Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Chromodomain-helikaasi-DNA-sitovan proteiinin 5 (CHD5 ) on äskettäin tunnistettu tuumorisuppressori, joka on usein vaimentua eri ihmisen syövissä. Meidän edellinen työ osoitti, että alhainen ilmentyminen CHD5 kolorektaalisyövässä korreloi CHD5 promoottori CpG-saarekkeen hypermetylaation. Tässä tutkimuksessa selvitimme vaikutus mikroRNA-211 (miR-211) -regulated CHD5 ilme peräsuolen kasvaimien syntyyn.

Menetelmät /Principal Havainnot

miR-211 ennustettiin kohdistaa CHD5 by TargetScan ohjelma-analyysillä. Stabiilisti ilmentävät eksogeenisiä miR-211 peräsuolen syövän solulinja (HCT-116

miR-211) synnytettiin käyttäen lentiviraalinen transduktion ja käytettiin mallina

in vitro

ja

in vivo

opinnot. Ilmaisu taso miR-211 HCT-116

miR-211-soluissa voimistuvan 16-kertainen verrattuna vektorisäädön soluihin (HCT-116

vektori). Eksogeeninen miR-211 sitoutuu suoraan 3′-alue (3′-UTR) ja CHD5 mRNA, minkä tuloksena 50%: n lasku CHD5 proteiinin tasolla HCT-116

miR-211 soluja. Tasot solujen lisääntymistä, kasvaimen kasvua ja solujen migraatio HCT-116

miR-211-solut olivat huomattavasti korkeampia kuin HCT-116

vektori soluja sekä

in vitro

ja

vuonna vivo

olosuhteissa, kuten määritettiin käyttäen menetelmiä MTT, pesäkkeiden muodostumisen, virtaussytometrialla, tyhjästä määrityksessä, ja kasvainksenografteja, vastaavasti. Lisäksi olemme havainneet, että täytäntöön ilmentyminen miR-211 HCT-116-solut on mahdollisuus muuttaa p53-reittiin liittyvien säätelevien proteiinien, kuten MDM2, Bcl-2, Bcl-x L, ja Bax.

Johtopäätös /merkitys

Tuloksemme osoittavat, että CHD5 on välittömänä kohteena miR-211 sääntelyä. Pakotettu ilmentymä miR-211 edistää kasvainsolujen kasvua ainakin osittain vähen- tämisessä ilmentymisen taso CHD5 tuumorisuppressorin. Tuloksemme ymmärtämään paremmin yhdistyksen välillä miR-211-säänneltyjen CHD5 ilmaisun ja CHD5 toiminta peräsuolen kasvaimien syntyyn.

Citation: Cai C, Ashktorab H, Pang X, Zhao Y, Sha W, Liu Y , et ai. (2012) MicroRNA-211 Expression Edistää peräsuolen syövän Cell Growth

In vitro

ja

In vivo

mukaan kohdistaminen Kasvain vaimennin CHD5. PLoS ONE 7 (1): e29750. doi: 10,1371 /journal.pone.0029750

Editor: Alfons Navarro, University of Barcelona, ​​Espanja

vastaanotettu: 05 lokakuu 2011; Hyväksytty: 3. joulukuuta 2011; Julkaistu: 03 tammikuu 2012

Copyright: © 2012 Cai et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain rahoitusta National Cancer Health (CA118770 ja CA102681) ja National Center for Research Resources (RCMI 2 G12 RR003048), USA. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

tunnistaminen syöpään liittyvien geenien ja ymmärtää niiden vaikutus kasvaimien syntyyn ovat kriittisiä vaiheita syöväntorjuntakeino. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että geenien ilmentyminen voi vaikuttaa muutokset kromatiinirakenteeseen ja yhdistyksen DNA Nukleosomien [1]. Esimerkiksi naa /Snf proteiinit voivat aiheuttaa ATP-riippuvaisten häiriöiden nukleosomin rakenteen promoottori, joka parantaa sitovan transkriptiotekijöiden niiden sitoutumiskohdat [1]. Toimet Näiden proteiinit voivat myös johtaa nukleosomiin liikkumista ja muutokset kromatiinin konformaation, jolloin syvällinen transkription aktivaation (tai tukahduttaminen) geenin tai alueen [1].

Chromodomain-helikaasi-DNA: ta sitovan geenejä ( CHD) koodaavat uutta luokkaa naa /Snf proteiineja, jotka eivät ainoastaan ​​sisällä naa /Snf kaltainen helikaasi ATPaasi-domeeni, mutta myös muita funktionaalisia domeeneja [2], [3]. Nämä proteiinit on DNA: ta sitova domeeni sekä chromodomain motiivi, joka voi suoraan vaikuttaa kroma- tiinin rakenteeseen ja geenien transkription. On yhä enemmän todisteita siitä, että CHD proteiini kompleksit voivat olla syvällinen vaikutus kromatiinirakenteeseen ja geenien ilmentymisen. Siksi on todennäköistä, että niillä on tärkeä rooli säätelyssä kehityksen solusyklikontrollin, ja oncogenesis [4]. Sepelvaltimotauti on super perhe, joka voidaan jakaa viiteen subfamilies perustuu spesifisten proteiiniaihetta, joka antaa kunkin perheen proteiinien kanssa ainutlaatuinen tehtävä. CHD5 muistuttaa eniten CHD3 ja CHD4 siitä, että se on sisältää kasvi homeodomain motiiveja. CHD5 tunnistettiin äskettäin uutena tuumorisuppressori, että karttoja 1p36, joka usein poistetaan monenlaisia ​​ihmisen syövissä [5], [6], ja kromatiinin-remodeling aktiivisuus CHD5 tarvitaan asianmukaisen transkription aktivointi p19

Arf /p53-reitin [7].

on selvää, että CHD5 puute on yleinen Alkutapahtuma ihmisen kasvaimien syntyyn. CHD5 usein vaimentua kautta promoottori hypermetylaation mahalaukun, rinta-, munasarja-, ja glioomakasvaimille [8], [9], [10], [11], mikä viittaa epigeneettiset vaimentaminen CHD5 metylointi voi myötävaikuttaa kasvaimien syntyyn näissä kudoksissa. Peräsuolen syöpä (CRC) on yksi kolmesta yleisin syövät Yhdysvalloissa [12] ja CHD5 usein hypermetyloitunut ihmisen paksusuolen syövän solulinjoissa ja primaarikasvainten [2], [13], [14].

Vaikka on olemassa monia tutkimuksia metylaatiostatuksen CHD5 erityyppisissä kasvaimia, on olemassa muutamia tutkimuksia, kuinka tärkeä epigeneettiset mekanismi, MikroRNA (miRNA), voi myös olla kriittinen rooli CHD5 puutteen aikana peräsuolen kasvaimien syntyyn. miRNA ovat pieniä, ei-koodaavat RNA-molekyylien läsnä eläimiä, kasveja, ja viruksia, jotka ovat ensisijaisesti geenien epätäydellisestä emäspariutumisen kanssa 3′-alueet (3′-UTR) erityisten mRNA: iden, joka indusoi mRNA: n hajoamisen [ ,,,0],15]. Löysä sitova rajoitusten puitteissa yksi miRNA sitoutua useita sivustoja yhden 3′-UTR ja useisiin mRNA tavoitteiden toteuttamiselle transcriptome, kartuttaa miRNA kanssa kyky estää useita geenejä kerralla [16]. Monet miRNA säilytetään poikki vaihteleva phyla, mikä osoittaa niiden fysiologiset merkitystä [15]. miRNA avainasemassa säätelyssä monipuolinen soluprosessien, kuten kehitys-, erilaistuminen, solun kasvu, apoptoosin, virusinfektio, ja aineenvaihdunta [17].

Osa miRNA jotka väärin säädellystä syövässä toimivat tuumorisuppressoreilla tai onkogeenejä [18]. Useat tällaiset miRNA on tunnistettu peräsuolen syöpä, mukaan lukien upregulated miR-31, miR-96, miR-135b, ja miR-183 ja vaimentua miR-133b ja miR-145 [19]. Koska miRNA sitovat 3′-UTR tavoitteensa mRNA: iden emäspariutumisen, alue täydentävät välillä miRNA ja sen mRNA tavoite on pieni. Tämä alue kattaa nukleotidit 2-7 5′-pää miRNA ja sitä kutsutaan nimellä ”siemen” alueella [20]. Erilaisia ​​laskennallisia lähestymistapoja on kehitetty ennustaa miRNA kohdesivustot koko genomin [21]. Käyttämällä tietotekniikkaan työkaluja Miranda PicTar, ja TargetScan, miR-211 ennustettiin emäsparin kanssa 3′-UTR CHD5, mutta

in vitro

ja

in vivo

kokeet ovat tarpeen vahvistamaan, onko miR-211 todella suunnattu CHD5.

Tässä tutkimuksessa olemme tutkineet rooli miR-211 on peräsuolen syövän solujen kautta downregulation CHD5

in vitro

ja

in vivo

. Ensin tutkimme ekspressiotasot miR-211 ja CHD5 että peräsuolen syövän solulinjoissa RKO ja HCT-116. Otimme HCT-116 ja vahvistetaan miR-211-pysyvästi transfektoitu solulinja HCT-116

miR-211. Lopuksi, käytimme tätä solulinjaa suorittamaan sarjan

in vitro

ja

in vivo

kokeita sen selvittämiseksi, onko miR-211 tavoitteet CHD5.

Tulokset

Expression tasot CHD5 proteiinia ja miR-211 ne ovat käänteisesti verrannollisia ihmisen paksusuolen syöpäsolulinjoissa

miR-211 valittiin ehdokkaaksi miRNA kohdentamiseksi CHD5 koska sen epätäydellisestä emäspariutu- 3 ’ -UTR of CHD5 (Fig. 1A). Olemme tutkineet ekspressiotaso miR-211 näiden kahden solulinjojen kvantitatiivisen tosiaikaisen RT-PCR: llä (Fig. 1 B). Jotta valita sopiva solulinjoja Tutkimuksessamme arvioimme taso CHD5 proteiinin neljä koolonsyöpäsolulinjaa Western blot-analyysi (Fig. 1 C), joka sisälsi kaksi aiemmin pysyviä solulinjoja (RKO ja HCT-116) ja kaksi CHD5 transfektoituja solulinjoja (RKO-S ja RKO-AS). Tuloksemme paljasti, että HCT-116 oli korkein ilmentymä CHD5 ja RKO oli pienin ilmaus CHD5. Näin ollen, HCT-116 ja RKO-solujen linjat käytettiin myöhemmissä kokeissa. Löysimme käänteinen korrelaatio CHD5 ja miR-211 lauseke (Fig. 1 D). Ilmaisu taso CHD5 HCT-116 oli 4-kertainen in RKO, kun taas ilmentymistaso miR-211 HCT-116 oli vain 20%, että RKO. Koska HCT-116-soluissa oli sekä korkeimman ilmentymistason CHD5 ja alimman ilmentymistaso miR-211, tämä solulinja valittiin ehdolle solulinjan pysyvästi transfektoida kanssa miR-211 lisätutkimisesta funktio miR-211 sääntelyssä CHD5 ilmentymistä soluviljelmässä ja -tuumoriksenografti olosuhteissa.

(A) RNA-sekvenssi kartta 3′-UTR CHD5 (Gene ID 26038) mRNA komplementaaristen sivuston (3′-UTR 130- 136) siemeneksi alueen miRNA-211. (B) miR-211 tasot RKO, HCT-116, RKO-S, ja RKO-AS solulinjoissa kvantitatiivisen RT-PCR perustuu miR-211 /U6 ilme kertaiseksi arvoja. (C) CHD5 proteiinin tasot kahdessa koolonsyöpäsolulinjaa (RKO ja HCT-116) ja kaksi pysyviä solulinjoja (RKO-S ja RKO-AS) kanssa täytäntöön CHD5-S ilmentyminen analysoitiin Western blot ja semi-kvantitatiivisesti perustuen CHD5 /β-aktiini suhteelliset intensiteetit. Bio-Rad Määrä One ohjelmistoa käytettiin densitometristä analyysiin Länsi blotit. (D) vertailu CHD5 ja miR-211 ekspressiotasot HCT-116 ja RKO solulinjoissa. * Merkitty P 0,05.

vakaasti täytäntöön ilmentymistä miR-211 suoraan downregulates CHD5 proteiinin tasot HCT-116-solujen

Tutkiakseen roolin miR-211 vaimennussäätely CHD5 mukaisesti soluviljelmässä olosuhteissa, rakensimme HCT-116-solulinja, joka pysyvästi ilmensivät miR-211 käyttäen lentiviruksen-jakelujärjestelmä lisätä ekspressiokasetti, jossa on P

CMV-promoottorin, EGFP: n, ja miR-211 esiaste (Fig. 2A). Olemme myös rakentaneet HCT-116-solulinja, HCT-116

vec, että pysyvästi ilmensivät GFP ohjaus vektorin. Neljäntoista päivän kuluttua lentivirus infektion, lähes kaikki HCT-116-solut oli havaittavissa vihreän fluoresenssin, mikä on osoitus tehokkaan infektion. Lentiviruksen toimitettujen EGFP-miR-211 ilmentyminen kvantifioitiin reaaliaikaisella RT-PCR. miR-211 ilmentymisen HCT-116

miR-211 kasvoi 16-kertaiseksi (

p

0,05). Lisäksi ekspressiotason CHD5 laski merkittävästi (Fig. 2B), jossa proteiinin taso CHD5 HCT-116

miR-211 solu vain 50%, joka on HCT-116

VEC-soluissa (kuvio . 2C). Lisäksi CHD5 vahvistettiin välittömänä kohteena miR-211 lusiferaasireport- määritys. Fluoresenssi aktiivisuus vähenee yli 90%, kun 293T-solut ko-transfektoitiin MIR-211 ekspressiovektoriin ja 3′-UTR CHD5 mRNA lusiferaasireportteri vektori verrattuna 3′-UTR CHD5 lusiferaasireportteri pelkällä vektorilla (Fig. 2D).

(A) Kaavamainen esitys miR-211 vektori, joka sisältää ekspressiokasetin, P

CMV-promoottorin, EGFP: n, ja miR-211 edeltäjää ja selektiivinen kasetti P

PGK promoottori ja Puro

r. (B) CHD5 proteiinin tasot solulinjoissa HCT-116

vec ja HCT-116

miR-211 arvioitiin Western blot ja (C) puoliksi määrällisesti perustuu CHD5 /β-aktiini suhteelliset intensiteetit. (D) lusiferaasireporttiterilla määrityksessä, jossa käytettiin HEK 293T-solut, jotka oli transfektoitu joko lusiferaasi /3′-UTR miR-211 toimittaja vektori, MIR-211 vektori, tai molemmat. Kaavioesitys lusiferaasi-CHD5 toimittaja vektori ja lusiferaasireportteri- kontrollivektori myös lisätty. * Merkitty P 0,05.

pakotetulta miR-211 ilmentyminen lisää proliferaatiota ja migraatio koolonkarsinoomasoluissa

in vitro

The effect of miR-211 solujen proliferaatio määritettiin käyttäen kolorimetristä muodostumisen määritys ja solujen elinkyky mitattiin käyttäen MTT-määritystä. HCT-116

vec ja HCT-116

miR-211-soluja ympättiin erillisiin 6-kuoppalevyille ja solujen kasvua tarkkailtiin päivittäin mikroskoopilla kymmeneksi päiväksi, kunnes pesäkkeet olivat selvästi nähtävissä paljaalla silmällä. Kuten odotettua, HCT-116

miR-211-solujen näytetä kasvoi merkittävästi proliferaatiota, jolloin muodostuu enemmän pesäkkeitä. Pesäkkeitä muodostava kyky HCT-116

miR-211-soluissa oli 221% (

p

0,05) enemmän kuin HCT-116

vec soluja (Fig. 3A). MTT-määritystä osoitti, että pakotettu ilmentymä miR-211 HCT-116

miR-211-solut johti 30%: n nousu solujen lisääntymisen verrattuna HCT-116

vec soluja (Fig. 3B). Solusyklin mittauksia FCM osoitti, että solujen osuus G1 vaiheessa väheni 53% (

p

0,05), ja että S-vaiheessa kasvoi 51% (

p

0,05.

(EN) naarmuuntunut avoimilla alueilla havaittiin tuntia 0, 5, 8, ja 24 HCT-116

vec ja HCT-116

miR-211 solulinjojen valomikroskoopilla at × 400 suurennus. (B) Solut laskettiin Eri ajanjakson saman koon tyhjästä alueen viitattu ajankohtana 0 h. Tulokset naarmu määrityksessä olivat kahdesta itsenäisestä kokeiluja kolmena rinnakkaisena ja * merkitty P 0,05.

pakotetulta miR-211 lisää leviämisen koolonkarsinoomasoluissa

in vivo

lisäksi tutkitaan biologisia toimintoja miR-211

in vitro

, me arvioi myös

in vivo

funktiona miR-211 käyttämällä ksenograftin elinsiirrot malli. Vuoteen ihon alle istuttamisen HCT-116

VEC tai HCT-116

miR-211-solut nude-hiiriin, me seurataan kasvaimen kasvua yli 6 viikon ajan. Kuten kuviossa 5 on esitetty, sen jälkeen 6 viikkoa kiinteä kasvain oli muodostunut oikeaan kylkeen kunkin hiirten keskimääräinen koko on 284 mm

3 ja keskimääräinen paino oli 0,592 g. Kuitenkin paljon pienempi kasvaimet muodostettiin vasempaan kylkeen, joiden keskikoko on 13,55 mm

3 ja keskipaino oli 0,028 g, mikä viittaa siihen, että miR-211 lisää leviämisen koolonkarsinoomasoluissa

in vivo

.

(A) -tuumoriksenografti kasvua HCT-116 ja HCT-116

miR-211 on esitetty alla kevyt ja fluoresenssikuvantamisella järjestelmä. Kasvaimen massa (g) mitattiin lopullinen koepäivänä heti kasvainkudoksen poistettiin hiirellä kirurginen. -tuumoriksenografti Kasvua HCT-116 ja HCT-116

miR-211 ryhmiä verrattiin. (B) Päivä soluinokulaation oli kokeellinen alkamispäivä ja kaikki hiiret tapettiin päivänä 43. kasvua kiinteän tuumoriksenograftien tarkkailtiin kerran viikossa ja mitataan noniusmittaharppia.

pakotettu ilmentymä Mir-211 muuttaa ekspression kasvuun liittyvien proteiinien ja p53 liittyvät reitin proteiinit

ilmentymisen tasot solun eloon jäämistä tukeva proteiinien Bcl-2 ja Bcl-x L HCT-116

asennuspalveli- 211 korotettiin 37% ja 29%, vastaavasti, kun taas ilmentymistaso kuoleman edistävä proteiini Bad väheni 22% (Fig. 6A, B). Expression of MDM-2, negatiivinen säätelijä p53, nostettiin 33% HCT-116

miR-211 soluja verrattuna HCT-116

vec soluja. Kuitenkin p53 ja sen kohdegeenin Bax väheni 18% ja 51%, vastaavasti (kuvio. 6C, D).

(A) tasot solujen kasvun liittyvien proteiinien in HCT-116

vec ja HCT-116

miR-211 solulinjoja analysoitiin Western blot ja (B) osittain määrällisesti perustuva kohdennettujen proteiini /β-aktiini suhteelliset intensiteetit. Tasot p53 liittyvän reitin proteiinien HCT-116

vec ja HCT-116

miR-211 solulinjoja analysoitiin Western blot (C) ja osittain määrällisesti perustuva kohdennettujen proteiini /β-aktiini suhteelliset intensiteetit (D).

keskustelu

CHD5 on äskettäin tunnistettu tuumorisuppressorigeenin [2] sijaitsevat 1p36 [7]. Pelkistetyssä ilmaus esiintyy monissa kasvaintyypeissä vuoksi hypermetylaation sen promoottorin [8], [9], [11]. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että CHD5 säätelee positiivisesti p53-välitteisten reittien. Vaimennussäätely ja hypermetylaatiota CHD5 on havaittu CRC [2], [13], [15]. Kuitenkin tiedetään hyvin vähän siitä, onko miRNA, toisen aspektin epigeneettisiä asetuksen vaikutus CHD5 ilmaisun ja fenotyypin CRC soluja.

miRNA ennustetaan säädellä yli 30% kaikista geenien ilmentymistä ja voi selittää jotkut poikkeava geenien ilmentyminen syöpäsoluissa. Käytimme bioinformatiikan työkaluja ja havaitsi, että miR-211 ennustetaan emäsparin 3′-transloimaton alue (3′-UTR) ja CHD5 (Fig. 2A). miR-211 on merkittävästi yliaktiivista muiden syöpien [22], ja se voi toimia onkogeenin, joka on yhdenmukainen kasvaimia estävä toiminta CHD5. Kuitenkin myös miR-211 suoraan kohdistettu CHD5 ja vaikuttaa fenotyypin solujen suolesta tarpeen vahvistaa. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme päättäneet, että täytäntöön ilmentyminen miR-211 on peräsuolen syövän solulinja suoraan downregulates CHD5, mikä lisää solujen elinkelpoisuuden, solusyklin etenemistä, ja muuttoliike kyky ja laski apoptoosin. Olemme vahvistaneet tulokset useilla eri tasoilla, myös soluviljelmässä tuumoriksenografteja, ja proteiini muutokset CHD5 liittyviä reittejä.

muodostanut koolonisyöpäsolulinja että pysyvästi ilmensivät EGFP-miR-211, HCT- 116

miR-211, käyttäen vakaa geenitransfektion tekniikka (Fig. 2A). RKO ja HCT-116 ovat molemmat peräsuolen syövän solulinjoissa. CHD5 oli nöyrä ilmaistu RKO ja erittäin ilmaistu HCT-116-solujen [14]. Ilmentymistasojen CHD5 ja miR-211 RKO, RKO-S, RKO-AS, ja HCT-116 havaittiin Western blot- ja reaaliaikaisella PCR: llä. Vaikka RKO-S on CHD5-stabiilisti transfektoitu solulinja, HCT-116 oli korkein ekspressiotaso CHD5. Koska HCT-116 on myös pienimmät ilmentymistaso miR-211, valitsimme tämän solulinjan pysyvästi transfektoida kanssa miR-211 (Kuva. 1 D). Pystyimme täytäntöön EGFP-miR-211 ilmentymistä koolonsolulinjassa HCT-116

miR-211 käyttäen Lenti-X ™ Lentivirusvektorikonstruktit Expression System. Olemme myös perustaneet solulinja transfektoitiin tyhjällä EGFP vektori, HCT-116

vec. Koska EGFP-geeni oli sama P

CMV promoottori kanssa miR-211-geenin, pystyimme helposti seurata miR-211 ilmentymistä soluissa fluoresenssimikroskoopilla. Koska ilmaus miR-211 HCT-116 ja HCT-116

vec soluissa oli samanlainen, HCT-116

vec käytettiin ohjaus solulinjan seuraavissa kokeissa. Ilmaisu taso miR-211 oli 15 kertaa suurempi HCT-116

miR-211 soluja verrattuna HCT-116

veccells.

Lisäksi taso CHD5 ilmentymistä merkittävästi vähentynyt HCT-116

miR-211 soluja verrattuna HCT-116

vec soluja (Fig. 2B, C). Pakotettu ilmentymä miR-211 HCT-116-solujen määrä nousi leviämisen, pesäkemuodostusta, elinkelpoisuutta (Fig. 3), ja muuttoliike kyky (Fig. 4)

in vitro

. Cell kauttakulun G0 /G1-S faasi kiihtyi (Fig. 3C, D) ja ilmentyminen solun eloon jäämistä tukeva proteiinien Bcl-2 ja Bcl-x L kasvoivat ja ilmentymistä kuoleman edistävän proteiinin Bad vähentynyt (Fig. 6A, B ). Ylössäätely miR-211 tehostettu leviämisen peräsuolen syövän solut voivat tapahtua vähen- tämisessä CHD5 (Fig. 2D) ja myös edistää kasvaimen kasvua

in vivo

. Kuuden viikon kuluttua ihonalaisen elinsiirron HCT-116

miR-211 ja HCT-116-solut nude-hiiriin, HCT-116

miR-211 kehittyi kasvaimia, joiden keskimääräinen paino on 0,592 g, kun HCT-116-solut vain muodostunut paljon pienempi kasvaimet, joiden keskimääräinen paino on 0,028 g. Ottaen tilit HCT-116 ja HCT-116

vec ei osoittanut mitään merkittäviä eroja biologista käyttäytymistä, tuloksemme osoittavat, että miR-211 edistää kasvaimen kasvua ksenograftien

in vivo

(Fig. 5 ).

Mielenkiintoista, downregulation CHD5 by miR-211 vaikuttaa fenotyypin peräsuolen solulinjan vaikuttamalla p53 liittyvän reitin proteiinit (Fig. 6C, D). p53 on yksi eniten tutkittu tuumorisuppressoreilla ja yli 50% ihmisen kasvaimissa suorittaa toiminnan menetys mutaatioiden [23]. p53 vaimentaa kasvaimen kehittymisen indusoimalla solusyklin-pidätystä tai apoptoosin ohjelmia vastauksena lukuisia eri solustressiä signaalit [24]. Tuumorisuppressorigeenin p53 sisältää myös muita mekanismeja, kuten säätelemällä metaboliareittiä [25]. CHD5 näyttää moduloida karsinogeneesi kautta p53 liittyvän reitin [7]. Tutkimuksessamme havaitsimme, että ylössäätely miR-211 HCT-116-solut johti downregulation of CHD5, jotka vaikuttavat ilmentyminen useiden p53-säännelty reitin proteiinit, mukaan lukien Mdm-2, p53, ja Bax. Taso Mdm-2, negatiivinen säätelijä p53, lisättiin samalla tasolla p53 ja sen kohdegeenin, Bax, oli vähentynyt, mikä osoittaa, että CHD5 puute vaarantaa p53-säännelty reittejä ja helpottaa kasvaimen kehittymisen. Pahanlaatuinen fenotyyppi HCT-116-solujen korotettiin ylössäätely miR-211 ja parantamiseksi leviämisen ja migraation HCT-116 solut voivat olla mukana myöhemmin muutoksia p53 liittyviä reittejä. Lisätutkimuksia tarvitaan, onko p53 liittyvä signalointi on ainoa tavoite miRNA-211 sääntely CHD5.

Yhdessä poikkeavaan ilmentyminen miR-211 ja myöhempi muutos tason CHD5 liittyy jossa peräsuolen kasvaimien syntyyn. Tuloksemme osoittavat, että täytäntöön ilmentyminen miR-211 kolorektaalisyövän solulinja HCT-116 lisäsi pahanlaatuinen fenotyyppi soluista suoraan vähen- tämisessä ilmaus CHD5 ja se voi olla moduloimalla p53-liittyviä reittejä. Erityisesti täytäntöön ilmentyminen miR-211 tehostettu edistäminen ja muuttoliike, vähentää apoptoosin, kiihtyi siirtyminen G0 /G1: stä S-vaiheeseen

in vitro

ja parannettu leviämisen

in vivo

. Koska yhden miRNA voi moduloida useita eri tavoitteita muut mahdolliset roolit miR-211 kolorektaalisyövässä on vielä tutkittava. Lisäksi lisää tutkimuksia tarvitaan vahvistamaan suhdetta miR-211 ja CHD5 ihmisen peräsuolen syövän kehitystä ja ennustetta. Tutkimuksemme tarjoaa ymmärtämään paremmin sääntelyn kapasiteetin miR-211 edistämisessä peräsuolen kasvainten synnyssä kohdistamalla CHD5 ilme.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja kulttuuri

Ihmisen paksusuolen syöpäsolulinjoista (RKO ja HCT-116) ja ihmisen alkion munuaisen solulinja (HEK293T) saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Käytimme kaksi CHD5-Sens ja CHD5-antiSens pakko ilmentymisen pysyvästi sijoittautunut RKO solulinjojen (CHD5 voimistunut solulinja RKO-S ja sen anti-sense RKO-AS) [26]. RKO-soluja viljeltiin MEM ja RKO-S ja RKO-AS-soluja viljeltiin MEM, joka sisälsi 900 ug /ml G418: aa. HCT-116-soluja viljeltiin McCoyn 5A-alustassa (ATCC). HEK293T-soluja viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen elatusaineessa (DMEM, Gibco, USA). Kaikki media on täydennetty 10% naudan sikiön seerumia ja 1% penisilliini /streptomysiiniä, ja kaikki solulinjoja pidettiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2 ja 95%: n kosteudessa.

tunnistetiedot microRNA tavoitteiden

algoritmeja Miranda (https://www.sanger.ac.uk), PicTar (https://pictar.bio.nyu.edu), ja TargetScan (http: //www.targetscan. org /) käytettiin ennustamaan, jotka ihmisen miRNA voi sitoutua 3′-UTR CHD5 (Gene ID 26038). Lyhyesti, nämä algoritmit tarjoavat 3′-UTR rinnastuksia ennustettu sivustoja ja linkit eri julkisten tietokantojen ennustamisessa miRNA sitoutumiskohdista.

miRNA louhinta ja kvantitatiivinen RT-PCR

Kokonais-RNA eristettiin käyttämällä RNeasy Mini Kit (Qiagen, Germantown, MD, USA). Mierossa-211 forward-aluketta (5′-TTCCCTTTGTCATCCTTCGCCT-3 ’) syntetisoitiin Sigma (Woodlands, TX). Kokonais-RNA polyadenyloituina mukaan polyA polymeraasia

E. coli

, ja sitten ensimmäisen juosteen cDNA-synteesi ja kvantitatiivinen PCR tehtiin kanssa korkean erityisyys miRNA QRT-PCR Detection Kit (Stratagene, La Jolla, CA). Polymeraasiketjureaktio (PCR) suoritettiin Mx3000P ™ Instrument (Stratagene Laboratory), jossa U6 sisäisenä kontrollina, koska sen vakaan ilmentymisen poikki ihmisen kudoksissa ja solulinjoissa, kuten valmistaja ehdottaa ja muut tutkijat [27]. Käytimme vertaileva kynnys (Ct) mittausmenetelmä suhteelliset muutokset miRNA ilme. Ct on syklin, jossa fluoresenssi signaali vahvistus juoni kulkee kiinteän kynnyksen. ACt = Ct (miR-211) -Ct (U6), ΔΔCt = ACt (vektori) -ΔCt (miR-211). Expression kertainen arvo = 2

-ΔΔCt. Kaikki kokeet tehtiin kolmena kappaleena. Negatiivinen kontrolli ilman mallin ajettiin rinnan kokonaisriskitason reaktion spesifisyys.

stabiili transfektointi miR-211

muunnettu kaupallisten pLVX-Tight-Puro vektorin (Clontech, Mountain View, CA), jossa ekspressiokasetti, joka sisältää P

CMV-promoottorin, EGFP miRNA linkkeri, ja pre-miR-211 korvaamalla P

tiukka promoottori [28]. Mirna linkkeri sisälsi moninkertaisen kloonauskohdan. Ennalta miR-211 kaksinkertainen juostesekvenssi suunniteltiin perustuen miRBase Sequence tietokanta version 12.0. Laskennallinen vektorit varmistettiin DNA-sekvensoinnilla. Rekombinantti-lentivirus- partikkeleita, jotka sisältävät joko miR-211-vektori tai EGFP-ohjaus vektori transfektoitiin HEK 293T pakkaus- soluihin, käyttämällä lentiphos ™ HT pakkausjärjestelmän ja seuraamalla valmistajan ohjeita (Clontech, Mountain View, CA). HCT-116-soluja kasvatettiin 70-80% konfluenssiin 6-kuoppalevyille ja infektoitiin 200 ul: lentivirus, joka sisälsi joko miR-211-vektori tai kontrollivektorilla 2 tuntia. Sen jälkeen, 2 ml McCoyn 5A-median 10% FBS: ää lisättiin kuhunkin kuoppaan. 48 tunnin kuluttua tartunnan saaneet solut valittiin tuoretta väliainetta, joka sisälsi 5 ug /ml puromysiiniä 4-5 kohtia. Solulinjoja, jotka ekspressoivat stabiilisti joko miR-211: n tai kontrollivektorilla ja tehtiin infektoituneiden solujen voidaan katsoa fluoresenssimikroskoopilla.

lusiferaasireporttiterilla määritys

lusiferaasireportteri- määritystä käytettiin sen varmistamiseksi, että komplementaarisen sekvenssin miR-211 sitoutuu 3′-UTR CHD5 mRNA. Fragmentti CHD5 mRNA, joka sisälsi miR-211: n sitoutumiskohta kloonattiin phCMV-FSR lusiferaasireportteri vektori (Genlantis, San Diego, CA). HEK 293T-soluja siirrostettiin 24-kuoppaiselle levylle niin, että ne olivat 50% konfluentti transfektion. Lusiferaasireportteri vektorin ja joko GFP-kontrollivektorilla tai miR-211 ekspressiovektori transfektoitiin HEK 293T-soluihin käyttäen kalsiumfosfaattisaostusta. Lusiferaasiaktiivisuus mitattiin elävissä soluissa 48 tuntia myöhemmin mukaan valmistajan protokollan bioluminenssina kuvantamisen kanssa Xenogren IVIS väline (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA).

3- (4, 5-dimetyylitiatsol-2- yyli) 2, 5-difenyylitetratsoliumbromidi (MTT)

MTT-määritys suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [29]. Lyhyesti, solut ympättiin 96-kuoppalevyille alkutiheydellä 5000 solua /kuoppa. 72 tunnin jälkeen, 200 ui MTT-liuosta (5 mg /ml, Sigma, St Louis, MO) lisättiin kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin 4 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Supernatantti heitettiin pois, ja 200 ui dimetyylisulfoksidia (DMSO) lisättiin jokaiseen kuoppaan sakan liuottamiseksi. 30 min jälkeen huoneenlämpötilassa, levyt skannattiin spektrofotometrisesti mikrolevylukijalla (Bio-Rad, Hercules, CA) asetettiin 560 nm mitataan absorbanssi. Kukin testi toistettiin viisi kuoppiin.

Pesäkkeenmuodostusta määrityksessä

pesäkkeiden muodostumisen määritys suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [29]. Lyhyesti, HCT-116

VEC ja HCT-116

miR-211-soluja maljattiin 6-kuoppaisille kudosviljelylevyille (Palo Alto, CA). Viisisataa soluissa HCT-116

vec ja HCT-116

miR-211 ympättiin kuhunkin kuoppaan kolmoismäärityksenä inkuboitiin 10 päivän ajan, ja pesäkkeet värjättiin 0,1% trypaanisinisellä 50% etanolia. Sisältävät pesäkkeet 50 tai enemmän solut lasketaan elinkelpoisia klonogeeniset soluja. Ainakin kaksi itsenäistä koetta suoritettiin.

Cell cycle määritys

Cell cycle-analyysi suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [29]. Lyhyesti, HCT-116

VEC ja HCT-116

miR-211 solujen kasvun log-faasissa kerättiin ja kiinnitettiin kylmällä 75% etanolilla ja varastoitiin -20 ° C: ssa 24 tuntia. Sen jälkeen, kun etanoli oli poistettu, solut inkuboitiin 1 mg /ml RNaasi A: PBS: ssä 30 minuuttia huoneen lämpötilassa, ja sitten soluja inkuboitiin vielä 30 min pimeässä 0,5 ml 50 mg /ml propidiumjodidia. Solujen jakauma koko solusyklin analysoitiin Becton-Dickinson FACScan, ja DNA-histogrammit analysoitiin muutetun ohjelmiston. Kukin koe toistettiin kolmena kappaleena.

Scratch määritys

Lyhyesti, avoin alue tai ”tyhjästä” tuotettiin 90% HCT-116

miR-211 yksisoluiset kerrokset käyttäen 200 ul pipetin kärki aikaisemmin kuvatulla [30]. HCT-116

miR-211 solut pestiin PBS poistamiseksi joutuneiden solujen avoimella alueella, ja viljeltiin McCoyn 5A nimetyille kertaa. HCT-116

vec käsiteltiin samalla tavalla ja viljeltiin McCoyn 5A. Kulkeutumista avoin alue havaittiin paljaalla silmällä.

Western blot-analyysi

HCT-116

vec ja HCT-116

miR-211 solut pestiin kylmällä PBS: llä ja lyysattiin RIPA lyysipuskuria jäissä 30 minuutin ajan.