Krooninen sairaus

tiivistelmä

ZBRK1, sinkkisormipolypeptidiin proteiinia, joka on vuorovaikutuksessa rintasyöpä 1 (BRCA1) ja KRAB-ZFP liittyvä proteiini 1 (KAP1), on ehdotettu palvelemaan tuumorisuppressorina kautta tukahduttamisesta kasvain etäpesäke /invaasio. Tähän mennessä yksityiskohtainen molekyylitason mekanismeja miten BRCA1 ja KAP1 osallistua ZBRK1 välittämän transkription repression, etäpesäke ja invaasio sekä niihin liittyvät kliinistä merkitystä edelleen epäselvät. Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että sekä N- ja C-terminaaliset domeenit ZBRK1 ovat tärkeitä solun uudiskasvun estämiseksi, ja ankkurista riippumaton kasvu kohdunkaulan syövän. Erityisesti N-pään KRAB domeenin ZBRK1 näkyy entistä keskeinen rooli metastaasin inhiboinnissa ja hyökkäyksen kautta modulaatio KAP1 funktion kopiointia riippuvaisella tavalla. Menetys ZBRK1 johtaa kasvua KAP1 ilmaisun, joka lisätä maastamuuttoa ja invaasion kohdunkaulan syöpäsolujen sekä

in vitro

ja

in vivo

. Lisäksi käänteinen korrelaatio ekspressiotasoja havaittiin välillä ZBRK1 ja KAP1 kasvaimen etenemistä in situ kohdunkaulan invasiivisia /metastaattinen kohdunkaulan syövän yksilöitä. Yhdessä nykyisen tulokset osoittavat, että menetys ZBRK1 myötävaikuttaa lisääntyneen ilmentymisen KAP1, voimistamaan sen rooli parantaa etäpesäkkeitä ja invaasiota.

Citation: Lin LF, Li CF, Wang WJ, Yang WM, Wang DD-H, Chang WC, et ai. (2013) menetys ZBRK1 Auttaa lisäys KAP1 ja Edistää KAP1 välittämä Etäpesäke ja Invasion kohdunkaulan syövän. PLoS ONE 8 (8): e73033. doi: 10,1371 /journal.pone.0073033

Editor: Yves St-Pierre, INRS, Kanada

vastaanotettu: 03 huhtikuu 2013; Hyväksytty: 16 heinäkuu 2013; Julkaistu: 22 elokuu 2013

Copyright: © 2013 Lin et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat NSC apurahan 101-2320-B-006-020-MY3 ja National Cheng Kung yliopisto maamerkki avustus C007 (Taiwan). Rahasto Open Access julkaiseminen tarjosi NSC apurahan 101-2320-B-006-020-MY3. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

pahanlaatuisuuden syöpä johtuu sen kyvystä tunkeutua ja metastasoituneet naapuri- ja distaalisen kudoksia, jolloin paikallisia ja systeemisiä elinhäiriöt. Etäpesäke on monimutkainen prosessi, joka vaatii usein kasvainsolut irtautumaan syöpäkasvaimen, hyökätä läpi soluväliaineen, ja niille intravasation verenkiertoon tai lymfaattinen verenkiertoelimistön, jota seuraa ekstravasaatio ja sisäänkäynnin kaukaisiin elimiin, mahdollistaa mikroetäispesäkkeiden kasvua [1]. Monet näkökohtia monimutkainen prosessi ei toistaiseksi tunneta, kuten geeni ilmaisuja hyvin tunnettu metastaattinen vaimentimet.

Yli 700 sinkkisormipolypeptidiin proteiineja on tunnistettu ihmisellä. Sinkki sormi proteiinit sitoutuvat tiettyihin DNA-sekvensseihin ja kytke geenejä päälle tai pois päältä. Lähes kolmasosa nisäkkäiden sinkkisormi proteiineilla on erittäin konservoitunut Kruppel-associated box (KRAB) motiivi. Toiminnot KRAB-sinkkisormi proteiinit eroavat huomattavasti lajien säätelyssä geeniekspressioiden, erityisesti niille, jotka osallistuvat transkription tukahduttamistoimiin. Ihmisen ZBRK1 on transkription repressori, joka sisältää N-terminaalisen KRAB domeenin, kahdeksan peräkkäisen C2H2 sinkkisormia, ja BRCA1-riippuvaisen C-pään transkription repression domeeni (CTRD) [2]. ZBKR1 on potentiaalia säädellä eri alavirran geenien vuorovaikutuksessa monipuolinen joukko proteiineja. Esimerkiksi on raportoitu, että ZBRK1 voi estää ilmentymisen angiopoietiini 1-geenin kanssa tapahtuvan vuorovaikutuksen välityksellä transkription korepressoreiden, CTIP ja BRCA1 [3]. Lisäksi, KAP1 vuorovaikutuksessa ZBRK1 kautta N-terminaalinen KRAB-domeenin ZBRK1. ZBRK1 ja KAP1 myös osaltaan oriLyt replikaation tehokkuutta BBLF2 /3 vuorovaikutus [4]. Tähän mennessä yksityiskohtaiset mekanismit ja niihin liittyvien solujen toimintoja ZBRK1 n vuorovaikutukset näiden proteiinien edelleen tutkimaton.

Ensisijainen aminohapposekvenssi KAP1 sisältää useita konservoituneita motiiveja: RING-finger, B-laatikot, kiertyneen kela alue, PHD sormi ja bromia verkkotunnuksen. Nimetön sormi, B-laatikot, ja rulla-kela kutsutaan yhteisesti RBCC verkkotunnus, jonka on osoitettu olevan riittävä homo- oligomerointi ja KRAB tukahduttamisen moduuli sitova [5,6]. Useat tutkimukset osoittivat, että KAP1 sitoutuu KRAB sisältävät proteiinit ja helpottaa KRAB sisältävän proteiinin välittämän transkription tukahduttaminen. Lisäksi KAP1 toimii myös mole- tukirakenteen säännellä kromatiinin rakenteeseen, joka välittyy vuorovaikutus Mi-2a, komponentti Nurd histonideasetylaasi kompleksi [7], metyylitransferaasin SETDB1 [8] tai heterokromatiinin proteiini 1 (HP1) perheen jäseniä [9 , 10]. Äskettäin KAP1 raportoitiin edistää inhibition E2F1-välitteisen apoptoosin [11] ja korreloi läheisesti huonoon ennusteeseen mahasyövän [12]. Lisäksi KAP1 kuvattiin pelissä rooli fibroblasti-spesifistä proteiinia 1 välittämää epiteelin-mesenkymaalitransitioon [13]. Näistä viimeaikaiset pyrkimykset selvittämisessä sen solu- toimintojen ja niihin liittyvien molekyylitason mekanismeja, roolit KAP1 kasvainten synnyssä edelleen suureksi osaksi tuntemattomia.

edellinen tutkimus osoittaa, että ZBRK1 toimii metastaattinen vaimentimen ja että menetys ZBRK1 tehostaa MMP9 transkriptio kohdunkaulan syövän [14]. Nykyisessä tutkimuksessa, huomaamme, että ektooppinen ilmentyminen KAP1 HeLa-soluissa lisää merkittävästi solumigraation /hyökkäystä. Tämä tutkimus tarjoaa ensimmäisen suoran todisteita osoittaakseen, että KAP1 on kyky edistää kasvaimen etäpesäkkeiden sekä

in vitro

ja

in vivo

. Lisäksi ZBRK1 estää tätä prosessia rekrytoimalla BRCA1 läpi C-päätteen vuorovaikutus ja estämällä KAP1 transkriptioaktiviteettia. Lisäksi kun kohdunkaulan syövän yksilöt me validoitu, ilmentymistasojen ZBRK1 korreloi käänteisesti menetys KAP1. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että ZBRK1 palvelee estää kasvaimen etäpesäke ja invaasio kohdunkaulan syövän kautta modulaatio KAP1.

Tulokset

KAP1 ja BRCA1 vuorovaikutuksessa N- ja C-terminaaliset domeenit, tässä järjestyksessä , on ZBRK1

Aikaisemmin huomasimme, että ZBRK1 toimii tuumorisuppressorina, uudiskasvun estämiseksi, muuttoliike, invaasio ja etäpesäkkeiden syöpäsolujen [14]. Kuten edellä mainittiin, KAP1 ja BRCA1 vuorovaikutuksessa N- ja C-terminaaliset domeenit, vastaavasti [15,16], ja ZBRK1. Olimme kiinnostuneita nimenomaan ymmärtämään toiminnallista maksuja näiden vuorovaikutusten tuumorisuppressiogeeneksi. Ensin arvioitiin sitova spesifisyys KAP1 ja BRCA1 villin tyypin tai typistetyn ZBRK1 käyttämällä immuunisaostustesti. Tulos osoitti, että KAP1 ja BRCA1 todellakin erityisesti vuorovaikutuksessa N- ja C-terminaaliset domeenit, vastaavasti, ZBRK1 HeLa-soluissa (kuvio S1 ja kuvio 1A).

A, in vivo vuorovaikutus ZBRK1 ja KAP1. Lysaatit HeLa-solujen, jotka ilmentävät stabiilisti EGFP (G), EGFP-ZBRK1 (GZB) tai EGFP-fuusioitunut katkaistun ZBRK1s (GZBDK ja GZBDZ) immunosaostettiin käyttämällä anti-GFP Ab (Roche). Immunosaostettiin proteiinit eluoitiin ensin kiehuvaan SDS-näytepuskurissa, ja erottamalla sitten 10%: isella SDS-PAGE-geelissä, minkä jälkeen immunoblot-analyysillä anti-KAP1-vasta-ainetta (Bethyl Laboratories) havaitsemiseksi KAP1 tai anti-GFP Ab havaita GFP . B, Katkaistu N- tai C-päähän ZBRK1 menettää kyky inhiboida kasvua.

Vasen

, yhtä suuret lukumäärät vakaa ilmentävien HeLa-solujen EGFP (G), EGFP-ZBRK1 (GZB) tai EGFP-fuusioitunut katkaistun ZBRK1s (GZBDK ja GZBDZ) ympättiin arvioida kasvua kristallivioletilla värjäämällä. Elävien solujen määrä määritettiin ilmoitettuina aikoina.

Oikea

, ilmaus ZBRK1 ja sen mutanttien HeLa-soluissa analysoitiin Western blot. C, Katkaistu N- tai C-päähän ZBRK1 menettää kyvyn estää proliferaatiota. Painopiste muodostumisen määritys suoritettiin käyttämällä erilaisia ​​stabiileja HeLa solulinjoissa.

Sarakkeet

, keskittyä numeroita;

baareja

, keskiarvo ± SD. **

p

0,01 verrattuna säätökennoja (G) käyttäen Opiskelijan

t

-testi;

NS

, ole merkitystä verrattuna säätökennoja (G).

Sekä N- ja C-päät ZBRK1 Tukahdetut Cancer Cell Proliferation, mutta vain N-päässä on ZBRK1 Inhibioitu Cell Migration

käsitellä solun toimintoja ZBRK1, olemme kehittäneet useita stabiileja HeLa-solulinjojen ektooppisesti EGFP: tä ilmentämään (G), EGFP-fuusioitunut täyspitkän ZBRK1 (GZB), tai EGFP-fuusioituneiden ZBRK1 poisto N-terminaalisen KAP1 sitovan alueen (GZBDK) tai C-terminaalista BRCA1-sitovan alueen (GZBDZ) (kuvio 1 B, oikea paneeli). Kasvu ZBRK1 johtaa proliferaation esto [14], joten ensin arvioidaan kasvun inhibition tehokkuuden näiden stabiileja HeLa-solulinjat. Verrattuna GZB ilmentäviä soluja, sekä GZBDK- ja GZBDZ-ilmentävien solujen menetetään kasvun esto. Tuloksena ehdotti, että molemmat KAP1 ja BRCA1 vuorovaikutukset olivat välttämättömiä ZBRK1-välitteistä kasvun estäminen (kuvio 1 B, vasen paneeli). Sama stabiileja solulinjoja käytettiin edelleen arvioida vaikutuksia KRAB ja CTRD domeenien ZBRK1 soluproliferaatioon käyttäen painopiste muodostumista määrityksessä. Samanlainen havainto oikea paneeli Kuvio 1B, GZBDK ja GZBDZ ilmentäviä HeLa-soluissa ei ole mitään vaikutusta solujen proliferaatiota verrattuna ZBRK1-ilmentäviä solulinjoja (kuvio 1C).

haavan paranemista määrityksessä solut ektooppisesti ilmentävät GZB näytetään heikennetyn muuttoliikkeen vaikutus, mikä oli yhdenmukainen aiempien raportti. Huomattavaa on, että solut, jotka ilmentävät GZBDK ei ollut vaikutusta solujen vaeltamiseen, kun taas solut, jotka ilmentävät GZBDZ oli kohtalaisen heikennetty solujen vaeltamiseen (kuvio 2A). Samanlainen ilmiö havaittiin joka Boyden kammiossa solun migraatiokokeessa (kuvio 2B). Lisäksi edellisessä tutkimuksessa todettiin, että ZBRK1 voi tukahduttaa hyökkäyksen kykyä syöpäsoluja [14], joka sai meidät arvioimaan osuudet N- ja C-pään alueisiin ZBRK1 solun hyökkäystä. Kun arvioimme hyökkäystä vaikutus käyttämällä Boyden kammioita sisältäviä Matrigel The GZBDK-ilmentävät solut menettivät vaikutus (kuvio 2C). Tämä havainto viittasi siihen, että N-terminaalinen KRAB-domeenin ZBRK1 on kriittinen inhibition solumigraation ja invaasiota.

Vasen

, haavan paranemista migraatiomääritys suoritettiin HeLa-solujen kanssa EGFP: tä ilmentämään (G), EGFP-ZBRK1 (GZB) tai mutatoituja ZBRK1 (GZBDK tai GZBDZ). Edustavat kuvat haavan tiiviste kerättiin päivänä haavautuma ja ylihuomenna haavan tyhjästä.

Oikea

taso solumigraation haavaan tyhjästä kvantifioitiin prosenttiosuutena haavan paranemista.

Sarakkeet

, keskimäärin kolme riippumatonta mittausta;

baareja

, keskiarvo ± SD. * P 0,05. B, HeLa-solut ekspressoivat GZBDK vapauttaa solun migraatiota estävän kyvyn. Solut ympättiin siirtoaltaat, ja taso solumigraation määritettiin. C, ilmentävien HeLa-solujen GZBDK vapauttaa soluinvaasion estävä vaikutus. Solut siirrostettiin BD matriisissa geelikerros, ja taso soluinvaasion määritettiin käyttäen CyQuant NF väriainetta (Invitrogen), kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Juoni on tilastotietoja Tulokset kolmesta riippumattomasta kokeesta.

Bars

, keskiarvo ± SD. * P 0,05.

KAP1 edistää solujen muuttoliikettä ja invaasiota

Kuten kuviossa 2C, solut, jotka ilmentävät ZBRK1 kanssa poistetaan KRAB verkkotunnuksen menettävät kyvyn tukahduttaa solujen lisääntymistä, muuttoliike ja invaasio. Tämä havainto viittasi siihen, että KAP1 saattavat olla tärkeitä jakaantumiseen, kulkeutumiseen ja hyökkäys syöpäsolujen. Tämän hypoteesin testaamiseksi, me syntyy HeLa-soluja ektooppisesti ilmentävien KAP1 (G-KAP1) (kuvio 3A, oikea paneeli) ja suorittaa solujen lisääntymistä, haavan paranemista ja solumigraatio /invaasio määrityksissä. Kuten käy solulisäkasvumääritykselle, HeLa-solut ektooppisesti ilmentävien KAP1 kasvoi hieman niiden kasvuvauhdin annoksesta riippuvaisella tavalla (kuvio 3A, vasen paneeli; vertailla KAP1 ilmaisun välillä kloonien 1 ja 3).

In vitro

solumigraatioon ja invaasiota analyysit osoittivat, että solut ektooppisesti ilmentävät KAP1 on tarkoituksenmukaisempaa parantava vaikutus ja korkeampi invaasio aktiivisuus kuin kontrolli solulinja (kuvio 3B-D). Nämä tulokset viittaavat siihen, KAP1 voi edistää syöpäsolujen muuttoliikettä ja invaasiota.

,

Oikea

, HeLa-solut transfektoitiin stabiilisti EGFP-KAP1 ilmentämiskonstruktioiksi. KAP1 mRNA: ta ja proteiinia tasot arvioitiin käänteistranskriptio-PCR: llä ja Western blottauksella.

Vasen

, KAP1 ilme tuskin indusoi solujen lisääntymisen. Yhtä suuret määrät EGFP (G) tai EGFP-KAP1 (G-KAP1 # 1 tai G-KAP1 # 3) HeLa-solut ympättiin, ja elinkelpoisten solujen määrä määritettiin osoitettuina aikoina. B, The arpeutumisprosessit migraatiomääritys suoritettiin ohjaus ja vakaa KAP1-ilmentäviä soluja. Soluvapaa raon (eli ”haavan”) luotiin käyttäen viljelyinsertistä. Edustavat kuvat haavan tiiviste kerättiin päivänä 0 ja seuraavana päivänä (päivä 1).

Oikea

taso solumigraation rakoon määrällisesti prosenttiosuutena haavan sulkemista.

Sarakkeet

, keskiarvo kolmesta riippumatonta mittausta;

baareja

, keskiarvo ± SD. ** P 0,01; * P 0,05. C, KAP1 parantaa kulkeutumista syöpäsoluja. Solut ympättiin siirtokuoppaan kammioon, ja taso solumigraation määritettiin. D, KAP1 parantaa invasiivisuus syöpäsoluja. Solut siirrostettiin BD matriisissa geelikerros, ja taso soluinvaasion määritettiin käyttäen CyQuant NF väriainetta, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät.

Sarakkeet

, keskiarvo kolmesta riippumatonta mittausta;

baareja

, keskiarvo ± SD. ** P 0,01; * P 0,05.

ZBRK1 tukahduttaa KAP1 transkriptio kautta tukahduttaa sen promoottorin aktiivisuutta

Useat raportit ehdotti, että ZBRK1 säätelee negatiivisesti transkriptiota

GADD45

,

ANG1

ja

p21

geenit [3,15,17]. Kiinnostavaa kyllä, havaitsimme, että KAP1 ilmentyminen vaimenee soluissa, jotka ilmentävät kohdunulkoinen ZBRK1 (kuvio 4A, vasen paneeli). Kuten lisävahvistusta, vaimennus ZBRK1 lisännyt vakaan tilan KAP1 mRNA ja proteiini tasoilla (kuvio 4A, oikea paneeli). Sen arvioimiseksi, onko muutos johtui eston KAP1 promoottorin aktiivisuutta tai posttranskriptionaalisella sääntelyä, selvitimme KAP1 mRNA vaihtuvuus hoidon jälkeen aktinomysiini D, estäjä transkription. Mitatut puoliintumisaika KAP1 mRNA oli noin 2 tuntia, ja ei ollut selkeää välillä havaittu ero vanhempien linjan ja solut ilmentävät kohdunulkoisen ZBRK1 (kuva S2). Tulos osoitti, että vähennys KAP1 mRNA vastauksena kohdunulkoinen ilmaus ZBRK1 johtui todennäköisesti tukahduttaminen KAP1 promoottorin aktiivisuutta, mutta ei läpi posttranskriptionaalisella asetuksella.

,

Vasen

, ZBRK1 estää KAP1 transkriptien HeLa-soluissa. Kokonais-RNA ja lysaatit EGFP (G) ja EGFP-ZBRK1 (GZB) HeLa-solut kerättiin RT-PCR ja Western blot -analyysit.

Oikea

, menetys-of-function ZBRK1 parantaa KAP1 selostukset. Stabiili ZBRK1-ilmentäviä soluja inkuboitiin lentiviruksen shRNA vastaan ​​ZBRK1 tai valvontaa. Kokonais-RNA: infektoituneiden solujen analysoitiin käyttäen RT-PCR: ää. Ihmisen GAPDH toimi kontrollina. B, ZBRK1 estää KAP1 toimittaja.

Top kaaviokuvaus lusiferaasireportteri konstruktit sisältävä KAP1 promoottori villityypin tai mutantti ZBRK1- sitovat motiivit. Sekvenssit villityypin (wt) ja mutantin (mut) ZBRK1-sitoutumisen motiiveja on esitetty. HeLa-solut ko-transfektoitiin EGFP-ZBRK1 (GZB) ja pGL3-promoottori reportteri (pGL3p), villityypin KAP1 tai mutantti-ZBRK1 sitova motiivi KAP1 toimittajille. Lysaateista transfektantteja kerättiin talteen 12 h lusiferaasimääritystä. Suhteellinen kertainen muutos lusiferaasiaktiivisuus eri KAP1 toimittaja konstruktit on esitetty normalisoinnin jälkeen villin tyypin KAP1 toimittaja.

Bars

, keskiarvo ± SD. C, ZBRK1 sitoutuu KAP1 promoottori

in vivo

. Leikatussa formaldehydi silloitettu kromatiini, uutetaan HeLa-soluja, jotka ekspressoivat stabiilisti EGFP (G) tai EGFP-ZBRK1 (GZB), immunosaostettiin mainituilla vasta-aineilla: kontrolli-lgG (gG), ZBRK1 (Z) ja GFP (-G) . PCR-monistus, jossa spesifisiä alukkeita kohdistettu

KAP1

promoottorin suoritettiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Kuviossa edustaa saadut PCR-tuotteet käyttämällä alukkeita, jotka ovat spesifisiä KAP1 promoottorialueen, kuten on esitetty yläpaneelissa. D,

Vasen

, C-terminaalisesti poistetaan ZBRK1 mutantti kääntää tukahduttava vaikutus KAP1 selostukset. Ilmentymistasojen KAP1 HeLa-soluissa eksogeenisesti EGFP: tä ilmentämään (G), EGFP-ZBRK1 (GZB), EGFP-ZBRK1 kanssa KRAB verkkotunnuksen poistamista (GDK), EGFP-ZBRK1 kanssa CTRD verkkotunnuksen poistamista (GDZ) tai EGFP-ZBRK1 sekä KRAB ja CTRD poistetaan (GDKZ). RT-PCR-määritys suoritettiin spesifisiä alukkeita on ilmoitettu geenejä.

Oikea

, BRCA1 on tärkeää ZBRK1 estoa KAP1 reportteri toimintaa. HeLa-solut kotransfektoitiin kanssa KAP1 reportteri ja EGFP (G), GZB, GDK, GDZ, GDKZ, KAP1 tai BRCA1 ekspressiovektoreihin. Lysaateista transfektantteja kerättiin talteen 12 h transfektion lusiferaasianalyysissä. Esitetyt tiedot on keskiarvo ± SD.

Sen arvioimiseksi, onko ZBRK1 tukahduttaa KAP1 ilmentymisen säätelyn kautta promoottorialueen KAP1 geenin promoottorialue, -690-+33, että KAP1 -geeni kloonattiin pGL-2 perusvektoriin reportterigeenin määritykset. Tulos toimittaja analyysit osoittivat, että ZBRK1 voidaan torjua KAP1 reportterin aktiivisuutta (kuvio 4B). Tärkeää on, että yli-ilmentyminen ZBRK1 ei tukahduttaa lusiferaasin aktiivisuus KAP1 reportteri, kun oletetun ZBRK1 sitova motiivi oli mutatoitunut (kuvio 4B). Me seuraavaksi suoritti

in vivo

DNA sitoutumismääritys arvioimaan, onko ZBRK1 voi sitoutua suoraan KAP1 promoottorin. Siru määritys suoritettiin käyttäen näytteitä, rajat linkin otteita vakaa EGFP (G) ja EGFP-ZBRK1 (GZB) HeLa-solut sitoutumisen havaitsemiseksi endogeenisen ZBRK1 ja ektooppisesti ilmaistuna EGFP-ZBRK1 sen promoottorialueen KAP1 geenin. Tulos ChIP-PCR-määritys osoitti, että ZBRK1 voi sitoutua suoraan alue, joka sisältää otaksutun ZBRK1 sitova motiivi on KAP1 promoottorin (kuvio 4C). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että ZBRK1 voidaan torjua KAP1 transkription kautta suoran sitoutumisen sen KAP1 promoottori.

ZBRK1 voivat olla vuorovaikutuksessa KAP1 ja BRCA1 läpi KRAB ja CTRD verkkotunnuksia, vastaavasti, ja toimii transkription repressori. Arvioimme panokset KAP1 ja BRCA1 ja ZBRK1 välittämää KAP1 geenin tukahduttaminen. Tuloksena RT-PCR-määritys osoitti, että KAP1 transkriptin tasot vaimennetaan ZBRK1 (GZB) ja KRAB-katkaistu ZBRK1 (GDK) transfektantteja mutta ei CTRD-katkaistu ZBRK1 (GDZ) tai sekä KRAB- ja CTRD- katkaistu ZBRK1 (GDKZ) transfektanteilla (kuvio 4D, vasen paneeli, ja kuva S3). Lisäksi toimittaja määritys suoritettiin edelleen arvioida voimakas osallistuminen KAP1 ja BRCA1 in ZBRK1 välittämää tukahduttamisesta KAP1 reportteri toimintaa. Yhteisymmärryksessä RT-PCR-tuloksiin, menetys tukahduttavia vaikutus havaittiin GDZ ja GDZK transfektanteissa (kuvio 4D, oikea paneeli; vertailla kaistat 2 ja 3 kanssa kaistat 1, 4 ja 5). Lisäksi kohdunulkoinen ilmaus BRCA1 muttei KAP1 tukahdutettu aktiivisuutta KAP1 reportteri (kuvio 4D, oikea paneeli; vertaa raidat 6 ja 7). Nämä tulokset viittaavat siihen, KAP1 ilmaisu kääntäen korreloi ZBRK1 tasoilla ja että vuorovaikutus ZBRK1 ja BRCA1 on välttämätöntä ZBRK1 välittämää tukahduttamisen KAP1 reportteri.

KAP1 tasot ovat käänteisesti verrannollisia ZBRK1 tasojen kohdunkaulan syövän yksilöiden

edellinen tutkimus osoitti, että ZBRK1 pienennettiin kohdunkaulan syövän yksilöt [14]. Kuitenkin suhteellinen taso ZBRK1 ja KAP1 kliinisistä näytteistä olivat epäselviä. Täällä, osoitimme, että endogeeninen taso ZBRK1 on korkea normaali kohdunkaulan kudosten ja pienenee, kun kasvain edetessä, erityisesti erittäin invasiivinen ja metastaattinen kohdunkaulan syövän yksilöt (kuvio 5A ja 5B, vasen paneeli). Toisaalta taso KAP1 oli alhainen normaalissa yksilöitä mutta korkeampi erittäin invasiivinen ja metastaattinen kohdunkaulan syövän yksilöt (kuvio 5A, oikea paneeli). Verrattuna ekspressiotasot ZBRK1 ja KAP1 samalla yksilöiden, lisääntynyt ilmentyminen KAP1 korreloi alentuneen ekspression ZBRK1 (p = 0,015).

, kaikki kasvaimen näytteitä 50 potilasta, joilla on eri vaiheet kohdunkaulan syöpä saatiin kirurgisesti resekoitu kudoksista. ZBRK1 ja KAP1 ekspressiota havaittiin ei-kasvain epiteelin (A, B), in situ karsinooma (C, D) ja invasiivisia (E, F) ja solmukohtien metastasoitunut (G, H) avulla immunohistokemiallisesti. B, edustaja kuva ZBRK1 osoittaa merkittävän portaittain laskua, kun taas KAP1 oli merkittävästi koholla ilme. Ilmentymistasojen ZBRK1 tai KAP1 normaalissa, CIS, kohdunkaulan syöpä ja metastaattinen laskettiin käyttäen varianssin analyysiä (ANOVA); p 0,001 pidettiin merkittävänä. ZBRK1 ja KAP1 ilmentymisen tasojen kasvaimen vaiheissa verrattiin käyttämällä Chi-Square-testin, jota varten kaksipuolinen testit merkitystä käytettiin. Arvoa p 0,05 pidettiin merkittävänä.

ZBRK1 vaimentaa KAP1 aiheuttama invaasiota ja etäpesäkkeiden

Kuvioissa 3 ja 4, me osoitamme, että menetys ZBRK1 parantaa KAP1 ilme ja kyky KAP1 edistää syövän solujen vaeltamiseen ja

in vitro

ja metastaasit. Nämä löydöt motivoi meitä entisestään vahvistamaan, ZBRK1 voi vaimentaa KAP1 aiheuttamaa invaasiota ja etäpesäkkeiden

in vivo

. Histologinen analysoi kuvitettu, että määrä mikrometastaattisessa leesioiden väheni merkittävästi keuhkoissa hiiriä, joihin injektoitiin KAP1-köyhdytettyä HeLa-soluja ja lisätä keuhkoissa injektoitujen hiirten HeLa-solujen kanssa, jotka ektooppisesti ilmaistaan ​​KAP1 (kuvio 6A ja 6B). Tulokset viittasivat siihen, että KAP1 lla toiminnallinen rooli solun etäpesäkkeitä ja invaasiota. Nämä tulokset tukevat edelleen ehdotusta, että menetys ZBRK1 laukaiseman kasvoi KAP1 lauseke edistää etäpesäkkeiden ja hyökkäys kohdunkaulan syövän.

hematoksyliinillä ja eosiinilla (H ja E) värjäys HeLa-soluista peräisin keuhkometastaasitestissä jälkeen 4 -6viikko näkyy. Kuusi NOD-SCID-hiiret olivat tail-laskimo (A) tai ihon alle (B) ruiskutetaan vanhempien, KAP1 ilmentäviä (G-KAP1) tai lentiviruksen shRNA vastaan ​​KAP1 (shKAP1) ilmentävillä HeLa-soluissa. Edustavat kuvat H kuitenkin, osallisuudesta ja osuudet ZBRK1-vuorovaikutuksessa proteiinien tässä monivaiheinen prosessi on edelleen heikko. Erityisesti N-terminaalinen KRAB domeenin ja C-terminaalisen BRCT domeenin ZBRK1 ovat vastuussa KAP1 ja BRCA1 vuorovaikutusta, vastaavasti. Tässä tutkimuksessa osoitimme, että KRAB verkkotunnus ZBRK1 pääasiassa säätelee syöpäsolun muuttoliike; kun ZBRK1 kykyä tukahduttaa solujen kasvua näyttää edellyttävän vuorovaikutusta sekä KRAB ja CTRD verkkotunnuksia. Mielenkiintoista on, että eksogeeninen ekspressio KAP1 osoitti vähäinen vaikutus solujen lisääntymistä (kuvio 3A), mikä tarkoittaa, että KAP1 ei voi olla ainoa proteiini, joka on vuorovaikutuksessa N-päähän ZBRK1. Johtuen KAP1 heikkoa osallistumista valvontaan soluproliferaatiokokeessa, BRCA1 on arveltu olevan yksi vastuussa sääntelystä syöpäsolujen lisääntymistä kautta vuorovaikutuksessa ZBRK1 [18,19], arveluihin, joka on tutkittava tarkemmin.

meidän edellinen työ on tunnistanut useita mahdollisia alavirran geenien ZBRK1 [14], mutta koordinoidun ja erilliset vaikutukset BRCA1 ja KAP1 on ZBRK1 välittämän geenisäätelyn jää epäselväksi. Tätä varten mRNA globaali analyysit tehtiin käyttäen kokonais-RNA: korjattu GZB, GZBDK ja GZBDZ vakaa HeLa solulinjoissa. Joka perustuu profilointi tulosten lisäksi KAP1, 21 reagoivat geenejä tunnistettiin ja luokitellaan niiden reagoida N-terminaalista KRAB domeeni (APP, CDH2, S100A6 ja CLDN3 geenit), C-terminaalinen CTRD domeenin (ODC1, VIM ja NFE2L2 geenien ) ja sekä N- ja C-päät (MMP-9, SH3GLB2 ja MAPK4K geenejä) (taulukko S1). RT-PCR validointi (kuva S3) tuettu että KAP1 ja BRCA1 voivat itsenäisesti tai yhteisöllisesti osallistua ZBRK1 välittämää geeniä määräyksiä soluissa.

ensisijainen kohdunkaulan syövän yksilöitä, KAP1 tasot ovat käänteisesti verrannollisia ZBRK1 tasolla koko eri kasvain vaiheissa. Lyhyesti, ilmaus ZBRK1 oli merkitsevästi alassäädetty erittäin invasiivisen ja metastaattisen kohdunkaulan syövän verrattuna ei-metastasoituneen kohdunkaulan syöpä. Toisaalta, taso KAP1 oli alhainen normaaleissa ja kasvaa, kun syöpä etenee (kuvio 5). Tiedämme, että tämä muutos transkription tasot voivat johtua joko promoottorin aktiivisuutta ja /tai posttranskriptionaalisella muutoksin /hajoamista. Olemme todenneet, että ZBRK1 voisi sitoutua suoraan KAP1 n promoottori tukahduttaa sen ilmaisua. Lisäksi puoliintumisaika KAP1: n mRNA: n ei eronnut merkittävästi siitä ilmentävien solujen ectopic ZBRK1 (kuva S2). Yhdessä nämä tulokset osoittivat, että KAP1 geeni oli alavirran kohde ZBRK1. Olemme myös havainneet, että KAP1 mRNA: n ekspressio on vähentynyt soluissa ektooppisesti ilmentävät ZBRK1 ja GZBDK, mutta ei GZBDZ. Se oli johdonmukainen havaintomme että KAP1 toimittaja oli matalalla soluissa ektooppisesti ilmentävät BRCA1 muttei KAP1. Nämä löytää erittäin suositeltavaa, että ZBRK1 n inhibitio KAP1 transkription oli kriittisesti säätelee ZBRK1 /BRCA1 vuorovaikutusta.

KAP1 on hyvin tutkittu transkription repressori, joka sitoutuu KRAB domeenit sinkkisormi proteiinien [20]. Me täällä osoittaa, että KAP1 voi olla vuorovaikutuksessa ZBRK1 edistää syöpäsolujen migraatiota

in vitro

ja kliiniset analyysit. Lisäksi olemme osoittaneet, että ZBRK1 olettaa tukahduttavan rooli lieventäviä KAP1 aiheuttama syöpä hyökkäystä. Nämä tulokset sai meidät tutkimaan, jos ilmentymä KAP1-liikkuvuuden lisääntyessä johtuu menetys KAP1 promoottorin tukahduttamisen ZBRK1 tai puute ZBRK1 /KAP1 proteiini-proteiini-vuorovaikutuksen. Ektooppisesti ilmentyminen ZBRK1 CMV promoottori rakentuvassa KAP1 ilmentävää solua ei muuttanut kykyä KAP1 edistää solujen vaeltamiseen ja invaasiota (kuva S4), mikä viittaa siihen, että proteiini-proteiini vuorovaikutusta ZBRK1 ja KAP1 on minimaalinen vaikutus KAP1 välittämän syöpäsolun muuttoliike.

on ollut useita epäsuoria todisteita nähdään viimeaikaiset tutkimukset viittaavat siihen, että KAP1 tehtävänä on edistää tuumorigeneesiä lisäksi syövän solujen vaeltamiseen. Ensinnäkin, proksimaalinen transkriptiotekijä (CBF-A) muodostaa kompleksin KAP1 ja FTS-1, joka aktivoi transkription säätelijöinä epiteelin-mesenkymaalitransitioon. Lisäksi on näyttöä siitä, että RNA tunnustamista motiivi (RRM) in CBF-A voi vuorovaikutuksessa PHD verkkotunnuksen KAP1 [21]. Toiseksi, vuorovaikutus CBF-A KAP1 sitoutunut FTS-1: n promoottori elementti voi olla proksimaalinen aktivaattori EMT [13]. Nämä tulokset viittaavat siihen, että KAP1 myös tärkeä rooli etäpesäke. Kolmanneksi KAP1 vuorovaikutusta MDM2 edesauttaa p53 toiminnallinen asetuksen [22], mikä viittaa KAP1 myös tärkeä rooli syövän estämällä p53. Nämä havainnot esiin kaksi tärkeää kysymystä: Mikä on ZBRK1 rooli näissä monimutkaisia ​​asetuksia ja miten KAP1 säätelee ZBRK1 ja BRCA1? Lab parhaillaan aktiivisesti vastauksia näihin kysymyksiin.

On ollut joitakin alustavia tutkimuksia, jotka tutkitaan, miten epigeneettiset taustatekijöihin ohjelmoida uudelleen geenien ilmentymisen suhteen syövän etäpesäkkeiden. Esimerkiksi Polycomb ryhmä proteiinin EZH2 katalysoi histonimodifikaation, edistää DNA: n metylaatio, ja on ennakoiva merkki invasiivisen kasvun metastaattisen eturauhassyövän ja rintasyöpiä [23,24]. Lisäksi aktivointi β-kateniinin-reptin chromatin-remodeling kompleksi johtaa hiljentäminen ja etäpesäkkeiden estävä geeni

KAI1

[25]. KAP1 on aiemmin tunnistettu molekyyli tukirakenteen säädellä kromatiinin rakenteen läpi sen vuorovaikutus Mi-2a, komponentti Nurd histonideasetylaasi kompleksi [7]; metyylitransferaasi SETDB1 [8]; ja heterochromatin protein1 (HP1) perhe [9,10], mikä KAP1 ensimmäinen potentiaali epigeneettiset säännöllisesti joka edistää solujen etäpesäke. Tämä löytö takaa tunnistamista komponenttien KAP1 välittämän kompleksi, joka osallistuu edistäminen etäpesäkkeiden.

Tässä työssä olemme osoittaneet, että KAP1 on kyky edistää syöpäsolumetastaasi vaikuttamatta syövän solujen lisääntymistä. Lisäksi KAP1 voi edistää ja metastaasit syöpäsoluja. Olemme myös paljasti uusi funktio ZBRK1 transkription repressori on KAP1 geenin. Kliinistä merkitystä havaitsimme, että ekspressiotasot ZBRK1 oli merkittävästi vähentynyt, kun taas tasot KAP1 lisättiin merkittävästi aggressiivinen kohdunkaulan syövän näytteitä. Yhdessä tuloksemme osoittavat, että ZBRK1 toimii vaimennin syövän etäpesäkkeiden mukauttamalla etäpesäkkeiden liittyvien geenien kautta transkription tukahduttamisesta KAP1.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaille ja kasvain näytteet

Institutional Review board of Chi Mei Medical Center (Tainan, Taiwan) oli hyväksynyt tutkimuksen käyttämällä formaliinilla kiinnitetyt kudosta kohdunkaulan syövän tätä tutkimusta varten (IRB100-11-009). Käytettävissä parafinoidut kudosblokeista haettiin 10 in situ karsinoomissa (CIS) [26], 15 invasiivisia karsinoomia, ja solmukohtien etäpesäkkeitä vielä 10 invasiivisia karsinoomia, sekä 10 ei-kasvain kohdunkaulan epiteelin näytteitä. Institutionaalinen Review Board hyväksyi voimme saada näytteitä meidän (Chi-Mei Medical Center) Biopankkiverkosto. Pääsääntöisesti kaikki näytteet on ilmoittautunut vain potilaan sopimuksia ja valmiiksi tietoista suostumusta. Koska jälkeen näytteet irti niiden tunnistettavia henkilötietoja, edelleen suostumus ei voi olla saatavissa, ja ei tarvita.

Soluviljely ja stabiilien solulinjojen perustaminen

Kohdunkaulan syöpä solulinjoja pidettiin täydellisessä alustassa, joka sisälsi DMEM, 5% naudan sikiön seerumia (FBS), 100 g /ml streptomysiiniä ja 100 yksikköä /ml penisilliiniä.