Krooninen sairaus

tiivistelmä

tavoitteena nykyisen oli tutkia ekspressiokuvion ja kliinis merkitys TRIM24 potilailla, joilla on ei-pieni keuhkosyöpä (NSCLC). Ilmaisu profiilia TRIM24 NSCLC kudoksissa ja viereisten noncancerous keuhkokudokset havaittiin immunohistokemiallisesti. TRIM24 havaittiin yliekspressoituvan 81 113 (71,7%) ihmisen keuhkosyöpä näytteitä ja korreloidaan p-TNM (p = 0,0006), huono erilaistumista (p = 0,004), Ki67-indeksi (p 0,0001), sykliini D1 ( p = 0,0096) ja p-RB-ilmentyminen (p = 0,0318). Lisäksi heikentävien TRIM24 ilmentymisen Sirna esti kasvun ja hyökkäyksen keuhkojen solulinjoissa. Lisäksi TRIM24 ehtyminen aiheuttama solusyklin pysähtymisen G1 /S rajan ja indusoi apoptoosin. Western blotting-analyysi paljasti, että knockdovvn TRIM24 vähensi proteiinin tasot sykliini A, sykliini B, sykliini-D1, sykliini E ja p-Rb ja lisääntynyt P27 ilme. Nämä tulokset osoittavat, että TRIM24 tärkeä rooli NSCLC etenemiseen.

Citation: Li H, Sun L, Tang Z, Fu L, Xu Y, Li Z, et al. (2012) yli-ilmentyminen TRIM24 korreloi syövän etenemisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä. PLoS ONE 7 (5): e37657. doi: 10,1371 /journal.pone.0037657

Editor: Rana Pratap Singh, Jawaharlal Nehru University, Intia

vastaanotettu: 02 tammikuu 2012; Hyväksytty 23. huhtikuuta 2012 Julkaistu: toukokuu 30, 2012

Copyright: © 2012 Li et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on yksi johtavista syistä kaikki syöpään liittyvien kuolemien maailmanlaajuisesti ja esiintyvyys keuhkosyövän kasvaa [1], [2]. Suurin osa diagnosoitu keuhkosyöpä tapauksissa ovat ei-pienisoluinen keuhkosyövässä (NSCLCs). Vaikka kolme hoitomuodot (kirurgisia resektio, kemoterapiaa, ja sädehoitoa) on perustettu, pysyvyyttä varten keuhkosyöpäpotilaita on edelleen yleisesti huono [3]. Monimutkaiset geneettisten, epigeneettiset ja microenvironmental tekijät tärkeitä rooleja selviytymisen ja kolonisaatio kasvainsolujen at uuteen paikkaan [4], [5]. Parannus ymmärtämään molekyylitason prosessien keuhkojen syövän synnyn on johtanut uusia hoitovaihtoehtoja kohdistetun pieniä molekyylejä ja rokotteet osoittavat rohkaisevia potentiaalia. Siksi määritellä paremmin synnyssä keuhkosyövän, etsivät hyödyllisiä biomarkkereita, ja tutkimalla uusia terapeuttisia kohteita ovat vaativia tehtäviä.

TRIM24 oli alun perin nimetty transkriptio välittäjä tekijä 1-alfa (TIF1α), joka tunnistettiin co -regulator retinoidi signaloinnin [6] – [8]. Poikkeava ilmentymä TRIM24 saattaa edistää kasvainten kehittymistä monin mekanismein. TRIM24 on tavoite kromosomitranslokaation muodostaa onkogeenisten fuusioproteiinien akuutissa promyelosyyttileukemian, papillaarinen kilpirauhassyövän ja myeloproliferatiivisten oireyhtymä [9] – [11]. TRIM24 voisi ubiquitylate ja säädellä negatiivisesti p53 tasoja, mikä teki TRIM24 terapeuttisena kohteena palauttaa tuumorisuppressiogeeneksi p53 [12]. TRIM24 sitoo myös chromatin ja estrogeenireseptorin aktivoida estrogeenin -riippuvaisella geenejä, joita liittyy solujen lisääntymistä ja kasvainten kehittymiseen [13], [14]. Kohonnut ilmaus TRIM24 voisi edistää etenemistä eturauhassyövän ja korreloi negatiivisesti selviytymisen rintasyöpäpotilaiden [14], [15]. Nämä havainnot viittaavat siihen, että TRIM24 oli onkogeenin kasvainten kehittymiseen. Kuitenkin viimeaikaiset tutkimukset osoittivat, että menetys TRIM24 hiirillä johti maksasolusyövän kehittämiseen ja TRIM24 vuorovaikutuksessa TRIM28 ja TRIM33 muodostaa sääntelyn komplekseja että tukahdutetaan hiiren maksasyövän, mikä viittaa sen rooli tuumorisuppressori heptocellular syöpä [16]. Lisäksi, valtimoiden kalkkiutuminen ja ilmentymistä D-vitamiinin reseptorin tavoitteet lisääntynyt joilta puuttuu TRIM24, joka osoittaa, että TRIM24 voisi estää kalkkiutumisen valtimoiden vähentämällä aktiivisuutta D-vitamiinin signalointireitin [17].

proteiinin ilmentymisen of TRIM24 perus keuhkosyöpää ja sen suhde kliinis tekijöitä ei ole vielä tutkittu. Lisäksi biologisia rooleja sekä TRIM24 keuhkosyövän solut ovat vielä epäselviä. Jotta edellä mainittuihin kysymyksiin, tarkastelimme TRIM24 ilmentymistä ei-pienisoluinen keuhkosyöpä kudoksia immunohistokemiallisesti. Lisäksi olemme myös tutkineet yhdistys TRIM24 kanssa leviämisen ja invaasion kyky useissa keuhkosyövän solulinjat.

Tulokset

yli-ilmentyminen TRIM24 proteiinin ei-pienisoluinen keuhkosyöpä Kudokset

Analysoimme ilmentymisen TRIM24 113 NSCLC yksilöitä ja niiden vastaavat normaalit kudokset immunohistokemiallisesti. TRIM24 ilmentyminen havaittiin ydin- osastoissa tuumorisolujen (kuvio 1 C-G), kun taas normaali keuhkoputkien epiteelin ja penumosyy- esillä negatiivinen tai alhainen värjäytymistä (kuvio 1 A, B). Värjäytymisintensiteettiä normaali hengitysteiden epiteelin vieressä kasvain voitaisiin arvioitu useissa kohdissa sisältävien pahanlaatuisia kasvaimia ja normaaleissa kudoksissa samassa slide. Kun taas yksikään heikko värjäys TRIM24 havaittiin normaalissa keuhkojen kudoksiin, voimakas värjäytyminen TRIM24 havaittiin vierekkäisten kasvainsoluissa (kuvio 1 C). Olemme tutkineet suhdetta koko TRIM24 ilmaisun ja kliinisten parametrien. Kuten taulukossa 1 on esitetty, ei ole tilastollista eroa välillä havaittiin TRIM24 yli-ilmentymisen ja ominaisuudet iän (p = 0,4697), sukupuolen (p = 0,1814), kasvaimen tila (p = 0,1812), imusolmukestatuksesta (p = 0,0825) ja kasvaimen tyyppi (p = 0,6327). Kuitenkin potilaat, joilla on korkea TRIM24 ilme oli huono erilaistumiseen (p = 0,004) ja oli edennyt pitkälle NSCLC (I vs II + III + IV, p = 0,0006). Tutkimme ilmaus Ki-67 tutkimaan suhdetta TRIM24 positiivisuus ja proliferatiivista aktiivisuutta syövän kudoksissa immunohistokemiallisesti. Tapaukset, joissa oli korkeita TRIM24 ilmaisun yleensä on korkea leviämisen indeksi ilmaistaan ​​Ki-67 merkintää (p 0,0001). Double immunofluoresenssianalyysillä suoritettiin ja co-localization of Ki-67 ja TRIM24 havaittiin (kuvio 2A, B). Immunovärjäys p53, retinoiinihapon alfa-reseptori (RARa), sykliini D1, p-Rb ja p27 suoritettiin myös ja niiden yhdessä TRIM24 ilmentyminen analysoitiin (kuvio 2 C-H). Kuten on esitetty taulukossa 1, TRIM24 yli-ilmentyminen korreloi korkean sykliini D1 (p = 0,0096) ja p-RB-ilmentyminen (p = 0,0318), kun taas mitään tilastollista eroa välillä havaittiin TRIM24 yli-ilmentymisen ja p53 (p = 0,9028), RARa (s = 0,1025), ja p27 tila (p = 0,6335).

. Negatiivinen värjäys normaaleissa keuhkoputken epiteelin syövätöntä keuhkokudoksessa. B. Negatiivinen värjäys normaalissa penumosyy- keuhkorakkuloihin ei-syöpä keuhkokudoksessa. C. TRIM24 Immunovärjäyksen oli negatiivinen keuhkoputkiepiteelissä vieressä keuhkojen adenokarsinooma. D. Negatiivinen TRIM24 värjäystä tapauksessa Stagel, kohtuullisesti erilaistunut okasolusyöpä. E. Negatiivinen värjäystä Stagel, hyvin eriytetty keuhkoadenokarsinooma. F. Positiivinen TRIM24 värjäyksen tapauksessa vaiheen II, huonosti eriytetty okasolusyöpä. G. Positiivinen TRIM24 värjäystä tapauksessa vaiheen III, kohtuullisesti erilaistunut adenokarsinooma. H. Negatiivinen kontrolli käyttämällä kanin immunoglobuliini.

Immunofluoresenssikoe värjäys osoitti kolokalisaation TRIM24 ja Ki-67 adenokarsinooma (A) ja okasolusyöpä (B). Immunohistokemiallinen värjäys TRIM24 (C) ja RARa (D), cyclinD1 (E), p-Rb (F), p27 (G) ja p53 (H) värjäystä tapauksessa NSCLC.

TRIM24 väheneminen Estää leviämisen, invaasio ja indusoi apoptoosia Lung Cancer Cell Lines

Expression of TRIM24 analysoitiin western blot paneelissa keuhkosyövän solulinjoja (kuvio 3). Löysimme taso TRIM24 ilmaisun H1299 ja A549-soluja oli suurempi kuin muut solulinjat. Koska rooli TRIM24 liittyy läheisesti p53 ja RARa tietyntyyppisissä kasvain, tutkimme myös p53 ilmaisun ja RARa keuhkosyövässä solulinjoissa. Ei ollut selvää yhdistyksen välillä näistä tekijöistä. Jotta tutkia biologisen toiminnan TRIM24 keuhkosyövän, käytimme siRNA jotta pudotus TRIM24 ilmaisua sekä H1299 ja A549 solulinjoissa. TRIM24-spesifisiä siRNA vähentää huomattavasti sekä mRNA: n sekä proteiinin ekspressiotasot TRIM24 jälkeen 48 tuntia siRNA hoidon (kuvio 3). Meidän soluproliferaatiota analyysi osoitti, että ehtyminen TRIM24 vuonna H1299 ja A549-solut johti merkittävä väheneminen leviämisen nopeus (A549 39% vähennys 5. päivänä, p 0,05; H1299 23% vähennys 5. päivänä, p 0,05) ja pesäkkeitä numerot sekä kokoja (A549 ohjaus vs TRIM24si: 400 ± 38 vs. 130 ± 20, p 0,05; H1299 ohjaus vs TRIM24si: 235 ± 25 vs. 85 ± 18, p 0,05), mikä viittaa siihen, että TRIM24 moduloi leviämisen keuhkosyöpään -solut (kuvio 4). Analyysi solusyklin osoitti, että TRIM24 pudotus solujen prosenttiosuus S ja G2-vaiheessa oli paljon pienempi kuin kontrollisolut ja prosenttiosuus G1 faasi kasvoi (kuvio 5A). Näin TRIM24 Knockdown esti solusyklin etenemisen.

. Ekspressiotasot TRIM24, p53 ja RARa analysoitiin western blot paneelissa keuhkosyövän solulinjat. B. Immunoblot TRIM24 ehtyminen tehokkuuden syöpäsoluissa. C. Reaaliaikainen PCR analyysejä TRIM24 ehtyminen tehokkuuden syöpäsoluissa.

. MTT-analyysi suoritettiin sen jälkeen, kun TRIM24 siRNA hoidon. Vähentäminen absorbanssi havaittiin (p 0,05 5. päivänä sekä A549 ja H1299). B. Arvio klonogeeniset potentiaalit TRIM24-köyhdytettyä syöpäsoluja. Pesäkkeiden lukumäärät laskettiin. Pesäkkeiden lukumäärä muodostuu soluissa, joita käsiteltiin TRIM24 siRNA oli paljon pienempi kuin kontrollisolujen (p 0,05). Pylväät, keskiarvo; baareja, SD. * P 0,05.

prosenttiosuus G1 faasi lisääntynyt solujen TRIM24 taintumisen (H1299 ja A549, p 0,05), kun taas prosenttiosuudet S-vaiheeseen (H1299, p 0,05) ja G2 vaihe (H1299 ja A549, p 0,05) pieneni näissä soluissa verrattuna säätökennoja (A). TRIM24 Knockdown indusoi myös solujen apoptoosia sekä A549- ja H1299 solulinjoissa (B, p 0,05). * P 0,05.

Lisäksi anneksiini V pakki käytettiin luonnehtimaan kuoleman ominaisuus H1299 ja A549 solut TRIM24 taintumisen (kuvio 5B). On selvää, merkittävä populaatio varhaisen ja myöhäisen apoptoosin (H1299: 7,22%; A549: 10,45%) havaittiin solujen TRIM24 Knockdown verrattuna scramble valvonta (H1299: 3,76%; A549: 8,43%), mikä osoittaa, että TRIM24 knockdown tuloksia apoptoosin keuhkosyövän soluja, erityisesti H1299-soluissa, joilla on suuri endogeeninen TRIM24 ekspressiota.

sen määrittämiseksi, onko TRIM24 edistää hyökkäys ei-pienisoluisen keuhkosyövän soluja, teimme matrigeeliä hyökkäystä määrityksissä. Kuten kuviossa 6A, TRIM24 knockdown esti soluinvaasiota (A549 ohjaus vs TRIM24si: 91 ± 15 vs. 68 ± 11, p 0,05; H1299 ohjaus vs TRIM24si: 62 ± 4 vs. 38 ± 8, p 0,05).

TRIM24 siRNA hoito on mitattavissa esto vaikutus solujen invaasiota molemmissa solulinjoissa. Määrä soluja valtaavat alempaan suodattimen pinta laskettiin, merkitsevä ero havaittiin (A, p 0,05). Pylväät, keskiarvo; baareja, SD. Ei ollut merkittävää muutosta MMP2 ja MMP-9 ekspressiotasot jälkeen TRIM24 taintumisen (B). * P 0,05.

Tutkimaan edelleen mekanismeja, joilla TRIM24 edistää NSCLC soluinvaasiota, selvitimme MMP-2 ja MMP-9 ilmaisun ennen ja jälkeen transfektion siRNA. Kuten kuviossa 6B on esitetty, mRNA: n MMP-2, MMP-9 tutkittiin Kvantitatiivinen reaaliaikainen RT-PCR: llä. Emme kuitenkaan eivät havainneet merkittäviä muutoksia niiden ilmaisua.

ehtyminen TRIM24 vaimentua CyclinA, B, D1 ja E Expression ja yliaktiivista P27 Lung Cancer Cells

solusyklin analyysit tehtiin syöpäsolujen kanssa tai ilman TRIM24 pudotus, ja totesi, että osuus G1 faasi kasvoi solujen TRIM24 pudotus, kun taas prosenttiosuus S-vaiheeseen aleni näissä soluissa verrattuna kontrollisoluihin (kuvio 5). Nämä tulokset osoittavat, että TRIM24 ehtyminen indusoi solusyklin pysähtymisen G1 /S rajan. Myös osuus G2-vaiheessa olevien solujen väheni. Tutkia mekanismia taustalla solusyklin pysähtymiseen, testasimme vaikutus TRIM24 pudotus on sykliini A, sykliini-B, sykliini D1, sykliini D3, sykliini E CDK2, CDK4, CDK6, P-Rb, P21 ja P27 tasolla. Kuten kuviossa 7A, Western blotting-analyysi paljasti, että pudotus on TRIM24 vähensi proteiinin tasot sykliini A, B, D1, E, p-Rb ja lisääntynyt P27 ilmentymistä. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että inhiboiva TRIM24 ilmentyminen indusoi solusyklin pysähtymisen G1-S-siirtymä ja estää keuhkojen syöpäsolujen kasvua. Mitata suoraan p53 transkriptionaalisen aktiivisuuden, joka on p53: een reagoiva lusiferaasireportteriplasmidi käytettiin tutkimaan suhdetta TRIM24 ja p53 aktiivisuutta keuhkosyövän solulinjat. Ei ollut merkittävää muutosta solun p53 aktiivisuuden jälkeen TRIM24 pudotus (kuvio 7B).

Western blot-analyysi sarjan solusyklin liittyvät tekijät osoittivat proteiinin tasot sykliini A, B, D1, E ja p- rb pienenivät ja P27 ekspressio lisääntyi jälkeen hiljentäminen TRIM24 vuonna H1299 ja A549-soluja (A). Ei ollut merkittävää muutosta p53 lusiferaasin aktiivisuuden jälkeen siRNA kohtelu sekä solulinjoissa (B).

Keskustelu

Up-regulation of TRIM24 ilmaisun oli osallisena useissa ihmisen syövissä, akuutti promyelosyyttinen leukemia, papillaarinen kilpirauhassyövän ja rintasyövän [9] – [11], [14]. Lisäksi TRIM24 yliekspressio korreloi selviytymisen rintasyöpäpotilaiden [14], [15]. Ilmaisulla kuvio TRIM24 sekä sen korrelaatiota kliinisten ja patologisten tekijöiden ei ole vielä määritelty ihmisen keuhkosyöpä. Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että TRIM24 proteiinin ilmentyminen keuhkosyövässä kudoksissa oli korkeampi kuin vastaavassa normaalissa keuhkojen kudoksiin. Oli läheinen korrelaatio TRIM24 ylössäätöä ja pTNM vaiheessa ja erilaistumista.

Edellinen tutkimus koskee sen ekspressiokuviota osoitti TRIM24 yliekspressoitiin rintasyöpiä sekä mRNA ja proteiini tasoilla ja sen yliekspressio korreloi ER, PR tila ja huono ennuste [15]. Tutkimuksemme löytyi korrelaatiota TRIM24 yli-ilmentymisen ja pTNM vaiheessa ja huono erilaistumista keuhkosyöpä, mikä oli sopusoinnussa aikaisempien tietojen, mikä viittaa TRIM24 voi olla tärkeä rooli keuhkosyövän etenemiseen. Validoida mahdollinen rooli TRIM24 keuhkosyövän kehittämiseen, tutkimme ensin sen ilmentymistaso useissa solulinjoissa ja kyytiin A549 ja H1299 suhteellisen korkea TRIM24 tason jatkotutkimuksiin. Meillä työskentelee siRNA on pudotus TRIM24 ilmentymistä näissä kahdessa solulinjassa. Löysimme heikentynyt leviämisen kapasiteetti ja pesäkkeiden muodostumista kyky sekä A549 ja H1299 solujen jälkeen TRIM24 knockdown. Lisäksi Matrigel invaasiomääritys osoitti vähentynyt tunkeutuvat kyky siRNA käsiteltyjen solujen. Siten meidän tutkimuksessa todettiin, että TRIM24 toimi onkogeenin keuhkosyövän kehittämiseen.

Edellinen raportin mukaan TRIM24 voi suoraan ubiquitinate p53 ja säätelemään negatiivisesti proteiinin taso P53 rintasyövän solulinjoissa, mikä sen roolit leviämisen ja apoptoosin [12]. Useimmat proliferatiivisen tekijät vaikuttavat solujen kasvua vaikuttamalla solusyklin etenemisen. Joten käytimme solusyklin analyysi ja havaitsi, että TRIM24 pudotus solut osoittivat korkeampaa G1 vaiheen ja alempi S-vaiheen kuin kontrollisolut. Joten TRIM24 Knockdown estetty G1 S siirtyminen solusyklin etenemisen, mikä saattaa selittää mekanismia TRIM24 keuhkosyöpään solujen lisääntymisen. TRIM24 Knockdown myös indusoi apoptoosin H1299 ja A549-soluja, jotka voivat osittain johtuu tukkeutumisen G1 /S siirtyminen. Lisäksi osoitimme, että TRIM24 siRNA tukossa soluinvaasiota. Tutkimaan edelleen mekanismi, selvitimme ilmaus hyökkäyksen liittyvien MMP2 ja MMP-9. Emme havainneet merkittäviä muutoksia näihin molekyyleihin. Voidaan väittää, että on olemassa muitakin toiminnallisia näkökohtia TRIM24 edistää asetuksella, joka tarvitsee lisätutkimuksia.

Selvittää mahdollisia mekanismia TRIM24 solusyklin sääntelyn, tutkimme vaikutus TRIM24 knockdown on määrä solusyklin liittyviä molekyylejä. Olemme tarkastetaan ilmentymistä cyclinA, B, D1, D2, D3, E, H, CDK2 /4/6, p-Rb, p21 ja P27. Huomasimme, että tasot cyclinA, B, D1, E ja p-Rb pienenivät jälkeen TRIM24 Knockdown, kun taas taso P27 ilmaisun oli koholla. Sykliini D1 vuorovaikutuksessa Cdk4 /6 muodostaen kompleksin fosforyloivalla Rb, joka säätelee solujen lisääntymistä säätelemällä etenemisensä rajoitus pisteeseen G1-vaiheen solusyklin [18]. Sykliini D1 yli-ilmentyy eri syöpien ja syöpään liittyvän soluproliferaatiota [19] – [21]. Sykliini tarvitaan solujen edetäkseen S-vaiheeseen [22]. Sykliini B on mitoosi sykliini ja sen kertyminen on vain osoitteessa G2-M siirtyminen [23]. Tuumorisuppressorigeenin proteiini p27 toimii solukierron etenemisen. Yhteistyössä CDK2 komplekseja, P27 palvelee estävän kinaasiaktiivisuutta ja lohko etenemisensä G1 /S [24], [25]. Siten tuloksemme osoittaa alentunut taso sykliini A, B, D1, E, p-Rb ja lisääntynyt p27-proteiinin korreloi sen kanssa, että alentunut taso S ja G2-vaiheessa olevien solujen, ja lisääntynyt G1 vaiheen soluissa, sen jälkeen TRIM24 pudotus, mikä viittaa siihen, TRIM24 tärkeä rooli solusyklikontrollin keuhkosyöpään solujen. Lisäksi TRIM24 yliekspressio liittyi korkea sykliini D1 ja p-Rb keuhkosyövässä yksilöitä.

Jotkin tiedot osoittivat, että rooli TRIM24 liittyi p53 ja retiinihapporeseptorin alpha. Tutkimme nämä kaksi tekijää kliinisissä näytteissä ja solulinjoissa. Emme kuitenkaan ei löytänyt merkittäviä suhde TRIM24 ja näistä tekijöistä. Lisäksi ei ole selvää muutosta solun p53-aktiivisuus havaittiin sen jälkeen, kun TRIM24 pudotus A549 (villityypin p53) ja H1299 (p53-tyhjä) solulinjoja käyttäen lusiferaasireportterisysteemillä, mikä viittaa rooliin TRIM24 solusyklin asetus oli riippumaton p53 aktiivisuutta.

Yhteenvetona Tässä tutkimuksessa selvitettiin ekspressiokuviota ja kliinis merkitys TRIM24 NSCLC ja käsiteltiin biologinen rooli ja potentiaali mekanismi TRIM24 keuhkosyövässä etenemiseen.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaat ja näytteet

Tämä tutkimus suoritettiin suostumuksella paikallisen Institutional Review board on China Medical University. 113 tapausta NSCLC näytteitä saatiin ensimmäinen Affiliated sairaala China Medical University aikana 2007 2009. histologiseen diagnoosiin ja arvosana erilaistumiseen kasvainten määriteltiin arviointi hematoksyliinillä ja eosiinilla värjätään kudosleikkeiden mukaan Maailman terveysjärjestön ohjeiden luokitusta. Kaikki 113 näytteet arvioitiin uudelleen suhteessa niiden histologinen alatyyppi, erilaistumista tila, ja kasvaimen vaiheissa. Sillä NSCLC näytteiden Okasolusyöpä ja adenokarsinooma havaittiin 42 ja 71 113 tapauksessa vastaavasti. Imusolmukemetastaaseja havaittiin 46 potilaalla. P-TNM taging järjestelmä International Union Against Cancer (seitsemäs painos) käytettiin luokitella yksilöjen vaiheet I (n = 49), II (n = 35), III ja IV (n = 29).

solulinjat

NHBE, A549, H1299, H157, H460, ja H1299 solulinjat saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). SPC, LTE, ja LK2 solulinjat ostettiin Shanghai Cell Bank of Kiinan Academy of Science. BE1 solulinja oli lahja Dr. J Zheng (Department of Pathology, Pekingin yliopisto, Beijing). Soluja viljeltiin RPMI 1640: ssä (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), joka sisälsi 10% vasikan sikiön seerumia (Invitrogen), 100 IU /ml penisilliiniä (Sigma, St. Louis, MO, USA), ja 100 ug /ml streptomysiiniä ( Sigma). Soluja kasvatettiin steriileillä kudosviljelymaljoihin ja siirrostettiin joka 2 päivää käyttäen 0,25% trypsiiniä (Invitrogen).

immunohistokemia

Kirurgisesti leikattiin kasvain näytteet kiinnitettiin 10% neutraaliin formaliiniin, valettiin parafiiniin ja 4 um: n paksuisia leikkeitä valmistettiin. Immunovärjäys suoritettiin käyttämällä avidiini-biotiini-peroksidaasi-kompleksin menetelmä (Ultra Sensitive TM, Maixin, Fuzhou, Kiina). Osat poistettiin parafiini ksyleenillä, rehydratoitiin asteittai- sessa alkoholisarjassa ja keitettiin 0,01 M sitraattipuskurissa (pH 6,0) 2 minuutin ajan autoklaavissa. Endogeeninen peroksidaasiaktiivisuus estettiin käyttämällä vetyperoksidia (0,3%), jota seurasi inkubointi vuohen normaalia seerumia voidaan vähentää ei-spesifisen sitoutumisen. Kudosleikkeet inkuboitiin TRIM-24 kanin polyklonaalista vasta-ainetta (1:150 laimennos) (Proteintech, Chicago, IL, USA). Kaniinin immunoglobuliinin käytettiin negatiivisena kontrollina. Immunohistokemiallinen värjäykset for Ki67 (1:200 laimennus) (Maixin, Fuzhou, Kiina), RARa (1:200 laimennus) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), p53 (1:200 laimennus) (DO-7, Santa Cruz Biotechnology), sykliini D1 (1:100 laimennus) (Cell merkinanto tekniikka, Boston, MA, USA), p-Rb (1:200 laimennus) (Cell merkinanto tekniikka, Boston, MA, USA) ja p27 (1: 150 laimennus) (Santa Cruz Biotechnology) suoritettiin myös. Värjäys kaikkien primaaristen vasta-aineiden suoritettiin huoneenlämpötilassa 2 tunnin ajan. Biotinyloitu vuohen anti-hiiri-seerumin IgG, biotinyloitu vuohen anti-kanin seerumia IgG (ready-to-use) (Maixin, Fuzhou, Kiina) käytettiin sekundaarisena vasta-aineena. Pesun jälkeen leikkeitä inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi-konjugoitua streptavidiinia-biotiini, jota seurasi 3, 3′-diaminobentsidiinitetrahydrokloridilla kehittää Peroksidaasireaktio. Counterstaining jaksoissa tehtiin hematoksyliinillä, jotka sitten vesi etanolissa ennen asennusta.

Kaksi itsenäistä tutkijat tutki kaikki kasvain dioja satunnaisesti. Viisi näkemyksiä tutkittiin kullekin levylle ja 100 soluja havaittiin per view 400 x suurennus. Immunovärjäystä TRIM24 teki seuraavat puoliksi Paljousosuusmenetelmää arvioimalla edustavilla kasvain alueilla, intensiteetti ja solujen prosenttiosuus osoittaa korkeampi immuunivärjäystä kuin kontrolli soluja. tumavärjäystä kasvaimen solut pidettiin positiivisena immunovärjäyksellä. Intensiteetti TRIM24 tumavärjäystä myös pisteytettiin 0 (ei värjäystä), 1 (heikko), 2 (merkitty). Prosenttiosuus pistemäärät määrätty 1- 1-25%, 2- 26-50%, 3- 51-75% ja 4 76-100%. Tulokset Kunkin kasvaimen näytteen kerrottiin antamaan lopullinen pistemäärä 0-8 ja koko ilmaus TRIM24 määritettiin joko negatiivisia tai heikkoa ilmentymistä (-): pisteet 4 tai yli-ilmentyminen (+): pisteet ≥4. Immuunihistokemialliset värjäytyminen Ki-67 arvioitiin ja pisteytettiin prosenttiosuus syöpäsolujen Ydinvoimalla immunoreaktiivisuus yhteensä 500 kasvainsolujen tutkittiin leikettä kohti. Mediaaniarvon tämän sarjan (35% positiivisia soluja) käytettiin kynnysarvo erottaa kasvaimia, joilla on alhainen (alle 35%) verrattuna korkea (≥35%) indeksi soluproliferaation. Aiempien arviointiperusteet sykliini D1, p53, pRb ilme, päätimme niiden taso niin korkea tai matala /negatiivinen ilmaus [26]. p27-ilmentyminen määritettiin positiivisia tai negatiivisia mukaan edellisen raportin [27]. Aiempien kriteerit, RARa ilmentyminen määritettiin korkea ilmentyminen tai heikkoa ilmentymistä [28].

Immunofluoresenssikoe

4-um: n leikkeitä poistettiin parafiini ksyleenillä, niihin lisätään lajitellut alkoholin sarjaan ja keitettiin 0,01 M sitraattipuskuria (pH 6,0) 2 minuutin ajan autoklaavissa. Double immunofluoresenssilla analyysi suoritettiin käyttäen hiiren monoklonaalista vasta-ainetta Ki67 (Maixin), ja kaniinin polyklonaalinen vasta-aine TRIM24. Vuohen anti-kani (Alexa Fluor 488 leimattua Molecular Probes) ja vuohen anti-hiiri (Alexa Fluor 594 merkitty, Molecular Probes) käytettiin sekundäärisiä vasta-aineita. Fluoresenssisignaalien analysoitiin tallennus värjätään Kuvien Olympus FV1000 Laser Scanning konfokaalimikroskoopilla.

Quantitative Reaaliaikainen PCR (SYBR Green Method) B

Quantitative reaaliaikaisia ​​PCR suoritettiin käyttäen SYBR Green PCR Master sekoitetaan (Applied Biosystems) kokonaistilavuudessa 20 ui on 7900HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems) seuraavasti: 95 ° C 30 sekuntia, 40 sykliä 95 ° C 5 sekunnin ajan, 60 ° C 30 sekuntia . Dissosiaa- vaihe suoritettiin tuottaa sulamiskäyrään vahvistaa spesifisyyden vahvistusta. β-aktiini käytettiin viite-geeniä. Suhteellisen geeni-ilmentymisen olivat edustettuina ACt = Ct-geeni-Ct viite, ja kertainen muutos geenien ilmentyminen laskettiin 2-ΔΔCt menetelmällä. Kokeet toistettiin kolme kertaa. Alukesekvenssejä ovat seuraajia: TRIM24 eteenpäin, 5 ’CGCCACCCAAGTTGGAGT 3’, TRIM24 käänteinen, 5 ’GCTGGGAACCTCAGTAGTGTCCT 3’; β-aktiini eteenpäin, 5 ’ATAGCACAGCCTGGATAGCAACGTAC 3’, β-aktiini käänteinen, 5 ’CACCTTCTACAATGAGCTGCGTGTG 3’. MMP2 eteenpäin, 5′-TGTGTTCTTTGCAGGGAATGAAT-3 ’; MMP2 käänteinen, 5’-TGTCTTCTTGTTTTTGCTCCAGTTA-3 ’; MMP-9 eteenpäin, 5’-CCTCTGGAGGTTCGACGTGA-3 ’; MMP-9 taaksepäin, 5’-TAGGCTTTCTCTCGGTACTGGAA-3 ’;

Western blot -analyysi

Yhteensä proteiinien solulinjat uutettiin lyysipuskuriin (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) ja kvantifioitiin käyttäen Bradfordin menetelmä. Viisikymmentä mikrogrammaa proteiinia erotettiin SDS-PAGE (12%). Siirron jälkeen, polyvinyli- fluoridi (PVDF) (Millipore, Bedford, MA, USA) inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa seuraavilla vasta-aineilla -TRIM24 (1:1000; Proteintech, Chicago, IL, USA), p53 (DO- 7, 1:500), RARa (1:500), beeta-Actin (1:500; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), sykliini A (1:1000), sykliini B (1:1000), sykliini D1 (1:1000), sykliini D2 (1:1000), sykliini D3 (1:1000), sykliini E (1:800), CDK2 (1:1000), CDK4 (1:1000), CDK6 (1:1000) , p-Rb (1:2000), P21 (1:800), P27 (1:800) (Cell signaling tekniikka, Boston, MA, USA). Inkuboinnin jälkeen peroksidaasiin kytkettyä anti-hiiri /kani IgG: tä (Santa Cruz Biotechnology), 37 ° C: ssa 2 tunnin ajan, sitoutuneet proteiinit tehtiin näkyviksi käyttämällä ECL (Thermo Fisher Scientific) ja detektoitiin käyttämällä Bioimaging Systems (UVP Inc., Ontario, CA, USA). Suhteellinen proteiinin tasot laskettiin perustuen β-aktiini kuin latauskontrollina.

Sirna Treatment

On-TargetPlus SMARTpool siRNA varten TRIM24 (M-005387-03-0005) ja ON -TARGETplus ei-suunnattu siRNA # 1 (D-001810-01-20) hankittiin Dharmacon. Transfektioihin, solut ympättiin 24-kuoppalevylle 24 tunnin ajan ennen koetta. Solut transfektoitiin siRNA: lla käyttäen DharmaFECT 1 (0,20 ul /kuoppa; ThermoFisher Scientific) mukaan valmistajan protokollaa. Transfektion jälkeen, mRNA ja proteiini-tasot arvioitiin 48 tuntia myöhemmin.

Cell Proliferation Test ja Colony muodostumisen määritys

Soluproliferaatiomääritys suoritettiin käyttäen Cell Counting Kit-8-liuosta (Dojindo, Gaithersburg, MD) mukaan valmistajan protokollaa. Lyhyesti, solut ympättiin pitoisuutena 5 x 10

3 solua /100 ul /kuoppa 96-kuoppaisille viljelylevyille ja käsiteltiin 10 ul /kuoppa Cell Counting Kit-8 ratkaisu viime 4 tunnin viljelmän . Optinen tiheys kuopista mitattiin 450 nm: ssä käyttäen mikrolevylukijaa. Sillä pesäkemuodostusta, soluja istutettiin kolmeen 6 cm soluviljelymaljoille (1000 per astia A549 ja H1299 solulinjoja) ja inkuboitiin 12 päivää. Levyt pestiin PBS: llä ja värjättiin Giemsa. Pesäkkeiden lukumäärä, joissa on enemmän kuin 50 soluja laskettiin.

Cell Cycle Analysis

Solut (500000) ympättiin 6 cm: n kudosviljelymaljoihin. Kaksitoista tuntia myöhemmin, solut transfektoitiin osoitetuilla määrillä siRNA. Solut synkronoitu kuluttua 20 h seerumistarvaatio ja sitten ajankohtina otettu 24 tunnin käytön jälkeen 10% seerumivähennysväliainetta arvioida vaikutuksia solusyklin. Solut kerättiin, kiinnitettiin 1% paraformaldehydi, pestiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja värjättiin 5 mg /ml propidiumjodidia PBS: ään lisättynä RNaasi A: lla (Roche, Indianapolis, IN) 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Tiedot kerättiin käyttäen BD järjestelmiä.

Matrigel Invasion Pitoisuus

Cell invaasiomääritys suoritettiin käyttäen 24-kuoppaisen Transwell kammio, jonka huokoskoko on 8 um (Costar, Cambridge, MA). Insertit päällystettiin 20 ul: n kanssa Matrigeliä (1:03 laimennus, BD Bioscience, San Jose, CA, USA). Neljäkymmentä kahdeksan tuntia transfektion jälkeen solut trypsinoitiin ja 3 x 10

5 solua 100 ul: ssa seerumia siirrettiin ylempään Matrigel kammioon ja inkuboitiin 16 tunnin ajan. Väliaineessa, jota täydensi 10% FBS: ää yksin tai, joka sisälsi 100 ng /ml EGF: ää (Invitrogen, Carlsbad, Carlsbad, CA) lisättiin alempaan kammioon, kuten kemoatrak-. Inkubaation jälkeen ei-hyökkäsi solujen ylemmän kalvon pinnan poistettiin puuvilla kärki, ja solut, jotka suodattimen läpi kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä ja värjättiin hematoksyliinillä. Lukumäärä tunkeutuneet solujen laskettiin 10 satunnaisesti valittua HPF mikroskoopilla. Tämä koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

Apoptosis Analyysi

havaitseminen apoptoosin, kiinnittyneet solut sekä kerättiin ja suspendoitiin uudelleen kylmään PBS: aan analyysiä varten. Solut värjättiin anneksiini V-FITC Apoptosis Kit (BD Pharmingen, USA) seurata apoptoosin soluissa ja propidiumjodidilla (PI) havaitsemiseksi kuolleita soluja. Tiedot kerättiin käyttäen BD järjestelmiä.

Transient transfektio ja Luciferase Reporter Assay

Reportteri geeni transfektio ja lusiferaasin aktiivisuuden määritys solut 80 konfluentteja kasvaa 24 kuoppalevyillä transfektoitiin yhdessä tulikärpäsen lusiferaasi raportoijana p53 sisältää TA promoottori (pp53-TA-luc, Beyotime Biotechnology, Kiina) (0,2 ug) yhdessä Renilla lusiferaasireportteri- (Promega Co.) (0,02 ug) 12 h käyttäen attractene reagenssia (QIAGEN) mukaan protokollat ​​autonvalmistajilta.

lusiferaasiaktiivisuus mitattiin solu-uutteiden käyttämällä kahta lusiferaasireportteriplasmidin geenin määritys kit (Promega, CA, USA). Suhteellinen aktiivisuus reportterigeenin laskettiin jakamalla signaalit p53 lusiferaasireportteri signaalit saadaan muodossa Renilla lusiferaasireportterigeenin.

Tilastollinen analyysi

SPSS versio 16.0 for Windows käytettiin kaikkiin analyyseihin.