Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

miR-18a on yksi säädelty miRNA in kolorektaalisyövissä (CRC), joka perustuu miRNA profilointia. Tässä tutkimuksessa selvitimme toiminnallinen merkitys miR-18a CRC.

Methods

Expression of miR-18a tutkittiin 45 CRC potilailla. Mahdolliset kohdegeenien miR-18a ennustettiin

in silico

etsiä ja varmistettiin lusiferaasiaktiivisuus määrityksellä ja Western blot. DNA-vaurioita mitattiin comet. Gene toiminto mitattiin solujen elinkelpoisuuden, pesäkkeiden muodostumisen ja apoptoosin määrityksiä.

Tulokset

säätely ylöspäin miR-18a oli validoitu ja vahvistettiin 45 ensisijaista CRC kasvaimissa verrattuna viereisten normaaleissa kudoksissa

(

p

0,0001). Kautta

in silico

haku, 3’UTR

Ataxia teleangiektasiaa mutatoitunut (ATM) B sisältää säilyneitä miR-18a sitoutumiskohdan. Expression of ATM oli säädellä vähentävästi CRC kasvaimet (p

0,0001) ja korreloi käänteisesti miR-18a lauseke (r = -0,4562, p

0,01). Yli-ilmentyminen miR-18a koolonkarsinoomasoluissa vähensi lusiferaasiaktiivisuutta konstruktin villin tyypin ATM 3’UTR muttei että mutantti ATM 3’UTR, inferring suoraa vuorovaikutusta miR-18a ATM 3’UTR . Tämä varmistettiin edelleen alaspäin säätely ATM proteiinin miR-18a. Koska ATM on keskeinen entsyymi DNA-vaurioiden korjaus, arvioimme vaikutus miR-18a DNA double-säikeen katkoksia. Kohdunulkoinen ilmentyminen miR-18a estivät merkittävästi korjaus DNA aiheuttaman vaurion etoposidin (p

0,001), mikä johtaa kertyminen DNA-vaurioita, lisäys solujen apoptoosin ja huono klonogeeniset selviytymistä.

Johtopäätös

miR-18a vaimentaa solun korjaus- DNA double-säikeen katkoksia suoraan tukahduttamalla ATM, avainentsyyminä DNA-vaurioiden korjaamiseen.

Citation: Wu CW, Dong YJ, Liang QY, hän XQ, Ng SSM, Chan FKL, et ai. (2013) MicroRNA-18a vaimentaa DNA Vahinkosaneerauksessa läpi ilmentymisen estämiseksi ataksia verisuoniluomen mutatoitunut peräsuolen syövän. PLoS ONE 8 (2): e57036. doi: 10,1371 /journal.pone.0057036

Editor: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kiina

vastaanotettu: 15 marraskuu 2012; Hyväksytty: 16 tammikuu 2013; Julkaistu: 21 helmikuu 2013

Copyright: © 2013 Wu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Hanke tukivat National Natural Science Foundation of China (NSFC) (Projektikoodi 81101488), Kiina 863 ohjelmaa (2012AA02A506) ja Hong Kong ITF rahasto (ITS /276/11). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

miRNA ovat 18- 25-nukleotidin ei-koodaava RNA-molekyylejä, jotka säätelevät mRNA käännös. Ne aiheuttavat vaikutukset kohdistamalla RNA aiheuttama hiljentäminen kompleksi (RISC) täydentäviin sivustoja 3’alue (UTR) niiden kohdegeenien [1]. Sitoutumisen miRNA ladattu RISC sen komplementaarisen sekvenssin johtaa joko translaation tukahduttamisen tai rappeutuminen kohdennetun mRNA [2]. Tätä kautta miRNA säätelevät erilaisia ​​soluprosesseja, mukaan lukien apoptoosin [3], [4], erilaistumiseen [5] ja solujen lisääntymistä [6]. Altered miRNA ekspressioprofiileja löytyivät useimmissa kasvaintyypeissä lukien peräsuolen syöpä (CRC) [7], [8], [9], [10]. Manipulointi erityisiä miRNA havaittiin olevan kykenevät moduloimaan kasvaimen kehittymisen eläinmallissa [6], [11], [12]. Aiemmin kautta profilointi ilmaus 667 miRNA ihmisen peräsuolen syöpä kudoksiin tunnistimme miR-18a kuin yksi säädelty miRNA ihmisen CRC [13]. Korkea miR-18a voidaan havaita ulosteesta CRC potilaista verrattuna yksilöiden normaalin kolonoskopia. Poistettaessa kasvain, ulosteesta taso miR-18a laski merkittävästi [13].

miR-18a kuuluu miR-17-92 klusteri, joka sijaitsee kromosomissa 13q31.1 alueella. Kasvaimia synnyttävän rooli miR-17-92 klusteri on hyvin dokumentoitu. Yli-ilmentyminen klusterin liittyy kiihdytetään kasvaimen kasvua [6] ja solujen lisääntymistä [14]. Kromosominen kopiomäärä voitto klo miR-17-92 klusteri alue liittyi neoplastisen etenemistä adenooma sinoomaan [15]. Korkea ekspressio miR-18a on liitetty rintasyövän [16], virtsarakon syöpä [17] ja haimasyövän [18]. Kuitenkin toiminnallista roolia miR-18a CRC jää epäselväksi. Tässä tutkimuksessa pyrittiin tunnistamaan sen kohdegeenin ja sen keskeinen rooli CRC.

Menetelmät ja materiaalit

ihmisestä otettujen kudosnäytteiden

Peräsuolen kasvainten ja viereisen ei-syöpäkudoksissa saatiin 45 histologisesti-vahvistettu peräsuolen syöpä, kun he leikkauksessa Prince of Wales sairaalan, Hong Kong vuonna 1999 2003 Normaali peräsuolen limakalvo saatiin terveiden verrokkien aikana kolonoskopia Prince of Wales sairaalan vuonna 2009. Kaikki potilaat jos niiden kirjallinen suostumus ennen näytteen keräämistä. Tutkimussuunnitelman ja suostumuksen menettely hyväksyttiin eettisen komitean Kiinan University of Hong Kong.

Cell Culture miRNA lähtöaineita ja transfektio

CRC solulinjoja HCT-116 ja HT-29 oli hyväksytään

in vitro

määrityksissä, koska nämä kaksi solulinjaa ilmentävät funktionaalista ATM vastauksena DNA double-lohkon murtuma (DSB: t) [19], [20]. Molemmat solulinjat hankittiin American Type Culture Collection, ja niitä viljeltiin McCoyn 5A-alustassa (Sigma-Aldrich, St Louis, MO), jossa oli 10% naudan sikiön seerumia (Invitrogen, Carlsbad, CA), 5% CO

2 37 ° C. Edeltäjä miR-18a (pre-miR-18a) ja negatiivinen kontrolli (pre-miR-ctrl) ostettiin Applied Biosystems (Foster City, CA). Transfektio suoritettiin käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen) valmistajan opas.

Dual-lusiferaasireportteri Pitoisuus

Mahdollinen miR-18a sitoutumiskohdan ATM 3 ’untranslation alue (3’UTR) ennustettiin targetscan (www.targetscan.org) ja Miranda (www.microRNA.org). Sekvenssit villityypin tai mutantti siemen alueet kloonattiin pMIR-SELVITYS sivektorissa (Applied Biosystems). Mutantti ATM 3’UTR sekvenssi valmistettiin mutatoimalla 5 nukleotidin siemen alueella. Syntetisoitu oligoja esitetään seuraavasti:

Wild-type sense-juoste:

5′-CTAGTTGTGTCCCAATTTCAAGTATTTTAATTGCACCTTAATGAAATTATCGAGCT-3 ’.

Wild-type anti-sense-juoste:

5′-CGATAATTTCATTAAGGTGCAATTAAAATACTTGAAATTGGGACACAA-3 ’.

Mutant juosteen:

5′-CTAGTTGTGTCCCAATTTCAAGTATTTTAATTTCGTATCAATGAAATTATCGAGCT-3′.

Mutant anti-sense strand:

5′-CGATAATTTCATTGATACGAAATTAAAATACTTGAAATTGGGACACAA-3 ’.

solulinjat transfektoitiin väliaikaisesti ennalta miR-18a tai esi-miR negatiivinen kontrolli (15 nM lopullinen pitoisuus) 24-kuoppalevyillä olivat yhteistyötä transfektoitu

Renilla

lusiferaasin raportti vektori (195 ng /kuoppa) ja

Firefly

sivektorissa (5 ng /kuoppa) käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Solut kerättiin 48 tuntia transfektion jälkeen ja lusiferaasin aktiivisuudet analysoitiin dual-lusiferaasireportteri- määritystä (Promega, Madison, WI).

miRNA Kvantitointi Kvantitatiivinen RT-PCR

Quantitative käänteinen transkriptio polymeraasiketjureaktio (qRT-PCR) yksittäisten miRNA suoritettiin käyttäen TaqMan-miRNA käänteistranskriptio kit (Applied Biosystems) ja TaqMan ihmisen miRNA-määritys (RNU6B: 001093; miR-18a: 002422; miR-16: 000391), joka perustuu modifioidun protokollan Applied Biosystems [21]. miRNA ilmentymistason normalisoitiin sisäisen valvonnan. Kokeilu operaattorit eivät tienneet kliiniset tiedot aikaan kvantifiointiin miRNA toteutettiin.

qRT-PCR mRNA

ATM mRNA määritysrajan, kokonais-RNA käänteistranskriptio satunnainen pohjamaalilla Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems), ja reaaliaikainen PCR asetettu Virta SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems). ATM ilmentyminen oli normalisoitu glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) Alukesekvenssit ovat seuraavat: ATM: Forward: 5′-GGAGAGCTGGAAAGCATTGG-3 ’; Reverse: 5’TGAGAAGCTGGGAGTGTTTCTG-3 ’. GAPDH: Forward: 5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3 ’Reverse: 5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’.

Western blot -analyysi

Yhteensä proteiini uutettiin ja proteiinipitoisuus mitattiin Bradfordin DC-proteiinin määritystä (Bio-Rad, Hercules, CA). 20-40 ui proteiinia kustakin näytteestä erotettiin 8% Bis /Tris-polyakryyliamidi- geelillä kautta elektroforeesilla ja siirrettiin nitroselluloosamembraaneille (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Blotit immunovärjättiin primaarisilla vasta-aineilla 4 ° C: ssa yön yli, ja sekundaarista vasta-ainetta huoneen lämpötilassa 1 tunnin ajan. Anti-ATM (2C1) vasta-aine hankittiin Genetex (Irvine, CA). Anti-fosfo-Checkpoint kinaasi 2-vasta-aine (Thr68) ostettiin Cell Signaling (Danvers, MA). Anti-GAPDH (SC-25778) vasta-aine hankittiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA).

Comet määritys

HCT-116-solut transfektoitiin väliaikaisesti ennalta miR-18a tai pre-miR negatiivinen kontrolli (15 nM lopullinen pitoisuus) 24-kuoppaisilla levyillä. Tunnin inkubaation 2 uM etoposidin tai DMSO, solut joko korjattu tai vaihdetaan elatusainetta ilman etoposidi 2 tunnin ajan, jotta DNA-vaurion korjaamiseen. Lopussa kokeen, solut kerättiin comet mukaan valmistajan oppaassa (Trevigen, Gaithersburg, MD). Pyrstö hetkiä solun komeettoja analysoitiin automaattisesti käyttäen komeetta analyysin ohjelmisto, CometScore (Tri Tek Corp, Sumerduck, VA). Tail hetkiä 50 tai enemmän solua slide määritettiin.

Colony Formation ja solunelinkykyisyysmääritys

Solut (1 x 10

5 per kuoppa) maljattiin 24-kuoppalevylle ja transfektoitu valmiiksi miR-18a tai ennalta miR-ctrl 15 nM. Kaksikymmentäneljä tuntia transfektion jälkeen soluja inkuboitiin 2 uM etoposidin tai DMSO: ssa 1 tunnin ajan, kerättiin talteen ja ympätään (500-1000 /kuoppa) tuoretta 24-kuoppaiselle levylle 9 päivää. Pesäkkeet laskettiin värjäyksen jälkeen

Harris hematoksyliinillä

ratkaisu. Solujen elinkelpoisuus määritettiin 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2, 5-difenyylitetratsoliumbromidi (MTT) (Promega) valmistajan ohjeiden mukaisesti opas. Lyhyesti, MTT-liuosta lisättiin kuhunkin kuoppaan, jonka lopullinen konsentraatio 1 mg /ml kuoppaa kohti ja levyjä inkuboitiin 37 ° C: ssa vielä 3 tuntia. Inkuboinnin jälkeen, 200 ui DMSO: ta lisättiin kuhunkin kuoppaan liuottamiseksi formatsaanisakka muodostunut, ja absorbanssi luettiin 570 nm: ssä käyttäen spektrofotometriä. Kaikki kokeet kolmena rinnakkaismäärityksenä.

anneksiini V apoptoosimäärityksessä

Solut (1 x 10

5 per kuoppa) ympättiin 24-kuoppalevylle ja transfektoitu valmiiksi miR-18a tai pre-miR-ctrl 15 nM. Kaksikymmentäneljä tuntia transfektion jälkeen soluja inkuboitiin 2 uM etoposidin tai DMSO: ssa 1 tunti. Apoptoosi arvioitiin virtaussytometrialla värjäyksen jälkeen anneksiini V (FITC-konjugoitu) (BD Biosciences, Erembodegem, Belgia) ja 7-amino-aktinomysiini (7-AAD; BD Biosciences).

Tilastot

Association between miR-18a ja ATM ilmentyminen analysoitiin Spearmanin r korrelaatio testi. Ero kahden ryhmän lusiferaasireportterigeenin määritys, comet ja pesäkemuodostusta määritettiin Studentin t-testillä. Associations of miR-18a ilmentymisen tason kanssa kliinis analysoitiin Fisherin tarkkaa testiä. Regressioanalyysi analysoitiin SPSS (IBM, New York, USA). Ero solujen kasvukäyrät määritettiin toistettiin ANOVA. Ilman taudin etenemistä analyysi tehtiin Kaplan-Meier menetelmällä ja tulokset testattiin käyttämällä Log-rank-testiä. p 0,05 otettiin tilastollista merkittävyyttä. Kaikki tilastolliset testit paitsi regressioanalyysillä oli tehnyt Graphpad Prism 5.0 (Graphpad Software Inc., San Diego, CA).

Tulokset

miR-18a on Up-säännelty Peräsuolen Kasvain

Niistä 45 paria peräsuolen syöpä kudosnäytteiden, 44 paria olivat korkeammat miR-18a ilmentyminen kasvainsoluissa kuin viereisen normaalin kudoksen (p 0,0001; kuvio 1A), jossa mediaani ero 11,46-kertainen (IQR 4,73 26.00). Suuri ilmaus miR-18a kasvainten liittyi korkeampi uusiutumisriski, joista 9: ssä 15 tapausta korkean kasvain miR-18a uusiutunut verrattuna vain 6 ulos 29 tapauksessa alhaisen kasvain miR-18a uusiutunut jälkeen kirurgisen resektion (p 0,0001, kuvio 3C). Suhteellinen lusiferaasiaktiivisuus villityypin rakennelma ATM 3’UTR HCT-116 väheni merkittävästi läsnä miR-18a (p 0,001; Mann-Whitneyn testi), kun taas tällainen tukahduttava vaikutus miR-18a lusiferaasiaktiivisuus ei havaittu läsnäollessa mutantin ATM 3’UTR (kuva 3D), mikä osoittaa suoraa ja spesifistä vuorovaikutusta miR-18a ATM 3’UTR. Vuorovaikutus varmistettiin lisäksi se havainto, että yli-ilmentyminen miR-18a pystyi vähentämään ATM proteiinin tason ja fosforylaatiota Checkpoint Kinase (CHK-2), suora alavirtaan fosforylaation kohteena ATM

in vitro

(Kuva 3E). Under etoposidi hoito 1 tunti, pCHK-2 taso oli merkitsevästi sääteli riippumatta miR-18a yli-ilmentyminen.

(A) MIR-18a linjaus site (alleviivattu) sisällä ATM 3’UTR eri laji säilyy. (B) ihmisen kypsä miR-18a-sekvenssin alue 3′-UTR ihmisen ATM sisältävät tunnistuskohta, joka kloonattiin konstrukti

Renilla

lusiferaasi. Mutantti 3′-UTR sisältää siemenen alueen 5 mutatoitunut nukleotidin (alleviivattu). (C) Expression of miR-18a HCT-116-solut transfektoitu miRNA lähtöaineiden valvontaa (pre-miR-ctrl) tai miR-18a esiaste (pre-miR-18a) 15 nM. (D) Lusiferaasiaktiivisuutta HCT-116-solut kotransfektoitiin

Renilla

lusiferaasi-konstrukti (joka sisältää villityypin tai mutantti-miR-18a siementen alue),

Monkey

lusiferaarikonstrukti ja pre-asennuspalveli- ctrl tai ennalta miR-18a 15 nM. Toiminnan taso laskettiin normalisoimalla

Renilla

lusiferaasi

Firefly

lusiferaasin. NS tarkoittaa tilastollista merkitystä. p-arvo määritettiin Studentin t-testiä. Keskiarvo ja keskihajonta (SD) laskettiin kolmen erillisen kokeen. (E) Immunoblot endogeenisen ATM ilmentymisen HCT-116-solut 48 tuntia transfektion jälkeen ennalta miR-ctrl ja pre-miR-18a. (F) Immunoblotti fosforyloitua muotoa CHK-2-proteiinia, suora alavirran kohde ATM, HCT-116-soluissa, transfektion jälkeen ennalta miR-ctrl tai ennalta miR-18a alla hoidon DMSO tai 2 uM etoposidi 1 tunti.

ATM on Down-säädellään peräsuolen kasvain ja CRC solulinjoissa

ATM ilmentyminen arvioitiin 45 paria peräsuolen kasvain ja viereisten normaaleissa kudoksissa. Toisin kuin miR-18a, ilmaus ATM oli merkitsevästi pienempi tuumoreissa kuin ei-tuumorikudoksissa (p 0,0001; kuvio 1 B), jossa mediaani ero 0,369-kertainen (IQR 0,127-0,575). Expression of miR-18a ja että ATM oli käänteisesti korreloivat Spearman r = -0,4562 (p 0,01; kuvio 1 C). Poikkeava säätely alaspäin ATM havaittiin myös CRC solulinjoissa verrattuna normaaliin paksusuolen koepaloja (p 0,05, kuvio 1 D).

miR-18a Säätelee Double-lohkon DNA Damage Recovery

ATM aktivointi merkitsee varhaista ja tärkeä tapahtuma DNA: n korjautumista vaste DNA DSB: ihin [24]. Kuten miR-18a voi tukahduttaa ATM ilmaisun oletamme, yli-ilmentyminen miR-18a soluissa estäisivät määrättävät. Taso DSB tutkittiin comet. Ilman induktio DNA-vaurioita, HCT-116-solut oli lähtötilanteessa hännän hetki 7,75 ± 4,37 yksikköä. Altistuminen 2 uM etoposidia 1 tunnin johti huomattavasti suurempi takaosan liike (15,46 ± 6,07 yksikköä, p 0,0001), mikä osoittaa, induktio DNA DSB etoposidin. Kun annettiin 2 tuntia normaalissa väliaineessa täydennettynä 10% FBS hyödynnettäväksi, pyrstö hetki etoposidi käsitellyn HCT-116-solujen palautuu perustasolle (7,69 ± 5,14 yksikköä), kun taas hännän hetki HCT116-solujen yli-ilmentävät miR-18a pysyi merkitsevästi lähtötasoa korkeampi taso (p 0,001), mikä osoittaa miR-18a indusoi ja kiellettiin DNA korjaukseen (kuva 4).

(A) aikajana suuruusluokkaa hoito (B) näytteitä komeetta jätteestä kussakin ryhmässä, vasemmalta oikealle, transfektoidut solut miRNA-ohjaus esiaste (pre-miR-ctrl) ja ilman lääkehoitoa, transfektoidut solut esi-miR-ctrl ja käsiteltiin 2 uM etoposidin, transfektoidut solut esi-miR-ctrl ja käsiteltiin 2 uM etoposidi ja transfektoidut solut esi-miR-18a ja käsiteltiin 2 uM etoposidin, kaksi viimeistä ryhmää solujen annettiin kahden tunnin ajan normaalissa väliaineessa, kun lääkehoitoa. (C) Laatikko käyrä takaosan liike solujen eri kohtelu perustuu analysointiin 50 solua satunnaisesta mikroskooppikentäs-. Laatikko edustaa kvartiiliväli, linjan poikki Ruudussa mediaaniarvot ja viikset ovat 5-95 prosenttipisteet. p-arvot arvioitiin epäparametrinen t-testiä.

miR-18a Lisäykset herkistyminen CRC-solujen Genotoxin

Ilman nopea vastaus ja korjaus, DNA-vaurioita kertyy ja vähentää solujen kasvua ja solujen elinkykyä. Olemme tutkineet vaikutusta miR-18a CRC solukasvua pesäkemuodostusta kaksi CRC-solulinjoissa (HT-29 ja HCT116). Ilman induktio DNA-vaurioita, yli-ilmentyminen miR-18a ei ollut merkittävää vaikutusta solujen kasvuun verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu lähtöaineiden valvontaa sekä HT-29 (kuvio 5A) ja HCT-116 (kuvio 5C). Altistuvat 2 uM etoposidia muodostunut pesäkkeitä vähensi merkittävästi HT-29 (kuvio 5A) ja HCT-116 (kuvio 5C). Johdonmukaisesti, ektooppinen ilmentyminen miR-18a huomattavasti tukahdutetaan solujen elinkelpoisuutta verrattuna lähtöaineiden valvontaa yli-ilmentävät HT-29 (p 0,001; kuvio 5B) ja HCT-116 (p 0,05, kuvio 5D).

vaikutus Kohdunulkoisten ilmentymisen miR-18a solujen kasvuun (A) HT-29-solujen tai (C) HCT-116-solujen kanssa tai ilman hoitoa 2 uM etoposidin. Keskiarvo ± SD laskettiin kolmesta itsenäisestä kokeesta. Merkitsevä ero määritettiin Studentin t-testillä. NS tarkoittaa tilastollista merkitystä. Vaikutus miR-18a (B) HT-29 ja (D) HCT-116 solujen elinkelpoisuus hoidon jälkeen 2 uM etoposidia. Keskiarvo ± SD laskettiin kolmesta itsenäisestä kokeesta. Merkitsevä ero määritettiin toistettiin toimenpidettä ANOVA.

miR-18a Edistää Genotoxin indusoiman apoptoosin

Ilman induktio DNA-vaurioita, yli-ilmentyminen miR-18a ei indusoinut merkittävää vaikutusta solujen apoptoosin HT-29 ja HCT-116 (kuvio 6). Altistuminen 2 uM etoposidia merkittävästi aiheuttamaa määrän apoptoottisten solujen sekä HT-29 ja HCT-116-solut (molemmat p 0,001; Kuva 6A2 ja 6B2). Yli-ilmentyminen miR-18a edelleen indusoi apoptoosia synergistisesti etoposidin sekä HT-29 (p 0,0001) ja HCT-116 (p 0,01) soluja.

(A) HT-29-solujen tai (B ) HCT-116-solujen kanssa tai ilman hoitoa 2 uM etoposidin. Keskiarvo ± SD laskettiin kolmesta itsenäisestä kokeesta. Merkitsevä ero määritettiin Studentin t-testillä. NS tarkoittaa tilastollista merkitystä.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa selvä yhteys miR-18a ja geeni ATM perustettiin. Lusiferaasireportterigeenin määritys ja western blot-analyysi vahvisti vuorovaikutusta, joka oli sitoutumisen kautta miR-18a 3’alueella ATM-mRNA: n ja sen jälkeen vaimentaa sen proteiinin translaation ja sen aktiivisuus. Tämä yhdistys oli ilmeisintä päässä käänteinen korrelaatio miR-18a ja ATM peräsuolen kasvain kudoksissa (p 0,01).

ATM on suurimolekyylipainoinen proteiinikinaasi, jolla on keskeinen ja varhainen rooli korjaus DNA DSB, jotka ovat yksi muoto useimpien sytotoksisten DNA vaurioita, joita syntyy molemmista endogeenisten (esim oksidatiivista stressiä) ja ulkosyntyisten (esim ionisoivan säteilyn ja genotoksisten aineiden) lähteistä. Stimuloimattomissa solu, ATM useimmiten esiintyy inaktiivisena homodimeerinä tai multimeeri, jossa kinaasidomee- yhden ATM-proteiini sitoutui sisäiseen verkkotunnus toisen ATM proteiinia sisältävä seriini 1981-fosforylaatiokohdan [24]. Tämä rakenne on tärkeää pitää ATM-proteiinin aktiivinen ja vakaa, kun ei ole DNA-vaurioita. Siksi missään ulkoisia ärsyke, joka johtaa DNA-vaurioita, miR-18a over-ilmentyminen ei aiheuttanut merkittävää fenotyypin muutosta HT-29 ja HCT-116 soluja ilmeistä solujen elinkelpoisuuteen, jakaantumiseen ja apoptoosin analyysi verrattuna kontrolliryhmiin. Kuitenkin vastauksena DNA aiheuttaman vaurion etoposidin, genotoksinen aine, joka nimenomaan aiheuttaa DSB, huomasimme, että solut yli-ilmentävät miR-18a olivat vähemmän pystyy palauttamaan vaurioilta verrattuna soluihin transfektoitu miRNA ohjaus esiaste, mikä vaarantunut DNA DSB: t korjaus mekanismi. Alle DNA-vaurioita ärsyke, kinaasidomee- yhden ATM-proteiinin fosforyloitua 1981-verkkotunnus vuorovaikutuksessa ATM-proteiini, jolloin aktiivinen kinaasi monomeerisessä [24]. Aktivoitu ATM vapautuu ja voi fosforyloida monipuolisista loppupään tavoitteita, jotka osallistuvat tapahtumiin korjata DNA-vaurioita [25]. Yli-ilmentyminen miR-18a vähensi ATM-proteiinin määrät, ja siten saatavuus aktivoitu ATM-DNA korjaukseen. Siksi, kuten DNA-vaurioita kertyy ilman pikaista korjausta, miR-18a yli ilmentävien solujen olivat alttiimpia sitoutua apoptoosin, vähentää klonogeeniset selviytymisen ja proliferaationopeus, kuten näkyy sekä HT-29 ja HCT-116-soluissa.

vaarantunut DNA-korjausmekanismin menettämisen vuoksi ATM-toiminto on tunnettu taipumus eri sairauksiin. Kaikkein ilmeinen esimerkki on peritty peittyvästi periytyvä sairaus, ataksia-telangiektasia (A-T), joka johtuu menetyksestä ATM-proteiinin ilmentymisen tai toiminnallisen proteiinituotteen. Tauti on tunnusomaista etenevä pikkuaivoataksian, neuro-rappeuma, radioherkkyyttä, solusyklin tarkastuspiste vikoja, genomin epävakautta, ja taipumus syövän eri muotojen [26], [27], [28]. Kromosominen voitto alueella 13q31.1, jossa miR-17-92 sijaitsee, on varhainen tapahtuma adenooma-karsinooma järjestyksessä. Johdonmukaisesti, säätely ylöspäin miR-18a havaitaan, koska precancerous vaiheessa CRC [13]. Tukahdutetaan DNA-korjausmekanismin aiheuttama säädelty miR-18a voisi palvella katalysoiva rooli muodostumista syöpä.

Tällä hetkellä, kasvain vaihe on kaikkein tärkein prognostinen indikaattori CRC potilaille. Kuitenkin monet potilaat kehittyi uusiutumisen jälkeen kirurgisen resektion riippumatta vaiheen tai tarjoaminen adjuvanttihoitoa. Muita prognostisia biomarkkerit tarvitaan tarjoamaan parempaa toistumisen riskinarviointi jotta potilaat voivat hyötyä läheisen seurannan. Löysimme korkea miR-18a tasoa liittyy korkeampi uusiutumisen nopeus ja nopeampaa toistumisen. On vielä selvittämättä, mikäli tämä ilmiö välittyy ATM tai muu miR-18a kohdegeenien. Kuitenkin rooli ATM ennustamisessa kemo- /radio-terapia resistenssin hoitopaikassa pysyy edelleen epäselvä. Roossink et ai. kertoi, että ATM aktivaatio indusoi suojaava rooli kemo- /radio-hoidon kohortin kohdunkaulan syöpäpotilaiden [29]. Jiang et al., Kuitenkin osoitti, että ATM voi herkistää ja suojaamaan doksorubisiinin aiheuttaman sytotoksisuuden, riippuen taitoa muiden DNA korjaavien geenien kuten p53 ja CHK-2 [30]. Huehls et ai. osoittivat, että ehtyminen ATM ei herkistää soluja 5-FU, joka on tärkein hoito käytetty CRC [31]. Admansen et ai. osoittivat myös, että kliinisesti merkittävää annostuksella 5-FU, ATM-reitin ei aktivoida DNA: n korjautumista CRC soluissa [32]. Siksi vaikka meidän

in vitro

data osoitti selvästi tukahduttamista ATM by miR-18a herkistyneet syöpäsolujen etoposidiksi rooli ATM rooli Chemo-resistenssi voi vaihdella kemoterapeuttista-erityinen ja kasvaimen erityisellä tavalla

in vivo

. Lisäksi miR-18a liittyvää toistumisen voidaan myös välittyvän muut mahdolliset kohdegeenien että houkuttele onkogeeniset luonne

in vivo

. Tämä hypoteesi on kuitenkin tarvitsee lisätutkimuksia ja validointi. Perustaminen miR-18a kuten toistumisen merkki Lisäksi on validoitu kohortin suurempaa otoskoko.

Yhteenvetona tunnistimme ATM, proteiinia tärkeää DNA: n korjaukseen, koska kohteena miR-18a. Vuonna peräsuolen syöpä kudoksissa, ilmentyminen miR-18a ja ATM korreloivat käänteisesti. Kohdunulkoinen ilmaisu miR-18a estää ATM ilmaisun ja vaimentaa DNA: n DSB korjaus. miR-18a, usein säädelty miRNA CRC, indusoi sen onkogeeninen vaikutus ainakin osittain tukahduttaa ATM. Lisäksi kasvaimen miR-18a taso on potentiaalinen markkeri peräsuolen syövän uusiutumiseen.