Krooninen sairaus

tiivistelmä

Drug jakauma soluissa on perustavan tärkeä, mutta usein unohdetaan, muuttuja lääkkeen tehoon. Monet heikosti emäksinen syöpälääkkeiden kertyvät laajasti happamassa lysosomeihin normaalien solujen kautta ioni ansastusta. Lysosomaalinen ansastusta aktiivisuutta vähentävä syöpälääkkeitä, koska syöpälääke tavoitteet ovat usein lokalisoitu solun sytosoliin tai tumassa. Jotkut syöpäsolut ovat viallisia happamoitumista lysosomeihin, mikä aiheuttaa uudelleenjako loukkuun huumeita lysosomeihin sytosoliin. Olemme aiemmin osoittaneet, että kyseiset erot huumeiden lokalisointi normaalin ja syöpäsolut voivat edistää näennäinen selektiivisyys heikosti emäksisen lääkkeiden syöpäsoluja

in vitro

. Tässä työssä, testasimme onko tämä solunsisäistä jakelua-pohjainen lääke valikoivuus voitaisiin optimoida perustuu happovakio (pKa) lääkkeen, joka on yksi vaikuttavista tekijöistä lysosomaalisen sitomisen kapasiteetti. Syntetisoimme seitsemän heikosti emäksinen rakenteellisia analogeja Hsp90 inhibiittorin geldanamysiini (GDA), jossa pKa-arvot välillä 5 12. selektiivisyys kunkin analogisen ilmaistiin ottamalla suhde antiproliferatiivinen IC

50-arvot inhibiittorien normaalien fibroblastien IC

50-arvot ihmisen leukemiasoluja HL-60-solujen. Samanlaisia ​​selektiivisyys arvioinnit suoritettiin pari syöpäsolulinjoja, että erosivat lysosomaalisen pH seurauksena siRNA-välitteisen muuttaminen vakuolaarisen protonin ATPaasi-alayksikön ilmentymistä. Optimaalinen selektiivisyys havaittiin analogien pKa-arvot lähellä 8. Samanlaisia ​​suuntauksia havaittiin kaupallisten syöpälääkkeiden vaihtelevalla heikosti emäksisen pKa-arvot. Nämä arvioinnit lisää tietämystä siitä, miten heikosti perusominaisuudet voidaan optimoida saavuttaa mahdollisimman syöpälääkettä selektiivisyyttä syöpäsolujen vialliset lysosomaalisten happamoitumisen

in vitro

. Muita

in vivo

tutkimuksia tarvitaan tutkia tämän menettelyn hyödyllisyyden tehostamiseksi valikoivuus.

Citation: Ndolo RA, Luan Y, Duan S, Forrest ML, Krise JP (2012) Lysosomotropic Properties heikosti Basic syöpälääkkeitä edistää Cancer Cell valittavuus

In vitro

. PLoS ONE 7 (11): e49366. doi: 10,1371 /journal.pone.0049366

Editor: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., Yhdysvallat

vastaanotettu: 1. kesäkuuta, 2012 Hyväksytty: 10 lokakuu 2012; Julkaistu: 07 marraskuu 2012

Copyright: © 2012 Ndolo et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus rahoittivat NIH RO1 avustus CA106655 (https://grants.nih.gov/grants/oer.htm). Rahoittaja ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Monet syöpälääkkeet kärsivät huonosta selektiivisyys kohdesoluihin, joka johtaa suurta myrkyllisyyden ja mahdollisesti hengenvaarallisia sivuvaikutuksia; siksi, kemoterapia usein ennenaikaisesti pysähtynyt, vähentää mahdollisuuksia lääkkeen saavuttaa täyden potentiaalinsa. Syöpälääkkeet tyypillisesti hallussaan jonkinasteista luontainen selektiivisyyttä syöpäsolujen takia biokemiallisten ja /tai metabolisen eroja normaalin ja transformoituja soluja [1] – [3]. Luontainen selektiivisyys syöpälääke voidaan edelleen tehostaa käyttämällä erilaisia ​​lääkeaineen lähestymistavat perustuvat Ehrlich ehdottama ”ihmelääke” [4], [5]. Kaikki nämä kohdistusstrategioihin yhteinen vaatimus, joka on se, että aktiivinen sytotoksinen aine on kertyy enemmän tai noin transformoiduissa soluissa suhteessa normaaleihin soluihin. Vaikka lukuisia luovia strategioita on tutkittu, kuten aihiolääkettä strategiat ja vasta huumeiden konjugaatteja, niiden terapeuttista käyttökelpoisuutta on jossain määrin rajoitettu [6].

solunsisäinen jakelu lääke on pohjimmiltaan tärkeä näkökohta lääkkeen tehoon. Nisäkässolut laajasti jaettu osastoihin, ja molemmat lääkeaineet ja niiden tavoitteita voi olla erityinen ja erillinen solunsisäinen sijainti kuvioita. Näin ollen, sillä on tarkoitettu terapeuttinen vaikutus tapahtuisi, solun sisällä lääkkeen lokalisointi on oltava sama, jossain määrin, kuin lääkkeen tavoite. Me ja muut ovat aiemmin osoittaneet, että fysikaalis-kemialliset ominaisuudet lääkkeet voivat ennustettavasti vaikuttaa niiden solunsisäinen lokalisaatio [7] – [10]. Lisäksi olemme osoittaneet, että yksittäinen lääke voi olla merkittävästi erilainen solunsisäinen sijainti ja kaupan malleja eri solutyypeissä [11], [12].

määrätietoinen kohdentamista syöpälääkkeiden ja solunsisäisiin osastoihin syöpäsoluja edustaa syntymässä alue etsintä [13], [14]. Esimerkiksi, mitokondriot on negatiivinen kalvojännite liittyvät niiden sisäkalvon, joka on osoitettu ohjaamaan kertyminen lääkeaineiden delocalized kationinen varaus [15]. Tältä osin johdannaisia ​​Hsp90 estäjien on kehitetty hyödyntämään tätä päätelmää ja näin ollen valikoivasti tavoite mitokondrio muoto Hsp90 [16].

Vaihtoehtoisesti monet heikosti emäksisiä lääkkeitä paikallisluonteisia kationivaraukset on osoitettu olevan laajalti erottautuvat hapan lysosomeihin solujen läpi ioni ansastusta mekanismi, ja ominaisuudet solun ja huume, joka vaikuttaa tähän ovat tarkastelleet [17]. Lyhyesti, pH lysosomeihin, suhteessa pH sytosoliin, on yksi tärkeimmistä fysiologiset parametrit, jotka sanelee ennustettu aste lysosomaalisen kertymistä [12], [17]. Mitä suurempi lysosomiin-to-sytosoliin pH-gradientin, sitä suurempi laajuus lysosomaalisen sitomiseen on. Monille amiineja, lysosomaalisen ansastusta on osoitettu olevan melko laaja, ja sen ajatellaan lähentää totaalisoluproteiinia kertyminen [18]. Koska lääkekohteita harvoin lokalisoitu lysosomeihin laaja pyydystäminen heikkoja emäksiä tässä osastossa voi merkittävästi vähentää tavoite vuorovaikutusta, mikä vähentää huumeiden toimintaa.

Mielenkiintoista, me ja muut ovat osoittaneet, että useat syöpäsolutyyppien on lysosomaalisen happamoitumisen vika [19] – [22]. Joissakin tapauksissa, lysosomaalisen pH syöpäsolujen on raportoitu olevan 2 pH-yksikköä korkeampi kuin lysosomaalisen pH normaalien solujen [22]. Tämä korkeus lysosomaalisen pH ennustetaan olevan merkittävä vaikutus solunsisäiseen jakamisesta heikosti emäksisen amiineja substraattien ioni ansastusta lysosomeihin (lysosomotropic aineet). Erityisesti, konsentraatio tällaisten lääkkeiden vähenee lysosomeihin näiden solujen ja samanaikaisesti lisätä sytosoliin sekä muissa extralysosomal osastoissa. Ehdotamme, että tämä ero lääkejakelujärjestelmien käyttäytyminen helpottaa lisälaite lääkeaineen aktiivisuutta syöpäsolujen suhteessa normaaleihin soluihin.

Olemme aiemmin perustettu pohjan tämän solunsisäisen jakelu-pohjainen lääke (IDB) kohdistaminen alustalla käyttäen sekä

in vitro

ja

in vivo

lähestyy [12], [23], [24]. Käyttämällä soluja kasvatettiin viljelmässä, me määrällisesti mitattuna lysosomissa-to-sytosolin pitoisuussuhteet huumausaineiden solujen alhainen tai koholla lysosomaalisen pH. Heikosti emäksinen syöpälääkkeiden osoitettiin jakaa alkaen lysosomeihin sytosoliin kun lysosomaalisen pH kohosi. Tämä solunsisäinen uudelleenjako huumeiden johti selvempiä sytotoksisuutta kohti solujen koholla lysosomaalisen pH. Tärkeää on, tällaiset muutokset solunsisäisessä jakelun ja myrkyllisyyttä ei havaittu syöpälääkkeiden ilman lysosomotropic ominaisuuksia. Viime aikoina loimme perustan IDB kohdistaminen alustan hiirissä arvioimalla astetta lääkkeen aiheuttamaa toksisuutta hiirillä, joilla on alhainen tai kokeellisesti kohonnut lysosomaalisen pH [24].

Tässä raportissa nimenomaan epäilivät lysosomotropic potentiaalia syöpälääkkeen korreloi asteen IDB valikoivuus. Tämä on erittäin tärkeä näkökohta, joka voisi ohjata järkevä suunnittelu uusien syöpälääkkeiden kanssa ominaisuuksia, jotka optimoivat lysosomotropism ja siksi IDB valikoivuus, tai muuttaa olemassa olevien lääkkeiden antamaan näitä ominaisuuksia.

Tulokset

valinta ja synteesi analogien geldanamysiinistä joiden valikoima heikosti emäksisen pKa-arvot

Olemme aiemmin osoittaneet, että heikosti emäksinen syöpälääkkeiden kanssa lysosomotropic ominaisuudet osoittavat suurempaa selektiivisyyttä syöpäsoluja kuin tekevät ei-lysosomotropic kollegansa [12]. Tässä työssä, testasimme ennusteen että lysosomotropic potentiaalia heikosti peruslääkkeitä korreloi niiden aste ero selektiivisyyttä syöpäsoluja.

käsittelee tätä kysymystä, me pidetään huumeisiin liittyvät tekijät, joiden tiedetään edistää lysosomotropism. Kaikki substraatteja ioni ansastusta-pohjainen lysosomotropism ovat heikosti emäksinen, mutta eivät kaikki heikosti emäksinen molekyylit ovat lysosomotropic. Hänen kommentoidaan aiheesta, de Duve ehdotti, että kaksi riippumatonta huumeisiin liittyvät ominaisuudet vaikuttavat lysosomotropic potentiaalia tietyn lääkkeen. Ensimmäinen parametri on nimeltään alfa ja edustaa lysosomaalisen kalvon läpäisevyyden suhde lääkkeen sen ionisoidut vs. järjestäytynyt muotoja. Olemme aikaisemmin kokeellisesti arvioidut alfa useita yhdisteitä mittaamalla oktanoli /puskuri jakaantumiskerroin, kuten pH: n funktiona ja korreloidaan näitä arvoja lysosomaalisten sitomiseen [7]. Toinen tärkeä lääke-liittyvä parametri on pKa konjugaatin hapon pohjan. Olemme aikaisemmin kokeellisesti vahvistettu, miten pKa lääkkeiden vaikuttavat lysosomaalisen sitomisen viljellyissä soluissa [8].

Tässä työssä päätimme arvioida vaikutuksen pKa valikoivuudesta käyttämällä estäjiä 0 kD lämpöshokkiproteiini (Hsp90 ), joka systemaattisesti vaihteli niiden heikko emäs pKa. Päätimme muuttaa 17-asemaan Hsp90 estäjän GDA luoda johdannaisia ​​monipuolinen pKa sillä aiemmat raportit olivat osoittaneet, että muutoksia tähän asentoon ei muuttanut toimintaa [25].

opastaa meidän valinta johdannaisten vaihtelevalla pKa, me pidetään aiemmin kuvattu teoreettinen suhde heikon emäksen pKa ja alfa on lysosomiin-to-solunulkoisen pitoisuuden suhde [17], joka on annettu seuraavalla lausekkeella.

konjugaatti happo heikon emäksen dissosiaatiovakio merkitään K

a, ja [H

+] osoittaa protoni pitoisuudet (alaindeksi E edustaa ekstrasellulaarisen ja alaindeksi L edustaa lysosomaalisen). Termi alfa (α) tarkoittaa suhdetta lysosomaalisen kalvon läpäisevyys varten ionisoidun base jaettuna kuin un-ionisoituneen lajit [26]. Tätä yhtälöä, laskimme teoreettinen lysosomiin-to-solunulkoisen pitoisuuden suhde useita lääkeaineiden pKa-arvot vaihtelevat 4 14. laskelmat, käytimme lysosomaalisen ja solun pH-arvoilla 4,4 ja 7,4, vastaavasti, jotka ovat tyypillisiä arvot normaaleille soluille [27], ja alfa-arvo on 0,01, jota oli aiemmin mitattu 17-DMAG, heikosti emäksinen johdannainen GDA [12]. Osoittaakseen mahdollinen vaikutus alfa on lysosomaalisen sitomisen, olemme sisällyttäneet tontteja, jossa tämä parametri vaihtelee. Piirtäminen ennustettu lysosomin-to-solunulkoisen pitoisuuden suhde vastaan ​​pKa antoi kellomainen käyrä, jolloin mahdollisimman suuren lysosomaalisen sitomisen ja pKa lämpötilassa, jossa tämä tapahtui olivat herkkiä suuruutta alfa parametri (katso kuva 1). Näiden pohjalta simulaatiot, me olettaisi, että syövän vastaisia ​​aineita, jotka vaihtelevat pKa noin 5 -12 olisi asianmukaisesti määritellä vaikutuksen lysosomaalisen sitomiseen kasvaimen valikoivuus.

Yhtälö käytetään näihin simulaatioiden löytyvät tekstistä. PH lysosomeihin ja ekstrasellulaaritilan asetettiin 4,4 ja 7,4, vastaavasti. Alfa parametri vaihteli kuten.

Siksi syntetisoitiin useita heikosti emäksisen analogien GDA yritetään kehittää pienten joukko johdannaisia, jotka oli pKa-arvot ulottuen tällä alueella. GDA-johdannaiset syntetisoitiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät sekä ominaista

1H-NMR (katso teksti S1). PKa-arvot analogien 1, 2, 3, 5 ja 6 (katso kuvio 2 kemialliset rakenteet) mitattiin 37 ° C: ssa käyttäen

1H-NMR. Määrittää pKa tällä menetelmällä, kemialliset siirtymät protonien alfa ionisoitumistiheys amiini piirrettiin pH, jolloin saatiin sigmoidal käyrät (kuvio S1), josta pKa on peräisin. Yhdisteille 4 ja 7, pKa ei voitu mitata

1 H-NMR johtuen joko liukenevat niukasti D

2O ja /tai huonosti ratkaistu protoni huiput. Siksi raportoimme aikaisemmin mitatun pKa-arvo yhdisteen 4, joka hankittiin käyttämällä vaihtoehtoista lähestymistapaa [12], ja raportoimme laskettu arvo yhdisteelle 7 (katso materiaalit ja menetelmät). Yhdiste 5 oli kaksi pKa-arvot 9,9 ja 4,2. Vain korkeampi pKa-arvo on selvitetty kuvassa 2, koska toinen on liian alhainen teoreettisesti edistää ioni ansastukseen lysosomeihin. Kollektiivisesti pKa-arvot kullekin johdannaisten vaihteli 5,8-12,4 (kuvio 2).

seitsemän johdannaisia, joilla on eri heikon emäksen muutoksia 17-asemaan GDA on esitetty. PKa-arvot johdannaisten 1, 2, 3, 5 ja 6 mitattiin kokeellisesti käyttäen protoni-NMR (n = 1). PKa yhdisteen 4 mitattiin kokeellisesti aiemmassa käsikirjoitus (katso tulokset). PKa yhdisteen 7 arvioitiin käyttämällä ohjelmistoa (katso materiaalit ja menetelmät). Sitoutumisaffiniteetti kunkin estäjien kanssa rHsp90 on esitetty (n = 2), ja se perustuu aiemmin määritettyihin fluoresenssin polarisaatio-määritys (katso materiaalit ja menetelmät).

asianmukaisesti testata vaikutuksen heikko emäs pKa valikoivuuteen, kaikki johdannaiset GDA tulisi säilyttää tietty kyky sitoutua Hsp90 ja toimivat inhibiittoreina. Tämän arvioimiseksi arvioimme sitoutumisaffiniteetti kunkin johdannaisten rekombinantti Hsp90 ja verrattiin sitoutumisaffiniteetti kanssa modifioimattoman GDA. Sitoutumisaffiniteetit arvioitiin käyttäen fluoresenssin polarisaation määritys, joka mittaa kyky testiyhdisteiden kilpailukykyisesti syrjäyttää FITC-konjugoitua GDA päässä Hsp90. Polarisaatio (mP) arvot muutettiin prosenttia kontrolli (ei lääkettä) ja piirrettiin konsentraation testiyhdisteiden, jolloin saatiin sigmoidal käyriä, joista IC

50-arvo määritettiin käyrän sovitus (kuva S2). K

i-arvot laskettiin IC

50-arvot, kuten aiemmin on kuvattu [28] käyttämällä online-laskin (vapaasti saatavilla https://sw16.im.med.umich.edu/software/calc_ki/). Laskettu IC

50 derivatisoimattomalla GDA oli 230 nM, joka on samanlainen kuin aiemmin raportoitu käyttämällä saatuja arvoja, tässä määrityksessä [29]. Vertailu Ki-arvot GDA ja sen johdannaiset viittaavat siihen, että ne kaikki säilyttää tietty kyky sitoutua Hsp90 ja ovat näin ollen sopivia arviointien tässä kuvatut (kuva 2).

arviointi solunsisäistä jakelua perustuva valikoivuus

määrällisesti ilmaista valikoivuus, me verrattain arvioitiin antiproliferatiivinen IC

50-arvot normaaleissa ja syöpäsoluissa, joissa oli alhainen ja kohonnut lysosomaalisen pH, vastaavasti. Näiden arviointien, käytimme HL60 ihmisen leukemiasolulinjan, jotka olemme aikaisemmin osoitettu kohonnut lysosomaalisen pH [22]. Ei-transformoitujen solujen, käytimme normaalia ihmisen esinahan fibroblasteja, joka oli aiemmin määritetty olevan lysosomaalisen pH 4,4 [22]. Sytotoksisuus käyrät ja IC

50-arvoja niistä on esitetty kuvassa S3. Jakamalla IC

50 määritettiin normaaleissa soluissa IC

50 syöpäsoluissa, saimme yleinen selektiivisyys (kuvio 3). Ei-lysosomotropic estäjä GDA oli kokonaisselektiivisyyden lähellä kahta, mikä osoittaa, että GDA oli lähes kaksi kertaa niin aktiivisia leukemiasolulinjan kuin se oli normaalit solut. Mielenkiintoista, heikosti emäksisiä estäjien kanssa pKa-arvot lähellä 8 oli moninkertaisesti suurempi aktiivisuus leukemiasolujen koholla lysosomaalisten pH verrattuna normaaleihin soluihin. Analogeja GDA joka oli pKa-arvot huomattavasti yli tai alle 8 ei ollut selvää kasvua selektiivisyys syöpäsoluissa verrattuna derivatisoimattomalla GDA. Kokonaisuutena vaikutus pKa valikoivuudesta yleensä saadaan kellomainen jakelu joka oli samanlainen kuin teoreettinen juoni korreloivat pKa kanssa lysosomotropism (kuva 1).

kokonaisselektiivisyyden edustaa IC

50 johdannainen normaaleissa ihmisen fibroblasteissa jaettuna saatu arvo HL60 ihmisen leukemiasoluja. Pylväät edustavat keskiarvoa ± S.D. (N = 3); *,

p

0,05 verrattuna GDA.

valikoivuus on monitekijäinen, ja mikä tahansa onnistunut syöpälääkkeen tulisi osoittaa suurempaa aktiivisuutta syöpäsolujen suhteessa normaaleihin soluihin mekanismien kautta, jotka eivät liity muutoksiin solunsisäisessä jakelu käyttäytyminen arvioidaan tässä käsikirjoitus [2], [3]. Jos haluat suoraan tutkia selektiivisyyttä voidaan nimenomaan katsoa muutoksiin solunsisäisessä jakelu käyttäytyminen normaalin ja transformoituja soluja, katsoimme välttämätöntä verrata antiproliferatiivista aktiivisuutta tietyn lääkkeen kahdessa solulinjoja, jotka ovat muuten samanlaiset, mutta on alhainen (normaali) ja kohonnut (syöpä kaltainen) lysosomaalisen pH. Tämä lähestymistapa olisi erittäin toivottavaa, koska kaikki solujen välisen vaihtelun tekijöitä, jotka voivat vaikuttaa lääkeaineen (esim ilmaus lääkevuoto- kuljettajat) olisi vähennettävä.

Vaikka monet syövän solulinjat on osoitettu olevan viallinen happamoitumista of lysosomeihin, huomasimme, että useat niistä säilyttää tavallisesti happamaksi lysosomeihin. Esimerkiksi, MDA-MB-231 rinnan adenokarsinoomasolulinja ylläpitää lysosomaalisen pH 4,2, on samanlainen kuin lysosomaalisen pH useimpien normaalien solujen [27]. Käyttämällä tätä solulinjaa, selvitimme siRNA lähestymistapa ohimenevästi nostaa lysosomaalisen pH. Lysosomien pH säätelee vakuolaarisen protoni ATPaasi (VH

+ – ATPaasi) [30], ja Lu ja työtoverit ovat aiemmin osoittaneet, että vähentämällä ilmaus alayksikön tämän entsyymin avulla siRNA, tuotti soluja, joilla on muuttunut V-ATPaasin protoni pumppaus toimintaa, jolla ei ole vaikutusta soluproliferaatioon [31]. Olemme käytetään samanlaista tekniikkaa luoda MDA-MB-231-soluja, joilla on kohonneet lysosomaalisen pH. Erityisesti olemme suunnattu V1E1 alayksikön V-ATPaasi varten Knockdown käyttämällä lentivirusvektorilla shRNA. Lentiviruksen-välitteinen siirto valittiin, koska tämä lähestymistapa mahdollistaa tehokkaan, suuren suoritustehon ja vakaa knockdown Kohdeproteiinien [30]. MDA-MB-231-solut, jotka oli käsitelty lentiviraalinen hiukkaset sisältävät ei-kohde (salattu) sekvenssi shRNA säilyttänyt alhainen lysosomaalisen pH ja toimi tärkeänä ohjaus mistään epäspesifisiä vaikutuksia lentiviruksen tartunnan solujen elinkykyä. Knockdovvn V1E1 ilmentymisen soluissa sai tavoite viruspartikkelien vahvistettiin Western-blot-analyysillä (kuvio 4A). Tärkeää on, pudotus on V1E1 alayksikön ei johtanut havaittavissa vaikutuksia solujen kasvuun yli ajan kuluessa IC

50 arvioinnit (kuvio 4B). Kokeellinen arviointi lysosomaalisen pH jälkeen kaatamalla V-H

+ – ATPaasi-alayksikköä osoitti, että lysosomaalisen pH oli merkittävästi kohonnut pH 4,4 arvoon 5,8 (kuvio 4A).

. Western blot analyysi V1E1 alayksikön ekspressio on esitetty yhdessä aktiini kuormituksen valvonta. Kokeellisesti määritetty lysosomaalisen pH-arvoja hoitamattomien, salattu shRNA- ja V1E1 shRNA käsiteltyjä soluja on esitetty (arvot edustavat keskiarvoa ± SD, n = 3) B. V-ATPaasi alayksikköä pudotus ei muuta kasvuvauhti MDA-MB 231 solua . Täytetyt ympyrät edustavat käsiteltyjä soluja salatun shRNA vektorin ja avoimet ympyrät edustavat käsiteltyjä soluja V-ATPaasin V1E1 shRNA. Solut maljattiin tiheydellä 3 x 10

5 solua /kuoppa on 6-kuoppalevylle ja trypsinoitiin, laskettiin ja maljattiin uudelleen 24 tunnin välein 3 päivän ajan (tietopisteet edustavat keskiarvoa ± SD, n = 3).

jälkikäteen arvio IC

50 Hsp90 estäjien molemmissa solutyypeissä (kuvio S4) ja laskettu selektiivisyys kuin IC

50 MDA-MB-231-solujen alhainen lysosomaalisen pH jaettuna IC

50 MDA-MB-231-solujen kohonnut lysosomaalisen pH. Yhdenmukainen odotuksia, aktiivisuus kuin lysosomotropic GDA ei vaikuttanut lysosomaalisen pH tilan solun ja näin ollen ole ilmeistä IDB valikoivuus (ts IDB selektiivisyydellä lähellä yhtä, katso kuva 5). Suuntaukset IDB selektiivisyys funktiona Hsp90-inhibiittorin pKa noudatti samanlaista kellon muotoinen profiili samoin kuin yleinen selektiivisyys tulokset esitetään kuviossa 3. Lisäksi, vertailuja suuruus IDB kanssa kokonaisselektiivisyyden viittaavat siihen, että IDB selektiivisyys on onnistuttu vähentämään merkittävästi tekijä yleistä selektiivisyyttä näiden aineiden.

IDB selektiivisyys määritellään IC

50 MD-MB-231-soluja käsiteltiin salattu shRNA, joilla on alhainen lysosomaalisen pH, jaettuna saatu arvo sama solulinja käsiteltiin shRNA vastaan ​​V1E1 alayksikköä vakuolaarisen protonin ATPaasi, joka on kohonnut lysosomaalisen pH. Pylväät edustavat keskiarvoa ± S.D. (N = 3); *,

p

0,05 verrattuna GDA.

Aiemmat tulokset ovat sopusoinnussa ajatus, että Hsp90-inhibiittorit optimaalisen lysosomotropic ominaisuudet (eli pKa-arvot lähellä 8) saavat omistaa suurimmassa määrin IDB selektiivisyyttä transformoituja soluja. Arvioida enempää, arvioimme IDB selektiivisyys muita luokkia syöpälääkkeiden, jotka eivät tai eivät omaa lysosomotropic ominaisuuksia.

Mitoksantronia ja daunorubisiini ovat heikosti emäksisiä syöpälääkkeiden, jotka ovat ydin- tavoitteita ja pKa-arvot lähellä 8 [32 ], jonka pitäisi edistää lysosomotropism ja IDB valikoivuus. Vaihtoehtoisesti antimetaboliittina 5-fluorourasiili on heikosti hapan, joiden pKa 8 [33], ja siten ei pidetä substraatti ioni ansastusta happamissa lysosomeihin. 5-fluoriurasiili on siis ei ole solunsisäistä jakelua tai aktiivisuus, joka vaikuttaa lysosomaalisen pH tilan solussa. Vastaavasti, syöpää ehkäisevät aineet, jotka ovat kahtaisionisia, sekä heikosti happamia ja heikosti emäksisiä ryhmiä, kuten klorambusiili [34], ei lysosomotropic eikä sen pitäisi esiintyä IDB selektiivisyys. Yhdenmukainen perustelumme, ei-lysosomotropic syöpälääkkeiden kanssa 5-fluorourasiili ja klorambusiili oli IDB selektiivisyys arvot ovat lähellä yhtä, joka on samanlainen GDA (kuvio 6). Vaihtoehtoisesti lysosomotropic aineet mitoksantroni ja daunorubisiinin molemmat osoittivat merkittäviä, mutta eri asteita IDB selektiivisyys (kuvio 6). Sytotoksisuus käyrät Arvioinneissa esitetään kuviossa S5.

Mitoksantronia ja daunorubisiini ovat heikosti emäksiseksi pKa-arvot lähellä 8 ja merkittäviä IDB selektiivisyys. Non-lysosomotropic syöpälääkkeiden 5-fluorourasiili ja klorambusiili on IDB selektiivisyysarvoja lähellä 1, joka osoittaa, että niiden toiminta ei vaikuta lysosomaalisen pH. Pylväät edustavat keskiarvoa ± S.D. (N = 3).

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa olemme ensimmäistä kertaa selvitetty systemaattisesti miten pKa heikosti emäksinen syöpälääkkeiden vaikutteita aste IDB selektiivisyyttä syöpäsolut koholla lysosomaalisen pH. Ehdotamme, että IDB lääke kohdistaminen alustan esittelee paradigman muutos lähestymistapaa suunniteltaessa uusia syöpälääkkeiden tiiviimmän ja optimoitu selektiivisyys kasvainsoluja kohtaan. Perinteinen SAR lähestymistapoja parantaa valikoivuus keskittyä pääasiassa lääkkeiden suunnitteluun enemmän tehoa vs. syöpäsoluja, joilla on vain vähän huomiota kiinnitetään lääkkeen aktiivisuutta normaaleissa soluissa. Useimmat lääkeannostelun lähestymistavat, jotka yrittävät lisätä valikoivuutta luottaa kasvainspesifisiä lääkkeen kertymisestä /toimitus, joka on osoittautunut varsin haastavaa ja vaikea saavuttaa. IDB lääke kohdistaminen Tässä kuvattu ratkaisu mahdollistaa sen, että lääke jakaa tasaisesti sekä tavallisia transformoidut solut; kuitenkin, lääke terapeuttinen indeksi on laajennettava määrätietoisesti suunnittelemalla lääke on epäsuotuisa solunsisäiseen -jakautusominaisuudet normaaleissa soluissa, mikä vähentää huumeiden vaikutusta näissä soluissa.

edellinen tutkimus oli osoittanut, että lysosomotropic molekyylit oli mitattavat IDB valikoivuus, mutta se jäi epäselväksi, onko aste lysosomotropism korreloi asteen IDB valikoivuus. Meidän hypoteesi johtaa tässä tutkimuksessa oli, että syöpälääkkeiden optimaalisen lysosomotropic ominaisuudet olisi optimaalista IDB selektiivisyys. Alussa käytetään ioni ansastusta periaatteet teoriassa luoda suhteita heikko emäs ominaisuuksien lääkkeiden, erityisesti läpäisevyys (alpha) ja pKa, ja lysosomaalisen sitomista (katso kuva 1). Nämä laskelmat paljastava ja ehdotti, että heikosti emäksinen molekyylejä, joilla on alhainen alfa ja pKa lähellä tai yläpuolella neutraalisuuden olisi optimaaliset lysosomotropic ominaisuuksia.

teoreettisten ennusteiden havainnollistavat, että alfa läpäisevyys parametri on tärkeä ennustaja lysosomaalisen sitomiseen; kuitenkin, se ei ole fyysinen parametri, joka voi olla järkevästi ja järjestelmällisesti muuttunut testata suhde lysosomotropism ja IDB selektiivisyys. Olemme aikaisemmin kokeellisesti arvioitu alpha mittaamalla oktanoli /vesi jakaantumiskertoimia funktiona pH: n ja totesi, että molekyylit joko yleensä on alfa parametreja lähellä nollaa tai lähellä yhtä [7]. Vaikka alfa voi vaihdella nollasta yhteen, meidän teoreettisten ennusteiden kävi ilmi, että suhteellisen pienet muutokset arvojen alfa lähellä nollaa ollut merkittävä vaikutus suhde heikon emäksen pKa ja suuruus lysosomaalisen sitomista (kuva 1). Tällä hetkellä on epäselvää, mitä rakenteellisia ominaisuuksia voisi olla vastuussa tällaisista pienet häiriöt alfa-parametrin (eli 0,01 versus 0,001).

Toisin kuin alfa-parametrin, pKa edustaa fysikaalinen ominaisuus, joka voidaan järkevästi muutettu testata suhde lysosomotropism ja selektiivisyys. Järjestelmällisesti tutkia vaikutuksen heikon emäksen pKa on IDB valikoivuus, syntetisoimme pieni kirjasto analogien GDA syntyy muuttamalla GDA 17-asemassa. Nämä GDA analogit erityisen hyvin tällaiseen hakemuksen, koska lukuisat analogit muodostettu synteettisestä muutoksia tässä asemassa on osoitettu säilyttävät kyvyn sitoutua ja estävät Hsp90 [25]. Lisäksi, GDA on sytosolin kohde, ja sen vuoksi, aktiivisuus GDA-analogien pitäisi olla herkkä muutoksille lysosomaalisen sitomiseen. Me syntetisoitiin heikosti emäksinen analogit GDA kanssa pKa-arvot vaihtelivat 5,8-12,4, ja havaitsimme, että ne kaikki näyttivät säilyttää tietty kyky sitoutua rHsp90 muuntamattomaksi GDA (kuva 2). On tärkeää huomata, että erot luontainen Hsp90 sitoutumisaffiniteetti kesken eri johdannaiset voi todellakin vaikuttaa suuruuteen kokeellisesti havaittu IC

50 arvoa yhdellä solulinjassa; kuitenkin, nämä erot eivät saisi teoriassa vaikuttaa meidän valikoivuus vertailut esitetään kuvioissa 3 ja 5. Tämä johtuu siitä, että raportti suhde IC

50-arvot yhden lääkeaineen soluissa matalalla tai kohonnut lysosomaalisissa pH, mikä factoring mitään eroja in luontaista aktiivisuutta, joka voi olla läsnä.

käyttö shRNA luoda variantit MDA-MB-231-solulinjoja, jotka erosivat lysosomaalisen pH on arvokas väline suoraan testata IDB valikoivuus. Meidän aiemmin julkaistu arviointeja, käytimme vertailevaa IC

50 arvioinnit kahdessa eri solulinjoissa alhainen tai kohonnut lysosomaalisen pH [12]. Lisäksi, käytimme farmakologinen modulaattori lysosomaalisen pH (ts ammoniumkloridi) saavuttaa lysosomaalisen pH korkeus. Molemmat lähestymistavat ovat rajoituksia, koska erot sytotoksisuus voitiin katsoa johtuvan eroista solulinjoja tai lisäämistä pH modifier eivätkä erityisesti eroja lysosomaalisen pH.

GDA analogi, jossa on mitattu pKa 8,1 havaittiin mahdollisimman suuren IDB valikoivuus. GDA analogien pKa-arvot selvästi yli tai alle 8 oli minimaaliset valikoivuus, joka on yhdenmukainen sen havainnon kanssa, että lysosomotropic potentiaali korreloi IDB valikoivuus. Kokonaisriskitason selektiivisyys GDA analogien, vertasimme suhde IC

50-arvot normaalien fibroblastien versus HL-60-leukemiasoluja, joiden on osoitettu olevan koholla lysosomaalisen pH [22]. On mielenkiintoista, että kehitys kokonaisselektiivisyyden GDA analogien oli samanlainen ulkonäkö ja suuruus kanssa IDB selektiivisyys tuloksia. Tämä havainto viittaa siihen, että IDB valikoivuus voi edustaa merkittävä tekijä kohti kokonaisselektiivisyyden.

edelleen arvioimista vaikutuksen lysosomotropism on IDB valikoivuus, me tutkittiin korrelaatio nykyisin käytössä olevien syöpälääkkeiden, jotka oli erilaisia ​​rakenteita, solunsisäinen tavoitteet ja vaikutusmekanismit kuin aiemmin arvioitiin Hsp90-inhibiittorit (kuvio 5). Yhdenmukainen hypoteesia, ei-lysosomotropic syöpälääkkeiden kanssa 5-fluorourasiili ja klorambusiili eivät osoittaneet merkittävää IDB selektiivisyyttä. Sen sijaan, heikosti emäksisiä syövän vastaisina aineina, joilla pKa-arvot lähellä 8 havaittiin olevan IDB selektiivisyys. Tarkemmin sanottuna heikosti emäksinen huumeiden mitoksantroni ja daunorubisiini, joiden pKa-arvot 8,1 ja 8,4, vastaavasti, molemmat todettu olevan merkittävää astetta IDB valikoivuus. On mielenkiintoista huomata, että daunorubisiini oli huomattavasti korkeampi IDB selektiivisyys kuin ei mitoksantronia. Tämä voi johtua siitä, että pKa daunorubisiinin on hieman korkeampi kuin pKa mitoksantronia ja että suhteellisen vähäisiä muutoksia pKa voi kääntää melko merkittäviä lisäyksiä IDB valikoivuus. On myös todennäköistä, että siellä voisi olla hieman vaihtelua alfa läpäisevyyden parametrin näille kahdelle yhdisteitä, jotka voivat aiheuttaa dramaattisia muutoksia lysosomotropism kuten teoreettisesti määritettiin (kuvio 1). Lisäksi näitä lääkkeitä, lukuisat muut kliinisesti hyväksytty syövän vastaiset aineet voidaan luokitella heikosti emäksinen molekyylejä. Tietääksemme, tällä hetkellä ei ole kliinistä näyttöä tukevat käsitystä, että heidän heikosti perusominaisuudet myötävaikuttaa niiden havaittiin selektiivisyyden.

On tärkeää korostaa, että IDB lääke kohdistaminen alustan kuvattu tässä ei yleisesti sovellettavissa kaikki syöpätyyppeihin. Ilmeinen edellytys onnistunut on, että syöpäsolut ovat lysosomaalisen happamoitumista vika. Me ja muut ovat osoittaneet, että monet eri syöpäsolutyyppien on viallinen lysosomaalisen pH [19] – [22]; kuitenkin, kuten on kuvattu tässä käsikirjoitus, joitakin syöpäsoluja, kuten MBA-MB-231-solulinja, on lysosomaalisen pH-arvot, jotka ovat samanlaisia ​​kuin normaaleissa soluissa.