Krooninen sairaus

tiivistelmä

patogeneesi haiman adenokarsinooma (PDAC) pysyy huonosti. S100 kalsiumia sitovan proteiinin A6 (S100A6) on liittynyt PDAC; kuitenkin, vaikutus S100A6 on PDAC muuttoliikettä ja hyökkäys ei ole vielä tutkittu. Tässä tutkimuksessa, Panc-1-solut transfektoitiin plasmidilla, joka aiheuttaa yli-ilmentymisen S100A6, ja β-kateniinin, joka pudotettiin käyttämällä erityistä lyhyttä hiusneula-RNA (shRNA). Haavan paranemista ja TranswellTM analyysit osoittivat, että S100A6 edistetään PDAC solujen vaeltamiseen ja invaasiota. Lisäksi β-kateniinin shRNA esti migraation ja invaasion PDAC soluja. Olemme vahvistaneet, että S100A6 indusoi PDAC solumigraatioon ja invaasiota aktivoimalla β-kateniinin in vitro. Arviointi mRNA: ta ja proteiinia tasot paljasti, että S100A6 indusoi voimistunutta ilmentymistä β-kateniinin, N-kadheriinin ja vimentiinin, ja vähentynyttä ilmentymistä E-kadheriinin in PDAC soluissa. β-kateniinin shRNA myös muuttanut ilmaus epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) liittyviä markkereita PDAC soluissa. Erityisesti ilmaisu E-kadheriinin lisättiin, kun taas ekspressio N-kadheriinin ja vimentiinin väheni. Lopuksi osoitimme, että S100A6 muuttaa ilmaus EMT liittyvien merkkiaineiden kautta β-kateniinin aktivointia. Lopuksi S100A6 indusoi EMT ja edistää solujen maahanmuuton ja invaasiota on β-kateniinin riippuvaisesti. S100A6 voi näin ollen edustaa uutta potentiaalia terapeuttinen kohde hoidettaessa haimasyöpä.

Citation: Chen X, Liu X, Lang H, Zhang S, Luo Y, Zhang J (2015) S100 Kalsium-Binding Protein A6 edistää Epiteelin-mesenkymaalitransitioon kautta β-kateniinin Haimasyöpä Cell Line. PLoS ONE 10 (3): e0121319. doi: 10,1371 /journal.pone.0121319

Academic Editor: Yue Wang, National Institute for Viral Disease Control and Prevention, CDC, Kiina, Kiina

vastaanotettu: 10 joulukuu 2014; Hyväksytty: 30 tammikuu 2015; Julkaistu: 23 maaliskuu 2015

Copyright: © 2015 Chen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Basic and Clinical yhteistyö Foundation of Capital Medical University No.13JL77 (Kiina). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haiman adenokarsinooma (PDAC) on vakava maailmanlaajuinen terveysongelma. Se on neljänneksi yleisin syy syöpään liittyvät kuolemat Yhdysvalloissa, jossa on 5-vuoden yleinen suhteellinen eloonjäämisluku 6% [1]. Kiinassa Keskimääräinen elinaika on PDAC potilaiden on 7,8 kuukautta, 30,0% potilaista, joille tehdään parantava tarkoitus toimintaa, ja vain 9,8%: lla potilaista kokonaisvaltaista hoitoa [2]. Huolimatta edistysaskeleita hoitoon, PDAC edelleen erittäin vastustuskykyisiä tällä hetkellä saatavilla sädehoidon ja solunsalpaajahoitoa [3]. Eräs vastaaja on huono ennuste on heikko käsitys patogeneesin haimasyövän. Näin ollen on kiireellinen tarve valaista molekyylitason mekanismeja, jotka liittyvät tapahtuman, kehityksen ja etäpesäkkeiden tämän tappava tauti.

S100A6 kuuluu S100 perheen ekspressio, joka on liitetty tuumorigeneesiin ja etäpesäkkeiden [4] . Logsdon et al. [5] käytetään microarray profiiliin PDAC geeniekspression tunnistamiseksi yhteensä 158 haiman syöpään liittyvien geenien, mukaan lukien S100A6. Ryhmämme on aiemmin esiintynyt immunohistokemiallinen analyysi S100A6 ilmentymisen haiman kudoksissa, joka vahvistaa, että S100A6 ilmentyminen on kohonnut PDAC näytteissä, verrattuna normaaleissa kudoksissa [6]. Ohuchida et al. [7], osoitti, että ilmentyminen S100A6 on ensisijaisesti rajoittunut ytimet haimasyövän soluja, ja ydinvoiman S100A6 proteiinin ilmentymisen tasot liittyvät huonoon ennusteeseen. Rooli S100A6 suhteessa kasvaimen muodostumisen ja etäpesäkkeiden on kuitenkin huonosti. Jotkut tutkimukset ovat osoittaneet, että S100A6 osallistuu säätelyyn Wnt /β-kateniinin signalointireitin [8], joka johtaa hajoamiseen β-kateniinin.

Wnt /β-kateniinin signalointi vaikutteita solukohtalon, leviämisen, napaisuus, ja solukuolemaan alkionkehityksen aikana, sekä kudoksen homeostaasin aikuisilla [9]. Poikkeuksellisesta säätelystä tämän reitin vuoksi liittyy erilaisia ​​sairauksia, mukaan lukien syöpä, fibroosi ja neurodegeneraatio [10]. Wnt-reitin koostuu wnt ligandin proteiinia ja solun pinnan reseptorin lisäksi sytoplasman komponentteja ja erityisen ydin- transkription kompleksi [11]. Kun Wnt-ligandi-proteiini sitoutuu frizzled, solun pinnan reseptoriin, Wnt-reitin aktivoituu. Sytoplasmisen β-kateniinin sitten siirtyy solun tumaan, jossa se moduloi transkriptio, jolloin vaikutetaan solujen lisääntymistä ja kasvaimen etäpesäkkeiden. Tässä prosessissa, β-kateniinin on avain efektorimolekyylin [12]. Erilaisia ​​solun proteiinien, kuten Wnt, voivat vaikuttaa β-kateniinin tuotantoa ja kertymistä sytoplasmassa. RNA sekvensointi haiman verenkierrossa olevia kasvainsoluja syytöksiä wnt ja β-kateniinin etäpesäkkeitä [13].

On runsaasti tutkimusta koskevat ominaisuudet kiertävien tuumorisolujen, jotka liittyvät epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) [ ,,,0],14,15]. EMT viittaa transdifferentiation epiteelisolujen osaksi mesenkyymisolujen tiettyjen fysiologisten ja patologisten tilojen, mukana solujen morfologia ja geeniekspression muutokset [16]. EMT esiintyy erilaisissa prosesseissa, kuten sikiön kehityksen, haavojen paranemista, joidenkin kroonisten sairauksien, ja varhaisessa vaiheessa kasvaimen etäpesäke. Down-regulation of E-kadheriinin, epiteelin merkki, on tunnusmerkki EMT. Menetys E-kadheriinin on liitetty säätelyä mesenkymaalisten markkereita, kuten N-kadheriinin ja vimentiinin. EMT on tarpeen, että suurin osa kasvaimen metastaasit, mukaan lukien PDAC [17]. Wnt /β-kateniinin reitti on yksi tärkeimmistä signalointireittejä mukana EMT induktioon.

Tässä raportissa selvitettiin funktio ja liittyvän mekanismin S100A6 suhteessa EMT induktion, arvioimalla sen vaikutus Pancin-1 solumigraation ja invaasiota.

Materiaalit ja menetelmät

Cell line

ihmisen haimasyövän solulinja, Panc-1, hankittiin American Type Culture Collection (USA). Soluja ylläpidettiin Dulbeccon modifioitu Eaglen väliaine (DMEM) (Invitrogen, USA), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (FBS, Invitrogen, USA), 1% penisilliiniä ja streptomysiiniä (Invitrogen, USA) 37 ° C: ssa, 5% CO

2.

Plasmidit ja RNA-interferenssi

täydentäviä DNA: t ihmisen S100A6 ja negatiivisen kontrollin DNA insertoitiin GV146 plasmidivektoriin ostettu Genechem (Shanghai, Kiina). ShRNA sekvenssin kohdistaminen β-kateniinin (5′-ATCACTGAGCCTGCCATCTGTGCTCTTCG-3 ’) ja negatiivinen kontrolli sekvenssi syntetisoitiin ja liitettiin pRFP-C-RS-vektoriin (Origene Technologies, USA). Plasmidit monistettiin mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Sekvenssianalyysi kloonauksen jälkeen paljasti 100% homologia julkaistuja sekvenssejä.

lyhytaikaista transfektiota ja luominen Vakaa solulinjojen

S100A6 yli-ilmentymisen plasmidi ja ohjaus plasmidi transfektoitiin Pancin-1-soluissa käyttäen opti- MEM vähensi seerumin väliaineessa (Invitrogen, USA) ja Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti.

β-kateniinin shRNA ja ohjaus shRNA transfektoitiin Panc-1-soluissa, kuten edellä on todettu. Transientin transfektion jälkeen, Panc-1-solut valittiin käyttämällä 1,0 ug /ml puromysiiniä, ja pidettiin kasvatusväliaineessa, jota oli täydennetty 1,0 ug /ml puromysiiniä. Klonaalisia populaatioita solut eristettiin siirtämällä yhden möhkäleitä solujen yksittäisiin kuoppiin kuuden kuoppalevylle. Sitten soluja pidettiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2.

Sitten S100A6 yli-ilmentymisen ja ohjaus transfektoitiin β-kateniinin pudotus stabiileja solulinjoja, kuten edellä on todettu.

haavan paranemista määritys

Solut ympättiin kuuteen-kuoppalevyille ja transfektoitiin kanssa S100A6 yli-ilmentyminen tai valvontaa plasmidi, ja β-kateniinin shRNA tai valvontaa shRNA. 36 tunnin kuluttua täydellinen kasvualusta korvattiin FBS-DMEM: ssä, ja sen jälkeen vielä 6 h, yksisolukerrokset haavoittuneen on 200 ui steriiliä muovista kärki. Viljelmät jälkeen pidettiin FBS-DMEM: ssä, ja haavan alueilla havaittiin ja valokuvattiin käyttämällä käännettyä mikroskooppia 0, 24 ja 48 tuntia haavoittamisen jälkeen. Haava leveys mitattiin käyttäen Image J ohjelmisto. Haavan paranevuus arvioitiin seuraavasti:

TranswellTM Pitoisuus

TranswellTM kammiot (Corning, USA), jossa on 8-um huokosia arviointiin käytettiin maahanmuuttoa 24-kuoppalevyillä. Transfektion jälkeen 200-ul määrä soluja, tiheydellä 1 x 10

5 /ml FBS-DMEM: ssä, ympättiin yläkammiot. Alakammioissa täytettiin DMEM, joka sisälsi 10% FBS: ää kuin stimuloiva tekijä. Kammiot inkuboitiin kostutetussa kudosviljelyinkubaattorissa 37 ° C: ssa, 5% CO

2 ilmakehässä, 8 h. Sitten solut kiinnitettiin 95% etanolissa 20 minuutin ajan, värjättiin kristallivioletilla 30 minuutin ajan, ja laskettiin käyttäen mikroskooppia, jossa on 40 x tavoite.

arvioimiseksi soluinvaasion, BioCoat Matrigel (BD Biosciences) (300 ug /ml, 100 ui per säiliö) levitettiin ylempään insertin kammiot 5 tuntia ennen seuraavaa menettelyä migraatiokokeessa edellä kuvatulla tavalla.

Quantitative Real-Time PCR

Kokonais-RNA Panc -1-solut eristettiin käyttäen TRIzol-reagenssia (Invitrogen, USA). Kokonais-RNA: ta käytettiin templaattina cDNA: n syntetisoimiseksi, mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti (Invitrogen, USA). Reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttäen 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, USA), jossa on reaktioseosta, joka koostuu 5-ui 2 x SYBR Green Master Mix, 1-il templaatti, 0,4 ul: forward-aluke, 0.4- ui reverse-aluke ja 3,2-ui RNA-vapaaseen veteen. Pyöräily olosuhteet olivat 95 ° C: ssa 10 min, jota seurasi 40 sykliä 95˚C 15 s ja 60 ° C 1 min. Geeniekspressiotasot normalisoitiin suhteessa, että GAPDH. Kaikki reaktiot suoritettiin kolminkertaisina. Suhteellinen mRNA-tasot esitettiin 2

-ΔΔCt [18]. Käytetyt alukkeet on esitetty yksityiskohtaisesti taulukossa 1.

Western-blottaus

Transfektion jälkeen solut kerättiin käyttäen RIPA lyysipuskuria (Solarbio, Peking, Kiina), johon oli lisätty PMSF: proteaasi-inhibiittorin (Solarbio , Peking, Kiina). Proteiinin pitoisuudet näytteistä määritettiin käyttäen proteiinin kvantitointi kit (KEYGEN Biotech, Nanjing, Kiina). Näytteet (40-100 ug) altistettiin sitten 10% SDS-PAGE: lla ja siirrettiin polyvinylideenidifluoridi kalvo (PVDF). Membraanit blokattiin 2 tunnin ajan 5% rasvattomassa kuivatussa maidossa. Membraanit inkuboitiin spesifisten vasta-aineiden 4 ° C: ssa yön yli. Seuraavat ensisijaiset vasta-aineita käytettiin tässä tutkimuksessa: anti-β-kateniinin (Cell Signaling Technology 8480, USA), anti-E-kadheriini (Abcam ab1416, USA), anti-N kadheriinin (Abcam ab19348, USA), anti-vimentiinistä ( Abcam ab8069, USA) ja anti-β-aktiini (Cell Signaling Technology 8457, USA). Membraanit inkuboitiin sitten vastaavan fluoresoivan sekundaarisen vasta-aineita (Odyssey). Western blotit kvantitoitiin käyttäen Odyssey infrapuna Imaging. Proteiinin ekspressiotasot normalisoitiin suhteessa kuin β-aktiini.

Tilastollinen analyysi

Kaikki kokeet suoritettiin kolmena kappaleena ja toistettiin riippumattomasti ainakin kolme kertaa. Data esitetään keskiarvoina ± SD (keskihajonta). Opiskelijan

t

-testi käytettiin tilastolliseen analyysiin. Kaikki tiedot analysoitiin SPSS 17.0 tilastollinen ohjelmistopaketti ja luvut luotu käyttäen GraphPad Prism 5 -ohjelmaa. Kaikissa testeissä, p 0,05 pidettiin osoittamaan tilastollista merkittävyyttä.

Tulokset

S100A6 edistää PDAC solujen vaeltamiseen ja invaasiota in vitro

Sen arvioimiseksi, onko S100A6 edistää PDAC solumigraatioon ja invaasio, Panc-1 solut transfektoitiin S100A6 yliekspressio plasmidissa tai kontrolli-plasmidi. Reaaliaikainen RT-PCR: ää käytettiin sen varmistamiseksi, että S100A6 yli-ilmentyminen plasmidista lisäsi mRNA-tasoja ja S100A6 in Panc-1-soluissa. Olemme havainneet merkittävää kasvua tason S100A6 mRNA: S100A6 yli-ilmentäviä soluja verrattuna kontrollisoluihin (p 0,001) (S1 Fig.). Seuraavaksi tutkimme vaikutus S100A6 ilmentymisen soluinvaasiota in vitro. Haava-parantava määritys paljasti merkittävän kasvun haavan paranemista korko S100A6 yli-ilmentäviä soluja verrattuna kontrollisoluihin, 24 ja 48 h (p = 0,006 ja p 0,001, vastaavasti) (Fig. 1A ja 1B). Transwell määritys myös havaittu olevan muuttoliikkeen ja hyökkäyksen S100A6 yliekspressoivat soluissa (p = 0,04 migraatiokokeessa, p = 0,006 varten invaasiomääritys) (Fig. 1 C ja 1 D). Nämä tiedot viittaavat siihen, että S100A6 edistää hyökkäys PDAC soluja.

(A) arpeutumisprosessit määrityksessä solut yli-ilmentävät S100A6 (vasemmalla), kontrolli-soluja (oikealla). (B) arpeutumisprosessit oli merkitsevästi korkeampi S100A6 yli-ilmentävät solut, suhteessa kontrollisoluihin, 24 ja 48 tuntia. (C) TranswellTM määritys, ”I” merkitsee S100A6 yli-ilmentymisen migraatiokokeessa; ”II” edustaa kontrolliryhmään migraatiokokeessa; ”III” edustaa S100A6 yli- ilmeneminen invaasiomääritys; ”IV” edustaa kontrolliryhmään invaasiomääritys. (D) edustaja tilastollinen kaavioon siirtokuoppaan määritys, joka osoittaa merkittävää kasvua muuttoliike (I) ja invaasiota (II) S100A6 yli-ilmentävät solut, suhteessa kontrolliin soluihin. * P 0,05; ** P 0.01.

S100A6 muuttaa ilmaus β-kateniinin ja EMT liittyviä markkereita PDAC soluissa

Kun tutkii mahdollisia alavirran välittäjinä S100A6 vastuussa edistämisestä PDAC solumigraation ja invaasiota , olemme huomanneet, että yliekspressio S100A6 johti merkittävään kasvuun β-kateniinin mRNA-tasoja in Panc-1-solujen (p = 0,006) (Fig. 2A). Koska EMT on tärkeä rooli invaasio-etäpesäkkeitä prosessi, me eteni arvioida ilmentymisen EMT liittyviä markkereita. Ilmaisu epiteelin markkerin E-kadheriinin aleni mRNA-tasolla, kun taas ekspressio mesenkymaalisten merkkiaineiden N-kadheriinin ja vimentiinin lisättiin (p 0,001, p = 0,002 ja p 0,001, vastaavasti) (kuvio. 2B). Tutkimme myös proteiinin tasot β-kateniinin ja EMT markkereita käyttäen Western-blottauksella, ja vahvistivat, että yli-ilmentyminen S100A6 lisäsi ekspressiota β-kateniinin (p = 0,024) (Fig. 2C ja 2D), laski, että E-kadheriinin , ja lisääntynyt ilmentyminen N-kadheriinin ja vimentiinista (p = 0,009, p = 0,026, p = 0,044, vastaavasti) (kuvio. 2E ja 2F). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että S100A6 nostaa β-kateniinin tasoilla ja muuttaa ilmaus EMT liittyvien merkkiaineiden PDAC soluissa.

(A) yli-ilmentyminen S100A6 johti merkittävään kasvuun tason β-kateniinin mRNA in Pancin-1-soluissa. (B) Reaaliaikainen PCR osoitti, että S100A6 yli-ilmentyminen johti vähentynyt ilmentyminen E-kadheriinin ja lisääntyneen ekspression N-kadheriinin ja vimentiinin. (C) Western blottauksella osoitti, että S100A6 voimistunut β-kateniinin proteiinin tasolla. (D) edustaja tilastollinen kaavio kasvoi β-kateniinin proteiinin tasoja, verrattuna kontrolliin. (E) Western blottaus osoitti, että S100A6 yliekspressio johti muuttunut ilmentyminen EMT liittyviä markkereita. Erityisesti proteiinin ilmentyminen E-kadheriinin oli vähentynyt, kun taas ekspressio N-kadheriinin ja vimentiinin lisättiin. (F) suhteellinen proteiinin tasot E-kadheriinin, N-kadheriinin ja vimentiinin erosivat toisistaan ​​merkittävästi S100A6 yli-ilmentyvä kunto ja valvontaa. * P 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001.

β-kateniinin shRNA muuttuneita muuttoliike ja invaasion PDAC solujen in vitro

tutkia vaikutuksen β-kateniinin maahanmuutosta ja invaasion PDAC soluja, käytimme β- kateniinin shRNA saavuttaa vakaa β-kateniinin pudotus Panc-1-solulinjassa. Panc-1-solut, jotka oli transfektoitu ei-kohde-shRNA käytettiin kontrollina. Knockdovvn β-kateniinin vahvistettiin reaaliaikainen PCR ja Western blotting (p 0,001 ja p = 0,001, vastaavasti) (S2 Kuva.). Haava-paranemista määritys ja siirtokuoppaan määritys tehtiin vaikutuksen arvioimiseksi β-kateniinin maahanmuutosta ja hyökkäystä. Arpeutumisprosessit määrityksessä osoitti, että pudotus on β-kateniinin inhiboi merkittävästi migraatiota PDAC solujen kontrolliin verrattuna kunnossa sekä 24 ja 48 tuntia (p = 0,013 ja p = 0,002, vastaavasti) (Fig. 3A ja 3B). Transvvell- määritys paljasti vähentynyt muuttoliikkeen ja miehityksen β-kateniinin pudotus soluja, verrattuna kontrolliryhmään (p = 0,009 migraatiokokeessa, p = 0,015 varten invaasiomääritys) (Fig. 3C ja 3D). Nämä tulokset osoittavat, että esto β-kateniinin vähentää maahanmuuttoa ja invaasion PDAC soluissa in vitro.

(A) arpeutumisprosessit määritys paljasti huomattavan laskun maahanmuuton β-kateniinin shRNA ryhmä (vasemmalla) suhteessa verrokkiryhmään (oikealla). (B) arpeutumisprosessit määrä oli merkitsevästi pienempi S100A6 ilmentävien solujen, verrattuna kontrolliin, 24 ja 48 tuntia. (C) Transvvell- määrityksessä osoitti, että β-kateniinin shRNA dramaattisesti vähensi määrä vaeltavia ja tunkeutuvat soluihin (x 40). ”I” tarkoittaa β-kateniinin shRNA in migraatiokokeessa; ”II” edustaa kontrolliryhmään migraatiokokeessa; ”III” edustaa β-kateniinin shRNA että invaasiomääritys; ”IV” edustaa kontrolliryhmään invaasiomääritys. (D) edustaja tilastollinen kaavioon siirtokuoppaan määritys, joka osoittaa merkittävä lasku muuttoliike (I) ja invaasiota (II) β-kateniinin shRNA ryhmä, verrattuna kontrolliryhmään. * P 0,05; ** P 0.01.

β-kateniinin shRNA muuttaa ilmaus EMT liittyvien merkkiaineiden PDAC soluissa in vitro

Sen arvioimiseksi, β-kateniinin on mukana EMT, arvioimme lauseke EMT: liittyvä markkereita mRNA ja proteiini tasoilla β-kateniinin-pudotus Pancin-1-soluissa. Knockdovvn β-kateniinin johti kohonneeseen E-kadheriinin mRNA, ja alentuneet N-kadheriinin ja vimentiinin mRNA: ta (p = 0,002, p 0,001 ja p 0,001, vastaavasti) (Fig. 4A). Western blotting koskevat tulokset proteiinin ilmentyminen olivat yhdenmukaisia ​​reaaliaikaisen RT-PCR-data. Erityisesti proteiinin ilmentyminen E-kadheriinin lisättiin, kun taas ekspressio N-kadheriinin ja vimentiinin laski (p = 0,004, p = 0,007 ja p = 0,017, vastaavasti), ja β-kateniinin-pudotus Panc-1-soluissa (kuvio . 4B ja 4C). Nämä tiedot viittaavat siihen, että β-kateniinin ilmentymistä tason korreloi ilmentymisen EMT liittyviä markkereita PDAC soluissa.

(A) β-kateniinin shRNA johti merkittävään kasvuun tasojen E-kadheriinin mRNA, ja merkittävä lasku tasot N-kadheriinin ja vimentiinista mRNA. (B) VVestern-blottaus osoitti, että β-kateniinin shRNA johti ilmen- tymisen lisääntymisen proteiinin ilmentyminen E-kadheriinin ja vaimentua proteiinin ekspressio N-kadheriinin ja vimentiinin. (C) proteiini tasot E-kadheriinin, N-kadheriinin ja vimentiinista olivat merkittävästi erilaiset välillä β-kateniinin shRNA ryhmän ja kontrolliryhmän. * P 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001.

S100A6 edistää PDAC solumigraatioon ja invaasion kautta β-kateniinin aktivaation in vitro

Tutkitaan onko S100A6 edistää PDAC solumigraatioon ja invaasiota säätelemällä β-kateniinin, transfektoimme vakaa β-kateniinin-pudotus Pancin-1 solut S100A6 yli-ilmentymisen plasmidiin. Arvioimme β-kateniinin ilmentymisen käyttäen reaaliaikaista RT-PCR ja Western blot -analyysit. Ei ollut merkittäviä eroja mRNA ja proteiini tasoilla näiden kahden ryhmän välillä (p = 0,354 ja p = 0,765, vastaavasti) (S3 kuvassa.). Nämä tulokset viittaavat siihen, että β-kateniinin oli todellakin vakaasti tippuu alas, ja että sen ilmentyminen ei vaikuttanut S100A6 yli-ilmentymisen. Seuraavaksi suoritimme haavan paranemista ja siirtokuoppaan määrityksiä arvioida muuttoliikettä ja invaasiota näiden solujen. Arpeutumisprosessit määrityksessä osoittaneet, että maahanmuuttoa ei ollut merkitsevästi erilainen näiden kahden ryhmän välillä, 24 tai 48 tuntia (p = 0,983 ja p = 0,875, tässä järjestyksessä) (Fig. 5A ja 5B). Tulokset siirtokuoppaan määrityksessä olivat yhdenmukaisia ​​arpeutumisprosessit määritys, jossa ei ole merkittävää eroa ryhmien välillä joko maahanmuuton tai invaasio (p = 0,803 migraatiokokeessa, p = 0,659 varten invaasiomääritys) (Fig. 5C ja 5D ). Nämä tulokset osoittavat, että S100A6 ei vaikuta muuttoliikettä ja hyökkäyksen vakaa β-kateniinin-pudotus PDAC soluissa. Tämä viittaa siihen, että S100A6 edistää PDAC solumigraatioon ja invaasion kautta β-kateniinin aktivaation in vitro.

(A) arpeutumisprosessit määritys paljasti mitään muutosta muuttoa β-kateniinin-shRNA solut yli-ilmentävät S100A6 (vasemmalla) verrattuna β-kateniinin-shRNA kontrolliryhmään (oikealla). (B) ei ollut merkittävää eroa haavan paranemista nopeudella näiden kahden ryhmän välillä. (C) ei ollut merkittävää eroa siirtokuoppaan määrityksen tulokset näiden kahden ryhmän välillä, suhteen sekä muuttoliikettä ja invaasiota (x 40). ”I” tarkoittaa β-kateniinin-shRNA + S100A6 yli-ilmentymisen migraatiokokeessa; ”II” edustaa β-kateniinin-shRNA + S100A6-ohjaus migraatiokokeessa; ”III” edustaa β-kateniinin-shRNA + S100A6 yli- ilmeneminen invaasiomääritys; ”IV” edustaa β-kateniinin-shRNA + S100A6-säädin invaasiomääritys. (D) edustaja tilastollinen kaavioon siirtokuoppaan määrityksessä, ei ilmene merkittävää eroa muuttoliike (I) tai invaasio (II) määritykset näiden kahden ryhmän välillä.

S100A6 edistää EMT aktivoitumisen kautta β-kateniinin

tutkia mahdollisuuksia mekanistinen suhdetta S100A6 ja β-kateniinin suhteessa EMT haimasyövän, transfektoimme vakaa β-kateniinin-knockdown Pancin-1 solut S100A6 yliekspressio plasmidissa tai kontrolli plasmidin, ja arvioida ilmaus EMT liittyviä markkereita. Reaaliaikainen RT-PCR: llä ei osoittanut merkittäviä eroja mRNA-tasojen E-kadheriinin, N-kadheriinin ja vimentiinin näiden kahden ryhmän välillä (p = 0,227, p = 0,228 ja p = 0,067, vastaavasti) (Fig. 6A). Olemme vahvisti, että proteiini tasot E-kadheriinin, N-kadheriinin ja vimentiinin myös eivät eronneet näiden kahden ryhmän välillä (p = 0,267, p = 0,638 ja p = 0,940, vastaavasti) (Fig. 6B ja 6C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että S100A6 ei ole mitään vaikutusta EMT liittyviä markkereita vakaa β-kateniinin-pudotus PDAC soluissa, mikä osoittaa, että S100A6 muuttaa ekspression EMT liittyviä markkereita aktivaation kautta β-kateniinin.

(A) ei ollut merkittäviä eroja ilmaus EMT liittyvien merkkiaineiden välillä β-kateniinin-shRNA solut yli-ilmentävät S100A6 ja β-kateniinin-shRNA ohjaus soluissa. (B) VVestern-blottaus paljasti samanlaisia ​​muutoksia ilmentymisen EMT liittyviä markkereita näissä kahdessa ryhmässä. (C) ei nähty merkittäviä eroja ryhmien välillä suhteessa ilmentyminen E-kadheriinin, N-kadheriinin ja vimentiinista proteiinia.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa olemme osoittivat, että S100A6 yliekspressio edistää, ja β-kateniinin shRNA estää, PDAC solujen vaeltamiseen ja invaasiota. Perustimme että S100A6 edistää PDAC solumigraatioon ja invaasion kautta β-kateniinin aktivaation in vitro. Meillä on myös vahvistanut, että S100A6 ilmentyminen korreloi että β-kateniinin ja että ilmentyminen EMT liittyviä markkereita PDAC soluissa on modifioitu sekä S100A6 yli-ilmentymisen ja β-kateniinin pudotus.

S100A6 on raportoitu yliaktiivista useita syöpiä, mukaan lukien keuhkojen, paksusuolen ja peräsuolen, ihon, mahalaukun, haiman adenokarsinooma ja muut epiteelisyöpien [19]. On todettu, että lisääntynyt ilmentyminen S100A6 voi edistää solujen proliferaatio ja migraatio ihmisen maksasyövän [20]. Lisäksi seerumin S100A6 tasot voivat toimia mahdollisena prognostista biomarkkereiden mahasyövän, ja inhibitio S100A6 vähentää metastaattista potentiaalia mahalaukun syövän soluihin [21]. Haiman Karsinogeneesin immunohistokemia määrityksiä on käytetty osoittamaan, että Panin 1a solut eivät ilmaise S100A6, ja että osuus positiivisesti värjättyä solujen kasvaa suhteessa kanssa Panin luokalla kanssa S100A6 mRNA-tasot myös kasvaa portaittain [22,23] .

monenlaisia ​​kokeellisissa malleissa viittaavia tärkeä rooli β-kateniinin haimasyövän etäpesäkkeiden [24]. Nowotny et al. [25,26], viittasi siihen, että S100A6 saattaa olla vaikutusta calcyclin-sitovan proteiinin (CacyBP) /Siah-1 vuorovaikutuksessa proteiini (SIP) ja vaimentimen G2 alleelin Skp1 (Sgt1). CacyBP /SIP tunnistettiin S100A6-sitovaa proteiinia, joka on mukana ubikitinaation ja hajoamista β-kateniinin [27]. Sekvenssi Sgt1 jakaa 20% identiteetti, joka on CacyBP /SIP. Lisäksi Sgt1 ja CacyBP /SIP havaittiin sitovan Skp1 ja aktivoivat Skp1p-Cullin-F-box-proteiini (SCF) ubikitiinipromoottori ligaasilla. Tämä ligaasilla on kuvattu nisäkässoluissa kompleksina, joka säätelee ubikitinaation ja hajoaminen fosforyloidun β-kateniinin [28]. Toisessa tutkimuksessa [29] vahvistettiin, että CacyBP /SIP ei havaita normaalissa haiman kudoksista mutta havaitaan haimasyöpä. Siksi spekuloida, että S100A6 vaikuttaa hajoamista β-kateniinin kautta Cacy BP /SIP ja Sgt1 in PDAC. Tässä tutkimuksessa, S100A6 indusoi β-kateniinin ilmentymistä sekä mRNA ja proteiini tasoilla. Lisäksi sekä haavan paranemista määritys ja siirtokuoppaan määrityksessä osoitti, että S100A6 yliekspressio edistää PDAC solujen vaeltamiseen ja invaasiota.

Useissa malleissa, kuten rintaepiteeli ja sinoomasolulinjoja, Wnt /β-kateniinin reitin ajatellaan aiheuttavan EMT. β-kateniinin on yleensä sidottu E-kadheriinin, joka on tärkeä solu-yhteydet ja kadheriinin solun tukirangan. Lisäksi, β-kateniinin kuljetus tumaan voi edistää ilmentymistä EMT liittyvien geenien [30]. Joissakin tutkimuksissa [31-34] ovat vahvistaneet, että tietyt tekijät voivat ohjata epiteelin plastisuus ja muuttaa etäpesäkkeiden kautta β-kateniinin riippuva sääntelyn PDAC, peräsuolen syöpä, maksasyövän ja rintasyövän. Tutkimuksemme osoitti myös, että β-kateniinin Knockdown voi aiheuttaa ylössäätely E-kadheriinin ja downregulation N-kadheriinin ja vimentiinista.

Tuore tutkimus kertoi, että S100A4, jäsen S100 perhe voisi olla avaintekijä edistämisessä EMT prosessin PDAC [35]. Tässä tutkimuksessa selvitimme välisiä suhteita S100A6, β-kateniinin, EMT ja PDAC soluinvaasiota. Olemme vahvistaneet, että S100A6 saattavat aiheuttaa EMT on β-kateniinin riippuvaisesti, osoittamalla, että S100A6 voi edistää solujen vaeltamiseen ja hyökkäyksen kautta β-kateniinin in vitro. Tarkka rooli S100 perheen ja siihen liittyvät proteiinit suhteen haimasyöpä on tärkeä asia, joka ansaitsee lisätutkimuksia.

Johtopäätös

S100A6 voi aiheuttaa EMT ja edistää solujen maahanmuuton ja invaasiota on β kateniinin-riippuvaisella tavalla. S100A6 voi siis edustaa uutta potentiaalia terapeuttinen kohde PDAC.

tukeminen Information

S1 Kuva. Transfektio S100A6 yliekspressio johti merkittävään kasvuun S100A6 mRNA-tasolla.

*** P 0,001.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0121319.s001

(TIF)

S2 Kuva. β-kateniinin onnistuneesti tippuu alas PDAC soluissa.

(A) Reaaliaikainen RT-PCR paljasti huomattavan lasku β-kateniinin mRNA tasolla β-kateniinin shRNA Pancin-1-soluissa. (B) VVestern-blottaus paljasti merkittävän vähenemisen β-kateniinin proteiinin β-kateniinin shRNA ryhmä, suhteessa kontrolliin. (C) taso β-kateniinin proteiini oli merkittävästi erilainen ryhmien välillä. ** P 0,01; *** P 0,001.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0121319.s002

(TIF)

S3 Fig. β-kateniinin ilmentymistä ei voimistuvan S100A6 in β-kateniinin-knockdown vakaa soluissa.

(A) ei ollut merkittäviä eroja β-kateniinin mRNA-tasojen välillä vakaana β-kateniinin-pudotus solut yli-ilmentävät S100A6 ja vakaa p-kateniinin pudotus solut, jotka ilmentävät ohjaus plasmidi. (B) VVestern-blottaus paljasti samanlaisia ​​muutoksia β-kateniinin näiden kahden ryhmän välillä. (C) ei ollut merkittäviä eroja β-kateniinin proteiinin tasot näiden kahden ryhmän välillä.

Englanti Tässä asiakirjassa on tarkastettu vähintään kaksi ammatillista toimittajille, molemmat äidinkielenään Englanti. Todistusta, kiitos see:https://www.textcheck.com/certificate/GZTsUk

doi:10.1371/journal.pone.0121319.s003

(TIF)