Krooninen sairaus

tiivistelmä

Meprin-α on metalloproteaasi yli-ilmennetään syöpäsoluja, mikä johtaa kertyminen tämän proteaasin osajoukko peräsuolen kasvaimia. Lisääntyneen meprin-α tasossa, kasvaimen etenemiseen ei tunneta. Olemme tutkineet vaikutus tämän proteaasilla solujen vaeltamiseen ja angiogeneesin

in vitro

ja tutki ilmentymistä meprin-α-mRNA, proteiini ja proteolyyttinen aktiivisuus ensisijainen kasvaimia asteittain ja maksametastaaseista potilaita, joilla on peräsuolen syöpä, sekä estävä aktiivisuus meprin-α seerumeissa syöpäpotilaan verrattuna terveisiin kontrolleihin. Olemme havainneet, että hepatosyyttikasvutekijän (HGF) – indusoi muuttavien vaste meprin-transfektoitujen epiteelisolujen lisääntynyt verrattuna villityypin soluihin, kun läsnä on plasminogeenin, ja että angiogeenisen vasteen organ viljeltiin rotan aortan eksplantaatteja on parannettu, että läsnäolo eksogeenisiä ihmisen meprin-α. Potilailla, meprin-α-mRNA ilmentyi paksusuolen adenoomia, primaarikasvainten UICC (International Union Against Cancer) vaiheen I, II, III ja IV, sekä maksassa etäpesäkkeitä. Sen sijaan, vastaavan proteiinin kertynyt vain ensisijainen kasvaimia ja metastaaseja, mutta ei adenoomien. Kuitenkin maksametastaaseista puuttui meprin-α aktiivisuuden lisääntymisestä huolimatta ilmentymistä vastaavan proteiinin, joka korreloi tehoton tsymogeeni aktivointi. Seerumit syöpäpotilaista oli vähemmän meprin-α eston terveisiin kontrolleihin verrattuna. Lopuksi meprin-α aktiivisuutta säädellään eri tavoin ensisijainen kasvaimia ja etäpesäkkeitä, mikä johtaa korkeisiin proteolyyttinen aktiivisuus ensisijainen kasvaimia ja alhainen aktiivisuus maksassa etäpesäkkeitä. Nojalla sen pro-muuttavien ja angiogeneesiä toimintaa, meprin-α voi edistää syövän etenemisen peräsuolen syövän.

Citation: Lottaz D, Maurer CA, Noël A, Blacher S, Huguenin M, Nievergelt A, et ai. (2011) Enhanced aktiivisuus Meprin-α, Pro-muuttavien ja angiogeneesiä Proteaasin vuonna peräsuolen syövän. PLoS ONE 6 (11): e26450. doi: 10,1371 /journal.pone.0026450

Editor: Hang Thi Thu Nguyen, Emory University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 06 syyskuu 2010; Hyväksytty: 27 syyskuu 2011; Julkaistu: 11 marraskuu 2011

Copyright: © 2011 Lottaz et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Swiss National Foundation (www.snf.ch myöntää # 3100A0-100772 ja EES), Berner Cancer League (www.bernischekrebsliga.ch, myöntää DL) ja Deutsche Forschungsgemeinschaft (www.dfg.de, DFG BE 4086 /1-1 CB). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

koordinoivan solunulkoinen proteolyyttinen tapahtumat voivat edistää syövän etenemistä häiritsemällä fyysisiä esteitä, kuten tyvikalvon ja käsittelemällä soluväliaineen, kasvutekijöiden ja sytokiinien kasvaimen strooman. Proteaasit vaikuttaa solujen adheesiota ja solun kasvua sekä yksilöllisen ja kollektiivisen solumigraatio [1], [2]. Syvällinen vaikutus proteaasien ohjataan säätelyyn proteaasin aktiivisuuden eri tasoilla kuten ekspressiotasoja, aktivointi tsymogeenillä muotoja, estäjä tasoja, ja inaktivointi.

aiemmin tunnistettu meprin-α, joka on metzincin proteaasia astacin perhe [3], uutena osa proteaasin verkon kolorektaalisyövässä [4]. On olemassa kaksi homologista isoformia meprin: meprin-α, jota koodaa

MEP1A

kromosomissa 6, ja meprin-β, jota koodaa

MEP1B

kromosomissa 18 [5]. Meprin-α ja meprin-β ovat koekspressoitu ohutsuolessa, kun taas vain meprin-α ilmaistaan ​​paksusuolessa [6]. Meprin-β kertyy apikaalisella solun pinnan enterosyyttien ohutsuolessa, kun taas meprin-α erittyy, ellei se pysyy solun pinnalla kautta ei-kovalenttisesti yhdessä meprin-β [6]. Yhden polypeptidiketjun eivät ole pysyviä, sekä isoformeja muodostavat proteiinin kompleksit meprin-β dimeerit, meprin-α ja meprin-β tetrameerejä tai multimeerisiä komplekseja jopa kymmenen meprin-α-alayksiköitä [7], [8]. Meprin-α ilmentyy epiteelisolujen terveen paksusuolen limakalvo sekä paksusuolen syövän [6]. Kuitenkin, toisin kuin normaalit suolen epiteelisolujen, jotka vapauttavat proteaasi suoleen onteloon, syövän solut erittävät proteaasia, joka ei ole polarisoitu tavalla, joka johtaa sen kertymistä ja aktivointia kasvaimen strooman [4]. Meprin-α pilkkoo useita erilaisia ​​alustoja

in vitro

[9], kuten soluväliaineen komponentteja tyvikalvoissa [9], [10], mutta harvat substraatteja on kuvattu

in vivo

[ ,,,0],11], [12], [13], [14], [15]. Kolme endogeenisen meprin estäjät on kuvattu, mannaania sitova lektiini (MBL) [16], fetuiinin-A ja kystatiini C [17].

Meprin-α eritetään epiteelisolujen tsymogeeninä [18].

In vitro

, propeptidi voidaan poistaa käyttämällä trypsiiniä, jolloin saadaan aktiivinen entsyymi. Trypsiini voi siten aktivoida meprin-α suolistossa onteloon

in vivo

. Vaihtoehtoinen aktivointi järjestelmä on todettu yhteistyössä viljelmistä koolonkarsinoomasolulinja Caco-2 ja suoliston fibroblasteissa. Fibroblasti-johdettu urokinaasi plasminogeeniaktivaattori (uPA) muuntaa plasminogeenin osaksi plasmiini, joka puolestaan ​​generoi aktiivisen meprin-α [19]. Vuonna ihon kallikreiini liittyvä peptidaasi 5 voitaisiin tunnistetaan promeprin-α muuttavan entsyymin [20].

Täällä voimme tarjota näyttöä angiogeneesiä ja pro-muuttavien aktiivisuus meprin-α ja ilmentymisen tutkimiseksi , aktivointi ja esto tämän proteaasin ensisijainen kasvaimia, maksametastaaseihin ja verenkiertoon peräsuolen syöpäpotilailla. Meidän tulokset osoittavat monimutkainen kuvio asetuksella, joka on sopusoinnussa proteaasin ollessa osallisena syöpäsolujen leviämistä primaarisista sivustoja.

Tulokset

Meprin-α edistää solujen vaeltamiseen ja angiogeneesi

in vitro

vaikutus meprin-α on solumigraation tutkittiin käyttämällä hyvin tunnettu sironnan vasteen Madin-Darby koiran munuaissolut (MDCK) soluja vasteena hepatosyyttikasvutekijä (HGF ) [21]. Vaste meprin-transfektoitujen solujen ja vanhempien MDCK-soluissa rekisteröitiin käyttämällä nopeutus Videomicroscopy ja määrällisesti kuten aikaisemmin on kuvattu (Fig. 1A) [22]. Vertasimme migraatio vanhempien MDCK-solujen MDCK-solut transfektoitiin joko meprin-α yksin, meprin-β yksinään tai ko-transfektoitiin sekä meprin-α ja meprin-β. Hoitamaton vanhempien ja meprin-transfektoidut MDCK-solut eivät siirry ja kasvaa soluklusterin että lopulta muodostavat yksisolukerrokselle. Pro-muuttavien vaste indusoitiin lisäämällä HGF. Meprin-transfektoidut ja ohjaus MDCK-solut vaelsivat samalla, kun läsnä on HGF yksin. Vasta sen jälkeen lisätään plasminogeenin lähteenä tuottaa plasmiini, joka puolestaan ​​aktivoi meprin-α [19], siirtymisen nopeus meprin-α /β co-transfektoiduissa soluissa oli kasvanut noin 50% verrattuna villin tyypin soluihin. Tämä ero poistettiin lisäämällä meprin estäjän aktinoniinin. Erityisesti pitää kytkettynä meprin-α solun pinnan läpi meprin-β on välttämätöntä lisätä tämän pro-vaeltavia vasteen, kun läsnä on HGF ja plasminogeenin, kuten MDCK-solut transfektoitiin joko meprin-α tai meprin-β yksin siirtynyt samalla vanhempien soluja.

(A) Vanhempien MDCK villityypin solujen (wt, avoimet pylväät) ja MDCK-solut ko-transfektoitiin meprin-α ja meprin-β (αβ, vasen paneeli, täytetty mustat pylväät) tai transfektoitu joko meprin-α (α) tai meprin-β (β) yksinään (oikea paneeli, täytetty harmaa pylväät) viljeltiin laminiini 1-päällystetty ruokia ja altistettiin HGF (20 nM), joilla muuttoliike puuttuessa tai läsnä plasminogeenin kuin osoitettu. HGF muuttoliikkeelle seuratun 3-4 tuntia käyttäen Videomicroscopy. Näkyy on keskimääräinen siirtonopeutta (+/- SEM) meprin-transfektoitujen solujen suhteen identtisesti käsiteltiin villityypin soluissa. Tulokset ovat keskiarvoja kolmesta neljään itsenäisen kokeen kullekin tilalle. Kun läsnä on plasminogeenin (100 nM), HGF-indusoitua migraation meprin-α /β co-transfektoiduissa soluissa oli merkittävästi parannettu. Tämä vaikutus on palautunut läsnä on meprin inhibiittorin aktinoniinin (100 nM). Solujen migraatiota transfektoitiin joko meprin alayksikkö yksinään ei ollut erilainen kuin villityypin soluissa. (B) Meprin-α edistää angiogeneesiä. Puhdistettu rekombinantti ihmisen aktiivinen meprin-α täydennettiin viljelyalustaan ​​(0,7 ug /ml) rotan aortan rengas määritys ja seuraus alusten osaksi kollageenia geeli kvantifioitiin käyttäen kuva-analyysiä (katso materiaalit ja menetelmät). N

v: alusten lukumäärä, N

b: määrä sivuhaaraa, L

max: enimmäispituus aluksia. * P 0,05 verrattuna hoitamattomiin elinviljelyssä. Tulokset ovat kolmen erillisen kokeen kanssa kolmena rinnakkaisena kullekin kunnossa.

Puhdistettu yhdistelmä-aktiivista ihmisen meprin-α edistänyt angiogeenisen vasteen rotan aortan rengas määritys [23] (Fig. 1 B). Tietokoneavusteisen kuva-analyysin rotan aortan eksplanttien 3-ulotteinen kollageenigeelissä kulttuuri osoitti, että meprin-α tehosti seuraus kapillaarien verrattuna kontrolliviljelmiin kannalta sekä pituuden (lisäys 44%, p 0,05) ja lukumäärä sivuhaaraa (3-kertainen, p 0,05).

meprin-α ilmentymistä kolorektaalisyövässä progressiivisen kasvain vaiheissa

Variable tasoja yhden 3,5 kb meprin-α-mRNA havaittiin potilas näytteet kaikissa vaiheissa, myös adenoomia, joka ei korreloinut merkitsevästi kasvaimen vaiheissa (Fig. 2A, B). Vaihtoehtoinen silmukointi meprin-β syövän on aikaisemmin raportoitu [24]. Ole näyttöä vaihtoehtoisesti liitettyjä mRNA isoformi meprin-α löydettiin kasvaimia. Immunobloteista meprin-α proteiini oli vain heikosti havaittavissa tai puuttuu adenoomia, kun taas osajoukko syöpänäytteissä, kuten primäärikasvain vaiheet I-IV ja maksametastaaseista, sisälsivät suuria määriä meprin-α-proteiinia (kuvio. 2C). Puhdistettu harjareunusten kalvoja ihmisen ohutsuolessa, jotka sisältävät sekä meprin-α ja meprin-β, analysoitiin positiivisena kontrollina. Kuten aiemmin on kuvattu [4], molekyyli- lajit meprin-α tuumoreissa oli 10-25 kDa pienempi kuin hallitseva 100 kDa: n proteiinin harjareunusten kalvoja. Immuunivärjäytyminen meprin-α in ensisijainen kasvaimia ja metastaaseja paljasti klustereita syöpäsolujen voimakassignaaliset vieressä negatiivinen syöpäsoluja (Fig. 3). Kaikki adenoomia mutta yksi teki minimiarvon 1 (Fig. 4A), kun taas ensisijainen kasvaimia ja metastaaseja sai korkeampi (p 0,025 ensisijaisen kasvaimia vaiheiden I-IV verrattuna maksametastaaseihin ja adenoomia).

(A ) edustaja Northern blot varten meprin-α on kokonais-RNA (12 ug) uutetaan kasvain näytteitä potilaista, joilla on eri kasvain vaiheiden (A adenooma, primaarikasvainten vaiheet UICC I UICC IV, M maksametastaaseja). Normaali ohjaus RNA terve paksusuolen limakalvon on myös esitetty (kaista C). Tasoerot yhden 3,5 kb: n mRNA lajia havaittiin. Määrä ladattu RNA arvioitiin reprobing täplää varten 7S RNA. (B) kvantifiointi meprin-α-mRNA-tasot suhteessa 7S RNA: ta. Rasiakuvaaja edustus densitometristä arvoja Northern blotteja. Laatikko sisältää alakvartiili, mediaani ja yläkvartiili, viikset osoittaa 5-95 persentiilin alue (N = 12 kussakin ryhmässä). Mitään merkittäviä eroja eri ryhmien välillä. (C) edustaja Western blot varten meprin-α proteiini otteita tuumorinäytteistä (40 ug). Kontrollina, puhdistettua ihmisen harjareunusten kalvoja ohutsuolessa (20 ug) analysoitiin myös (BBM), jossa meprin-α liittyy transmembraanisen meprin-β heterodimeerisessä proteiinin komplekseja. Meprin-α havaittiin osajoukko kasvaimia. Jotta paljastaa heikkoja signaaleja, kalvo overexposed suhteessa kasvaimen näytteitä, joka osoitti voimakasta ekspressiota.

immuunivärjäytyminen meprin-α on kudososat formaliinilla kiinnitetyt ja parafinoidut peräsuolen kudosnäytteistä käyttämällä kaniinin polyklonaalista primääristä vasta-ainetta yhdessä peroksidaasi-kytketty sekundaarinen vasta-aine ja diaminobentsidiiniä kromogeenisen substraatin. Counter tahra: hematoksyliinillä. Tavoite suurennus: 40 ×. Bar = 50 pm. (A) In normaali paksusuolen limakalvon meprin-α on tuskin havaittavissa. Joskus signaalit havaittiin juuressa crypt alueiden sytosoliin solujen kärkeä paikallinen ytimet (tähdellä). Spesifisyys näistä signaaleista ja identiteetti solujen jota ei tutkittu tarkemmin. (B) edustaja näyte meprin-α positiivinen primaarikasvaimen vaiheen III. Kasvaimet näytteille mosaiikki ilme kuvio. Syöpäsolun klustereita, solut vahvat signaalit meprin-α (nuolet) sekoitetaan keskenään soluilla, jotka osoittavat heikkoja signaaleja tai mitään signaalia lainkaan. Solut strooman eivät ilmennä meprin-α (C) edustaja näyte meprin-α positiivinen primaarikasvaimen vaihe IV osoittaa klustereita meprin-α positiiviset syöpäsolut (nuolet). (D) Syöpäsolut ilmentävät meprin-α (nuolet) maksassa etäpesäkkeitä (Met). Ympäröivä normaali maksakudosta (Hep) on vain heikosti värjätään.

(A) Semikvantitatiivisilla arviointi meprin-α ilmentymisen peräsuolen karsinoomat käyttäen immunohistokemiallista pisteet (vähintään pisteet 1, maksimi pisteet 16) . + = Mediaaniarvot. (B) Lisääntynyt proteolyyttisen aktiivisuuden meprin-α in primaarikasvainten vaiheiden I-IV verrattuna adenoomien ja etäpesäkkeitä. Proteolyyttisen aktiivisuuden meprin-α mitattiin käyttämällä keinotekoista substraattia N-bentsoyyli-L-tyrosyyli-p-aminobentsoehappoa (PABA-peptidi). Kynnysarvo 2,5 umol /h /g proteiinia vastaa kahden keskihajonnan keskiarvon yläpuolelle on adenooma ryhmässä. Kasvua proteolyyttisen toiminnan yli kynnyksen havaittiin 36%, 40%, 44% ja 33% primaarikasvaimen näytteet vaiheissa UICC I, II, III ja IV, vastaavasti, mutta ei maksassa etäpesäkkeitä. Tilastollinen analyysi suoritettiin välillä primaarikasvainten vaiheiden I-UICC IV yhtenä ryhmänä ja adenoomia, tai etäpesäkkeitä (yksipuolinen Wilcoxonin summa testi riippumattomien näytteiden). + = Mediaaniarvot.

Meprin-α aktiivisuutta, tsymogeenillä aktivointi ja esto

Meprin-α-aktiivisuus nimenomaan mitattiin proteiiniuutoksia kudosnäytteistä läsnäollessa laajan proteaasinestäjä suunnattu kaikille proteaasin luokkia lukuun ottamatta metalloproteaasit. Meprin-α aktiivisuus oli alhainen adenoomien, kun taas merkittävästi parannettu aktiivisuus mitattiin osajoukko (33 44%) primaarikasvainten vaiheiden I-IV (Fig. 4B, p 0,01 vaiheissa I-IV verrattuna adenoomia). Maksan etäpesäkkeitä, yllättäen, meprin-α aktiivisuuden taso oli niinkin alhainen kuin adenoomissa, huolimatta merkittävästä proteiinin ilmentymistä (p 0,01 verrattuna primaarikasvainten vaiheiden I-IV).

Näennäinen ristiriita alhainen aktiivisuuden ja korkeat meprin-α proteiini tasoilla maksassa etäpesäkkeitä (Fig. 2C ja 3) saattaa johtua puute meprin-α tsymogeenillä aktivoinnin, eikä estäjä nimenomaan läsnä maksassa etäpesäkkeitä. Sen määrittämiseksi, missä määrin tsymogeeninä aktivaation Tuumorinäytteissä ensin immunosaostettiin -tsymogeeni ja aktiivisten muotojen meprin-α ja mitattu aktiivisuus suoraan helmiin. Tämä arvo, joka edusti endogeenisesti aktivoitu proteaasi-allas, verrattiin toiminnan immunosaostumissa jälkeen enintään tsymogeenillä aktivointi rajallinen trypsiinikäsittelylle [18]. Esiaste muoto meprin-α vallitsivat kaikissa näytteissä. Kuitenkin endogeenisen aktivointi meprin-α oli merkitsevästi suurempi primaaristen kasvainten kuin maksan metastaaseja (Fig. 5A). Vuonna ensisijainen kasvaimia I-IV, peräti 20% koko meprin-α aktivoitiin endogeenisesti, ja kaikki paitsi yksi näyte näkyy endogeenisen aktivointi yli 5%. Kääntäen, endogeeninen aktivointi oli alle 5% kaikissa muissa paitsi kahdessa näytteessä maksametastaaseista. Lopuksi kasvanut tsymogeenillä aktivointi voi myötävaikuttaa lisääntyneeseen meprin-α aktiivisuutta primaarikasvaimen sivustoja verrattuna metastaasien maksassa.

Meprin-α immunosaostettiin kasvainnäytteet, kahteen erään johtaa endogeenisen ja kokonaisaktiivisuus, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. (A) suhde endogeenisen meprin-α aktiivisuus verrattuna kokonaisaktiivisuus primaaristen kasvainten (P, N = 7) ja metastaaseja (M, N = 10). Tsymogeenillä aktivointi on merkittävästi parannettu primaarikasvainten verrattuna maksametastaaseja. (B) Seeruminäytteitä kolorektaalisyövän potilaista esiintyy alempi estävä toiminta vastaan ​​meprin-α. Proteolyyttisen aktiivisuuden puhdistetun ihmisen rekombinantti meprin-α (800 ng /ml) määritettiin, kun läsnä oli 20% ihmisen seerumia. Toiminta on esitetty suhteessa viite-määrityksessä 20% fosfaattipuskuroitua suolaliuosta, pH 7,3 (= 1). N: Normaali terveiden verrokkien (N = 19), NC: Non-syöpäpotilaille ryhmä, johon kuuluu näytteitä 22 inviduals kanssa tulehdussairauksiin suolistossa, CRCI-III: peräsuolen syöpäpotilailla (N = 15) vaiheiden I-III. CRCIV: peräsuolen syöpäpotilailla (N = 9) vaihe IV. Vähensi merkitsevästi esto meprin-α seerumissa peräsuolen syöpäpotilailla.

Alennettu esto meprin-α seerumeista peräsuolen syöpäpotilaiden

Kiertävä syöpäsoluja saattaa törmätä tekijät veressä jotka moduloivat meprin-α aktiivisuutta. Itse asiassa, toiminnan määritys rekombinantti meprin-α, kun läsnä on 20% ihmisen seerumia, terveiden kontrollien ja ryhmän potilailla, joilla on suoliston tulehdussairaudet merkitty esto 35% (5-50%) ja 22% (vaihteluväli 0-59 %), vastaavasti. Sen sijaan seerumit peräsuolen syöpäpotilailla (vaiheet I-IV) esti meprin-α on huomattavasti vähemmän (12% keskimäärin 0-37%, p = 2,8 * 10

-6 terveisiin kontrolleihin verrattuna, p = 0,013 verrattuna potilaisiin, tulehdussairauksiin) (Fig. 5B). Potilaiden seerumi vaiheissa I-III oli alennettu estävää kapasiteettia verrattuna normaaliin potilaille, joka ei merkittävästi eronnut potilaiden vaiheessa IV. Estymistä seerumissa oli riippumaton MBL, kuten MBL pitoisuudet seerumissa ei eronnut merkittävästi ryhmien välillä ja myös ei korreloinut meprin-α esto (ei kuvassa). Lisäksi, yhdistelmä-DNA-MBL ei estä ihmisen, hiiren ja rotan meprin N-bentsoyyli-L-tyrosyyli-p-aminobentsoehappoa (PABA-peptidi) määrityksessä (taulukko S1).

Yhteenvetona voidaan todeta, että on dynaaminen ja monimutkainen sääntely malli aktiivisuuden meprin-α kolorektaalisyövässä. Lisääntynyt tsymogeenillä aktivointi voi osaltaan lisätä proteolyyttinen aktiivisuus primaarikasvainten vaiheiden I-IV, ja estävä vaikutus meprin-α vähenee veressä peräsuolen syöpäpotilailla.

Keskustelu

Tutkimus merkitsee, että meprin-α on aktiivinen siirtyminen hyvänlaatuinen kasvu (adenoomia) pahanlaatuiseen primaarikasvaimia. PABA-peptidin aktiivisuuden syöpäkudoksessa on spesifinen meprin meidän määrityksessä, kun me hoiti tukahduttaa mahdolliset epäspesifiset toimintaa täydentämällä määrityksessä laajan proteaasiestäjäseostabletit. Erityisesti, kymotrypsiinin kaltaisia ​​proteaaseja, jotka ovat ainoa tunnettu entsyymejä pilkkomaan pystyvän PABA-peptidin lisäksi meprin [25], estyvät näissä olosuhteissa. Meprin-α proteiini ja aktiivisuus lisääntyi jälkimmäisessä ryhmässä, vaikka ei ollut merkittävää eroa vastaavien mRNA-tasojen välillä eri ryhmiin. Adenoomia määritelmän on ominaista lisääntynyt kasvunopeus solujen normaalin erilaistumisen ja solujen polarisaatio [26]. Siksi, muistuttaa normaalin paksusuolen limakalvo, meprin-α voidaan erittää ja menetti sen jälkeen suoleen onteloon, kun taas proteaasi säilyy sisällä kasvainkudoksen kolorektaalisyövässä johtuen poikkeavasta polaroimatonta eritystä, mekanismi kuvata meitä aikaisemmin [ ,,,0],4]. Lisäksi on näyttöä posttranskriptionaalisella sääntelyä meprin-α edellisestä tutkimuksessa, koska meprin-α-mRNA havaittavissa

in situ

hybridisaatio sekä krypta ja nukka alueilla, kun taas proteiinia havaita Immunovärjäys vain läsnä villus enterosyyteissä [6].

kolorektaalisyövän, primaarikasvainten sisälsi kasvoi meprin-α aktiivisuuden ja usein kanna alapopulaation syöpäsolujen vahvojen meprin-α-proteiinin ilmentymisen, erityisesti UICC vaiheet III ja IV, eli sen jälkeen eteneminen etäpesäkkeiden imusolmukkeisiin ja kaukaisiin kohtiin (Fig. 2 ja 3). Levittäminen syöpäsolujen siten korreloi lisääntyneeseen meprin-α-proteiinin ja aktiivisuutta. Kuitenkin toteamme, että korrelaatio immunoblot signaaleja immunovärjäyty- tulokset ja meprin-α-aktiivisuuden tasot ryhmissä primaarikasvainten ei ole tiukka. Immunovärjäyksen pisteet ei harkita tiheyttä ja meprin-α signaalien joukossa syöpäsoluja ainoastaan ​​paikallisesti rajoitetulla alueella näytteen, kun taas immunoblot signaali on keskimäärin koko otoksesta erittyy meprin-α kerääntymistä kasvaimen strooman [4] . Meprin-α aktiivisuustaso kohdistuu lisäksi -tsymogeeni aktivointi ja läsnäolo estäjien.

sairastavien potilaiden seerumi peräsuolen syöpä näkyy huomattavasti alhaisempi estävä aktiivisuus meprin-α kuin terveiden verrokkien ja potilailla, joilla on suoliston tulehdussairauksien, mikä osoittaa, että maastamuutto verenkierrossa meprin-α ilmentävien syöpäsolujen ulos verisuonista voidaan helpottaa. Inhibitorinen aktiivisuus seerumissa ei johtunut mannaanin sitova lektiini, endogeeninen meprin inhibiittorin on raportoitu aiemmin [16], ja näin ollen on vaikuttanut yksi tai useita muita estäjä (t). Tuoreessa raportissa, fetuiini-A ja kystatiini C on raportoitu sellaisenaan endogeenisten meprin inhibiittorit [17]. Itse asiassa, käyttämällä rekombinantti ihmisen MBL, ei havaittu olevan inhibitiota meprin (taulukko S1). Tämä havainto on ristiriidassa raportin Hirano et al. [16]. Kuitenkin meidän tiedot ovat sopusoinnussa puute korrelaatio inhibitiota potilaiden seerumit ja MBL keskittyminen. Toiseksi, kuten Hirano et ai. käytetyt MBL puhdistettiin ihmisen seerumin niiden meprin inhibitiomäärityksissä spekuloida, että ero välillä ja niiden tiedot johtuu likaantumistekijät ihmisen seerumista, kuten fetuiinin-A: n ja /tai kystatiini C.

on dynaaminen ja monimutkainen sääntely rakenteessa aktiivisuuden meprin-α kolorektaalisyövässä. Lisääntynyt tsymogeenillä aktivointi edistää korkeampi proteolyyttisen aktiivisuuden primaaristen kasvainten vaiheiden I-IV (Fig. 5A), ja estävä vaikutus meprin-α vähennetään veren kolorektaalisyövässä potilailla (kuvio. 5B). Tehoton aktivaatio metastaaseja on mukaisesti edellisen havainnon, että uPA-järjestelmä, meprin-α aktivaattori, on inaktiivinen metastaaseja, koska ei ole uPA aktivointi ja yli-ilmentyminen plasminogeeniaktivaattori-inhibiittori [27] , [28]. Vaikka monet matriksimetalloproteaaseja (MMP: t) tiedetään lisätään invasiivisia primaarikasvaimille kolorektaalisyövässä [29], on olemassa muutamia analyysit, jotka sisältävät maksan etäpesäkkeitä. Yhdessä tällaisessa tutkimuksessa, MMP-9: n osoitettiin lisätään primaaristen kasvainten, mutta ei maksassa etäpesäkkeitä [30]. Tämä tutkimus ja meidän tiedot osoittavat merkittäviä eroja proteaasin verkkojen ensisijainen kasvaimia ja metastaaseja, jotka ovat merkityksellisiä hoitomenetelmät käyttäen proteaasinestäjät.

tutkittu soluvaelluksen MDCK soluissa, jotka ilmentävät meprin-α solun pinnalla sidottu heterodimeeriproteiinia komplekseja transmembraanisen meprin-β [31]. Meprin-ilmentävien solujen siirtyivät huomattavasti nopeampaa laminiini-1 päällystetty ruokia läsnä plasminogeenin ja HGF. Meprin-α voidaan aktivoida solun pinnalla plasmiini, syntyy plasminogeenin toiminnan kautta urokinaasi plasminogeeniaktivaattorin (uPA), sitoutuu sen reseptoriin (u-PAR), jotka molemmat tiedetään olevan ajan säädellään HGF MDCK-solut [32]. Tämä järjestelmä todennäköisesti edistää myös aktivoinnin meprin-α kasvaimissa

in vivo

, kuten u-PA ja u-PAR ovat säädellään ylöspäin kolorektaalisyöpä [33], [34], [35] , [36]. Meidän migraatiokokeessa, pro-muuttavien vaikutus on todellakin johtuu meprin-α, kuten plasmiini aktivoi meprin-α mutta ei meprin-β [7] ja koska aktinoniinin, joka kääntää pro-muuttavien vaikutus, tekee estävät meprin-α kanssa noin 100-kertainen vaikutus (K

i 2 * 10

-8 M) kuin meprin-β (K

i 2 * 10

-6 M) [10].

sekä laminiini-1 ja laminiini-5 lohkaistaan ​​meprin-α

in vitro

[37], ja me spekuloida, että meprin-α voi altistaa kryptisiä pro-vaeltavien epitoopit samalla tavalla kuin on ollut aiemmin näytetään laminiinin-5 ja laminiini-1 MT1-MMP [38] ja elastaasin [39], tässä järjestyksessä. UPA-plasminogeeni järjestelmä on myös ratkaiseva merkitys angiogeneesissä [23], [40], ja plasmiini puolestaan ​​saattaa aktivoida meprin-α alavirran angiogeenisten efektori kolorektaalisyövässä. Mukaisesti tietomme, pro-angiogeeninen vaikutus meprin-α on havaittu myös morfolinojohdannainen knockdown seeprakalasta [14].

Pro-angiogeneettisiä aktiivisuus oli ilmeistä ekstrasellulaarisen liukoisen meprin-α, kun taas sen pro-muuttavien vaikutus näkyi soluihin kanssa meprin-α niiden solun pinnalla. Siksi pro-angiogeneettisiä vaikutus meprin-α vapautuu syöpäsolut voidaan edistää sen proteolyyttinen aktiivisuus ulkopuolella ja etäällä angiogeneesiä /vaskulogeeniseen soluja. Erittyy meprin-α voi siten ilmastoida kasvaimen ympäristö edistää parannettu angiogeneesiä yhdessä muiden pro-angiogeenisten tekijöiden, kun taas meprin-α kytkettyinä solun pinnalla voi edistää siirtymistä syöpäsolujen itse. Sekä meprin riippuvia prosesseja odotetaan yhdessä edistämään syövän etenemiseen.

Yhteenvetona tämä tutkimus paljastaa monimutkainen ja dynaaminen sääntelyn malli meprin-α kasvaimen etenemiseen. Siirtyminen pahanlaatuisia vaiheisiin Kolorektaalituumorien korreloi lisääntyneeseen meprinα aktiivisuus primäärikasvain sivustoja, sopusoinnussa rooli hyökkäyksen ja metastaattisen levittäminen syöpäsoluja. Rooli for meprin-α tässä prosessissa tukee lisäksi sen angiogeneesiä ja pro-muuttavien aktiivisuutta. Tuloksemme osoittavat myös, että edistäminen muuttoliikkeen riippuu samanaikaisiin ilmaus meprin-β-jaon meprin-α päälle solun pintaan. Puute havaittavissa meprin-β mRNA koko kasvain ei sulje pois sen induktio in alapopulaation syöpäsoluja. Tuloksemme ovat yhtä mieltä mieltä, että meprin-α /β koekspressoivan syöpäsolujen todennäköisesti siirtyy pois kasvain massasta. Olemme aiemmin kuvattu, että meprin-β heikentää välisissä liitoksissa [41]. Jatkotutkimuksissa tulisi keskittyä analysointiin roolin meprins maastamuuttoalueilla näistä syöpäsoluja. Inhibitorinen aktiivisuus meprin-α on pienempi sairastavien potilaiden seerumi peräsuolen syöpä, joka saattaa helpottaa levittämistä meprin ilmentäviä syöpäsoluja. Hoitomenetelmät proteaasinestäjien kanssa kohdistamista meprin-α perusasteen kasvaimia ja verenkiertoon voisi toimia kasvaimen etenemistä. Toisaalta, meprin-α aktiivisuus on alhainen maksaetäpesäkettä, ja siksi esto tämän proteaasin tällä sivustolla ei odoteta olevan tehokas hoito.

Materiaalit ja menetelmät

Rekombinantti ihmisen meprin

Rekombinantti aktiivinen meprin-α ja meprin-β puhdistettiin hyönteissolut kuten aiemmin on kuvattu [7], [42]. Ole mitään jäljelle jäävää trypsiinin aktiivisuus oli havaittavissa puhdistettua rekombinanttista meprins.

Cell migraatiokokeessa

Madin-Darby koiran munuaissolut (MDCK) soluja kasvatettiin minimi essential medium (MEM), jota oli täydennetty 5% FCS , 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä (soluviljelyalustassa ja täydentää Invitrogen, Basel, Sveitsi). Meprin-transfektoidut MDCK-solut [31] ja villin tyypin kanta-MDCK-soluja siirrostettiin 1-laminiinin päällystetty 12-kuoppalevyille tiheydellä 10000 solua /kuoppa (12-kuoppalevyillä Costar, Cambridge, MA, USA, puhdistettua laminiini-1 peräisin Engelbreth-Holm-Swarm hiiren sarkooma, Sigma, St. Louis, MO, USA A) ja inkuboitiin yön yli MEM 5% FCS. Sen jälkeen, kun esi-inkubointi 48 h seerumittomassa väliaineessa (Advanced DMEM, Invitrogen), joka sisälsi 20 nM hepatosyyttikasvutekijän (HGF), vaeltavat solut rekisteröitiin käyttäen Viivästys Videomicroscopy 3-4 h. Plasminogeeni (American Diagnostica, Pfungstadt, Saksa) ja aktinoniinin (Sigma) sekä lisättiin 100 nM. Migration kappaleita arvioitiin raportoitu aiemmin [22]. HGF aiheuttama migraatio MDCK-soluissa nopeudella välillä 27 ja 84 um /h. Koska HGF, MDCK-solut kasvavat klustereita ja eivät siirry. Koska teknisen rajoittamiseen koejärjestely käytetty useita muuttoliike kokeita jouduttiin suorittaa peräkkäin eri päivinä. Koska keskimääräinen muuttoliikkeen nopeudet vaihtelivat merkittävästi kokeellisen istuntojen riippumatta olosuhteet arvioidaan. mittaukset normalisoitiin muuttoa Villityypin soluista todettiin kummassakin koetilannetta.

angiogeneesimääritys (aortan rengas määritys) B

Rings rotan rintakehä aortan (1 mm pituus) viljeltiin 3-ulotteinen kollageenigeelit (rotan hännän interstitiaalinen kollageenigeeli, 1,5 mg /ml, Serva, Heidelberg, Saksa) [23]. Viljelmiä ylläpidettiin 9 päivää 37 ° C: ssa 6 ml MCDB 131 (Invitrogen) ja 25 mM NaHCO 3, 1% glutamiinia, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä läsnä tai poissa ollessa 0,7 ug /ml puhdistettua yhdistelmä-aktiivista ihmisen meprin-α. Angiogeeninen vaste kvantifioitiin käyttäen kuva-analyysi-ohjelmiston Aphelion 3,2 (Adcis) on kolmen erillisen kokeen (kukin kolmena kappaleena). Sen jälkeen geometriset ja morfologiset parametrit määritettiin: määrä pienten verisuonten (NV), maksimaalinen pienten suonten pituus (Lmax) ja kokonaismäärä oksat mikroverisuonten (Nb) [43].

Potilaat

kokoelma kasvain näytteet aikana kirurgiset toimenpiteet hyväksyttiin eettisen komitean lääketieteellisen tiedekunnan, University of Bern, Sveitsi. Kirjallinen suostumus saatiin kaikilta potilailta. Karsinoomien lavastettu mukaan UICC nimikkeistön. Tutkimukseen osallistui 72 potilasta (49/23 mies /nainen, mediaani 64,5 v, alue 20-90 vuotta), jossa 12 potilasta kussakin kuuteen ryhmään adenoomia (5/7 m /f, mediaani 68,5 v, alue 20 -89 v), primaarikasvainten vaiheessa I (7/5 m /f, mediaani 72,5 v, alue 60-90 v), vaihe II (7/5 m /f, mediaani 73 v, alue 50-82 v), vaihe III (10/2 mies /nainen, mediaani 64 v, alue 48-84 v), vaihe IV (9/3 m /f, mediaani 60,5 v, alue 43-84 vuotta) ja maksametastaaseista (11/1 m /f , mediaani 57,5 ​​v, vaihtelevat 31-84 v). Näytteet Tämän tutkimusryhmä on analysoitu Northern ja Western blotting, immunohistokemia ja alistettiin meprin aktiivisuuden määrityksissä. Kokeet kuvassa. 5A /B sisältyy uuden kahdeksan näytettä maksametastaaseista (6/2 m /f, mediaani 68 v, alue 37-82 v).