Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

kinesiiniin perheenjäsen 4A (KIF4A), mikroputkeen-pohjainen moottori proteiini, oli mukana sääntelyn kromosomaalisesta rakenteesta ja Kinetokori mikrotubulusdynamiikan. Ottaen huomioon toimintojen KIF4A, on oletettu, että KIF4A on mukana etenemisen suun okasolusyöpää (OSCCs) aktivoinnin kautta kehräkokoonpanon tarkistuspiste (SAC). Kuitenkin tiedetään vähän merkitystä KIF4A käyttäytymisessä OSCC. Olemme tutkineet KIF4A ilmentymisen aseman ja sen toiminnan mekanismit OSCC.

Methods

KIF4A ekspressiotasot seitsemässä OSCC peräisin olevat solut analysoitiin kvantitatiivisella käänteistranskriptaasi-polymeraasiketjureaktiolla ja immunoblot -analyysejä. Käyttämällä KIF4A knockdown malli, arvioimme ilmaus (SAC) liittyvien molekyylien (BUB1, MAD2, CDC20, ja sykliini B1), solusyklin ja solujen lisääntymistä. Lisäksi

vitro

tiedot, kliininen korrelaatio KIF4A ekspressiotasot perusterveydenhuollossa OSCCs (n = 106 potilasta) ja ennusteeseen viittaavia tilan immunohistokemiallinen (IHC) myös arvioitiin.

Tulokset

KIF4A mRNA ja proteiini oli säädelty merkittävästi (

P

0,05) seitsemässä OSCC peräisin olevia soluja verrattuna ihmisen normaalia suun keratinosyyttien. Vuonna KIF4A pudotus solut, SAC aktivaatio havaittiin kautta lisääntynyt BUB1 ilme Kinetokori, sopiva Kinetokori lokalisointi MAD2, alas-säätely CDC20, ylössäätöä sykliini B1, ja solusyklin pidätettiin G2 /M vaiheessa. Tulokset osoittivat, että solujen lisääntymistä KIF4A Knockdown solujen väheni huomattavasti (

P

0,05) verrattuna kontrolli soluihin. IHC osoitti, että KIF4A ilmentymistä ensisijainen OSCCs oli merkitsevästi (

P

0,05) suurempi kuin normaalissa suun kollegansa ja että KIF4A-positiiviset OSCCs korreloivat tiiviisti (

P

0,05) kanssa kasvainten kokoa.

Johtopäätökset

tulokset ehdotti ensimmäistä kertaa, että KIF4A ohjaa solujen lisääntymisen kautta SAC aktivointi. Näin ollen, KIF4A voi olla keskeinen säädin kasvaimen etenemisen OSCCs.

Citation: Minakawa Y, Kasamatsu A, Koike H, Higo M, Nakashima D, Kouzu Y, et ai. (2013) kinesiiniin Perheenjäsen 4A: Mahdolliset Predictor varten eteneminen Human Oral Cancer. PLoS ONE 8 (12): e85951. doi: 10,1371 /journal.pone.0085951

Editor: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kiina

vastaanotettu: 6. kesäkuuta, 2013 Hyväksytty: 10 joulukuu 2013; Julkaistu: 30 joulukuu 2013

Copyright: © 2013 Minakawa et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kinesiiniin superperheen proteiinien (KIFS), luokitellaan 14 subfamilies, ovat ATP-riippuvaiset moottori proteiineja mikrotubulusten riippuvan plus-end motion kyky [1,2]. Mitoosin aikana, toiminta KIFS karan mikrotubulusten ohjataan tarkasti, jotta mitoottisiin tapahtumien järjestäjiä oikeassa järjestyksessä koko mitoosin [3,4]. Nämä proteiinit napojen mikrotubulusten hallita tasapaino ulospäin voimien ja sisäänpäin voimat varmistaa kromosomi talteenoton ja kiinnityksen karat ja estää karan venymään ennen Anaphase [5,6]. Niistä KIFS, KIF4A ohjaa kara organisaatio, kromosomi tasausta ja Kinetokori mikrotubulusdynamiikan proteiinin kanssa säätelijä sytokineesin 1 [4,7-13]. Häiriöstä KIF4A aiheuttaa epänormaalien kara erottaminen ja aiheuttaa aneuploidia- tytärsolujen [14,15]. Solut vaikuttaa aneploidy on ominaista voitto tai tappio geneettisen materiaalin. Ne ovat vahvasti epäillään liittyvän syövän etenemisessä [16]. Siksi me arveltu, että KIF4A saattavat liittyä syövän etenemisessä.

kehräkokoonpanon tarkistuspisteen (SAC) valvoo vuorovaikutukset Kinetokori ja karan mikrotubulushaarojen mitoosin aikana ja ohjaa metafaasissa-Anaphase siirtyminen kunnes kaikki kromosomit perustaa kaksiakselisen suuntaamisen. Siksi SAC on tärkeä rooli soluproliferaatiokokeessa kautta solusyklin valvontamekanismia, mikä on erityisen tärkeää oikeellisuudesta kromosomi erottelu [17-19]. Asianmukainen toiminta SAC edellyttää yhtenäistä toimintaa useiden Checkpoint proteiineista, ts bubR1: tä, Bub1, Bub3, MAD1, ja Mad2 [19-22]. Aktiivinen Checkpoint estää Anaphase edistää kompleksi /cyclosome (APC /C) pysähtymisen anafaasia [23-26]. Esto APC /C estää hajoamisen useiden keskeisten mitoosi proteiineja, jotka on hajonnut varten Anaphase aloittaa [23-28]. Läsnäolo irrallinen kromosomien tai puute karan jännitys, joka on normaalisti syntyy kaksisuuntainen kromosomin kiinnityksen johtaa edelleen Checkpoint aktivointi, mitoosi pidätys, ja lopulta ohjelmoidun solukuoleman [17-19,23-25]. Lisäksi SAC on raportoitu olevan viallinen useissa ihmisen syövissä, mukaan lukien suun kautta, peräsuolen, kilpirauhasen, ja munasarjasyövät, ja se liittyy syövän etenemisessä [29-32].

Koska suhde SAC ja KIF4A alkavat vasta ymmärtää, oletimme, että häiriöstä KIF4A osallistuu etenemisen suun squamous karsinoomia (OSCCs) aktivoimalla SAC [4,5,17 , 33,34]. Me raportoimme tässä, että poikkeava ilmentyminen KIF4A vuonna OSCCs oli toiminnallisesti ja kliinisesti liittyy kasvaimen kasvua ja että KIF4A voisi olla molekyyli- merkkiaine etenemisen OSCCs.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics Statement

Eettinen komitea Graduate School of Medicine, Chiba University hyväksyi tutkimussuunnitelman (hyväksymisnumero, 236). Tutkimus suoritettiin mukaisesti eettisiä Helsingin julistuksen. Kaikki potilaat toimitti kirjallisen tietoisen suostumuksensa.

OSCC johdettuja solu linjat ja kudosnäytteiden

Immortalisoidut ihmisen OSCC solulinjat (HSC-2, HSC-3, HSC-4, Ca9-22 , Sa3, HO-1-u-1, ja KON) saatiin Human Science Research Resources Bank (Osaka, Japani) tai RIKEN BRC (Ibaraki, Japani) kautta National Bio-Resource projekti opetusministeriön, Culture, Sports, Science and Technology (MEXT) (Tokio, Japani). Lyhyt tandem toista pro fi les con fi rmed solun identiteetti. Kaikki OSCC johdettuja soluja kasvatettiin Dulbeccon Modified Eagle Medium /F-12 HAM (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) täydennettynä 10% naudan sikiön seerumia (Sigma) ja 50 yksikköä /ml penisilliiniä ja streptomysiiniä (Sigma). Ensisijainen viljellyissä ihmisen normaalia suun keratinosyyttejä (HNOKs) käytettiin tavallisena ohjaus [35-40]. He olivat terveitä suun limakalvon epiteelin kerätyt näytteet nuorten potilaiden Chiba University Hospital. Kolme riippumatonta HNOKs olivat ensisijainen viljeltiin ja ylläpidettiin Oral Keratinosyyttien Medium (ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA), johon kuuluu 5 ml suun keratinosyyttikasvutekijäksi täydennys (ScienCell Research Laboratories) ja 5 ml penisilliini /streptomysiiniä ratkaisu (ScienCell Research Laboratories).

Sata kuusi ensisijainen OSCC näytteitä ja potilaan vastaaviin normaaleihin epiteelin saatiin leikkausten aikana suoritetaan Chiba University Hospital. Resektoitua kudokset fiksattiin 20% puskuroidussa formaldehydiliuosta patologista diagnoosin ja immunohistokemia (IHC). Histopatologiset diagnoosi jokaisen OSCC näytteistä suoritettiin Maailman terveysjärjestön kriteerien Department of Pathology of Chiba University Hospital [41]. Ennusteeseen viittaavia lavastus määritettiin TNM luokittelu International Union syöpää vastaan ​​[42]. Kaikilla potilailla oli OSCC joka oli histologisesti varmennettu, ja kasvainten tarkastettiin sen varmistamiseksi, että kasvainkudoksen oli läsnä yli 80% yksilöiden.

valmistaminen cDNA ja proteiini

eristettiin kokonais-RNA käyttämällä Trizol-reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. cDNA luotiin käyttäen 5 ug kokonais-RNA: OSCC solulinjat käyttäen Ready-To-Go You-Prime First-Strand helmiä (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) ja oligo (dT) alukkeen (Hokkaido System Science, Sapporo, Japani) mukaan valmistajan ohjeiden. Solut pestiin kahdesti kylmällä fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja sentrifugoitiin lyhyesti. Solupelletit inkuboitiin 4 ° C: ssa 30 minuuttia lyysipuskurissa (7 M urea, 2 M tioureaa, 4% paino /tilavuus CHAPS, 10 mM Tris, pH 7,4), jossa on proteinaasinestäjä cocktail (Roche, Diagnostics). Proteiinipitoisuus mitattiin BCA Protein Assay Kit (Thermo, Rockford, IL).

mRNA: n ilmentymisen analyysi

Reaaliaikainen kvantitatiivinen käänteistranskriptaasi-polymeraasiketjureaktiolla (qRT-PCR) suoritettiin käyttämällä LightCycler 480 laitetta (Roche Diagnostics, Mannheim, Saksa). Alukkeita ja universaali alukkeet suunniteltiin käyttämällä Universal Probe Kirjasto (Roche Diagnostics), joka erity fi es sopivin asetettu. Alukesekvenssejä käytetty qRT-PCR olivat:

KIF4A

, eteenpäin,

5′-TCTGTTTCAGGCTGCTTTCA -3 ’

; käänteinen,

5′-GCCCTG AAATATTTGATTGGAG -3 ’

; ja yleinen koetin 25, ja glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH), eteenpäin,

5′-CATCTCTGCCCCCTCTGCTGA-3 ’

; käänteinen,

5′-GGATGACCTTGCCCACAGCCT-3 ’

; ja universaali koetin 60. transkriptio määrä

KIF4A

arvioitiin asiaa koskevaa standardia käyrät ja normalisoidaan

GAPDH

transkriptio määritetyn määrän, joka vastaa näytteitä. Kaikki näytteet analysoitiin kolmena kappaleena ja kolme riippumatonta valmisteet RNA analysoitiin kustakin solulinjasta.

immunoblottaus-analyysi

proteiiniuutteet (20 gg) erotettiin natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi 4 -12% geeliä, siirrettiin nitroselluloosamembraaneille ja blokattiin 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa Blocking Yksi (Nacalai Tesque, Tokio, Japani). Membraanit inkuboitiin kanin anti-KIF4A polyklonaalista vasta-ainetta (Gene Tex, San Antonio, TX), hiiren anti-GAPDH monoklonaalinen vasta-aine (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), hiiren anti-CDC20 monoklonaalinen vasta-aine (Santa Cruz Biotechnology), ja kanin anti-sykliini B1 polyklonaalista vasta-ainetta (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) yön yli 4 ° C: ssa. Membraanit pestiin 0,1% Tween-20: Tris-puskuroitu suolaliuos, inkuboidaan sekundaarisen vasta-aineen ja piparjuuriperoksidaasiin konjugoitua anti-kani tai anti-hiiri-IgG: tä (Promega, Madison, WI) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Lopuksi kalvot todettiin käyttäen SuperSignal West Pico Chemiluminescent alustan (Thermo), ja immunoblottaus tehtiin näkyväksi valottamalla kalvojen ATTO Light-Capture II (ATTO, Tokio, Japani). Signaalin voimakkuudet kvantitoitiin käyttäen CS Analyzer versio 3.0-ohjelmisto (ATTO).

Transfektio shRNA plasmidilla

OSCC solujen linjat (HSC-3 ja Ca9-22) transfektoitiin KIF4A shRNA (shKIF4A ) tai kontrolli shRNA (shMock) vektorien (Santa Cruz Biotechnology) käyttäen Lipofectamine LTX ja Plus reagenssit (Invitrogen). Transfektion jälkeen stabiilit transfektantit eristettiin elatusaineesta, joka sisälsi 2 ng /ml puromysiinille (Invitrogen). Kaksi tai kolme viikkoa transfektion jälkeen, elinkelpoisia pesäkkeitä siirrettiin uusia ruokalajeja. shKIF4A ja shMock soluja käytettiin lisäkokeisiin.

Immunofluoresenssi

transfektantit maljattiin kammion dioja (BD Falcon, Franklin Lakes, NJ), 50% konfluenssiin, pestiin jääkylmällä PBS: llä ja kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä PBS: ssä 20 minuuttia, sitten läpäiseviksi PBS: ssä, joka sisälsi 0,2% Triton X-100, kuten aiemmin on kuvattu [43]. Käytimme seuraavia ensisijainen vasta-ainetta SAC aktivointi: kanin anti-KIF4A polyklonaalista vasta-ainetta (Gene Tex), hiiren anti-BUB1 monoklonaalinen vasta-aine (Santa Cruz Biotechnology), ja hiiren anti-MAD2 vasta-ainetta (Santa Cruz Biotechnology). Kiinnitettyjä soluja inkuboitiin blokkausliuosta, joka sisälsi 0,5% naudan seerumin albumiinia 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa ja inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla yli yön 4 ° C: ssa. Huuhtelun jälkeen PBS: llä, soluja inkuboitiin toissijaisen vasta-aineiden 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Toissijainen vasta-aineet olivat fluoreseiini-konjugoitu anti-kani-IgG-vasta-ainetta (Vector Laboratories, Burlingame, CA) ja Texas-Red-konjugoidulla anti-hiiri-IgG-vasta-ainetta (Vector Laboratories) inkuboitiin 1 tunti huoneenlämpötilassa pimeässä. Lopuksi leikkeet pestiin kolme kertaa PBS: llä ja asennettu käyttämällä Asennus Medium DAPI (Vector Laboratories). Immunofluoresenssitutkimukset suoritettiin konfokaalimikroskopiaa ja analysoitiin Fluoview ohjelmisto (Olympus Optical, Tokio, Japani).

Cell-kaarianalyysin

synkronoida solut G0 /G1 tai G2 /M siirtyminen solut vietiin seerumia 48 tunnin ajan tai käsiteltiin 200 ng /ml nokodatsoli (Sigma) 20 tuntia [44,45]. Määrittämiseksi solukierron jakelu, solut kerättiin, pestiin PBS: llä, ja tutkittiin CycleTEST Plus DNA reagenssipakkauksen (Becton-Dickinson, San Jose, CA) valmistajan protokollan. Virtaussytometrinen määritys DNA-pitoisuus analysoitiin BD AccuriTM C6 -virtaussytometrillä (Becton-Dickinson). Fraktioiden solut G0-G1, S ja G2-M-vaiheisiin analysoitiin käyttäen FlowJo ohjelmistoa (Tree Star, Ashland, OR).

Cellular kasvun

transfektantit ympättiin kuuden-kuoppalevyille tiheyteen 1 x 10

4 elävää solua kuoppaa kohti. Solut kerättiin 168 tuntia, ja lasketaan 24 tunnin välein. Ilmoitettuina ajankohtina solut trypsinoitiin ja laskettiin käyttäen hemosytometria kolmena kappaleena näytteissä.

IHC

IHC suoritettiin 4-um: n osat parafiiniin upotettu näytteitä käyttäen kaniinin anti-KIF4A polyklonaalinen vasta-aine (Gene Tex). Lyhyesti, sen jälkeen, kun deparaffinization ja nesteytys, endogeeninen peroksidaasiaktiivisuus pysäytettiin 30 minuutin inkuboinnin seokseen, jossa oli 0,3% vetyperoksidiliuosta 100% metanolia; kohdat blokattiin 2 tunnin ajan huoneen lämpötilassa 1,5% esto seerumia (Santa Cruz Biotechnology) PBS: ssä ennen reagoimaan anti-KIF4A-vasta-ainetta 4 ° C: ssa kosteassa kammiossa yön yli. Kun inkubaatio primaarisen vasta-aineen, näytteet pestiin kolme kertaa PBS: ssä ja käsiteltiin Envision reagenssilla (DAKO, Carpinteria, CA), minkä jälkeen värin kehittyminen on 3,3′-diaminobentsidiinitetrahydrokloridilla (DAKO). Objektilasit sitten oli hieman vasta- värjättiin hematoksyliinillä, kuivattu etanolilla, puhdistetaan ksyleenillä, ja asennettu. Epäspesifinen sitoutuminen vasta-aineen proteiineille, muu kuin antigeenin joskus tapahtunut. Negatiivisena kontrollina, kolmena kappaleena leikkeet immunovärjättiin ilman altistumista primaarisilla vasta-aineilla, jotka vahvistivat värjäyksen spesifisyys (kuvio S1A). Kvantifioimiseksi tilan KIF4A proteiinin ilmentymistä näitä komponentteja, käytimme IHC pisteytysjärjestelmät kuvattu aiemmin [39,40,46-49]. Yhteenvetona, keskimääräinen prosenttiosuudet positiivisten kasvainsolujen määritettiin vähintään kolmessa satunnaisesti kentät 400 x suurennus kussakin osassa. Intensiteetti KIF4A-immunoreaktiotuotteen pisteytettiin seuraavasti: 0+, ei mitään; 1+, heikko; 2+, kohtalainen; ja 3+, voimakas. Solu numero ja värjäytymisen intensiteetti oli kerrottu tuottamaan KIF4A IHC pisteet. Mietimme värjäytymisen intensiteetti Lihassoluissa, jotka olivat positiivisia kontrolleja varten KIF4A (kuvio S1B). Tapaukset, joissa on KIF4A IHC pisteet yli 95,0 (+3 keskihajonta [SD] sijoituksen normaalia kudosta) määriteltiin KIF4A-positiivisia. Poikkesi ± 3-SD sulku, joka tilastollisesti vain 0,2% mittauksen voisi odottaa laskevan tämän alueen ulkopuolella, käytettiin koska se tuskin vaikuttaa satunnainen kokeellinen virhe tuotettu näytteen manipulointi [50]. Kaksi itsenäistä patologia Chiba University Hospital, joista kumpikaan ei ollut mitään tietoa potilaan kliininen tila, teki nämä tuomiot.

Tilastollinen

välisessä vertailussa KIF4A ekspressiotasoja, tilastollista merkittävyyttä arvioitiin Mann-Whitneyn U-testiä. Väliset suhteet KIF4A-immunohistokemiallinen värjäys tulokset ja kliinis profiilit arvioitiin χ

2 testiä, Fisherin testiä, ja Mann-Whitneyn U-testiä.

P

0,05 pidettiin merkittävänä. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskivirhe keskiarvon (SEM).

Tulokset

arviointi KIF4A ilmentymisen OSCC johdettuja solu linjat

tutkimiseksi mRNA ilmaus

KIF4A

, suoritimme qRT-PCR-analyysi käyttäen seitsemää OSCC johdettuja solu linjat (HSC-2, HSC-3, HSC-4, Ca9-22, Sa3, Ho-1-u-1, ja KON) ja HNOKs.

KIF4A

mRNA oli säädelty merkittävästi kaikilla OSCC johdettuja solu linjat verrattuna HNOKs (kuvio 1A). Data ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM kolmena kappaleena tulokset (

P

0,05). Olemme myös suorittaa immunoblottaus analyysi tutkia KIF4A proteiinin ilmentymisen tila OSCC johdettuja solu linjat ja HNOKs (kuvio 1 B). Merkittävä kasvu KIF4A proteiinin ilmentyminen havaittiin kaikissa OSCC solujen linjat verrattuna HNOKs. Expression analyysi osoitti, että sekä transkriptio ja kääntäminen tuotteita tämän molekyylin olivat erittäin ilmaistaan ​​OSCC johdettuja solu linjat.

(A) kvantifiointi KIF4A mRNA: n ekspression OSCC johdettuja solu riviä qRT-PCR-analyysillä. Merkittäviä lisäävä säätely KIF4A mRNA nähdään seitsemän OSCC johdettuja solu linjat verrattuna HNOKs (

P

0,05, U-testi). Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± SEM kolmena kappaleena tuloksia. (B) immuuniblottausanalyysi KIF4A proteiinin OSCC johdettuja solu linjat ja HNOKs. KIF4A proteiinin ilmentymistä ajan säännelty OSCC johdettuja solu linjat verrattuna että HNOKs. Densitometrinen KIF4A proteiini Aineisto on normalisoitu GAPDH-proteiinin tasoja. Arvot ilmaistaan ​​prosentteina HNOKs (

P

0,05, U-testi).

perustaminen KIF4A pudotus solujen

Koska KIF4A ilme oli ajan säännelty OSCC solujen linjat, loimme KIF4A knockdown soluihin käyttäen shRNA teknologioita. HSC-3 ja Ca9-22 solut transfektoitiin KIF4A shRNA (shKIF4A) ja ohjaus- shRNA (shMock) plasmidit. Ekspressiotasot KIF4A mRNA: ta ja proteiinia shKIF4A solut olivat merkittävästi alemmat kuin ne, jotka shMock soluissa (HSC-3 ja Ca9-22 johdettu transfektanttien) (kuvio 2A, B) (

P

0,05) .

(A) qRT-PCR osoittaa, että KIF4A mRNA: n ilmentymisen on shKIF4A soluissa (HSC-3-ja Ca9-22 johdettu transfektantit, 2 kloonit kukin) on huomattavasti pienempi kuin shMock soluissa (

P

0,05, U-testi). (B) Immunoblottaus analyysi osoittaa, että KIF4A proteiini tasot shKIF4A-transfektoiduissa soluissa (HSC-3- ja Ca9-22 johdetut transfektantit; 2-kloonit kukin) on myös vähentynyt merkittävästi verrattuna että shMock soluissa (

P

0,05, Mann-Whitney U-testi).

aktivointi SAC

tutkimiseksi mekanismi, jonka KIF4A liittyy SAC, teimme immunofluoresenssianalyysillä varten kara-tarkastuspiste proteiini (BUB1) ja tarkistuspisteen anturin proteiini (MAD2). BUB1 todettiin kondensoitiin kromosomien shKIF4A soluissa, mutta ei paikallistettu Kinetokori on shMock soluissa (kuvio 3A). MAD2 on paikallistettu Kinetokori on shKIF4A soluja, kun taas Kinetokori lokalisointi ei nähty shMock soluissa (kuvio 3B). Suora kohteena SAC aktivointi on CDC20, joka on aktivaattori anafaasia edistävän kompleksin /cyclosome (APC /C) [23-26]. Lisäksi sykliini B1 on kriittinen säätelijä G2 /M-etenemistä ja M-G1 siirtyminen [27]. Arvioida M vaiheen pysähtymisen aktivoimalla SAC, myös suoritetaan immunoblottaus CDC20 ja sykliini B1, ja virtaussytometria-analyysiä. Kuten odotettua, kun taas CDC20 merkittävästi alassäädetty, sykliini B1 oli säädellään ylöspäin shKIF4A soluissa (kuvio 4A). Lisäksi prosenttiosuus G2 /M-vaiheen shKIF4A soluissa oli merkittävästi (P ​​ 0,05) korkeampi kuin shMock soluissa (kuvio 4B). Nämä tulokset osoittivat, että alas-säätely KIF4A saattaa aiheuttaa solusyklin pidätyksen tai viivästys M vaiheessa kautta SAC aktivaation.

lokalisaatio BUB1 ja MAD2 että Kinetokori verrataan shKIF4A ja shMock solujen immunofluoresenssilla. (A) BUB1 on Kinetokori kasvanut shKIF4A soluissa verrattuna että shMock soluissa (vihreä, KIF4A, punainen, BUB1, sininen, DNA). (B) Asianmukainen paikallistaminen MAD2 nähdään shKIF4A soluissa, kun taas Kinetokori lokalisointi ei nähty shMock soluissa (vihreä, KIF4A, punainen, MAD2, sininen, DNA).

tutkimiseksi SAC aktivointi ja solusyklin etenemisen, määritimme ekspressiotasot CDC20 ja sykliini B1, ja DNA-pitoisuus G0-G1, S ja G2-M-vaiheisiin. (A) shKIF4A solut osoittivat alas-säätely CDC20 ja ylös-säätely sykliini B1 (HSC-3- ja Ca9-22 johdetut transfektantit; 2-kloonit kukin) verrattuna shMock soluihin (

P

0,05 , U-testi). (B) virtaussytometrinen analyysi suoritettiin tutkimaan solusyklin shKIF4A ja shMock soluja. Prosenttiosuus G2 /M-vaiheen shKIF4A soluissa (HSC-3- ja Ca9-22 johdetut transfektantit, 2-kloonien kunkin) on kasvanut selvästi verrattuna shMock solut (

P

0,05, Mann-Whitneyn U-testi).

Alennettu solujen kasvua KIF4A pudotus soluissa

vaikutuksen arvioimiseksi KIF4A knockdown solu- kasvuun, teimme solujen lisääntymisen määrityksessä. shKIF4A ja shMock solut ympättiin kuudella-kuoppalevyille tiheyteen 1 x 10

4 elävää solua /kuoppa, jotka laskettiin 168 tuntia. Oli merkittävä (

P

0,05) lasku solujen kasvua shKIF4A solujen verrattuna shMock soluja (kuvio 5).

vaikutuksen määrittämiseksi shKIF4A on soluproliferaatioon shKIF4A ja shMock solut ympättiin kuudella-kuoppalevyille tiheyteen 1 x 10

4 elävää solua /kuoppa. Molemmat transfektantit laskettiin seitsemän päivää yhtäjaksoisesti. Solu kasvu shKIF4A-transfektoiduissa soluissa (HSC-3- ja Cas9-22 johdetut transfektantit; 2-kloonit kukin) olivat merkittävästi estivät verrattuna shMock soluihin 7 päivän jälkeen (168 tuntia). Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvoina ± SEM arvoja kolmesta määrityksissä. Tähdet osoittavat merkittäviä eroja shKIF4A ja shMock solut (

P

0,05, U-testi).

arviointi KIF4A proteiinin ilmentymisen ensisijainen OSCC

edustaja IHC tulokset KIF4A proteiinia normaalissa suun kudosten ja ensisijainen OSCC esitetään kuviossa 6A-C. Positiivista värjäytymistä nähtiin pääasiassa ytimet ensisijaisen OSCC näytteistä (kuvio 6A, B). KIF4A IHC arvosanat ensisijainen OSCCs (62,3-188, mediaani, 131) olivat merkittävästi korkeampia kuin normaaleissa kudoksissa (26,5-103, mediaani, 66,5) (kuvio 6C) (

P

0,05). Me määritelty tapauksia, joissa IHC pisteet yli 95 (+3 SD sijoituksen normaalia kudosta) kuin KIF4A-positiivisia. Väliset korrelaatiot ennusteeseen viittaavia ominaisuuksia potilaiden OSCC ja asema KIF4A-proteiinin ekspression on esitetty taulukossa 1. Yksi kliinisten parametrien, KIF4A ilmentyminen liittyi merkitsevästi (

P

0,05) ensisijaiseen koon ja OSCC kasvaimia. Nämä tulokset viittaavat siihen, KIF4A saattavat liittyä läheisesti kasvainten etenemiseen.

edustaja IHC tulokset KIF4A proteiinia normaalissa suun kudoksessa (A) ja ensisijaisen OSCC (B). A, B: Alkuperäinen suurennos, × 400. Mittaviivat 10 pm. Vahva KIF4A immunoreaktiivisuus havaittiin ensisijaisen OSCCs; normaali suullinen kudosten näkyvät lähes negatiivinen immunovärjäyksen. C: tila KIF4A proteiinin ilmentymisen ensisijaisen OSCCs (n = 106) ja normaali kollegansa. KIF4A IHC tulokset laskettiin seuraavasti: IHC pisteet = 0 × (lukumäärä unstained solujen alalla) + 1 × (lukumäärä heikosti värjäytyneiden solujen alalla) + 2 x (lukumäärä kohtalaisen värjäytyneiden solujen alalla) + 3 × (lukumäärä voimakkaasti värjätään solujen alalla). KIF4A IHC pistemäärät normaalia suun kudoksia ja OSCCs vaihteli 26,5-103 (mediaani, 66,5) ja 62,3-188 (mediaani, 131), tässä järjestyksessä. KIF4A proteiinin ekspressiotasot OSCCs ovat merkittävästi (

P

0,05, Mann-Whitneyn U-testi) korkeampi kuin normaalissa suun kudoksiin.

Tulokset immunovärjäyksen

Kliininen luokitus

No. potilaalla (%)

Yhteensä

KIF4A- negatiivinen

KIF4A-positiivisten

P

arvo

Ikä leikkauksen (vuosia) 603914 (36) 25 (64) ≧ 60, 702212 (55) 10 (45) 0,121

b

≧ 704510 (22) 35 (78) Sukupuoli Male7529 (39) 46 (52) 0,122

c

Female31 7 (23) 24 (77) T-primaarikasvaimen T19 5 (56) 4 (44) 0,005

d

T25825 (43) 33 (57) T319 3 (16) 16 (84) T420 3 (15) 17 (85) T1 + T26730 (45) 37 (55) 0,010

c

T3 + T439 6 (15) 33 (85) N-alueellinen imusolmuke N (-) 4515 (33) 30 (67) 0,920

c

N (+) 6121 (34) 40 (66) vaihe I9 5 (56) 4 (44) 0,121

d

II3814 (37) 24 (63) III11 4 (36) 7 (64) IV4813 (27) 35 (73) histopatologinen tyyppi Well6123 ( 38) 38 (62) 0,352

d

Moderately3711 (30) 26 (70) Poorly8 2 (25) 6 (75) Kasvaimen päällä Gingiva32 9 (38) 23 (63) 0,861

d

Tongue6527 (42) 38 (58) Suun mucosa6 0 (0) 6 (100) Suun floor3 0 (0) 3 (100) Taulukko 1. korrelaatio KIF4A ilmaisun ja kliininen luokittelu OSCCs.

P

0,05 katsottiin merkitseväksi,

b

χ

2 testiä,

c

Fisherin testiä,

d

Mann-Whitneyn U-testiä. CSV Lataa CSV

Keskustelu

Koska KIF4A yliekspressoitui usein OSCC solulinjat, loimme KIF4A pudotus solujen nähdä onko KIF4A on tärkeimpien toimintojen OSCCs. shKIF4A solut osoittivat laski solujen kasvua SAC aktivoituminen johtaa solusyklin pidätyksen M vaihe. Sen lisäksi, että

in vitro

data, Huomasimme myös, että KIF4A oli säädelty kliinisissä OSCC näytteissä verrattuna normaaleista kudoksista ja että KIF4A-positiivisten OSCC tapausta liittyvät läheisesti kasvainten kokoa. Nämä tulokset osoittivat, että KIF4A liittyy sääntelyn solun syklin M vaiheessa ja sillä on tärkeä rooli tuumorien etenemistä OSCCs.

Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että KIFS kriittisiä rooleja, mukaan lukien kasvaimen kehittymisen ja etenemisen, syövissä [12-14,31,32]. Niistä KIF2C, KIF18A, KIF20A, ja KIF20B oli säädelty useilla maligniteettien ja liittyy kasvaimen etenemiseen [51-56]. Sen sijaan KIF1A oli alassäädetty nenänielun karsinooma ja raportoidaan mahdollisena kasvainten vaimennin [57]. KIF4A yliekspressoitui kohdunkaulan ja keuhkosyövässä [58,59], kun taas KIF4A oli säädellä vähentävästi mahasyövistä [60]. Sen lisäksi, että nykyisten tietojen että KIF4A oli merkitsevästi säädellään ylöspäin OSCCs, Castillo et al. raportoitu, että yli-ilmentyminen joidenkin moottorin kinesiinien, kuten KIF4A, jotka aiheuttavat ylimääräisiä ulospäin voimia mitoosin aikana, aiheuttaa liiallista kara erottaminen johtaa epätasaiseen jakautumiseen geneettisen materiaalin Anaphase ja lopulta kehitys tytärsolujen vaikuttaa aneuploidia- [61]. Sen sijaan useat tutkimukset ovat raportoineet, että menetys KIF4A saattavat vaikuttaa kasvainten lisääntymistä ja syövän syntymistä [34,62]. Koska ristiriitaisia ​​tuloksia, kuten nämä, lisää tutkimuksia tarvitaan paremmin ymmärtämään monimutkaisia ​​tehtäviä KIF4A pelaa syövän kehittymistä ja etenemistä.

Romaani fi ndings nykyisessä tutkimuksessa on korrelaatio KIF4A Knockdown ja häiritsi mitoosin johtuvat SAC aktivointi. SAC aktivaatioreitti on tiukasti ohjataan kara tarkastuspiste proteiineja, kuten BUB1 ja MAD2 [17-22]. Vastauksena sopimatonta kiinnitys kromosomien kara mikrotubuluksiin, jotka aiheuttavat epänormaalia solujen jako, BUB1 on keskitetty Kinetokori mitoosi soluissa ja auttaa paikantamaan MAD2 on Kinetokori [62-64]. Aktivoidut MAD2 lokalisoitu oikein Kinetokori voi estää CDC20, joka aktivoi ubikitiinipromoottori ligaasilla kutsutaan APC /C [65-67]. Siten tämä todisteet osoittavat, että KIF4A Knockdown saattaa aiheuttaa SAC aktivointi kautta APC /C inaktivaation [23-27].

havaittu, että korkea sykliini B1 ja M vaiheen pysähtymisen havaittiin KIF4A knockdown-soluja. Induktion aikana G2 /M vaiheessa pidätyksen jälkeen solujen käsittely mikrotubulusten estäjiä, jotka aktivoivat SAC häiritsemällä mikrotubulusdynamiikan ja vakaus, kuten nokodatsoli ja paklitakseli, selvästi lisääntynyt sykliini B1-proteiinin tasot myös nähtiin [65-69]. Näin ollen, down-regulation of KIF4A indusoiman solusyklin pidätyksen OSCC solujen samankaltaisia ​​toimintoja mikrotubulusverkoston estäjiä.

KIF4A proteiinin ekspressiotasot ensisijainen OSCCs korreloivat kasvaimen kokoa; Tämä viittaa vahvasti siihen, että KIF4A voi olla tärkeä rooli OSCCs etenemistä ja kehitystä. Yhdessä kerrostuminen potilaalla on OSCC perustuu KIF4A tila voi tarjota enemmän henkilökohtaista lähestymistapaa ihmisen suun syöpähoidon.

Johtopäätös

Nykyinen Tulokset osoittivat, että Ensimmäistä kertaa joka KIF4A yli-ilmentyy usein in OSCC, mikä viittaa siihen, häiriöitä toiminnan karan tarkistuspisteen proteiineja, kuten BUB1, MAD2, ja CDC20. KIF4A ilmentyminen korreloi kasvaimen koko KIF4A-positiivisten tapausten, viittaa siihen, että SAC aktivaatio on tärkeä rooli solujen proliferaation OSCC. KIF4A ilme on todennäköisesti keskeinen säätelijä kasvaimen etenemisen OSCCs.

tukeminen Information

Kuva S1.

KIF4A immunologisen negatiivisissa ja positiivisissa kontrolleissa. Arvioidaan spesifisyyden KIF4A vasta-selvitimme värjäytymisen intensiteetti negatiivisia ja positiivisia kontrolleja. Alkuperäinen suurennos, × 400. Mittaviivat 10 pm. (A) Kuten negatiivinen kontrolli, ensisijainen OSCC näytteet immunovärjättiin ilman altistumista ensisijainen vasta-aineita. Ei ollut värjäytyneiden solujen. (B) luustolihasvaurio on positiivisena kontrollina KIF4A. Vahva KIF4A immunoreaktiivisuus erityisesti havaittu solujen tumaan.

doi: 10,1371 /journal.pone.0085951.s001

(TIF) B

Kiitokset

Kiitämme Ms Lynda C. Charters of Medical International muokkaamiseen tämän käsikirjoituksen.