Krooninen sairaus

tiivistelmä

Protein arginiini metyylitransferaasin 5 (PRMT5) soittaa useita rooleja lukuisissa solun prosesseja, ja sen solunosasijaintia dynaamisesti säädellään hiiren kehityksen aikana ja solujen erilaistumista. Kuitenkin vähän tiedetään, että toiminnallisia eroja PRMT5 sytoplasmassa ja PRMT5 tumassa. Tässä me osoitimme, että PRMT5 pääasiassa sijaitsi sytoplasmassa eturauhasen syöpäsoluja. Solunosasijaintia määritykset suunniteltu kattavat koko avoimen lukukehyksen PRMT5 proteiinin paljasti kolme ydin- syrjäytymisen signaaleja (Ness) on PRMT5 proteiinia. PRMT5 ja p44 /MED50 /WD45 /WDR77 kolokalisoituvat sytoplasmassa, ja molemmat vaaditaan kasvun eturauhassyövän soluista PRMT5 metyylitransferaasiaktiivisuus-riippuvaisella tavalla. Sen sijaan, PRMT5 tumaan esti solukasvun metyylitransferaasiaktiivisuus-riippumattomalla tavalla. Yhdenmukaisesti näiden havaintojen, PRMT5 tumassa hyvänlaatuisen eturauhasen epiteelin, kun se lokalisoitu sytoplasmassa eturauhasen syöpää edeltävä ja syöpä kudoksiin. Olemme lisäksi havainneet, että PRMT5 yksin metyloituja sekä histoni H4 ja SmD3 proteiineja mutta PRMT5 kompleksoituna p44 ja pICln metyloitu SmD3 mutta ei histoni H4. Nämä tulokset merkitsevät uutta mekanismia, jolla PRMT5 säätelee solujen kasvua ja edistää eturauhasen kasvaimien syntyyn.

Citation: Gu Z, Li Y, Lee P, Liu T, Wan C, Wang Z (2012) Protein arginiini metyylitransferaasi 5 toiminnot vastapäätä tapoja sytoplasmassa ja Nucleus eturauhassyöpäsolujen. PLoS ONE 7 (8): e44033. doi: 10,1371 /journal.pone.0044033

Editor: Hari Koul, University of Colorado, Yhdysvallat

vastaanotettu: 06 helmikuu 2012; Hyväksytty: 01 elokuu 2012; Julkaistu: 27 elokuu 2012

Copyright: © Gu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain apurahan 1R01 DK065156 01 National Institute of Diabetes ja Ruuansulatusjärjestelmään ja munuaistautirekisterin, Yhdysvaltojen National Institutes of Health (NIH) (ja ZW), jonka Cancer Center Support (Core) avustus CA16672 National Cancer Institute , NIH The University of Texas MD Anderson Cancer Center, jonka NYUSOM Urology Center of Excellence rahoitusta PL, ja National Natural Science Foundation of China (81171922) ja Key Project Research Fund Shaanxin maakunnan tieteen ja teknologian Program, Kiina. (2008K27G01) ja ZP. Ei ylimääräistä ulkoista rahoitusta saatiin tätä tutkimusta varten. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Protein arginiini metyylitransferaasin 5 (PRMT5) on tyypin II proteiinia, arginiini metyylitransferaasi, joka katalysoi symmetrinen dimetylaatio arginiinin tähteiden kohdeproteiinit [1]. PRMT5 on erittäin konservoitunut hiivasta, eläimiä, ja korkeammat kasvit ja on ollut mukana erilaisissa solu- ja biologisten prosessien, kuten kopioinnin säätely [2], [3], [4], RNA aineenvaihdunta [1], [5], ribosomien biogeneesin 6], Golgin laitteen rakenne huolto [7], ja solusyklin etenemisen [2]. PRMT5 on mukana myös sukusolujen muodostumiseen, erittely, ja ylläpito [8], [9], [10], [11], [12], [13]. Nisäkässoluissa, PRMT5 paikantuu sekä sytoplasmaan ja tumaan, ja se metyloi useita histoni ja nonhistone proteiinit [1]. Tumaan, PRMT5 on havaittu, että SWI /SNF ja Nurd chromatin-remodeling kompleksit [14], [15], jossa se metyloi histonien sekä transkriptiotekijöitä /säätävät [2], [3], [4]. Sytoplasmassa, PRMT5 muodostaa 20S-proteiinin arginiini metyylitransferaasi kompleksi, jota kutsutaan ”methylosome”, joka koostuu spliceosomal snRNP Sm proteiineja, PRMT5, pICln, ja WD toista proteiinia (MEP50 /WD45) [16], [17], [18] . Tässä monimutkaisessa, PRMT5 metyloituja Sm proteiinit [16], [19], ja tällainen metylaatio lisääntynyt sitoutumisaffiniteetti näiden Sm proteiinien eloonjäämisen motoneuronisairaudet (SMN), selkärangan lihasatrofia taudin geenin tuote [20], [21] . Myöhemmin PRMT5- ja SMN-kompleksit yhteistyötä ladata Sm proteiinien päälle U snRNAs muodostaen U snRNP: eille [22]. Vaikka

in vitro

biokemiallinen näyttö osoitti, että symmetrinen arginiini dimetylaatio on olennaista ennalta mRNA [23], missä määrin PRMT5 vaikuttaa silmukoinnin

in vivo

edelleen heikko. PRMT5 on ratkaisevaa hiiren alkion kehitystä [8].

puhdistettu ja kloonattu uusi androgeenireseptorin (AR) -interacting proteiini, nimetty p44 [24], [25]. Proteiinisekvenssin p44 on identtinen osan (MEP50) on methylosome kompleksin [18] ja alayksikön (WD45) Seurantaverkoston kompleksin [17]. P44-proteiini sisältää 342 aminohappotähdettä ja seitsemän otaksuttu WD-40 toistoja ja on myös nimetty WDR77 geenipankin (liittymistä: AAH9411.1). Se on vuorovaikutuksessa AR ja säätelee ilmentymistä joukko androgeenin kohdegeenien eturauhanen ja eturauhasen syöpä [24], [25], [26], [27]. P44-proteiini lokalisoituu sytoplasmaan eturauhasen epiteelisolujen hiirien alle 28 päivää; P44 tumaansiirtymiseen alkaa iässä 28 päivää ja on valmis iässä 45 päivää [28]. Tumaansiirtymiseen ja p44 korreloi dramaattiseen laskuun leviämisen määrä epiteelisolujen [28] ja funktionaalinen cytodifferentiation Ontelonsisäisen solujen ilmennyt ekspressiota eturauhasen eritystekijän proteiinit [29], [30], [31] , [32]. Siten p44 sytoplasman lokalisointi liittyy eturauhasen epiteelisolujen proliferaatiota, kun taas sen tumalokalisaatio liittyy epiteelisolujen erilaistumista. Immunohistokemiallinen värjäys eturauhasnäytteissä osoitti, että p44-proteiini lokalisoituu tumaan hyvänlaatuisten epiteelisolujen ja sytoplasmassa eturauhassyöpäsolujen [25]. Translokaatio p44 tumasta sytoplasmaan tapahtuu eturauhasen intraepiteelinen neoplasia ja eturauhassyövän vaurioita [25], [26]. Pakko ydinvoiman lokalisointi p44 inhiboi kasvun eturauhassyöpäsolujen kudosviljelmässä [25], ja poistetaan kokonaan kasvun eturauhassyövän nude-hiirissä [26]. Tämä kasvun esto liittyi säätelyä

p21

ja

p27

geeniekspression; downregulation

sykliini

,

sykliini B

, ja

CDK2

geeniekspression; ja solusyklin pysähtyminen G

1 /G

0 vaiheessa [25], [26]. Siten p44-toiminto säätelee sen solunosasijaintia.

(A) PC3 ja LNCaP-solut immunohistokemiallisesti värjättiin anti-PRMT5 ja -p44 vasta-aineita (paneelit ag) tai anti-PRMT5 plus -coilin vasta-aineita (paneeli h ). Fluoresoivia signaaleita havaittiin alle -konfokaalimikroskoopilla punaisella suodattimella (havaitsemiseksi PRMT5) tai vihreä suodatin (havaitsemaan p44 tai coilin). Oikea paneeli näyttää sulautunut kuvat PRMT5 ja p44 tai coilin värjäystä. Valkoinen ja vihreä arrowheads osoittavat PRMT5 ja p44 tai coilin signaaleja tumaan, vastaavasti. (B) Western blot sytoplasmisen ja ydinvoiman jakeet LNCaP ja PC3-soluja, joilla on anti-PRMT5, -p44, -HSP90, tai anti-lamiini B-vasta-aineen. C, sytoplasma; N, tuma.

PRMT5 muodostaa stoikiometrisen kompleksin p44 /MEP40 /WD45 /WDR77 erilaisissa soluissa [33], [34], [35], ja sen solunosasijaintia dynaamisesti säännelty aikana hiiri kehittäminen [8]. Toiminnallista roolia PRMT5 sytoplasmassa ja tumassa ja suhde sen solunosasijaintia eturauhassyöpään ei ole tutkittu. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme huomanneet, että sytoplasminen PRMT5 on välttämätön kasvulle eturauhassyövän soluja, kun taas ydin PRMT5 estää eturauhasen syöpäsolujen kasvua. Yhdenmukaisesti näiden havaintojen, PRMT5 paikantuu tumaan hyvänlaatuinen eturauhasen epiteelisolujen ja sen sijaan paikantuu sytoplasmaan premalignien ja syöpä- eturauhaskudoksiin. Siksi PRMT5 toiminto säätelee sen solunosasijaintia, ja tämä nucleocytoplasmic liikenne voi olla tärkeä rooli eturauhasen kasvaimien syntyyn.

(A) kaaviot on PRMT5 katkaisut ilmaistuna GFP-fuusioproteiineja. Prosenttiosuudet solujen GFP-PRMT5 lyhentymisiä sytoplasmassa (C), nucleus (N), tai solulimassa sekä tumassa (C /N) on esitetty oikealla. (B) solunosasijaintia eristetyn tumasta signaaleja. Solut transfektoitiin pcDNA-f: GFP-PRMT5, -PRMT5 (1-90), -PRMT5 (500-560), -PRMT5 (576-637), tai pcDNA-GFP: n ja tarkkailtiin konfokaalimikroskoopilla. (C) Western blot-analyysi soluliman ja ydinvoiman jakeet transfektoitujen solujen pcDNA-f: GFP-PRMT5, -PRMT5 (1-90), PRMT5 (500-560), tai PRMT5 (576-637), joissa anti-FLAG, -HSP90 tai -lamin B-vasta-aineen.

Materiaalit ja menetelmät

Tutkimuksemme ei liity ihmisen osallistujia ja eläimiä, vain käyttää ihmisen eturauhassyövän kudoksiin. Potilaat ei voida tunnistaa suoraan tai välillisesti tunnisteet liittyvät aiheet. Siten tutkimushanke on vapautettu kyseisten Poikkeus 4 (45 CFR Part 46) ja eettisen selvitys ei tarvita.

(A) kaaviot on PRMT5 katkaisut. Solut transfektoitiin pcDNA-GFP-p44 ja pcDNA-PRMT5 tai pcDNA-PRMT5 typistykset, ja prosenttiosuudet solujen GFP-p44 sytoplasmassa (C) tai solulimassa plus tumassa (C /N) on esitetty oikealla. (B) sytoplasmisia translokaatio GFP-p44 ohjaavat PRMT5. Solut transfektoitiin pcDNA-GFP-p44 yksin tai yhdessä pcDNA-f: PRMT5, -f: PRMT5 (91-637), tai f: PRMT5 (325-637), ja GFP-p44 solunosasijaintia havaittiin alle konfokaalimikroskoopilla. (C) Western blot-analyysi soluliman ja ydinvoiman jakeet Cos 7 solujen kuvattu B anti-p44, -HSP90 tai -lamin B-vasta-aineen.

eturauhassyöpänäytteissä ja immunohistokemia

Hyvänlaatuinen ja syöpä- eturauhaskudoksiin olivat peräisin eturauhasen yksilöitä 19 potilaalla on eturauhassyöpä käsitellään New York University Medical Center, ja tutkimussuunnitelman hyväksyi sen Institutional Review board. Potilaan identiteetit poistettiin kaikista näytteistä ja vapautuksen tarvetta suostumuksen myönsi Institutional Review Board of New York University School of Medicine, joten ei tietoisen suostumuksen tarvittiin. Kudokset kiinnitettiin 10% neutraaliin puskuroituun formaliiniin ja upotettiin parafiiniin. Immunohistokemiallinen analyysi suoritettiin 19 ihmisen eturauhassyöpänäytteissä kuten aiemmin on kuvattu [36], [37]. Vasta-aineet (anti-p44-vasta-aine, 1:50, anti-PRMT5-vasta-aine, 01:20; BD Transduction Laboratories) levitettiin dia osiin ja inkuboitiin yön yli. Streptavidiini-biotiini-peroksidaasi-tunnistusjärjestelmä 3,3′-diaminobentsidiiniä substraattina käytettiin mukaisesti valmistajan ohjeiden (DAKO A /S, Grostrup, Tanska).

(A) mutaatiot p44 poistetaan PRMT5 perustuva P44 sytoplasminen translokaatio. Solut transfektoitiin pcDNA-GFP-p44 (WT) tai pcDNA-GFP-p44 (MT) yksin tai yhdessä pcDNA-PRMT5. Tuma värjättiin Far-punainen, ja solunosasijaintia GFP-p44 havaittiin alle -konfokaalimikroskoopilla. (B) Mutaatiot p44 kumottiin vuorovaikutusta P44 kanssa PRMT5. Solut transfektoitiin pcDNA-f: p44 (WT) (kaista 1) tai pcDNA-f: p44 (MT) (kaistat 2-5), ja koko solun lysaatit valmistettiin immunosaostus anti-FLAG-vasta-ainetta (M2 agaroosi) . Western blot anti-PRMT5 suoritettiin havaita saostunut PRMT5 (alapaneeli). Yläpaneeli esittää ekspressiota villityypin (WT) tai mutatoituja (MT) p44 lysaateissa käyttää immunosaostusta.

Viljellyt solut kasvatettiin kammion dioja ja kiinnitetään kylmällä metanolilla (-20 ° C) 10 min. Epäspesifinen proteiinit blokattiin 4% kalagelatiinin PBS: ssä 20 minuutin ajan. Inkuboimalla yön yli 4 ° C: ssa primaaristen vasta-aineiden on suoritettu sen jälkeen 1-h inkubointi anti-hiiri- tai anti-kani-lgG-vasta-aine on leimattu Alexa 595 (1:500; Invitrogen) huoneenlämpötilassa. Näytteet pestiin PBS: ssä ja sitten vastavärjättiin TOPRO 3, Far-punainen, tai Sytox vihreää (Molecular Probes) 10 minuuttia huoneenlämpötilassa, joka on asennettu Histogel (Linaris Histogel), ja analysoitiin suoraan fluoresenssin konfokaalimikroskopialla. Kaksinkertainen värjäys anti-PRMT5 ja anti-p44 ja anti-PRMT5 ja anti-coilin (1:100, ProteinTech) inkuboitiin solujen kanssa yön yli 4 ° C: ssa. Sekundaarinen vasta-aineita (anti-kani-lgG-leimattu DyLight 488, 1:1,000, ja anti-hiiri-IgG leimattu DyLight 649, 1, 1000), käytettiin.

(EN) shRNA-välitteinen hiljentäminen PRMT5 tai P44 ilmentymistä eturauhasen syöpäsoluja. Western blot-analyysi kokosolulysaateista valmistettu LNCaP-soluja infektoitiin lentiviruksen ilmentävät ei-kohteena (NT) shRNA (kaistat 1, 5), PRMT5 (kaistat 2-4), tai p44 (kaista 6) shRNAs. ShRNA kestävä PRMT5 (kaista 3) tai PRMT5 R368A mutantti (kaista 4) oli ilmaistu PRMT5 ilmentävien LNCaP-soluissa. (B) kasvukäyrät eturauhassyövän soluissa, jotka ilmentävät NT shRNA, PRMT5 shRNAs, p44 shRNA, PRMT5 shRNAs plus PRMT5, p44 shRNA sekä p44, tai PRMT5 shRNAs plus PRMT5mt.

Soluviljelmä ja kasvun määritys

LNCaP, PC3 ja Cos 7-soluja viljeltiin RPMI 1640-alustassa (Cellgro), 10% (v /v) naudan sikiön seerumia (HyClone). Solun kasvun määrityksessä soluja (5000 kuoppaa kohti) maljattiin 24-kuoppalevyille, ja solujen määrä laskettiin joka päivä 7 päivää.

(A) vaimentaminen PRMT5 ilmentyminen väheni p44-proteiinin tasoa sytoplasmassa . LNCaP-solut infektoitiin NT-shRNA tai PRMT5 shRNA ja immunovärjättiin anti-PRMT5 tai -p44 vasta-aine. Tuma vastavärjättiin Sytox vihreä (keskellä paneelit, vihreä). Näytteet tarkkailtiin konfokaalimikroskoopilla. (B) Western blot sytoplasmisen (C) ja ydin (N) murto-LNCaP-soluja, jotka ilmentävät NT-shRNA, PRMT5 shRNA, tai p44 shRNA anti-p44 ja anti-PRMT5-vasta-aine.

DNA rakentaa ja Ohimenevä transfektio

PRMT5 cDNA-fragmentit monistettiin pcDNA-PRMT5 rakentamiseksi [24] ja subkloonattiin pcDNA-f: GFP rakentaa [28] esittää N-terminaalista f: GFP-fuusioproteiinien of PRMT5 typistyksiä. Kaikki konstruktit todennettiin restriktioentsyymidigestiolla ja DNA-sekvensoinnilla. Vahva tumalokalisaatiosignaalin (RKKKRKV) oli fuusioitu N-terminaalisen pään PRMT5 ilmaista NLS-PRMT5 fuusioproteiinin. DNA-konstruktit (1 mikrogramma kutakin konstruktia) transfektoitiin transientisti LNCaP, PC3, tai Cos 7-solut (1 x 10

5) käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen) seuraten valmistajan ohjeita. Transfektoidut solut kiinnitettiin kylmällä (-20 ° C) metanolia 10 minuutin ajan, värjättiin TO-PRO 3 (10 mikrogrammaa /ml) (Molecular Probes), joka on asennettu Histogel (Linaris), ja analysoitiin välittömästi fluoresens- konfokaalimikroskopialla.

(EN) PRMT5 proteiinin LNCaP soluissa, jotka ilmentävät PRMT5, PRMT5mt, NLS-PRMT5 tai NLS-PRMT5mt immunovärjättiin anti-PRMT5 vasta-aine. Näytteet tarkkailtiin konfokaalimikroskoopilla. (B) Western blot sytoplasmisen (C) ja ydin (N) murto-LNCaP-soluja, jotka ilmentävät PRMT5, f: PRMT5mt, NLS-PRMT5 tai NLS-PRMT5mt anti-PRMT5, -p44, -lamin B tai -HSP90 vasta-aine . (C) kasvukäyrät eturauhassyövän LNCaP soluja, jotka ilmentävät PRMT5, f: PRMT5mt, NLS-PRMT5 tai NLS-PRMT5mt.

RNA Häiriöitä

P44 shRNA (p44-shRNA) (kohdesekvenssi: 5′-GGGAACTAGATGAGAATGA-3 ’), PRMT5 shRNA (kohdesekvenssi: 5′-GGATAAAGCTGTATGCTGT-3′), ja nontargeting shRNA (NT-shRNA) (kohdesekvenssin: 5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3 ’) olivat suunniteltu hiusneula ja tarttuvat päät (Clal ja Mlul). Oligonukleotidit hybridisoitiin osaksi lentiviruksen geeninsiirtovektori, pLVTHM käyttämällä Clal ja MluI restriktioentsyymikohdat. DNA-konstruktit sekvensoitiin testata asetettu oikein ja pituus lisää. Lentivirus sitten tuotettu transfektoimalla ihmisalkion munuaissoluissa (293FT; Invitrogen) ja sekvenssin-todennettujen PLVTHM vektori, pakkaus plasmidi (MD2G), ja kirjekuoren plasmidi (PAX2), joita tarvitaan viruksen tuotantoa. Kolme päivää myöhemmin viruksen supernatantti kerättiin ja suodatettiin solujäänteiden poistamiseksi. LNCaP-soluja (1 x 10

5) maljattiin kuuden kuopan levyille ja transdusoitiin lentiviruksen -vektoripartikkelien. 16 tunnin kuluttua virus sisältävä väliaine poistettiin ja korvattiin normaalilla kasvualustaan. Kolme päivää infektion jälkeen solut halkaistu 1:06 ja kasvatettiin 3 päivää. Kokosolulysaateista (5 mikrogrammaa proteiinia) valmistettu tartunta solut analysoitiin Western blot.

(A) SDS-PAGE PRMT5 komplekseja tuottaman koekspressoimalla in

E. coli

. (B) metylointi SmD3 ja histoni H4 alustoille PRMT5 ja PRMT5 sisältäviä komplekseja. Top: geelin autoradiografialla. Bottom: Coomassie blue Geelin värjäys.

Nontargetable PRMT5 ja p44 Expression

Luo nontargetable PRMT5 ja p44 ekspressiovektoreita, nukleotidisekvenssit kohteena shRNAs mutatoitiin käyttämällä oligo- suora -mutageneesitarvikkeissa. Kohdesekvenssi GGATAAAGCTGTATGCTGT on PRMT5 shRNA mutatoitiin GGATAAAattaTATGCTGT. Kohdesekvenssi GGGAACTAGATGAGAATGA of p44 mutatoitiin GGGAAtTgGAtGAGAATGA. Mutantti PRMT5 tai p44-cDNA subkloonattiin lentiviraalinen ekspressiovektoriin (dsRed-OG2). Rekombinantti lentivirus tuotettiin 293T kuten edellä on kuvattu. Pelastaa PRMT5 tai p44 ilmentymistä, LNCaP PRMT5-shRNA tai p44-shRNA solut maljattiin kuuden kuopan levyille ja transdusoitu viruksella, joka sisältää joko nontargetable PRMT5 tai p44 ekspressiovektoriin tai tyhjän vektorin. 48 tunnin kuluttua solut uudelleen päällystetty, ja PRMT5 tai p44-ilmentyminen vahvistettiin Western blot.

. Immunohistokemiallinen värjäys p44 ja PRMT5 ihmisen hyvänlaatuinen (ylälevyissä), eturauhasen epiteelin liikakasvu (PIN, keskimmäinen paneeli), ja pahanlaatuinen eturauhas- (PCA, Gleason asteen 4, pohja-paneelit) kudoksiin.

Sytoplastiset ja Nuclear Extract valmistelu

Sytoplastiset ja ydin- fraktiot valmistettiin viljellyistä soluista käyttäen Nuclear Extract Kit (luettelo # 40010 ja 40410, Active motiivi) kuten aiemmin on kuvattu [28].

Western Blot analyysi

PRMT5 ja p44 havaittiin kokosolu-uutteet (5 mikrogrammaa) 10% SDS-PAGE: lla ja siirrettiin Immobilon-P siirto kalvolla (Millipore). Membraanit pestiin Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa, jossa Tween 20 (10 mM Tris-HCl, pH 8, 150 mM NaCl ja 0,05% Tween 20) ja blokattiin 5% rasvatonta maitoa Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa, jossa Tween 20: ssa 1 h . Jälkeen blotit tutkittiin yön yli primaaristen vasta-aineiden laimennoksilla 1:2,000 (anti-p44), 1:1,000 (anti-PRMT5), 1:1000 (anti-HSP90, Santa Cruz Biotechnology), 1, 500 (anti-lamiini B, Santa Cruz Biotechnology), ja 1:1,000 (anti-β-aktiini, Sigma-Aldrich). 1,5 tunnin jälkeen inkubaation piparjuuren peroksidi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen, immunoreaktiivisia proteiineja havaittiin tehostetulla kemiluminesenssilla käyttämällä ECL tunnistusjärjestelmä kohti valmistajan ohjeiden (GE Healthcare). Proteiinikonsentraatiot määritettiin käyttämällä Bradfordin proteiinimäärityksellä (Bio-Rad).

Co-immunosaostus

PC3-solut (3,6 x 10

6) transfektoitiin 6 mikrogrammaa pcDNA- f: P44, -f: p44 (26-27AAA), -f: p44 (29-31AAA), -f: p44 (35-37AAA), tai f: p44 (42-44AAA) Lipofectamine 2000. koko -solujen lysaatit valmistettiin transfektoiduista soluista 48 tuntia transfektion jälkeen ja inkuboitiin 15 mikrolitran M2 (Sigma) 2 tunnin ajan 4 ° C: ssa lopulliseen tilavuuteen 0,5 ml, joka sisältää 20 mM HEPES (pH 7,9), 0,2 mM EDTA , 20% glyserolia, 2 mM DTT: tä, 300 mM KCI ja 0,1% NP40. Helmet pestiin viisi kertaa (1 ml kutakin) inkubointipuskurilla. Sitoutuneet proteiinit eluoitiin 30 ul FLAG peptidien (0,2 mg /ml) 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa ja analysoitiin Western blot anti-PRMT5-vasta-aine.

Protein Expression and Purification

PRMT4, p44, pICln tai SmD3 cDNA kloonattiin pET15d (Novagen) ilmaistava aminoterminaalinen His

6-merkittyä proteiinia. Sillä PRMT5 koeskspressio p44 tai pICln, PRMT5 kloonattiin pACYCDuet (Novagen), jossa on aminoterminaalinen His

6 tag, ja p44 tai pICln koodaava alue kloonattiin toinen monikloonauskohtaan sama vektori N-terminaalinen FLAG-epitooppi-tag. Sillä PRMT5 koeskspressio p44 ja pICln, PRMT5 kloonattiin pACYCDuet kanssa aminoterminaalisen His

6 tagin pICln koodaava alue kloonattiin toinen monikloonauskohtaan samassa vektorissa, ja koodaavan alueen p44 kloonattiin pET-vektoria, jossa on N-terminaalinen FLAG-epitooppi-tag. Proteiinit ilmennettiin BL21 (DE3) solut 30 ° C: ssa 3 h induktion jälkeen 0,1 mM isopropyyli-1-tio-β-D-galaktopyranosidi. Solut hajotettiin sonikoimalla kolme kertaa 5 min kukin lyysipuskuria (10 mM HEPES, pH 7,9, 0,3 M KCI: a, 0,1% NP40: tä, 0,1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia, 2 pG /ml pepstatiini A: ta, ja 2 mikrogrammaa /ml leupeptiiniä). Proteiinit puhdistettiin käyttämällä Ni-NTA-agaroosia (Qiagen) mukaisesti valmistajan protokollan imidatsolilla eluointi ja sen jälkeen puhdistettiin M2 (Sigma-Aldrich), FLAG-peptidi eluointi varten PRMT5 sisältäviä komplekseja. Histoneita puhdistettiin HeLa-soluista, kuten aikaisemmin on kuvattu [24].

metyylitransferaasi Pitoisuus

metylointi reaktiot suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu, jossa on muutamia muutoksia [24]. Reaktiot, jotka sisältävät 6 fmol PRMT5 tai PRMT5 sisältäviä komplekseja, 1 mikrogramman SmD3 tai histonien, ja 1 uCi S- [metyyli-

3H] adenosymethionine (PerkinElmer) inkuboitiin 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EGTA ja 1 mM EDTA 30 ° C: ssa 1 h. Reaktiot keitettiin SDS-näytepuskurissa ja erotettiin 15% polyakryyliamidigeelillä. Geelit kiinnitettiin 30 min 40% metanoli-10% etikkahappo, inkuboitiin 20 ml: n monistaminen (Amersham Life Science), 10 minuutin ajan, kuivattiin ja altistettiin röntgenfilmille -80 ° C: ssa.

tulokset

PRMT5 ja p44 Co-lokalisoitu sytoplasmassa eturauhassyöpäsolujen

solunosasijaintia PRMT5 dynaamisesti säädellään hiiren kehityksen aikana [8]. Se paikantuu tumaan aikana varhaisen kehityksen ja löytyy sytoplasmassa pluripotenttien epiblast solujen solunsisäisen massa alkion päivänä 6,5. PRMT5 ensisijaisesti paikantuu sytoplasmaan somaattisten solujen kuten 293T, Cos-1, U2OS ja normaali B-solut [35], [38], [39]. Nykyisissä tutkimuksessa, immunovärjäys anti-PRMT5 vasta-aine, osoitti, että PRMT5 on pääasiassa sytoplasmista eturauhassyövässä PC3 ja LNCaP-solut (Fig. 1A, paneelit a ja d).

Western blot sytoplasmisen ja ydinvoiman jakeet vahvisti solunosasijaintia (Fig. 1 B, yläpaneeli). PRMT5 havaittiin myös ytimet PC3 ja LNCaP-soluissa, kuten erilliset ydin- elimet (Fig. 1A, kaistat c, f, ja g, merkitty valkoisilla nuolilla).

ydin sisältää monia dynaamisia ydin- rakenteet, mukaan lukien Cajal elimet [40]. Vaikka toiminta Cajal kehon edelleen tuntematon, on huomattavaa näyttöä siitä, että se voi olla mukana snRNA kypsymiseen /biogeneesin, histoni pre-mRNA: n prosessointiin, ja kokoonpanoa transcriptosomes [41], [42]. Cajal runko sisältää useita komponentteja kuten coilin (markkeri Cajal elinten), snRNP: eille, ja SMN. PRMT5, MEP50, pICln, ja Sm proteiinit muodostavat methylosome kompleksin, joka välittää kokoonpanoon spliceosomal snRNP [18], [20]. SMN-kompleksi, joka sisälsi Sm proteiineja ja PRMT5, on välttämätöntä ja riittävää kokoonpanossa UsnRNA [21], [43]. Olemme immunovärjättiin LNCaP-soluja käyttäen kanin anti-coilin ja hiiren anti-PRMT5 vasta-aine. Yhdistetyn kuvan osoitti, että PRMT5 ei yhteistyössä paikallistaa Cajal elinten tumassa (Fig. 1A, paneeli h).

suostumuksella meidän aiemmin raportoitujen tietojen [25], p44-proteiini lokalisoitu pääasiassa solulimassa eturauhassyövän PC3 ja LNCaP-soluissa (kuvio. 1A, paneelit b ja e, Fig. 1B, toinen paneeli). Sulautuneella kuvat osoittivat hyvää kolokalisaation PRMT5 kanssa p44 sytoplasmassa, kun taas tämä yhteistyö lokalisointi ei havaittu ytimen PC3 ja LNCaP-soluissa (kuvio. 1A, kaistat c, f, ja g).

PRMT5 sisältää kolme Nuclear syrjäytymisen Signals

N-terminaalinen tehostetun vihreän fluoresoivan proteiinin (GFP) hännitetty PRMT5 (GFP-PRMT5) ilmennettiin väliaikaisesti PC3, LNCaP ja Cos 7-soluissa, ja tuloksena GFP-PRMT5 fuusioproteiini oli hallitseva sytoplasmisen lokalisointi (Fig. 2B, ruudut a ja e; tietoja ei näytetä PC3-solut) niissä soluissa, on samanlainen kuin endogeenisen PRMT5 proteiinin (Fig. 1A, ruutu d). GFP-proteiinia paikantuu sekä sytoplasmassa ja tumassa näissä soluissa (kuvio. 2B, kaistat I ja J). Tunnistaa molekyylitasolla määräävä solunosasijaintia PRMT5 päällekkäisiä fragmentteja ulottuu koko avoimen lukukehyksen PRMT5 (Fig. 2A), kloonattiin lukukehykseen tuottaa pcDNA-f: GFP-PRMT5 fuusiorakenteita. Nämä rakenteet transfektoitiin Cos 7 soluihin määritetään kriittisen alueiden PRMT5 välttämättömiä ydin- vientiä tai tuontia.

Kaksi proteiinifragmenteista, PRMT5 (1-324) ja PRMT5 (325-637), löydettiin sisällä sytoplasmassa 100% transfektoitujen solujen (Fig. 2A), viittaa siihen, että nämä fragmentit sisältävät tarvittavat signaalit sytoplasmisen lokalisointi. Poistaminen 144 tai 234 aminohappotähdettä C-terminaalin päähän PRMT5 (1-324) fragmentti ei vaikuttanut sen sytoplasmisen lokalisoinnin. Lisäksi deleetioita kuusi tai seitsemän aminohappotähdettä N-terminaalisesta tai C-terminaalisesta johti täydellinen menetys sytoplasmisen lokalisointi, mikä osoittaa, että nämä aminohappotähteet ovat kriittisiä sytoplasmisen lokalisointia tämä fragmentti. Alueen PRMT5 (1-90) havaittiin sytoplasmassa 100% transfektoitujen solujen (Fig. 2A, 2B, kaista b), ja on uusi NES, nimetty NES1. NES1 ei muistuta tavanomaista leusiinirikkaita NES [44].

Lisäksi deleetioanalyysi tunnistettu kaksi muuta NES sekvenssien C-terminaalinen osa PRMT5. Alue ulottuu aminohappotähteistä 500-560 paikantuvat sytoplasmaan 100% transfektoitujen solujen (Fig. 2A, 2B, kaista c). Siten PRMT5 (500-560) fragmentti on myös toiminnallinen NES, nimetty NES2. Alue ulottuu aminohappotähteistä 576-637 paikantuvat sytoplasmaan 98% transfektoiduista soluista (Fig. 2A, 2B, kaista d) ja on toinen toiminnallinen NES, nimetty NES3. Sekvenssien analyysi osoitti, että nämä kaksi NES sekvenssit ovat uusia ja eivät muistuta klassisen leusiinirikkaita NES [44]. Western blot-analyysi soluliman ja ydinvoiman jakeet transfektoitujen solujen vahvisti sytoplasminen lokalisaatio täyspitkän PRMT5 proteiinit ja tunnistettiin Ness (Fig. 3C, yläpaneeli). Ei ydinvoiman lokalisointi signaalit (NLSs) havaittiin PRMT5 proteiinin analyysin. Tunnistettu Ness toimivat samalla tavoin LNCaP-soluissa (kuvio. 2B, keskimmäinen paneeli), ja PC3-solut (tuloksia ei ole esitetty).

PRMT5 Edistää Sytoplasmiset translokaatio p44

PRMT5 fyysisesti vuorovaikutuksessa ja muodostaa kompleksin jossa P44 /MEP40 /WD45 /WDR77 eri soluissa, mukaan lukien eturauhassyöpä solut [33], [34], [35], ja yhteistyö paikallistaa p44 sytoplasmassa eturauhassyöpäsolujen (Fig. 1A). Sitten tutkittiin, PRMT5 ilme vaikuttaa solunosasijaintia P44. Cos 7-solut transfektoitiin pcDNA-GFP-p44 yksin tai yhdessä pcDNA-PRMT5. Yhdenmukaisia ​​aiempien julkaistut tulokset [28], vahva GFP-p44 signaaleja näkyivät tumassa transfektoiduissa Cos 7-soluissa (kuvio. 3B, paneeli a). Kuitenkin, koekspressio PRMT5 johti yksinomainen sytoplasman lokalisaatio GFP-p44 100% transfektoitujen solujen (Fig. 3A, 3B, paneeli b). Poistetaan analyysi osoitti, että C-terminaalinen osa (aminohappotähteet 325-637) on olennainen ja riittävät edistämään GFP-p44 sytoplasminen translokaatio (Fig. 3A, 3B, ruutu d). PRMT5 perustuva sytoplasmista translokaatio p44 vahvistettiin Western blot -analyysillä sytoplasmisen ja ydinvoiman jakeet transfektoitujen solujen (Fig. 3C, yläpaneeli). Samanlaisia ​​havaintoja saatiin LNCaP ja PC3-solut (Fig. 3B, alhaalla kaksi paneelia). Konservoituneiden arginiinitähde (R368) on välttämätön metyylitransferaasin aktiivisuus PRMT5 [45]. Mutaatio on R368A on PRMT5 poisti metyylitransferaasiaktiivisuus [24], mutta ei vaikuta sen kykyyn edistää p44 sytoplasman translokaatio (Fig. S1). Siten PRMT5 on ensisijainen voima määritettäessä sytoplasman lokalisoinnin PRMT5-P44 proteiinikompleksi.

Euroopan PRMT5-p44 Vuorovaikutus tarvitaan PRMT5 perustuva Sytoplasmiset translokaatio p44

Deleetioanalyysi osoittivat, että aminohappotähteet 26-45, että p44-proteiini olivat kriittisiä PRMT5 perustuva sytoplasmista translokaatiota P44 (kuva. S2). Me mutatoitunut aminohappotähteet (

26CME

28,

29RQL

31,

35RYR

37 tai

42LLL

44) alaniineiksi että p44-proteiinin ja tutki seurauksena näiden mutaatioiden PRMT5 perustuva sytoplasmista translokaatio GFP-P44 (Fig. 4A). Nämä mutaatiot eivät muuta GFP-p44 solunosasijaintia Cos 7-soluissa (kuvio. 4A, paneelit g, m, s, y vastaan ​​a). Kuitenkin mutaatiot (

35RYR

37

35AAA

37 ja

42LLL

44

42AAA

44) poisti PRMT5-odotuksiin sytoplasmista translokaatio GFP-p44 (Fig. 4A, paneelit v, b ’vs. d).

Nämä mutaatiot ilmaistiin FLAG-epitooppi-tagged proteiineja PC3-soluissa. Mutaatiot vähentynyttä ilmentymistä tasoja p44-proteiinin (Fig. 4B, yläpaneelin, kaistat 2-5 verrattuna kaista 1). Immunosaostus anti-FLAG-vasta agaroosipalloihin (M2-agaroosi) osoitti, että mutaatiot (

35RYR

37

35AAA

37 ja

42LLL

45

42AAA

44) in p44 poisti sen vuorovaikutus PRMT5 (Fig. 4B, pohjapaneelin, kaistat 4 ja 5 versus kaistat 1-3). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että vuorovaikutus p44 ja PRMT5 on olennaista PRMT5 perustuva sytoplasman lokalisointia P44.

Sekä PRMT5 ja p44 tarvitaan kasvun eturauhassyöpäsolujen

onko PRMT5 on merkitystä eturauhassyövässä, testasimme onko hiljentäminen PRMT5 ilmentymisen LNCaP vaikuttaa niiden kasvua. Tätä varten olemme suunnitelleet lyhyt hiusneula-häiritsevä RNA (shRNA) suunnattu vasten PRMT5 järjestyksessä. Sen testaamiseksi, shRNA voi tukahduttaa PRMT5 ilmaisu, me tartunnan LNCaP-solujen kanssa lentivirusvektorilla transdusoimalla DNA-segmentti määritellään siten, shRNA sekvenssi. Kuten on esitetty kuviossa. 5A shRNA vähentynyt huomattavasti ilmentymistä PRMT5 proteiinin LNCaP-solujen 4 päivän kuluttua lentivirukselle infektion (kaista 2, yläpaneeli) verrattuna ilme ei-kohde (NT) shRNA (kaista 1, yläpaneeli), jonka sekvenssi teki ei vastaa mitään tunnettujen ihmisen geeniä.