Krooninen sairaus

tiivistelmä

oksidatiivisen stressin, tärkeä tekijä modulaatio glykolyyttisen reitin ja induktio stressiä aktivoitu geenien, on edelleen täydennetty alentuneen antioksidantti puolustusjärjestelmä, joka edistää syövän etenemisen kautta angiogeneesin. Curcumin, luonnossa esiintyvä chemopreventive phytochemical, on raportoitu estävän syövän syntymistä eri koe-eläinmalleissa. Kuitenkin taustalla olevaa mekanismia osallistuvien syöpää toiminta curcumin koska sen pitkän aikavälin vaikutus on vielä raportoitu, koska sen nopeasta metaboliasta, vaikka metaboliitteja kertyy kudoksiin ja pysyä pidempään. Siksi pitkän aikavälin vaikutus curcumin tarvitsee perusteellisen tutkimuksen. Tässä tutkimuksessa pyrittiin analysoimaan antikarsinogeenisia toimintaa curcumin maksassa, vaikka hoidon lopettamisen jälkeen Dalton lymfooma hiirille. Oksidatiivisen stressin havaittu lymfooman eteneminen pienentää antioksidantti-entsyymin toimintaa, ja angiogeneesin sekä aktivointi varhaisen stressiä aktivoitu geenit ja glykolyyttisten reitin. Curcumin hoito johti aktivoituminen antioksidantti-entsyymin superoksididismutaasi ja alas säätely ROS tasolla sekä aktiivisuuden ROS tuottaa entsyymiä NADPH: oksidaasin ilmentyminen stressin aktivoitua geenien HIF-1α, cMyc ja LDH-aktiivisuus kohti normaalia tasoa. Lisäksi se johtaa huomattaviin angiogeneesin estäminen, havaittiin kautta MMP toimintaa, PKC-a ja VEGF tasolla, sekä Matrigel tulppa määrityksessä. Näin Tämän tutkimuksen päätellä, että pitkän aikavälin vaikutus curcumin osoittaa antikarsinogeenisia potentiaalia indusoimalla antioksidantti puolustusjärjestelmää ja angiogeneesin estäminen kautta alas säätely stressiä aktivoitu geenien ja glykolyyttisen reitin maksassa lymfoomaa kantavien hiirten.

Citation : Das L, Vinayak M (2014) Long Term vaikutus Curcumin asetuksen glykolyyttisten Pathway ja Angiogeneesi kautta modulaatio Stressi Aktivoitu geenien syövän ehkäisy. PLoS ONE 9 (6): e99583. doi: 10,1371 /journal.pone.0099583

Editor: Gautam Sethi, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, Singapore

vastaanotettu 25 maaliskuuta, 2014; Hyväksytty: 15 toukokuu 2014; Julkaistu: 16 kesäkuu 2014

Copyright: © 2014 Das, Vinayak. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki tiedot sisältyvät paperin.

Rahoitus: Työtä tukivat avustuksia Ministry of Science and Technology (Grant No.-SR /S0 /AS-97/2007), Intian hallitusta MV . Rahoittaja ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kohonneet reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) kuten superoksidiradikaaleja ja H

2O

2 toimivat signalointimolekyylejä eri osa kasvutekijä-vasteita kuten angiogeneesin aikana syövän etenemisen. Päälähde ROS tuotanto säätelee NADPH oksidaasin. Verisuonten endoteelin kasvutekijä (VEGF) on merkittävä angiogeneesiä indusoija, joka stimuloi proliferaatiota, migraatiota, ja putken muodostumiseen endoteelisolujen (EC) läpi VEGF-reseptori Type2. VEGF: n indusoimaa angiogeneesiä välittää proteiinikinaasi C: n (PKC), PKC on mukana signalointireitissä VEGF-välitteistä kasvaimen kehittymisen ja angiogeneesissä [1]. PKC-a edistää angiogeenistä aktiivisuutta endoteelisolujen kautta induktion VEGF: n ja VEGF parantaa omaa ilmentymisen kautta PKC-a-riippuvaisia ​​positiivisen palautteen avulla [2]. Lisäksi VEGF säännellään transkription tasolla hypoksia-indusoituva tekijä 1-α (HIF-1α) vastauksena hypoksia [3], [4]. HIF-1 paitsi säätelee hapensaanti (angiogeneesi), mutta hapenkulutus (glykolyyttisissä aineenvaihdunta) myös hypoksinen kasvaimen mikroympäristössä [5]. Expression useita geenejä alkaen onkogeeni-välitteisen seurasi HIF-1 välitteistä geenit indusoidaan, jotka edistävät aineenvaihdunnan muutosten aikana karsinogeneesiin. Se johtaa siihen, että erittäin glykolyyttisissä ”Warburg” fenotyyppi ja tukahduttaminen mitokondrioiden biogeneesin [6]. Säätely on laktaattidehydrogenaasin A (LDH-A) on tärkeä molekyyli välittäjäaine Warburg vaikutus, joka esiintyy myös aerobisen kunnon seurauksena hypoksinen kasvain mikroympäristön ja muutoksia tietyissä onkogeenien tai tuumorisuppressorigeeneille [7]. Lisäksi, yliekspressio LDH-A säätelee HIF-1 kanssa säätelemättömään c-Myc. On havaittu, että onkogeeniset aktivaation kautta sääntelemättömään ilmentymiseen c-Myc edistää tuumorigeneesiä eri kudoksissa transgeenisissä hiirissä ja monenlaisia ​​ihmisen syövissä, mukaan lukien lymfoomat [8]. Niinpä vapauttaminen ilmentymisessä onkogeenien, kasvaimeen synnyssä ja vakautta geenit ovat mukana Karsinogeneesin jotka johtavat entistä alhaisemmalle tasolle antioksidanttipuolustuksen kasvaimen mikroympäristössä ja syöpäsolujen [9]. Lisäksi, matriksimetalloproteinaasi (MMP) ovat sinkkiä riippuvaisia ​​proteolyyttiset entsyymit, katkaisevat soluväliaineen sekä ei-matriksisubstraatteja (kasvutekijät, solun pinnan reseptorit, jne) ja säädellä signalointireittejä, jotka ohjaavat solujen kasvua, tulehduksia tai angiogeneesiä. Se toimii modulaattori kasvaimen microenvironment ja voi jopa työskennellä proteolyyttiset tavalla. Vapautuminen MMP on mukana monia sairauksia, kuten kasvaimen etäpesäke, nivelreuma, ja parodontiitin [10], [11]. Lisäksi MMP: t uudelleen angiogeenisen VEGF-aktiivisuutta heikentämällä valikoidusti sidekudoksen kasvutekijä (CTGF), yhtenä isoformeja VEGF sitoo CTGF ja angiogeenisen VEGF estyy VEGF-CTGF kompleksin [12]. Siten esto angiogeenisten toiminnan kautta modulaatio glykolyyttisen reitin aktivaatio endogeenisen antioksidantin puolustusjärjestelmää ja estämällä ROS muodostumisen voisi olla askel estää syövän synnyn. Aikana etenemistä Dalton lymfooman (hiiren transplantable non-Hodgkinin T-solulymfooma), eri osat ovat vaikuttaneet myös maksan ja luuytimen ulkopuolella imunestejärjestelmän. Maksa on tärkein metabolinen ja detoxifying elin elin vaikuttaa suuresti aikana lymfooma etenemisen. Lisäksi, etäpesäke ja maligniteetin on vahvistettu aiemmin maksassa Dalton lymfooma laakeri (DL) hiiriä, jotka ovat ominaisuuksia, non-Hodgkin-lymfooma [13], [14].

Laaja valikoima luonnollisesti esiintyviä fytokemikaaleja voi antaa optimaalisen terveyshyötyjä ihmisille. Käyttö täysuutteella tai yhden eristetty aineella tai aineenvaihduntatuote eristetyn osatekijän saavuttamaan toivottavaa terveyshyötyjä on ollut kysymys aiemmin useita vuosia. Curcumin, luonnossa esiintyvä chemopreventive phytochemical johdettu kurkuma (

Curcuma longa

), on raportoitu estävän kemiallisesti indusoidun syövän syntymistä useita elinkohdissa eri koe-eläinmalleissa. Curcumin tukahduttaa aktivointi useiden transkriptiotekijöiden, jotka osallistuvat kasvaimia synnyttävän toimintaan, lohkot muutos, leviämisen ja invaasion sekä indusoi apoptoosia kasvainsoluissa. Näin curcumin osoittaa valtava lupaus syövän hoitoon [15]. On kuitenkin vielä ilmoitetaan onko antikarsinogeenisia toiminnan curcumin johtuu kumulatiivinen vaikutus sen aineenvaihduntatuotteiden tai johtuu curcumin itsessään, kuten metabolia curcumin on erittäin nopea, mutta aineenvaihduntatuotteita säilyä pitempään eri kudoksissa [16]. Edelleen, varaamiseen todisteet viittaavat siihen, että kulutus kokonaisuudessaan tai osittain puhdistettu ruoka otteita on edullisempaa yli yhden eristetty osatekijän olemassaolon johdosta synergistisiä vuorovaikutuksia fytokemikaalit koko elintarvikkeet [17], [18]. Siksi esillä oleva tutkimus suunniteltiin tutkimaan mekanismiin osallistuvien syöpää toimintaan curcumin jälkeenkin peruuttamisen annon. Tutkimus keskittyy glykolyyttisen reitin ja angiogeneesiä, yhteistyöhaluisesti säätelee c-Myc ja HIF-1 hapettavissa kasvain microenvironment metastaattisessa maksasta lymfooman kantavien hiirten.

Materiaalit ja menetelmät

reagenssit

Kaikki kemikaalit olivat analyyttistä ja molekyylibiologian luokka sekä endotoksiinia ja käytettiin ilman lisäpuhdistusta. Curcumin, reagensseja RNA: n eristys ja Taq-polymeraasi, fluoresoimaton 2 ’, 7’-dikloorifluoresiinidiasetaattia (H2DCFDA) ja HRP konjugoitu anti-β-aktiini ostettiin Sigma Aldrich. Käänteiskopioijaentsyymi-, ribonukleaasi Inhibitor, satunnaisia ​​alukkeita ja 100 emäsparin Plus DNA tikkaiden Fermentase Life Science ja alukkeilla RT-PCR syntetisoitiin Metabion. Anti-hiiri PKC-a ja VEGF-A-vasta-aine hankittiin Santacruz bioteknologian ja Biolegend vastaavasti. HRP-konjugoitua vuohen anti-kani ja kanin anti-rotta-sekundaarista vasta-ainetta Bangalore genei. Matrigel tyvikalvon matriisi BD Biosciences, gelatiinia Amresco ja ECL (Super signaali Kit) hankittiin PIERCE Biotechnology.

Eläimet ja induktio T-solulymfooma (Dalton lymfooma) B

Hiiret (AKR kanta) kasvatettiin ja ylläpidettiin vakio laboratorio-olosuhteissa asianmukaista ihmisen hoitoa, kohti suuntaviivat institutionaalisten eläimen eettisen komitean, 25 ± 2 ° C: ssa 12 h valo /12 h pimeäjaksoilla varustettu standardin hiirillä rehun ja juomaveden

halun

. Kaikki eläinkokeet suoritettiin hyväksyntää Institutional Animal eettisen lautakunnan, Banaras Hindu University. Tervettä aikuista uroshiirillä (16-20 viikkoa vanhoja ja 30 ± 2 g) käytettiin kokeellista työtä. Dalton-lymfooman (transplantable non-Hodgkinin T-solulymfooma) askites-solut transplantoitiin aikuisen hiirissä vatsaonteloon (ip) sarjasiirteillä noin 1 x 10

6 elinkelpoisia askites kasvainsoluja 1 ml: ssa fosfaattipuskurisuolaliuosta (PBS) hiirtä kohti, kuten aiemmin on kuvattu [19]. Dalton-lymfooma askites solut lahjakas professori Ajit Sodhi, School of Biotechnology, Banaras Hindu yliopisto, Varanasi, Intia. Dalton-lymfooma on transplantable hiiren T-solulymfooma alkunsa kateenkorva on DBA /2-hiiren National Cancer Institute, Bethesda, MD, vuonna 1947. [20].

kehittäminen DL varmistettiin epänormaali vatsan turvotusta ja lisääntynyt kehon paino, joka oli näkyvissä selvästi 10-11 vuorokautta transplantaation ja DL hiiret selvisivät 20 ± 2 päivää. Ensimmäinen 7-9 päivää alkaen seuraavan päivän DL elinsiirrot, kasvua Dalton lymfooma ei osoittanut mitään suurta muutosta kehon painon ja askites nesteen kertymistä. Niinpä ensimmäinen 7-9 päivää voidaan verrata lag-vaihe /valmistelu–vaiheessa sigmoidikäyrä varten askites solupopulaation kasvua. Siksi aikataulu curcumin hoidon DL hiiret valittiin vastaavasti 9 päivää alkaen seuraavana päivänä sen jälkeen, kun DL elinsiirron ja hiiret tapettiin 18. päivänä jälkeisen DL elinsiirron (ennen DL hiiret kuolee luonnollisesti) saada pitkän aikavälin vaikutus curcumin, kuten curcumin on täysin metaboloituu aineenvaihdunnan ennen 9 päivää viimeisenä hoitopäivänä. Siten vaikutus olisi johdu välitöntä vaikutusta curcumin mutta saattaa johtua metaboliittien curcumin.

Aikataulu curcumin hoidon DL hiirille ja kudoksen keräys

Yksi ryhmä normaali hiiriä käytettiin kontrollina, ilman mitään käsittelyä (N). DL-hiiret jaettiin satunnaisesti viiteen ryhmään 6 hiirtä kussakin ryhmässä (n = 6). Kolme ryhmää käsiteltiin eri annoksilla curcumin: 1,5 mg [Dalton lymfooma, joissa hiirissä, joita käsiteltiin 50 mg curcumin /kg kehon painoa (DLT50)], 3 mg [Dalton lymfooma, joissa hiiret, joita käsiteltiin 100 mg curcumin /kg kehon paino (DLT100) ], ja 4,5 mg [Dalton lymfooma, joissa hiiret, joita käsiteltiin 150 mg curcumin /kg kehon painoa (DLT150)], liuotettiin 50 ul: aan DMSO: kunkin hiiren päivässä läpi ip 9 päivää peräkkäin, alkaen seuraavana päivänä sen jälkeen, kun DL elinsiirrosta. Yksi ryhmä DL hiiret saivat 50 ui DMSO: ajoneuvon (DL + DMSO) samalla tavalla, ja toinen ryhmä DL-hiiriä käytettiin ilman mitään käsittelyä (DL). Kaikki hiirtä kustakin ryhmästä lopetettiin päivänä 18 jälkeisen DL elinsiirtojen taittamalla niskasta. Maksa irrotettiin heti Eläinten lopetuksen ja pestiin jäähdytetty normaalia suolaliuosta. Maksa kaikki eläimet (n = 6) ja yksi ryhmä yhdistettiin ja sekoitettiin hakkaamalla aseptisesti 4 ° C: ssa keskimääräinen tulos. Kerätyt kudosta käytettiin välittömästi tai säilytettiin -80 ° C: ssa jatkotutkimuksiin.

In vivo

angiogeneesimääritys

Toinen joukko kuusi ryhmää, jossa on kolme hiirtä per ryhmää otettiin tutkia

in vivo

angiogeneesiä. Kaikki käsittelyt olivat samat kuin edellä, paitsi että tällä kertaa DL transplantaation, kukin hiiriä kaikki ryhmät injektoitiin subkutaanisti 500 ui BD Matrigel tyvikalvon matriisin (Matrigel plug). Heti uhraa, matrigeeliä tulpat poistettiin. Tulpat olivat välittömästi valokuvattiin ja punnitaan. Kvantitoimiseksi vaskularisaatiosta tulpan, hemoglobiinin määrä (Hb) kerääntynyt tulppa mitattiin käyttämällä HEMOCOR-D kit (Crest Biosystems, Tulip Group, Intia) seuraten valmistajan protokollaa ja näytteiden absorbanssi mitattiin 540 nm: ssä.

RT-PCR

Yhteensä-RNA eristettiin käyttäen TRI-reagenssia (Sigma-Aldrich) kohti sen käyttöopas. DNaasikäsittely suoritettiin kokonais-RNA: käyttäen TURBO DNA-Free ™ Kit I poistaa genomista DNA-kontaminaation. RNA kvantitoitiin 260 nm: ssä ja eheys tarkistettiin 1% formaldehydiä agaroosigeelielektroforeesilla. CDNA syntetisoitiin eristetty kokonais-RNA: sta käyttämällä standardia seosta, joka sisältää kutakin dNTP: tä, satunnainen heksameeriä, M-MuLV käänteistranskriptaasia, RNaasi inhibiittoria ja reaktiopuskuria standardin protokollan Fermentas Life Science, ja cDNA: ta käytettiin välittömästi tai säilytettiin -80 ° C. Expression of isotsyymien SOD ja NOX, HIF-1α, cMyc, LDH-A, PKC-a, VEGF-A: n ja MMP 9 2 geenit tutkittiin semikvantitatiivinen RT-PCR: llä käyttäen syntetisoitiin cDNA. Taq-polymeraasi ja asianmukaisia ​​alukepareja (taulukko 1) käytettiin PCR-reaktioissa käyttäen Thermal cycler (Applied Biosystem). PCR aloitettiin 3 min 95 ° C: ssa denaturoinnin jälkeen suoritettiin kolme-vaiheen lämpötila aikana (taulukko 1). Lopullinen pidennys 72 ° C ° C: ssa 7 min otettiin sen jälkeen, kun viimeinen sykli loppuun polymerointia. Jaksojen määrä optimoitiin sisällä eksponentiaalinen vaihe vahvistusta. Koko monistetut tuotteet tarkistettiin agaroosigeelielektroforeesilla käyttäen 100 bp tikkaat. Yhtye voimakkuus monistettujen tuotteiden agaroosigeelissä tehtiin näkyväksi, valokuvattu ja analysoitiin käyttämällä Gel Doc-järjestelmää (Alpha Innotech

EY). Lisäksi bändi intensiteetti normalisoitui vastaaviin kaistalle β-aktiini sisäisenä kontrollina.

Ei-denaturoivaa PAGE ja spesifinen aktiivisuus värjäys

Toiminta geeliä määrityksiä käytetään mittaamaan entsyymiaktiivisuuden ja isoentsyymien kuvio antioksidantti-entsyymin SOD sekä NOX ja LDH. Koska korjauksilla entsyymiaktiivisuus on liittynyt metabolisia muutoksia, ei-denaturoivaa PAGE-analyysillä ja aktiivisuus geeli määritys parempana immunodetektioon, koska menetelmä hyödyntää substraattispesifisyys perustuva tunnistus vain aktiivinen osa proteiinia. Siten se katsotaan erittäin tärkeitä korreloimiseksi muutosta tason tietyn isoentsyymin kanssa, aineenvaihdunnan muutoksia solutasolla.

(SOD) B

aktiivisuus geelillä määritys SOD suoritettiin ei-denaturoivalla PAGE, jonka jälkeen aktiivisuus värjäys kohti menetelmä Beauchamp ja Fridovich [21]. Sama määrä proteiinia kustakin näytteestä erotettiin 10% ei-denaturoivaa PAGE 4 ° C: ssa. Elektroforeesin jälkeen geeli upotettiin 1,23 mM NBT liuosta 20 minuutin ajan pimeässä. Geeli oli lyhyesti pesty tislatussa vedessä ja inkuboidaan 15-20 minuutin ajan pimeässä 100 mM fosfaattipuskurissa (pH-7,0), joka sisälsi 28 mM TEMED ja 0,28 mM riboflaviini. Sitten geeli altistettiin loisteputki kunnes ulkonäkö selkeä vyöhykkeiden aromaattinen aktiivisuuden bändejä sinisellä pohjalla. Intensiteetti bändejä analysoitiin densitometrinen skannaus käyttämällä Alpha Image Analyser-järjestelmää (Alpha Innotech, San Leandro, CA, USA).

Toiminta värjäys NADPH: Oksidaasipositiivinen

taso entsyymiaktiivisuus NOX isotsyymien tunnistettiin kuin denaturointia PAGE, jonka jälkeen toiminta värjäyksen NBT väheneminen menetelmällä Sagi ja Fluhr [22]. Sama määrä proteiinia kustakin näytteestä erotettiin 10% ei-denaturoivaa PAGE 4 ° C: ssa. Elektroforeesin jälkeen geeli värjättiin 50 mM Tris-CI (pH-7,4) 0,2 mM NBT, 0,1 mM MgCl2: a, ja 1 mM CaCl2, pimeässä 20 min. Sitten 0,2 mM NADPH lisättiin värjäysliuos ja ulkonäkö sinisen formatsaanin bändejä havaittiin. Reaktio pysäytettiin upottamalla geelejä tislattua vettä. Intensiteetti bändejä analysoitiin densitometrinen skannaus käyttämällä Alpha Image Analyser-järjestelmää (Alpha Innotech, San Leandro, CA, USA).

Toiminta värjäytymisen laktaattidehydrogenaasin (LDH) B

geeli entsymaattisen aktiivisuuden määritys laktaattidehydrogenaasin suoritettiin ei-denaturoivalla PAGE seurasi spesifinen aktiivisuus värjäyksellä, kuten on kuvannut Dietz ja Lubrano [23]. Sama määrä proteiinia kustakin näytteestä erotettiin 8% ei-denaturoivaa PAGE 4 ° C: ssa. Elektroforeesin jälkeen geeli altistettiin LDH-spesifinen aktiivisuus värjäytymistä värjäytyminen, joka sisälsi 125 mM Tris-CI (pH-7,4), 0,5 mM magnesiumkloridia, 0,1 mM litium-laktaattia, 1 mg /ml NAD, 10 mM NaCl, 0,25 mg /ml NBT ja 0,025 mg /ml PMS kevyesti ravistellen 5-10 minuuttia huoneenlämmössä sen jälkeen, kun kehitys LDH bändejä geeli pestiin. Intensiteetti bändejä analysoitiin densitometrinen skannaus käyttämällä Alpha Image Analyser-järjestelmää (Alpha Innotech, San Leandro, CA, USA).

Vetyperoksidia määritys

Vetyperoksidi tasolla maksakudosta oli mitattiin spektrofotometrisesti ottamalla absorbanssi 570 nm: ssä, kuten aiemmin on kuvattu [24]. Pitoisuus H

2O

2 kussakin näytteessä määritettiin käyttämällä standardikäyrää, syntyy ottamalla tunnettu määrä H

2O

2, ja ilmaistaan ​​umol /mg proteiinia.

ROS Pitoisuus

Yhteensä ROS taso määritettiin oksidatiivisen konversion fluoresoimaton 2 ’, 7′-dikloorifluoresiinidiasetaattia (H2DCFDA) erittäin fluoresoiva 2′, 7’-dikloori-(DCF), kuten aiemmin on kuvattu [25 ]. Maksa uutteet määrä 100 ui, inkuboitiin 37 ° C: ssa 60 minuutin ajan 100 ul: lla 2 mM H2DCFDA (Invitrogen) PBS: ssä. Fluoresenssi kirjattiin 485 nm (viritys) ja 527 nm (emissio) HITACHI F-3000 fluoresenssispektrofotometriä. Taso ROS kussakin näytteessä määritettiin tarkkailemalla fluoresenssin (absorbanssi) /mg proteiinia.

gelatiinitsymografialla

aktiivisuus MMP kudoksen näyte analysoitiin tutkia liivate hajottavaa aktiivisuutta käyttäen symografialla, kuten on kuvattu aiemmin [26]. Sama määrä proteiinia kustakin näytteestä sekoitetaan yhtä suureen tilavuuteen 2X ei-pelkistävän puskuria (0,125 M Tris-Cl, pH-6,8, 20% glyserolia, 4% SDS: ää, 0,003% bromifenolisinistä) erotettiin 4 ° C: ssa 8% ratkaista ja 5% pinoaminen SDS-PAGE, joka sisälsi 0,1% gelatiinia. Elektroforeesin jälkeen geeli pestiin kahdesti 2,5% Triton X-100: ssa 20 minuuttia kukin, jotta SDS: n poistamiseksi ja renaturoi entsyymejä. Geeli inkuboitiin sitten 20 tunnin ajan 37 ° C: ssa puskurissa, joka sisälsi 21 mM Tris-CI (pH-7,6), 10 mM CaCl2, ja 0,04% NaN3. Sitten geeli pestiin tislatulla vedellä, värjättiin CBB ja väri poistettiin metanoli ja etikkahappoa. Proteaasiaktiivisuutta havaittiin selkeä bändi pilkottu liivate. Intensiteetti bändejä analysoitiin densitometrinen skannaus käyttämällä Alpha Image Analyser-järjestelmää (Alpha Innotech, San Leandro, CA, USA).

Tilastollinen

Tilastollinen analyysi suoritettiin SPSS-ohjelmistoa käyttäen yhtä -way ANOVA seurasi Tucky testi. Arvot ilmaistiin keskiarvo ± SEM saatu kolme erilaista kokeissa, p 0,05 otettiin tilastollisesti merkitsevä (95%: n luottamusväli). # P 0,05 ja ## 0,01 verrattuna N * p 0,05 ** p 0,01 verrattuna DL + DMSO-ryhmässä.

Tulokset

Expression ja entsyymiaktiivisuus SOD

SOD maksassa DL ja DL + DMSO hiirillä havaittiin säädeltiin merkittävästi verrattuna normaaliin. Ilmaisut Sekä Mn-SOD ja Cu /Zn-SOD DL hiirillä olivat 75% ja 78% normaalista hiirten ja 82% ja 69% normaalista vastaavasti DL + DMSO. Merkittävä ylös ekspression säätelyn sekä isotsyymien SOD todettiin kohti tavanomaiselle tasolle curcumin hoito; Mn-SOD voimistunut Jopa 1.21 kertaiseksi ja 1.22 kertainen DL + DMSO hiiriä 100 ja 150 mg curcumin /painokilo vastaavasti ja Cu /Zn-SOD Jopa 1,15 kertainen, 1,42-kertainen ja 1,1-kertainen DL + DMSO 50, 100 ja 150 mg curcumin /painokilo vastaavasti [Fig. 1 (A)]. Samoin aktiivisuus SOD seuraa myös samanlainen trendi vaihtelun ilmaisun. Aktiivisuus Mn-SOD DL ja DL + DMSO hiirillä havaittiin olevan 65% ja 63% normaalien hiirten vastaavasti. Curcumin hoito kohonnut aktiivisuus annoksesta riippuvaisia ​​tavalla, joka oli noin Jopa 1,3 kertainen, 1,39 kertaiseksi ja 1,58-kertainen DL + DMSO 50, 100 ja 150 mg curcumin /kg vastaavasti. Samoin aktiivisuus Cu /Zn-SOD väheni DL ja DL + DMSO hiirillä enintään 61% ja 61,5% normaalien hiirten vastaavasti. Curcumin hoito oli omiaan lisäämään aktiivisuutta Cu /Zn-SOD samalla annoksesta riippuvalla tavalla, noin enintään 1,24-kertainen, 1,35 kertainen, 1,5-kertainen DL + DMSO hiirillä 50, 100 ja 150 mg curcumin /kg vastaavasti [Fig. 1 (C)].

Effect of kurkumiinista mRNA: n ilmentymisen ja entsymaattisen aktiivisuuden SOD isotsyymien maksassa lymfooman kantavien hiirten (A) RT-PCR: llä Mn-SOD, Cu /Zn-SOD ja β-aktiini geeni, (B) densitometrinen skannaus Mn-SOD ja Cu /Zn-SOD-geenien jälkeen normalisoinnin β-aktiinin, (C) Erityiset värjäys osoittaa aktiivisuutta SOD-isoentsyymien, (D) densitometrinen skannaus toiminnan kaistan SOD isotsyymien. Maksat kaikki kuusi eläimiä kustakin ryhmästä yhdistettiin erikseen ja uuttamisessa käytetty kokonais-RNA ja proteiineja ei denaturointia kunnossa. Data edustaa keskiarvoa ± SEM # P 0,05 verrattuna N-ryhmän ja * p 0,05 verrattuna DL + DMSO vastaavasti ryhmä. Cur on curcumin, M on 100 emäsparin merkki ja bw on kehon painoa. N, DL, DL + DMSO, DLT50, DLT100 ja DLT150 edustaa normaalia, Dalton lymfooma laakerin, Dalton lymfooma kantavien hiirten käsiteltiin DMSO: n ja Dalton lymfooma, joissa hiirissä, joita hoidettiin 50, 100 ja 150 mg curcumin /kg liuotettuna DMSO: hon vastaavasti.

Expression ja entsymaattinen aktiivisuus NOX

ilmentyminen NOX1 ja NOX2 havaittiin merkittävästi yliaktiivista DL ja DL + DMSO-hiirissä verrattuna normaaleihin hiiriin, jotka oli mukautettu kohti normaalitasolle curcumin käsittely [Fig. 2 (A)]. Ilmentyminen NOX1 havaittiin olevan noin 1,75-kertaiseksi ja 1,44-kertainen normaalien hiirten maksassa DL ja DL + DMSO hiirten. Curcumin pienensi lauseke, joka oli noin 83%, 86% ja 72% DL + DMSO-hiiriä annoksella 50, 100 ja 150 mg /kg vastaavasti. Samoin verrattuna normaaliin, ilmentyminen NOX2 havaittiin olevan noin 2,7-kertainen ja 2,38-kertaisesti maksassa DL ja DL + DMSO hiirten, jotka oli säädeltiin jälkeen curcumin hoidon, kuten havaittiin olevan noin 60%, 86% ja 87% DL + DMSO-hiiriä annoksella 50, 100 ja 150 mg /kg vastaavasti. Samoin aktiivisuus NOX havaittiin olevan koholla sen mRNA: n ekspression. NOX säätelee muodostumista ROS; Siksi aktiivisuutta NOX voidaan mitata indikaattorina ROS tasolla. Verrattuna normaaleihin hiiriin, aktiivisuus NOX1 oli noin 1,6-kertainen ja 1,45-kertainen, jossa aktiivisuutena NOX2 oli 1,37-kertainen ja 1,3-kertaisesti maksassa DL ja DL + DMSO hiirten. Eri annoksia curcumin hoidon merkittävästi moduloitu aktiivisuutta kohti normaalia tasoa. Aktiivisuus NOX1 havaittiin olevan noin 86%, 70% ja 80% DL + DMSO hiirissä, kun taas aktiivisuus NOX2 havaittiin olevan noin 78%, 84% ja 84% DL + DMSO-hiiriä annoksella 50, 100 ja 150 mg /kg tässä järjestyksessä [Fig. 2 (C)].

Effect of kurkumiinista mRNA: n ilmentymisen ja entsymaattisen aktiivisuuden NOx-isoentsyymejä maksassa lymfooman kantavien hiirten (A) RT-PCR NOX2, NOX1 ja β-aktiini geeneistä, (B) densitometrinen skannaus NOX2 ja NOX1 geenien jälkeen normalisoinnin β-aktiini, (C) Erityiset värjäys osoittaa aktiivisuutta NOX isotsyymien, (D) densitometrinen skannaus toiminnan bändi NOX isotsyymien. Maksat kaikki kuusi eläimet kussakin ryhmässä yhdistettiin erikseen ja uuttamisessa käytetty kokonais-RNA ja proteiineja ei denaturointia kunnossa. Data edustaa keskiarvoa ± SEM # P 0,05 ja ## 0,01 verrattuna N-ryhmän, * p 0,05 ** p 0,01 verrattuna DL + DMSO vastaavasti ryhmä. Cur on curcumin, M on 100 emäsparin merkki ja bw on kehon painoa. N, DL, DL + DMSO, DLT50, DLT100 ja DLT150 edustaa normaalia, Dalton lymfooma laakerin, Dalton lymfooma kantavien hiirten käsiteltiin DMSO: n ja Dalton lymfooma, joissa hiirissä, joita hoidettiin 50, 100 ja 150 mg curcumin /kg liuotettuna DMSO: hon vastaavasti.

taso H

2O

2 ja yhteensä ROS maksakudoksessa

taso H2O2, että indikaattori oksidatiivisen stressin heijastaa oksidatiivisen tilan kudoksen. Taso vetyperoksidin maksassa DL ja DL + DMSO hiirillä kohonnut merkittävästi, enintään noin 1,47-kertainen ja 1,39-kertaisesti normaalien hiirten vastaavasti. Curcumin hoito vähensi merkitsevästi tasolle enintään 82% DL + DMSO-hiiriä 100 mg curcumin /kg hiirillä ja 96% ja 90% DL + DMSO-hiiriä 50 ja 150 mg curcumin /kg hiirten [Fig. 3 (A)]. ROS syntetisoi NOX sekä muista lähteistä toimii tärkeänä signalointi molekyyli oksidatiivisen kasvaimen mikroympäristössä aiheuttaa syövän syntyyn. Yhteensä ROS taso mitattuna fluoresenssin (absorbanssi) /mg proteiinia oli merkittävästi koholla DL ja DL + DMSO hiirillä enintään noin 2,59-kertaiseksi ja 2,64-kertainen normaalien hiirten. Hoito curcumin tukahdutetaan ROS tasolla merkittävästi, mikä havaittiin olevan noin 62%, 51% ja 67% DL + DMSO-hiiriä annoksella 50, 100 ja 150 mg /kg vastaavasti [Fig. 3 (B)].

Effect of kurkumiinista oksidatiivisen stressin kokonaiskulutus H2O2 tason ja koko ROS tasolla maksassa lymfooman kantavien hiirten (A) Histogrammi osoittaa yhteensä H2O2 tasolla eri ryhmissä, (B) Histogrammi osoittaa yhteensä ROS tasolla eri ryhmissä. Maksat kaikki kuusi eläimet kussakin ryhmässä yhdistettiin erikseen ja homogenaattia valmistettiin määrittämiseksi H2O2 ja ROS tasolla. Data edustaa keskiarvoa ± SEM # P 0,05 verrattuna N-ryhmän, * p 0,05 verrattuna DL + DMSO vastaavasti ryhmä. N, DL, DL + DMSO, DLT50, DLT100 ja DLT150 edustaa normaalia, Dalton lymfooma laakerin, Dalton lymfooma kantavien hiirten käsiteltiin DMSO: n ja Dalton lymfooma, joissa hiirissä, joita hoidettiin 50, 100 ja 150 mg curcumin /kg liuotettuna DMSO: hon vastaavasti.

Expression of HIF-1α ja cMyc

mRNA ilmentyminen HIF-1α ja cMyc tutkittiin varhaisena reaktio stressiin geeni ja onkogeeni vastaavasti hypoksinen kasvaimen mikroympäristössä. Ilmentymisen sekä HIF-1α ja cMyc oli jopa säädellä DL ja DL + DMSO-hiirissä verrattuna normaaleihin hiiriin, jotka oli merkittävästi laskea curcumin hoitoon [Fig. 4 (A)]. Ekspression HIF-1α maksassa DL ja DL + DMSO hiirillä havaittiin olevan noin 1,85-kertaiseksi ja 1,51-kertainen normaalien hiirten vastaavasti. Expression taso jälkeen curcumin hoidon oli noin 93%, 91% ja 78% DL + DMSO hiiriä annoksella 50, 100 ja 150 mg /kg vastaavasti. Vastaavasti, ilmaus cMyc havaittiin olevan noin 2,03-kertaiseksi ja 1,45-kertainen normaalien hiirten maksassa DL ja DL + DMSO hiirten ja sen jälkeen curcumin hoidon ekspressio väheni noin 95%, 83% ja 78% DL + DMSO hiiriä annoksella 50, 100 ja 150 mg /kg vastaavasti.

Effect of kurkumiinista mRNA ilmentyminen stressin aktivoitua geenin HIF-1α ja cMyc maksassa lymfooman kantavien hiirten (A) RT -PCR HIF-1α, cMyc ja β-aktiini geeneistä, (B) densitometrinen skannaus HIF-1α ja cMyc geenien jälkeen normalisoinnin β-aktiini. Maksat kaikki kuusi eläimet kussakin ryhmässä yhdistettiin erikseen ja uuttamisessa käytetty kokonais-RNA. Data edustaa keskiarvoa ± SEM # P 0,05 ja ## 0,01 verrattuna N-ryhmän, * p 0,05 verrattuna DL + DMSO vastaavasti ryhmä. Cur on curcumin, M on 100 emäsparin merkki ja bw on kehon painoa. N, DL, DL + DMSO, DLT50, DLT100 ja DLT150 edustaa normaalia, Dalton lymfooma laakerin, Dalton lymfooma kantavien hiirten käsiteltiin DMSO: n ja Dalton lymfooma, joissa hiirissä, joita hoidettiin 50, 100 ja 150 mg curcumin /kg liuotettuna DMSO: hon vastaavasti.

Expression ja entsymaattinen aktiivisuus LDH-A

mRNA ilmentyminen LDH-A maksassa DL ja DL + DMSO hiirten voimistunut enintään noin 1,4-kertainen ja 1,4- kertainen normaalien hiirten vastaavasti. Kaikki annokset curcumin merkittävästi säädeltiin ilmaisua. Ilmaisun jälkeen curcumin hoidon havaittiin olevan noin 90%, 79% ja 80% DL + DMSO-hiiriä annoksella 50, 100 ja 150 mg /kg vastaavasti [Fig. 5 (A)]. Pyruvaatti ei voida metaboloidu aerobisesti mutta muunnetaan laktaatti LDH-A hypoksinen kasvaimen mikroympäristössä. Näin ollen, glykolyyttiset aineenvaihduntaa voidaan seurata kannalta LDH-aktiivisuus-A. LDH-aktiivisuus-A havaittiin olevan koholla enintään noin 1,76-kertaiseksi ja 1,64-kertainen normaalien hiirten maksassa DL ja DL + DMSO hiirten. Hoito curcumin vähensi merkittävästi LDH-aktiivisuus-A, joka oli noin 75%, 67% ja 85% DL + DMSO-hiirissä annoksilla 50, 100 ja 150 mg /kg vastaavasti [Fig. 5 (C)].

Effect of kurkumiinista mRNA: n ilmentymisen ja entsymaattisen aktiivisuuden LDH-A maksan lymfooman kantavien hiirten (A) RT-PCR LDH-A ja β-aktiini geeneistä, (B) Densitomet- skannaus LDH-A jälkeen normalisoinnin β-aktiini, (C) Erityiset värjäys osoittaa aktiivisuutta LDH-A, (D) densitometrinen skannaus toiminnan bändi LDH-A. Maksat kaikki kuusi eläimet kussakin ryhmässä yhdistettiin erikseen ja uuttamisessa käytetty kokonais-RNA ja yhteensä proteiineja ei denaturointia kunnossa. Data edustaa keskiarvoa ± SEM # P 0,05 ja ## 0,01 verrattuna N-ryhmän, * p 0,05 ** p 0,01 verrattuna DL + DMSO vastaavasti ryhmä. Cur on curcumin, M on 100 emäsparin merkki ja bw on kehon painoa. N, DL, DL + DMSO, DLT50, DLT100 ja DLT150 edustaa normaalia, Dalton lymfooma laakerin, Dalton lymfooma kantavien hiirten käsiteltiin DMSO: n ja Dalton lymfooma, joissa hiirissä, joita hoidettiin 50, 100 ja 150 mg curcumin /kg liuotettuna DMSO: hon vastaavasti.

Expression ja proteiinin taso PKC-a

mRNA ilmentyminen PKC-a havaittiin jopa säänneltävä DL ja DL + DMSO hiirillä enintään noin 1,75-kertaiseksi ja 1,65-kertainen normaaliin hiirillä. Kaikki kolme annosta kurkuma vähensi ilmentymisen PKC-a huomattavasti.