Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Microtubule lääkkeet ovat tehokkaita syöpälääkkeet, pääasiassa johtuen niiden kyvystä indusoida mitoottisiin pidätys ja johtaa solukuolemaan. Kuitenkin jotkut syöpäsolut ovat luontaisesti resistenttejä tai hankkia vastarintaa. Puute apoptoosin seuraava mitoosi pidätyksen ajatellaan osaltaan lääkeresistenssi, joka rajoittaa tehoa mikrotubuleihin kohdistaminen syöpälääkkeet. Geneettiset tai farmakologiset aineet, jotka selektiivisesti helpottavat apoptoosin mitoosi pidätettiin solujen läsnä mahdollisuuksia vahvistaa terapeuttista tehoa.

Menetelmät ja tärkeimmät havainnot

Raportoimme luonnontuote Celastrol tavoitteet tubuliinia ja helpottaa mitoosi solukuolemaa aiheuttama mikrotubulusten huumeita. Ensinnäkin pieni molekyyli seulonta vaivaa, tunnistamme Celastrol estäjänä neutrofiilikemotaksista. Myöhemmät Aikaintervallitallennuksen kuvantamisen analyysit paljastavat, että esto mikrotubulia välittämän solujen prosesseja, mukaan lukien solujen vaeltamiseen ja mitoosi kromosomi linjaus, on varhaisin tapahtumia vaikuttaa Celastrol. Epäjärjestystä, ei depolymerisointiprosesseja, mitoosi karat näyttää vastaavan mitoosi vikoja. Celastrol vaikuttaa suoraan biokemialliset ominaisuudet tubuliinin heterodimeerin

in vitro

ja vähentää sen proteiinin taso

in vivo

. Solutasolla, Celastrol indusoi synergistinen apoptoosin yhdistettynä perinteisiin mikrotubulia kohdistaminen huumeita ja ilmentyy kaikille tehoa kohti taksoliresistenttiä syöpäsoluja. Lopuksi, nopeutus kuvantaminen ja seuranta mikrotubulusten huumeiden käsiteltyjä soluja, osoitamme, että Celastrol ensisijaisesti aiheuttaa apoptoosia mitoosi pidätettiin solujen kaspaasiriippuvaisen tavalla. Tämä selektiivinen vaikutus ei ole estämällä yleistä solujen eloonjäämisreittejä tai mitoosi-kinaasien, jotka on osoitettu parantavan mikrotubulia lääkkeen aiheuttamista solukuoleman.

Päätelmät ja merkitys

Tarjoamme näyttöä uusien solujen polkuja, että kun häiriintynyt, valikoivasti indusoivat apoptoosin mitoosi pidätettiin syöpäsolujen tunnistaa mahdollisen uuden strategian parantaa terapeuttisen tehon tavanomaisten mikrotubulia kohdistaminen syöpälääkkeitä.

Citation: Jo H, Loison F, Hattori H, Silberstein LE, Yu H, Luo HR (2010) Natural Product Celastrol destabilizes Tubulin heterodimeerin ja helpottaa Mitoottista Cell Death laukaisema Microtubule-Targeting syöpälääkkeet. PLoS ONE 5 (4): e10318. doi: 10,1371 /journal.pone.0010318

Editor: Nils Cordes, Dresdenin teknillinen yliopisto, Saksa

vastaanotettu: 17 marraskuu 2009; Hyväksytty: 04 maaliskuu 2010; Julkaistu 23. huhtikuuta 2010

Copyright: © 2010 Jo et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: H. Jo tukevat National Institutes of Health (NIH) Training Grant HL066987. H. Luo tukee NIH avustuksia HL085100, AI076471, HL092020 ja GM076084 sekä Research Scholar Grant American Cancer Society. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mikrotubulukset (MT), rihmamaisia ​​polymeerit alfa- ja beeta-tubuliinin heterodimeeri, ovat välttämättömiä solun tukirangan rakenteita, jotka ohjaavat olennainen solun prosesseja, kuten solunjakautumista, muuttoliike, solunsisäinen liikenne ja merkinanto (tarkistettavaksi [1]) . MT ovat dynaamisia luonteeltaan ja jatkuvasti tehdään vaiheissa kutistuminen ja uudelleen kasvua, prosessi tunnetaan ”dynaamisia epävakautta”. Tämä dynaaminen ominaisuus taustalla valtaosa MT-pohjainen soluprosesseissa [1]. Yleinen dynamiikka MTS vaihtelevat solutyypeissä ja solujen yhteyksissä ja säädellään useita tasoja, kuten translaation jälkeisiä modifikaatioita tubuliinin itsensä ja vuorovaikutusta monenlaisia ​​MT sitovien proteiinien [2], [3], [4] , [5], [6].

fysiologisissa olosuhteissa dramaattisin uudelleenjärjestely MT tapahtuu alkaessa mitoosin kun interphase MT ovat depolymerisoitunut ja repolymerized muodostaa mitoottisiin karan. Ajallisesti ja kokoonpano ja dynaaminen käyttäytyminen mitoosi karat ovat ratkaisevan tärkeitä oikean kohdistuksen ja eriytymistä kahdennettu kromosomeja, joiden vioittuminen johtaa solun kuolemaan tai perimän epävakaisuuden (tarkistettavaksi [7]). Mitoosi karat ovat erityisen herkkiä erilaisille luonnollisia ja synteettisiä MT lääkkeitä, jotka heikentävät niiden kokoonpano ja tehtävät, mikä johtaa mitoottisiin pidätys ja johtaa solukuolemaan. Tästä johtuen toimintaa, MT lääkkeitä laajimmin käytetty hoitoon ihmisen syövissä. Kuitenkin jotkut syöpäsolut ovat luontaisesti resistenttejä ja lääke-alttiina syöpäsolut usein hankkia vastarintaa.

Discovery ja hyödyntäminen rakenteellisesti erilaisia ​​uudentyyppisiä antimikrotubulusaine aineita voidaan ratkaista tällaisia ​​ongelmia. Esimerkiksi kliininen hyöty rakenteellisesti erilaisia ​​MT stabilointiaineita voittamiseksi Taxol-resistenssin on raportoitu [8], [9], [10]. Toisiaan täydentävät lähestymistavat voivat sisältää yhdistettynä esto solun muiden tekijöiden, kuten mitoosi kinaasien ja moottori proteiinit [11]. Ottaen kuitenkin huomioon keskeisiä tehtäviä MT: iden eri solujen prosesseissa, jotkut astetta sytotoksisuuden normaaleihin solut näyttävät väistämätöntä.

On raportoitu, että suhteellinen kestävyys eri ihmisen syöpäsolujen linjat yhteisiin antimitoottiset aineet korreloi puute solukuoleman sijaan mitoosi pidätys [12]. Tämä havainto on yhdenmukainen sekä kliiniset havainnot ja eläinmallikokeissa että tunnistettu aste solukuoleman seuraavista Taxol hoidon määräytyy kokonaistulosta sen tehokkuuden [13], [14]. Siksi geneettinen tai farmakologiset aineet, jotka selektiivisesti helpottaa apoptoosia mitoosi pidätettiin solujen (eli lisääntyvissä syöpäsolujen) läsnä mahdollisuuksia vahvistaa tehoa MT lääkkeitä, joilla on vain vähän vaikutusta huumeisiin alttiina interphase soluja (eli ei-jakamalla normaalit solut).

Vuoden pienimolekyylisiä seulonta vaivaa (julkaisematon tulos) tunnistimme luonnontuote Celastrol, perinteisesti tunnettu sen tulehdusta ja syövän vastaisen toiminnan estäjänä neutrofiilikemotaksista. Käyttämällä joukko kokeita, jotka sisältävät viiveen kuvantaminen solumigraation ja kromosomi yhdenmukaistaminen sekä biokemiallisten ja solubiologinen lähestymistapoja, me paljasti, että esto MT toimintojen oli yksi varhaisimmista solutapahtumiin vaikuttavat uudet tubuliinia kohdistaminen aktiivisuus of Celastrol. Olemme lisäksi osoittaneet, että tämä ainutlaatuinen toiminta voidaan hyödyntää indusoida taksoliresistenttiä syöpäsoluja, ja selektiivisesti helpottaa mitoosi solukuolema MT lääkkeen pidätetty syöpäsoluja. Nämä havainnot antavat molekyylitason selitys tulehdusta ja syövän aktiivisuutta Celastrol, ja se on mahdollinen strategia parantaa mitoosi solukuolema tavanomaisilla mikrotubulia kohdistaminen syöpälääkkeet.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja sukupolven taksoliresistenttiä solulinja

sekä HEK293 ja HeLa-solulinjat saatiin American Type Culture Collection (ATCC), ja niitä pidettiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumin ja 1% PENISILLIINIT ja streptomysiiniä alle 5% CO

2.

Voit luoda taksoliresistenttiä solulinjan, HeLa-solut, jotka ekspressoivat stabiilisti EGFP fuusioitu histoni 2B syntyi. Nämä solut maljattiin 60 mm: n viljelymaljalle (1 x 10

6), kun läsnä on 0,5 nM Taxol. 72 tunnin kuluttua, elävät solut otettiin talteen ja uudelleen päällystetty läsnä ollessa saman lääkkeen pitoisuus. Tämä menettely toistettiin vähintään kolme kertaa tietyn lääkeaineen pitoisuus. Pitoisuus Taxol nostettiin vähitellen lopulliseen pitoisuuteen 5 nM. Resistentti solut nimetty H2B-TXR ylläpidettiin ja etenevät läsnäollessa 5 nM Taxol.

reagenssit ja vasta

Celastrol hankittiin EMD Biosciences ja kaikki muut kemikaalit, ellei olivat Sigma Aldrich ja Tocris Bioscience. Hiiren monoklonaalisia vasta-aineita gamma-Tubulin (T3320), alfa-Tubulin (T6199), ja beeta-Tubulin (T4026) olivat Sigma Aldrich; Kanin polyklonaalisia vasta alpha Tubulin (ab18251) ja beeta-Tubulin (ab6046) olivat Abcam. HRP-konjugoitua anti-kani-anti-hiiri-vasta-aineet olivat Amersham Biosciences; kaikki muut vasta-aineet hankittiin yhtiöltä Cell Signaling Technology.

Neutrofiilien puhdistus ja EZ-taxiscan Kemotaksismääritys

Ihmisen ääreisveren neutrofiilit puhdistettiin kuten aikaisemmin on kuvattu [15]. EZ-taxiscan kammio (Effector Cell-instituutti, Tokio, Japani) koottiin 260 um leveä x 4 um piisiru valmistajan mukaan opetusta. Inhibiittori-käsitelty neutrofiilien (3 x 10

6 /ml) sekoitettiin RPMI (0,1% BSA) ja ladataan alempaan kammioon (3000 solua per kuoppa). Yksi mikrolitra fMLP (100 nM lopullinen) lisättiin ylempään kammioon. Kulkeutuva neutrofiilit kohti ylempää kammio oli kuvattu 30 sekunnin välein 20 minuutin ajan. Elokuva analysoitiin käyttämällä DIAS ohjelmistoa (Solltech, Oakdale, IA) lasketaan nopeus.

Western blot ja immnunostaining.

valmistaminen kokosoluliuotteissa Western blot, ja muut standardeja molekyylibiologian tekniikat olivat oleellisesti samat kuin on kuvattu aikaisemmin [16]. Analysointiin mitoosi tumat, solut kiinnitettiin kun läsnä oli 3% PFA (esilämmitettyä) 5 minuuttia ennen DAPI-värjäyksellä. Immunovärjäystä mikrotubulusten, solut maljattiin 35 mm: n lasin pohja astia (MatTek Corp.) ja kiinnitettiin 5 minuuttia ennen jäähdytetty (-20 ° C) metanolia. Sen jälkeen kun oli pesty kolme kertaa PBS-Triton X-100 (0,05%), kiinteä solut tehtiin läpäiseviksi 30 minuuttia 5% normaalia vuohen seerumia, joka sisälsi 0,3% Triton X-100. Laimennettu vasta-aine (1:2000 perus- ja 1:1000 johdetun vasta-aineen) samalla liuosta ja inkuboitiin 3 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Sen jälkeen kun oli pesty kolme kertaa PBS-Triton X-100, Alexa fluor väriaine-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta lisättiin ja inkuboitiin 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Värjäytyminen visualisoitiin alla fluoresenssimikroskoopissa (Olympus IX71) ja kuva otettiin käyttäen 100 X objektiivilinssi. Tutkia viat paikannus kaksi sentrosomien suhteen pohjamaa in Celastrol saaneilla mitoosi soluissa, kaksi kuvaa eri polttotasojen, keskittyi gamma-tubuliinin värjäystä kunkin navan, otettiin yhdessä alfa-tubuliinin värjäytymisen karat (Kuva S1B).

Biokemialliset määritykset tubuliinit

eksponentiaalisesti kasvavat HEK293-solut kerättiin ja pestiin kerran PBS: llä. Solupelletti jäädytettiin kuivalla jäällä 15 minuuttia ja hajotettiin määrityspuskuriin, joka sisälsi 0,3% CHAPS, 200 uM GTP ja proteaasiestäjäseostabletit (Sigma Alderich) PBS: ssä. Lysaattia pidettiin kuivan jään päällä 15 minuuttia ja sulatettiin huoneenlämpötilassa. Kun sulatettu, solulysaatti sentrifugoitiin välittömästi 14000 rpm: llä 5 minuuttia 4 ° C astetta. Vain juuri valmistettua solulysaatti (2-4 ug /ml) käytettiin

in vitro

oligomerisaation määrityksessä tyypillisesti 50 ul: n reaktiotilavuudessa. Sen jälkeen kun esi-inkubaatio, kun läsnä on lääkettä 10 minuuttia jäillä, lysaattia inkuboitiin 37 ° C: ssa 15-60 minuuttia. Reaktio pysäytettiin lisäämällä yhtä suuri tilavuus 2 x MAP-puskuria ja keitetään 5 minuutin ajan ennen SDS-PAGE: lla. Määritystä varten puhdistetun tubuliinin ( 99% päässä Cytoskeleton, Inc), tubuliinin liuos laimennettiin pitoisuuteen 10 ug /ml määrityspuskurissa, ja reaktio suoritettiin olennaisesti sama kuin solulysaatissa. Immunosaostukseen, HEK293-solut hajotettiin samalla puskurilla kuin edellä (tyypillisesti 1 ml per 60 mm viljelymaljalle). Lysaatti kirkastettiin sentrifugoimalla ja inkuboitiin jään päällä 10 minuuttia, kun läsnä on eri lääkkeitä. Polyklonaalinen alfa tubuliini-vasta-ainetta (ab18251, Abcam) lisättiin (5 ug vasta-ainetta kohden 1 mg proteiinia per näyte) ja inkuboitiin 1 tunti kylmässä huoneessa ennen kuin lisätään proteiini G /A-agaroosi-lietettä (30 ui näytettä kohti) . Kun oli inkuboitu vielä 2 tunnin ajan, immunecomplex pestiin kolme kertaa jääkylmässä määrityspuskurissa 4 ° C: ssa ennen SDS-PAGE.

Caspase toimintaa, solujen elinkelpoisuus ja proteasomiaktiivisuuden määritys

kolorimetrinen kaspaasiaktiivisuus määritys suoritettiin käyttäen raakaa solu-uutteen läsnä kaspaasin substraatin, Ac-DEVD-pNA (Biomol International). Lääke käsitellyt solut kerättiin ja pestiin kerran PBS: llä. Solut lyysattiin jäillä 10 minuutin ajan puskurissa, joka sisälsi 0,1% CHAPS, 50 mM HEPES (pH 8,0), 12,5 mM NaCl, 0,1 mM EDTA: ta, ja 5 mM DTT: tä juuri lisätty. Lysaattia sentrifugoitiin 5 minuuttia nopeudella 14 000 rpm 4 astetta. Kirkastettu lysaatti (noin 200-400 ug proteiinia) sekoitettiin Ac-DEVD-pNA (200 uM lopullinen) 100 ul: n reaktiotilavuudessa 96-kuoppaiselle testilevylle. Levyä inkuboitiin 37 ° C: ssa ja entsyymin aktiivisuus mitattiin lukemalla absorbanssi 405 nm: jokaista 1 tunti käyttäen levynlukijaa (TriStar LB 941, Berthold Technologies). Solujen elinkelpoisuus määritettiin MTT-analyysi, kuten aiemmin on kuvattu [16]. Mitata proteasomiaktiivisuuden, HEK293-solut (1 x 10

6) käsiteltiin kunkin kemikaalien (5 uM) 1 tunti, ja hajotettiin jäillä 15 minuutin ajan 200 ul: ssa lyysipuskuria (20 mM Tris-HCl, pH 7,5; 150 mM NaCI; 1 mM EDTA; 1 mM EGTA; 1 mM beeta-Glyserofosfaatti; 1% Triton X100). Selvittämisen jälkeen solu roskat sentrifugoimalla 4 astetta, uute altistettiin proteasomaalista aktiivisuuden määritys käyttäen Proteasome-Glo ™ kymotrypsiininkaltaisten Assay (Promega).

Aikaväli elävien solujen kuvantamiseen

solujen migraatiomääritys, HeLa-solut, jotka ilmentävät histoni H2B EGFP (HeLa-H2B) maljattiin 35 mm: n viljelymaljalle (4 x 10

5), ja viljeltiin 48 tunnin ajan. Scratch tehtiin käyttämällä kärjen keskellä lautasen ja pestään kerran esilämmitettyä Leibovitzin L15 täydennetty 0,5% FBS. 10 minuutin kuluttua paranemista samassa väliaineessa, lääke lisättiin ja time-lapse elokuva otettiin 15 minuutin välein 150 minuutin ajan käyttäen IPLab ohjelmistoa. Siirtyminen ala määritettiin vähentämällä pinta-ala solut hetkellä 150 minuuttia kanssa, ajankohtana 0 minuuttia kunkin lääkkeen. Suhteellinen muuttoaluetta laskettiin normalisoimalla vastaan ​​ohjaus (DMSO-käsitelty) ryhmässä. Sillä mitoosi kromosomi linjaus, HeLa-H2B-solut maljattiin 35 mm: n lasin pohja astia 20% yhtymäkohdassa ja viljeltiin 48 tunnin ajan. Väliaine korvattiin Leibovitzin L15, johon on lisätty 0,5% FBS: ää. Välittömästi lisäyksen jälkeen kunkin lääkkeen, The prophase solut tunnistettiin alla fluoresenssimikroskoopilla ja viiveen elokuva otettiin 5 minuutin välein 90 minuutin ajan. Apoptoottisen kuoleman mitoosi pidätettiin soluja, HeLa-H2B solujen kasvaa eksponentiaalisesti (eli noin 70% konfluenssiin) 35 mm: n malja korvattiin 2 ml: lla Leibovitzin L15 (0,5% FBS), joka sisälsi 10 nM vinblastiini ja viljeltiin 4 tunnin ajan. Lisäyksen jälkeen kunkin lääkkeen, viiveen elokuva otettiin 15 minuutin välein 4 tunnin ajan. Apoptoottisen kuoleman vain ”pre-pidätetty” mitoosi soluissa, jonka osoittaa pyöreän morfologian hetkellä 0, pisteytettiin ja nimettiin ”mitoosi kuolema” (katso kuva S4). Ei-mitoottisiin solukuolemaa määriteltiin kiinnittyneet ja litteä soluja (huume-alttiina interphase solut) kuoli kahden seuraavan kehyksen (30 minuuttia). Apoptoottisen kuoleman ”vasta pidätetty” mitoottisiin solujen aikaintervallitallennuksen kuvantaminen ei lasketa. Voit selvittää vaikutukset Celastol on mitoosi soluissa, me synkronoitu ja rikastettu mitoosi HeLa-H2B solujen ”double-tymidiinin block” [17]. Lyhyesti, soluja kasvatettiin 20-30% konfluenssiin ja viljeltiin 19 tunnin ajan, kun läsnä oli tymidiiniä (2 mM), ja inkuboitiin 10 tunnin ajan ilman tymidiiniä. Toinen lohko suoritettiin viljelemällä 17 tuntia tymidiinillä (2 mM). Solut pestiin ja niitä inkuboitiin 5 tuntia ilman tymidiiniä, ja elatusaine korvattiin Leibovitzin L15 (0,5% FBS) väliaineessa. Soluja viljeltiin vielä 4 tuntia, ennen kuin lisättiin Celastrol, ja kohtalo mitoosi soluja seurataan nopeutus elokuva.

Tulokset

Celastrol estää solujen vaeltamiseen

Celastrol on yksi aktiivisten yhdisteiden, jotka ovat peräisin kasviuutteita perinteisesti käytetty hoitoon tulehdusoireita [18]. Immuunisolujen paikalle tulehduksen edeltää sarjan solureaktioita johtavien tapahtumien tulehdusreaktioita, ja estämällä tämän rekrytointi voi vaimentaa tulehduksellisia prosesseja. Aikana pieni molekyyli seulonta, Celastrol todettiin estäjä fMLP-indusoidun neutrofiilikemotaksista (julkaisematon tulos). Celastrol on osoitettu estävän proteasomaalista aktiivisuutta ja moduloivat lämpösokkiproteiini (HSP) 90 reitti [19], [20], [21]. Siksi tutkimme vaikutuksia tunnettuja estäjiä näistä reiteistä, 17AAG varten HSP90 ja MG132 varten proteasomin, samoissa kokeellisissa asetusta. Kontrolliin verrattuna solujen Celastrol saaneilla neutrofiilit osoittivat noin 50% vähennys siirtymiseen nopeudella kohti kaltevuus lähde fMLP (Elokuva S1 ja S2). Kuitenkin, mitään havaittavaa vaikutusta ei havaittu, kun läsnä on muita kemikaaleja. Lisäksi, Gedunin, jonka on osoitettu estävän HSP90 reitin samanlainen Celastrol [20], on myös osoittanut mitään inhiboivaa vaikutusta (kuvio 1A ja B). Lisäksi, kun testattiin kokosolulysaatissa määrityksessä, Celastrol osoitti hyvin vähän estävää aktiivisuutta proteasomin (kuvio 1 B). Näin ollen, vaikutusta Celastrol neutrofiilien kemotaksista ei aiheuttama inhibitio proteasomaalisten toiminnan.

(A-B) Celastrol estää fMLP-indusoidun neutrofiilikemotaksista. (A) Vasta eristettyjä ihmisen perifeerisen veren neutrofiilien esikäsitelty kunkin kemikaalin 30 minuuttia, ja sen jälkeen niille fMLP-välitteisen kemotaksista 20 minuuttia käyttäen EZtaxiscan. Ensimmäinen ja viimeinen kuvia videoiden näytettiin kullekin lääkkeelle. fMLP (100 nM), Celastrol (2 uM), 17AAG (4 uM), MG132 (10 uM), ja Gedunin (20 uM) käytettiin ilmoitettu yhdistelmän. (B) Vasen paneeli on kvantifiointia vaeltavat nopeus nähden jokaista lääkehoitoa. Oikea paneeli on kokosolulysaatissa-määritys proteasomaalisten toimintaa käsitellään kunkin lääkkeen 1 tunti. Pitoisuus kemikaaleista oli 5 uM. (C-D) Celastrol vähentää epiteelin syöpäsolujen liikkuvuutta. (C) Konfluentit HeLa Solut naarmuuntunut käyttäen kärki. 10 minuutin kuluttua elpymisen, kunkin lääkkeen lisättiin ja time-lapse kuvia otettiin joka 15 minuutti 150 minuutin ajan. Edustaja pysäytyskuvia ensimmäisen (aika 0) ja viimeinen (aika 150) ajankohtina näytettiin. Sillä näyte ”Celastrol-wash”, soluja esikäsiteltiin Celastrol 3 tuntia ennen naarmuuntumista; ja viiveen elokuva tehtiin huumeiden väliaineessa. (D) kvantifiointi solumigraation. Suhteellinen muuttoaluetta kontrolliin (DMSO-käsitelty) esitettiin. * Osoittaa p 0,05 opiskelijan T-testiä.

Seuraavaksi tutkimme jos tämä havainto voitaisiin laajentaa muihin solutyyppeihin. Tuore tutkimus osoitti, että Celastrol esti TNF-alfa-indusoitua kasvainsolun invaasiota estämällä geenin ilmentymisen ohjataan NF-κ B-reitin [22]. Kuitenkin, koska pidempi lääkkeelle altistumisen tässä tutkimuksessa, onko Celastrol vaikuttaa suoraan motiliteettia epiteelisolujen ei voitu määrittää. Näin ollen tutkimme suora vaikutus Celastrol kasvaimen solujen vaeltamiseen käyttäen haavan paranemista määritystä. Konfluenttien Hela-solut naarmuuntunut, ja time-lapse kuvia muuttoliikkeen kohti haavoittuneita alue otettiin. Yhdenmukainen sen vaikutukset neutrofiilikemotaksista, Celastrol tehokkaasti esti solujen vaeltamiseen, keskimäärin 60% vähennys vuosien ajan kuluessa 150 minuuttiin (Elokuva S3 ja S4). Sulkea pois mahdollisuutta, että tämä estovaikutus johtui yleisen solun myrkyllisyyttä, me esikäsitelty solut Celastrol 3 tuntia. Poistettaessa lääkkeen siirtymisen solujen kapasiteetin oli täysin palautettu, mikä osoittaa tämä estovaikutus oli palautuva ja ei johtunut yleisestä myrkyllisyys (kuvio 1 C ja D). Samanlaisia ​​mitä havaittiin neutrofiilien, estämällä joko proteasomireitillä tai HSP90 polku ei ollut estävää vaikutusta tässä koetilalle (kuvio 1 C ja D). Nämä tulokset osoittavat läsnäolo solukohteeseen (t) Celastrol, herkkä estämällä proteasomireitillä tai HSP90 reitin.

Celastrol heikentää mitoosi etenemistä estämällä kromosomi linjaus

Dynaaminen ja koordinoitua sääntelyä tukirankansa verkko, kuten aktiinisäikeiden ja mikrotubulusten, on kriittinen vaeltavien solujen. Inhiboiva vaikutus solujen vaeltamiseen sekä neutrofiilikemotaksista ja epiteelin haavan paranemista viittaavat mahdollisuuteen, että Celastrol voivat häiritä solun tukirangan verkkoon. Mitoosin aikana, MT dynamiikka on ratkaiseva rooli yhdenmukaistaminen ja kromosomien segregaatiota. Siksi tutkimme poikkeavuuksien osuus mitoosi vaiheiden yhteydessä Celastrol hoitoa. Vaikka DMSO-käsiteltyjen HeLa-solut osoittivat samanlaisen osuuden prometaphase, metafaasivaiheeseen, ja Anaphase /telophase kromosomeja, yli 70 prosenttia kromosomien Celastrol käsiteltyjä soluja toimineet ”prometaphase kaltainen” fenotyypit (kuvio 2A). Edelleen vahvistaa tämän tuloksen, teimme prometaphase-pidätys ja Vapautumiskoe (kuvio 2B). Ensin pidätettiin solut prometaphase mukaan nokodatsolin hoitoa, ja pidätti solut kerättiin napauttamalla levyä. Poistettaessa nokodatsolin Mitoosi karat uudelleen koottu, jotka kohdistavat kromosomit metafaasivaiheen tasoon myöhempää mitoosi progressions tapahtua. Tämä julkaisu koe suoritettiin läsnäollessa eri kemikaaleja arvioida niiden vaikutuksia sukkularihmaston toimintoja. Vuonna kontrolliryhmään, lähes puolet pidätettyjen solujen ovat edenneet Anaphase aikana 30 minuutin release (inkubointi) aikana. Kuitenkin, kun läsnä on Celastrol, suurin osa soluja pidätettiin prometaphase, kun taas inhibitiota HSP90 ei ollut vaikutusta. Proteasomin esto MG132 hieman kertynyt solujen metafaasivaiheen (kuvio 2B). Edelleen vahvistaa nämä havainnot, suoritimme live kuvantaminen mitoosi soluissa (kuvio 2C ja D). Välittömästi lisäyksen jälkeen kunkin kemikaalin prophase solut, jonka osoittaa tiivistyneen kromatidia, oli kuvattu niille tehdään kromosomin linjaus ja erottelu (Elokuva S5 ja S6). Vuonna Kontrolliryhmässä prophase solut edennyt Anaphase 60 minuutissa. Kuitenkin läsnä ollessa Celastrol, he eivät etene ja jäi prometaphase kaltainen tila. Yhdenmukainen tulokset prometaphase-pidätys ja vapauta kokeilu, esto HSP90 ollut ilmeisiä vikoja. On huomionarvoista, että pitkäaikainen inhibitio HSP90 vaikuttaa mitoosi etenemisen heikentämällä centrosomal toiminnot [23], [24], [25]. Toisaalta tämän lyhyt esto kunnossa, mitään ilmeistä vika havaittiin. Kuten odotettua, esto proteasomin viivästynyt eteneminen anafaasia, koska sen aktiivisuutta tarvitaan kromosomin erottamisen (kuvio 2C ja D).

(A) HEK293-soluja käsiteltiin Celastrol (2 uM) 1 tunnin ajan ennen kiinnitys ja värjäys DAPI. Mitoottisen solut laskettiin ja sijoitettiin niiden kromosomi-morfologia. Osuus kunkin mitoottisen vaiheen aikana kokonaismäärä laskettiin solujen esitettiin. (B) HeLa-soluja käsiteltiin nokodatsoli (100 nM) 6 tuntia. Pidätetty solut kerättiin napauttamalla levy, pestiin PBS: ssä, ja maljattiin uudelleen seerumivapaassa väliaineessa. Kun 15 minuuttia kiinnityksen (aika 0), kunkin lääkkeen lisättiin ja inkuboitiin 30 minuuttia ennen kiinnitystä ja värjäystä DAPI. Keskimääräinen solujen määrä kussakin vaiheessa päässä nelinkertaisesti näytettiin. ”ND” tarkoittaa ei-mitoosi tai kuolleita soluja. (C) Hela-solut yli-ilmentävät EGFP-H2B proteiini hoidettiin ilmoitettu huumeita. Välittömästi lääkkeen Lisäksi prophase solut tunnistettiin ja viiveen kuvaa otettiin joka 5. minuutti 90 minuutin ajan. Suurennettu yksittäisiä kuvia edustaja elokuvia näytettiin. (D) Yhteenveto Aikaintervallitallennuksen elokuvia mitoosi kromosomi linjaus C). Aste mitoosi etenemisen prophase solujen 60 minuuttia, kun läsnä on kunkin kemiallinen määritys perustuu kromosomi muotoon, ja osoitettiin rekki. Numerot osoittavat solujen määrä tutkittiin. Edustaja kromosomi muodot valvonnan solujen eri mitoosi vaiheissa näytettiin alapaneeli viitteenä.

Celastrol disorganizes mitoosi karat

ymmärtää paremmin vaikutuksia Celastrol solutasolla tutkimme jos rakenne MT vaikuttivat käsitellyissä soluissa. Yllättäen on pitoisuus Celastrol (2-4 uM), joka esti solujen vaeltamiseen ja kromosomi linjaus, löysimme suhteellisen ehjänä MT rakennetta interfaasivaiheessa soluissa (kuvio 3A ja B). Kuitenkin merkittävä epäjärjestyksestä on sukkularihmaston nähtiin mitoosi soluissa (kuvio 3 A ja B). Aikana prometaphase Mitoosi karat ja siihen liittyvä moottori proteiinit auttavat align kromosomien at metafaasivaiheen tasossa. Tässä vaiheessa, lukuun ottamatta centrosomal localization, gamma-tubuliinia on myös paikallistettu karat auttamaan kokoonpano [1]. Epiteelisoluissa, sukkularihmaston on koottu rinnakkain substraattiin [26]. Tämän mukaisesti kertomuksen, useimmissa ohjaus HeLa-solujen (95%, n = 25), kaksi sentrosomien visualisoituina gamma-tubuliinin värjäytyminen havaittiin samassa polttotasoon 100 x objektiivilinssin (kuvio 3A ja kuvio S1A). Kuitenkin Celastrol käsiteltyjä soluja, kara lokalisaatio gamma-tubuliinia merkitsevästi lakkautettiin (93%, n = 42/45) ja tasossa kaksi napaa suhteen pohjamaa pahoin vääristynyt, jättäen kaksi sentrosomien tuskin samaan polttoväli tason (78%, n = 35/45) tai sijoittamalla ne toistensa viereen (22%, n = 10/45) (kuvio 3B ja kuvio S1B). Nämä viat näyttivät olevan erilaisia ​​kuin aiheuttama vinblastiini, MT depolymerizer tai paklitakselia MT stabilointiainetta, joka pääasiassa vaikuttaa polymerointi /depolymeroitumisen MT (kuvio 3C ja D). Tämä havainto viittaa siihen, että Celastrol disorganizes Mitoosi karat käyttämällä eri mekanismilla.

edustaja immuunivärjäystä mikrotubulusten (alfa- tubuliinin) ja sentrosomimäärän (gamma-tubuliinin) on interphase ja kara morfologia mitoosi HeLa-solujen käsitelty 1 tunti ilmoitetuilla huumeiden; Celastrol (4 uM), vinblastiini (10 nM), ja taksolin (10 nM).

Celastrol aiheuttaa rakenteellisia puutteita tubuliinin

in vitro

ja vähentää sen taso

vuonna vivo

Celastrol aiheuttama puutteita, MTS voi johtua estämällä monissa solun tekijöitä. Testasimme mahdollisuus, että tubuliiniin itsessään voi olla suora tavoite. Sen lisäksi vakiintunut polymerointi

in vitro

, joka vaatii korkean pitoisuuden (yli 1-2 mg /ml) ja GTP, tubuliinin heterodimeeri ilmenee useita muita biokemiallisia ominaisuuksia, kuten GTP-riippumattoman oligomeroimalla intra- ja molekyylien välisen disulfidisidoksen, ei-disulfidisidoksen ristisilloitukseen ja ei-entsymaattisesti [27], [28], [29], [30], [31]. Tutkimme jos Celstrol voi vaikuttaa kaikkiin näistä biokemialliset ominaisuudet. Kuten aikaisemmin ilmoitettiin, inkuboinnin puhdistetun tubuliinin johti oligomeroinnissa (tai korkean molekyylipainon komplekseja) havaittavissa ei-pelkistävissä olosuhteissa (kuvio 4A). Suurin osa, mutta ei kaikkia näitä oligomeerien katosi vähentää kunnossa (kuva S2A). Määrät jäljellä tubuliinin oligomeerien vaihtelivat kussakin kokeessa ja voi edustaa SDS kestävä ja ei-disulfidi silloitetut tubuliinit [31]. Lisääminen GTP, joka stabiloi tubuliinin rakennetta, mutta ei ATP, lisääntynyt taso oligomeerien molemmissa HEK293-solulysaateista ja puhdistettu tubuliinit, osoittaa tämä oligomerisaatioon saattaa vaatia jonkin verran rakenteellista vakautta (kuvio S2B). Käyttämällä tätä määritystä HEK293 solujen lysaatin, olemme huomanneet, että Celastrol esti muodostumista tubuliinin oligomeerien, kun taas 18 beta-glycyrrhetic happo (18-βGCA), joka on triterpene rakenteellisesti samanlaisia ​​kuin Celastrol, oli paljon heikompi estävä vaikutus (kuvio 4A). Samanlainen inhiboiva vaikutus havaittiin myös, kun puhdistettua tubuliinia käyttää (kuva S3).

(A) HEK293-solulysaateista inkuboitiin kun läsnä on ilmoitettua määrää Celastrol tai 18-beeta-GCA 15 minuuttia ennen SDS-PAGE ei-pelkistävissä olosuhteissa. Kalvo blotattiin alfa-tubuliinin (ylhäällä) tai beeta-tubuliinin vasta-ainetta (alhaalla). (B) Solulysaatit valvonnan HEK293-solut valmistettiin ja jaettu tasaisesti neljään eri putkiin, ja immunosaostus suoritettiin polyklonaalista alfa-tubuliinin-vasta-aineen läsnä ollessa DMSO: ssa tai osoitettujen määrien Celastrol. SDS-PAGE, immuuni- kompleksi blotattiin hiiren monoklonaalinen vasta-aine alfa-, beta- tai gamma-tubuln. Määrä alfa-tubuliinin (yläpaneeli) toimii latauskontrollina. (C) immuunisakkautuksen ja Western blot suoritettiin kuten B), kun läsnä on eri kemikaaleja. (D) HEK293-soluja käsiteltiin osoitetulla määriä Celastrol 1 tunnin ajan, ja koko solulysaatit analysoitiin osoittivat solujen proteiinit. Samat lysaatit blotattiin fosfo-CDK alustan vasta-aine (oikea paneeli).

Tämä estävä vaikutus voi johtua epävakautta (eli piirtyy) on tubuliinit läsnäollessa Celastrol. Jos näin on, niin Celastrol voi häiritä dimeerisen vuorovaikutusta alph- ja beeta-tubuliinia. Suoraan tämän mahdollisuuden testaamiseksi, ensin valmistetaan solulysaatit valvonnan HEK293-solut, ja alfa-tubuliinin immunosaostettiin polyklonaalisella vasta-aineella, kun läsnä on eri määriä Celastrol. Taso beta- ja gamma- tubuliinin tuloksena immunecomplex tutkittiin. Kiehtovan määrä beeta-tubuliinin laskettiin on Celastrol-annoksesta riippuvaisella tavalla, kun taas gamma-tubuliinin pysyi suurelta osin muuttumattomana (kuvio 4B). Kun testattiin samoissa koeolosuhteissa, toinen MT lääkkeet eivät osoittaneet tällaista vaikutusta (kuvio 4C), mikä osoittaa, että Celastrol voivat vaikuttaa rakenteellista eheyttä tubuliinin heterodimeerin.

biogeneesin tubuliinia heterodimeerin on tarkoin säädeltyä, ja vaurioituneet tubuliinit joutuvat hajoamisen tai kierrätykseen polku, joka sisältää tubuliinin erityisiä kofaktoreita [32].