24 tuntia käsittelyn jälkeen paljasti, että suurin osa yhdistelmien NSAID testatuista indusoiman apoptoosin merkittävästi enemmän kuin kumpikaan NSAID yksin munasarjasyöpäsoluja (kuvio 2a). Tietyt yhdistelmät kuten sulindaakkisulfidilla ja diklofenaakki, sulindaakkisulfidilla ja naprokseeni ja diklofenaakki ja naprokseeni olivat tehokkaampia apoptoosin induktion kuin toiset (kuva 2a). Me validoitu nämä tulokset CAOV-3 ja SW626 solulinjoissa (kuvio S2). Isobologrammi analyysillä käyttäen yhdistelmiä Diklofenaakki ja sulindaakkisulfidin osoittaa, että yhdistelmät lääkkeillä johtaa synergistinen vaikutus (kuvio 2b).

(A) Apoptosis määritys SKOV-3-soluja hoidon jälkeen 10 uM sulindaakkisulfidi, 40 uM diklofenaakki, 25pM Ebselen tai 40 uM naprokseeni ja niiden yhdistelmästä tai DMSO. Apoptoosi mitattiin 24 tunnin kuluttua altistuksesta. Tiedot tarkoittaa ± S.D. kolminkertaisten itsenäisen kokeen kullekin käsittelylle. (B) normalisoidut isobologram- saatu ohjelmisto Compusyn. CAOV-3-soluja käsiteltiin yhdistelmällä 5 uM sulindaakkisulfidin ja 20 uM diklofenaakki osoittaa synergistisen vaikutuksen.

NSAID hoito vähentää munasarjasyövän ksenograftin kasvun SCID-hiirissä

Sen määrittämiseksi, onko NSAID vähentää kasvaimen kasvua

in vivo

, SKOV-3 munasarjasyövän solua injektoitiin ihon alle SCID-hiirissä. Hiiret jaettiin satunnaisesti 3 ryhmään ja ruokitaan yksi kolmesta ruokavalion läpi koko kokeen: AIN-93G kontrollina ja AIN-93G ruokavaliota täydennetään joko 200 ppm sulindaakkisulfidilla tai 100 ppm diklofenaakki. Kaksi kuukautta myöhemmin eläimet tutkittiin kasvaimen muodostumisen ja tuumorin paino. Kaikki hiirille kehittyi kasvaimia osoittaa, että tämä tietty annos NSAID ei estä kasvaimen muodostumisen. Kuitenkin, kuten kuviosta 3 nähdään, sulindaakkisulfidi ja diklofenaakki pienensi kasvaimen keskimääräinen tilavuus 30% ja 20%, vastaavasti, verrattuna kontrolliin ruokavaliota p-arvo 0,05, vahvisti antituumoriteholla.

kunkin rokotus, 2 x 10

6 SKOV-3-soluja injektoitiin subkutaanisesti SCID hiiriin. Hiiret jaettiin satunnaisesti kolmeen ryhmään (n = 7 /ryhmä) ja syötetään yksi kolmesta ruokavalion läpi koko kokeen: AIN-93G kontrollina, AIN-93G ruokavaliota täydennetään 200 ppm sulindaakkisulfidilla tai AIN-93G ruokavalio täydennetty 100 ppm diklofenaakki. Koko kasvaimia ja tuumorin paino mitattiin sen jälkeen, kun 2 kuukautta. Arvot eivät jakavat saman kirjaimet ovat tilastollisesti merkitseviä p-arvot ainakin 0,05.

induktio GADD45 α ja γ geenien ilmentyminen ja aktivaatio JNK munasarjasyövän tulehduskipulääkkeiden

Olemme aiemmin raportoitu, että apoptoosin induktio NSAID liittyy tiiviisti induktion

MDA

-7 /IL-24 ilmentyminen ja näin ollen GADD45 α ja γ upregulation useissa syöpäsolulinjoissa [23]. Koska NSAID aiheuttaa

MDA

-7 /IL-24 ilmentyminen munasarjasyöpäsoluja (kuva 1c ja S1c), arvioimme muutosten GADD45 α ja γ geenin ilmentymistä.

Sen arvioimiseksi, onko sääntely GADD45 geenit on mukana NSAID-välitteistä apoptoosia, ilmaus GADD45 α ja y mRNA: t mitattiin reaaliaikaisella PCR: llä SKOV-3, CAOV-3, ja SW626-solut käsiteltiin NSAID. NSAID vahvin pro-apoptoottista aktiivisuutta myös sulindaakkisulfidi, diklofenaakki, naprokseeni ja Ebselen voimakkaasti parannettu GADD45 α ja γ ilmaisua, mikä osoittaa, että lisääntynyt GADD45 α ja γ ilmaisun läheisesti korreloi pro-apoptoottista aktiivisuutta tulehduskipulääkkeiden (kuvio S3a ja S3b). Lentivirusvektorikonstruktit ilmaus siRNA vastaan ​​

MDA

-7 /IL-24 in munasarjasyöpäsoluja osoitti, että knockdovvn

MDA

-7 /IL-24 vähentää diklofenaakin aiheuttamaa GADD45 α ja γ-geenin ilmentyminen osoittaa että GADD45α ja γ induktio on ainakin osittain riippuvainen

MDA

-7 /IL-24 ilmentyminen (kuvio S3C).

Koska muita ja olimme osoittaneet, että JNK aktivointi on rooli apoptoosin induktio syöpäsoluissa ja GADD45 α ja γ vuorovaikutuksessa ylävirtaan kinaasin JNK, MTK1 [52], arvioimme aktivointi JNK aikana NSAID-välitteisen apoptoosin. JNK-kinaasiaktiivisuutta testattiin proteiiniuutoksia saatu CAOV-3 ja Skov-3-solut käsiteltiin sulindaakkisulfidilla (50 uM), diklofenaakki (200 uM) tai DMSO: ssa 24 tunnin sisällä

in vitro

kinaasimääritys. Western blot analyysi paljasti hyvin vähän JNK aktiivisuutta käsittelemätön kontrolli-soluissa ja vahva kasvu JNK aktiivisuuden molemmissa solulinjoissa käsittelemällä sulindaakkisulfidilla ja diklofenaakki (kuvio 4a ja 4b). Vahvistavia nämä todisteet heikko indusoija

MDA

-7 /IL-24, GADD45 α ja γ ja apoptoosin, flurbiprofeeni, osoitti vain marginaalinen induktion JNK aktiivisuuden (tuloksia ei ole esitetty). Valaista toiminnallista merkitystä GADD45 α ja γ ja

MDA

-7 /IL-24 NSAID-välitteisen JNK induktio ja apoptoosin munasarjasyövän, JNK-kinaasiaktiivisuutta testattiin proteiiniuutoksia saatu

CAOV -3

solut käsiteltiin sulindaakkisulfidilla ja diklofenaakki ja tartunnan lentiviruksen koodauksen siRNA vastaan ​​GADD45 α ja

MDA

-7 /IL-24-geenien. Western blot analyysi paljasti JNK-kinaasin aktivoitumisen sulindaakkisulfidilla ja diklofenaakki oli selvästi riippuvainen GADD45 α ja

MDA

-7 /IL-24 induktio, koska JNK-kinaasiaktiivisuutta sulindaakkisulfidilla ja diklofenaakki käsitelty

MDA

-7 /IL-24 – /- solut poistettiin verrattuna

MDA

-7 /IL-24 + /+ -soluista (kuvio 4b). Jotta edelleen luonnehtia vaikutus tulehduskipulääkkeiden apoptoosin tasot PARP aktivaation mitattiin Western-blot, joka osoittaa, että sulindaakkisulfidilla ja diklofenaakki ovat voimakkaiden induktoreiden PARP pilkkominen (Kuva S4a).

(A ) Yhteensä lysaatti ennen Immunopresipitointi. (B) Kinaasimääritys osoittavat induktion JNK-kinaasiaktiivisuuden tulehduskipulääkkeitä. Induktio JNK aktivoitumisen sulindaakkisulfidilla ja diklofenaakki analysoitiin solulysaatteja SKOV-3 ja CAOV-3-solut käsiteltiin 50 uM sulindaakkisulfidi, 100gM diklofenaakki tai DMSO käyttämällä SAPK /JNK määritys Kit (Cell Signaling). (C) Western blot-analyysi käyttäen anti-fosfo JNK vasta solulysaatteja CAOV-3-solut käsiteltiin 50 uM sulindaakkisulfidi, 100gM diklofenaakki tai DMSO ja infektio lentiviruksen koodaus

MDA

-7 /IL-24 siRNA, GADD45α ja GFP duplexes.

Kombinatoriset hoitoon farmakologisen estäjiä NF-KB-reitin kanssa NSAID aiheuttaa apoptoosin munasarjasyöpäsoluja

Tutkimme biologista merkitystä NF KB-väylän munasarjasyöpäsoluja ja määritetään funktionaalinen seuraukset eston. Sen sijaan käyttää adenoviruksen toimituksen IKB estäjän muutimme kohti kliinisesti merkittäviä mallia ja käyttää farmakologisen estäjät NF-KB-reitin. Estäjät NF-KB-reitin testattiin niiden kykyä indusoida apoptoosia munasarjasyöpäsoluja. Apoptoosi mitattiin 24 tunnin kuluttua hoidon SKOV-3, CAOV-3 ja SW626 munasarjasyöpäsoluja neljä eri estäjien NF-KB: n, 5 nM 6-amino-4- (4-phenoxyphenylethylamino) kinatsoliini [53], 50 uM Isohelenin [54], 50 uM IKK-2-estäjän SC-514 [55], ja 200 uM IKK-inhibiittori II Wedelolactone (7-metoksi-5,11,12-trihydroksi-coumestan) [56] tai DMSO (kontrolli). 6-amino-4- (4-phenoxyphenylethylamino) kinatsoliini on tehokas apoptoosin indusoija kaikissa kolmessa solulinjoissa, ja IKK-inhibiittori II Wedelolactone (7-metoksi-5,11,12-trihydroksi-coumestan) indusoi apoptoosin kaksi kolme solulinjat. Käsittely Isohelenin tai IKK-2-estäjä SC-514 aiheutti ainoastaan ​​marginaalinen tai ei apoptoosin (kuva 5a). Lisäksi, Real-time PCR-analyysi osoittaa, että Wedelolactone (7-metoksi-5,11,12-trihydroksi-coumestan) indusoi voimakkaan aktivointi GADD45 α ja γ-geenin ilmentymistä (kuvio S4b), ja edistää JNK fosforylaatiota (kuvio S4c) ja pilkkominen PARP (kuva S4a).

(A) farmakologinen NF-KB-inhibiittorit indusoivat apoptoosin munasarjasyöpäsoluja. SW626, CAOV-3, ja SKOV-3-soluja hoidon jälkeen 5 nM 6-amino-4- (4-phenoxyphenylethylamino) kinatsoliini (6-amino), 50 uM Isohelenin, 50 uM IKK-2-estäjän SC-514, ja 200 uM IKK-inhibiittori II Wedelolactone (7-metoksi-5,11,12-trihydroksi-coumestan) tai DMSO: n ohjaus. Tiedot tarkoittaa ± S.D. kolminkertaisten itsenäisen kokeen kullekin käsittelylle. (B) annos-riippuvainen apoptoosin induktio NF-KB: n estäjien munasarjasyöpäsoluja. Apoptoosin määritystä SKOV-3 munasarjasyöpäsoluja. Soluja käsiteltiin 5, 2,5, 1 ja 0,5 nM 6-amino-4- (4-phenoxyphenylethylamino) kinatsoliini (6-amino) 50, 25, 10 ja 5 uM Isohelenin, 50, 25, 10 ja 5 uM IKK-inhibiittori II Wedelolactone (7-metoksi-5,11,12-trihydroksi-coumestan) (Wedelolactone), 50, 25, 10 ja 5 uM IKK-2-estäjän SC-514 tai DMSO: ssa. Apoptoosi mitattiin 24 tunnin kuluttua altistuksesta. Tiedot tarkoittaa ± S.D. kolminkertaisten itsenäisen kokeen kullekin käsittelylle. (C) apoptoosi munasarjasyöpäsoluja jälkeen NSAID-hoitoa yhdistettynä NF-KB-inhibiittorit. SW626, CAOV-3, ja SKOV-3-soluja hoidon jälkeen 10 uM sulindaakkisulfidi, 40 uM diklofenaakki, 25 uM Ebselen, 40 uM naprokseeni, 1 nM 6-amino-4- (4 phenoxyphenylethylamino) kinatsoliini (6-amino), ja 200 uM IKK-inhibiittori II Wedelolactone ja niiden yhdistelmästä. Apoptoosi mitattiin 24 tuntia käsittelyn jälkeen. Tiedot tarkoittaa ± S.D. kolminkertaisten itsenäisen kokeen kullekin käsittelylle. (D) Normalised isobologram- saatu ohjelmisto Compusyn. CAOV-3-soluja käsiteltiin yhdistelmällä 10 uM sulindaakkisulfidin ja 2,5 nM 6-amino osoittaa synergistisen vaikutuksen.

Kuten NSAID teimme annos-vaste-analyysi 6-amino-4- ( 4-phenoxyphenylethylamino) kinatsoliini ja Wedelolactone (7-metoksi-5,11,12-trihydroksi-coumestan) määrittää pienin annos, joka edelleen indusoi ohjelmoidun solukuoleman munasarjasyöpä soluja. Vähentäen konsentraatio 6-amino-4- (4-phenoxyphenylethylamino) kinatsoliini 5 nM 1 nM on vielä indusoiman apoptoosin, kun taas vähentynyt annokset Wedelolactone johti menetykseen apoptoosin induktion (kuvio 5b).

määrittämiseksi onko NF-KB: n estäjät 6-amino-4- (4-phenoxyphenylethylamino) kinatsoliini ja Wedelolactone (7-metoksi-5,11,12-trihydroksi-coumestan) parantaa pro-apoptoottisen toiminnan NSAID yhdistimme alimman annoksen kumpaakin neljä NSAID, sulindaakkisulfidi, diklofenaakki, Ebselen ja naprokseeni, jolla on pienin annoksina kaksi NF-KB: n inhibiittoreita, jotka edelleen aiheuttavat apoptoosia (kuvio 1 b ja 5b). NSAID ja NF-KB: n estäjät testattiin kykynsä apoptoosin yksin ja yhdistelmänä. SKOV-3, CAOV-3, ja SW626 munasarjasyövän soluja käsiteltiin 10 uM sulindaakkisulfidi, 40 uM diklofenaakki, 25 uM Ebselen, 40 uM naprokseeni, 1 nM 6-amino-4- (4 phenoxyphenylethylamino) kinatsoliinia ja 200 uM Wedelolactone . Apoptoosi mitattiin 24 tunnin kuluttua hoidon paljastaa, että yhdistelmät NSAID kanssa NF-KB estäjä 6-amino-4- (4 phenoxyphenylethylamino) kinatsoliinin merkittävästi parannettu apoptoosin munasarjasyöpäsoluja verrattuna joko lääkkeiden yksinään (kuvio 5c). Sen sijaan, Wedelolactone parannettu pro-apoptoottinen vaikutus vain joitakin NSAID-lääkkeiden ja vähemmän tehokkaasti SKOV-3-soluja (kuvio 5c). Isobologrammi analyysi osoittaa, että yhdistelmä 6-Amino-4- (4 phenoxyphenylethylamino) kinatsoliinin kanssa sulindaakkisulfidilla johtaa synergistinen vaikutus (kuva 5d).

Keskustelu

NSAID ovat nousseet mahdollisina lääkkeet kemopreventiolle syövän mutta niiden hyödyt ovat edelleen ko. Jotkut perinteiset NSAID kuten Sulindaakilla testataan parhaillaan kliinisissä kokeissa eri syöpiä. Todellakin, prekliinisissä tutkimuksissa tasaisen todisteita siitä, että NSAID voidaan tehokkaasti estää kasvainten synnyssä erityisesti syklo-2 (COX-2). Tärkeää on, aspiriinin käyttö on liittynyt pienentynyt riski kaukaisten rintasyövän uusiutumisen ja rintasyöpäkuolema [57].

Epidemiologiset tutkimukset osoittavat, käänteinen assosiaatioita käytön steroideihin kuulumattomien tulehduskipulääkkeiden (NSAID) ja ilmaantuvuus munasarjasyöpä [5], [6], [7]. Useat raportit viittaavat siihen, että tietyt NSAID apoptoosin ja solukierron pysähtymisen ihmisen munasarjasyöpäsoluja mutta tarkka molekyylitason mekanismi, jonka NSAID indusoi antitumorigenic toiminta ei ole selvä. Aiemmin meidän ryhmiä on kuvattu uudenlainen reitin, jolla tulehduskipulääkkeiden apoptoosin ja kasvun pysähtymisen syöpäsoluissa. Olemme osoittaneet, että induktio pro-apoptoottisten sytokiini MDA-7 /IL-24 NSAID on ratkaiseva ohjelmoidun solukuoleman aiheuttama NSAID [23]. Kuitenkin tässä tutkimuksessa ei ollut munasarjasyöpäsoluja.

Useat raportit käyttämällä adenovirus, joka koodaa

MDA

-7 /IL-24-geenin (Ad

MDA

-7 ) osoittavat syvän ja selektiivinen syövän vastaista aktiivisuutta eläinmalleissa [26], [27], [50], [58], [59], [60] mukaan luettuna raportti selektiivisesti solukuolema munasarjasyövän solujen, joka johtaa tukahduttaminen kasvaimen kasvun

in vivo

[58]. Kuitenkin tilapäisen ilmentymisen, mahdollisesti haitallisia immuunireaktioita (välittämiä adenovirus) ja ongelmia systeemisesti rajoittaa käyttö on yleistynyt adenovirus- toimituksen

MDA

-7 /IL-24, erityisesti kun sitä annetaan systeemisesti ei-replikoituva adenovirus.

tässä yhteydessä havaintomme että NSAID kanssa syövän vastaista aktiivisuutta indusoi korkeita

MDA

-7 /IL-24 in munasarjasyöpäsoluja tarjota uusi terapeuttinen strategia parantaa

MDA

-7 /IL-24 tasossa systeeminen tasolla. Todellakin, olemme saaneet kattavan yleiskuvan seurauksia koko paneelin NSAID on munasarjasyövän solujen selviytymistä vertaamalla niiden tehot apoptoosin ja

MDA

-7 /IL-24 ilmentyminen. Voimakkaimmat indusoijia

MDA

-7 /IL-24-geenin ilmentymisen kuuluvat sulindaakkisulfidilla ja diklofenaakki. Meidän havainto vastaa aiemmissa raporteissa, jotka osoittivat, että hoito ihmisen keuhkojen kasvain nude-hiirissä, joilla Ad-

MDA

-7 lisäksi Sulindaakilla vähensi kasvainten kasvua tehokkaammin kuin Ad-

MDA

– 7 [50]. Lisäksi nämä tulokset tukevat meidän aikaisempia havaintoja, apoptoosin induktio proapoptoottisten sytokiini

MDA

-7 /IL-24 välittää induktio GADD45 α ja γ ilmaisun ja JNK toimintaa muiden syöpien [23]. Vaikka sulindaakkisulfidilla ja diklofenaakki itse välttämättä ole ihanteellinen huumeiden aiheuttamaan

MDA

-7 /IL-24 ja apoptoosin munasarjasyöpäsoluja, ja erityisesti diklofenaakki herättää monia haittavaikutuksia potilailla, jotka rajoittavat sen käyttöä syöpäpotilailla , pitäisi olla mahdollista tuottaa muutettuja versioita näistä lääkkeistä, jotka ovat tehokkaampia niiden syöpälääkkeen toimintaa ja vähemmän haitallisia ja off-tavoite vaikutuksia. Itse muokattu versio Sulindaakilla on viime aikoina raportoitu olevan aktiivisia syöpäsoluja vastaan ​​estämättä COX 1 ja 2 [61].

Diklofenaakki on aiemmin osoitettu indusoivan apoptoosin paksusuolen ja okasolusyöpä ja estää haiman kasvaimen kasvua [62], [63]. On kuitenkin olemassa mitään raportteja sen käyttö munasarjasyövän. Tässä osoitamme, että diklofenaakki sekä sulindaakkisulfidilla apoptoosin ja estää kasvaimen kasvua munasarjasyöpä. Nämä pakottavia tiedot vahvistavat käsitettä mahdollisia hyötyjä NSAID-hoitoa varten munasarjasyöpä.

Havaitsimme myös naprokseeni ja Ebselen kohtalainen indusoijia apoptoosin ja

MDA

-7 /IL-24 ilmentyminen munasarjasyöpä soluja. Vaikka naprokseeni auttaa estämään virtsarakon ja paksusuolen syövän syntymistä [64], Ebselen on osoitettu vähentävän sisplatiinihoitoon myrkyllisyys rotalla munasarjasyövän malleja, parantaa antituumorivaikutuksen ja parantamalla kuolleisuutta, sairastavuutta ja tulos [65]. Kuten aiemmin mainittiin, olemme raportoineet, että induktio on

MDA

-7 /IL-24 rakenteellisesti eri NSAID on ratkaiseva apoptoosin induktion rinta-, eturauhas-, munuais- ja mahasyöpä solujen [23]. Kuitenkin tässä edellisessä tutkimuksessa, naprokseeni ja Ebselen oli vain marginaalinen vaikutus apoptoosin induktioon. Tässä raportissa havaitsimme erilaisia ​​huumeita varten naprokseeni ja Ebselen. Ebselen ja naprokseeni aiheuttaman apoptoosin ja

MDA

-7 /IL-24 ilmentyminen munasarjasyöpäsoluja ja myös synergized kanssa voimakkaampi tulehduskipulääkkeiden, diklofenaakki ja sulindaakkisulfidi, mikä viittaa siihen, mahdolliset kliiniset käyttökelpoisia munasarjasyövän hoidossa.

Olemme aiemmin osoittaneet, että NF-KB syöpäsoluissa kasvattaa apoptoosin edistämättä

MDA

-7 /IL-24 tuotantoa [23]. Yksi suurimmista transkription piirit osallisena tulehduksessa on NF-KB /IKB-reitin [66]. Lisäksi NF-KB on liitetty syövän solujen eloonjäämistä ja paeta ohjelmoidun solukuoleman ja aktivoidaan kemoterapeuttisten aineiden syöpäsoluja [30], [31], [33]. Mutaatiot eri geenien NF-KB-reitin ja konstitutiivisesti aktiivinen NF-KB havaitaan usein erityyppisiä syöpiä [33]. Todellakin, munasarjasyöpäsoluja usein aktivoituja NF-KB ennen hoitoa ja ne ovat siksi odotetaan olevan resistenttejä kemoterapiaa

a priori

. 5′CTGTCTAGACAAAAACTTTGTTCTCATCGTGTCATCTCTTGAATGACACGATGAGAACAAAGGGGGATCTGTGGTCTCATACA-3′.

Animal