Krooninen sairaus

tiivistelmä

Vaikka lisääntynyt oksidatiivinen stressi ja hypometylaatio pitkä välissä ydin- elementti-1 (LINE-1) associate virtsarakon syöpä (BCA) kehittäminen, suhde näiden muutosten ei tunneta. Arvioimme oksidatiivisen stressin ja hypometylaatio LINE-1 61 BCA potilailla ja 45 terveillä henkilöillä. Mitata metylaatiotasoilla ja erottamaan LINE-1-loki hypermetyloitunut, osittain metyloidut ja hypometyloidut, ääreisverenkierron solujen, virtsan paisutettu soluja ja syöpä- kudoksia arvioitiin yhdistettiin bisulfiitti restriktioanalyysillä PCR. Virtsan yhteensä Antioksidanttistatuksen (TAS) ja plasman proteiineihin karbonyyli pitoisuus määritettiin. LINE-1 metylaatiotasoilla ja kuvioita, etenkin hypometyloidut loci, veressä ja virtsassa solujen BCA potilaat olivat erilaiset tasot ja kuviot terveillä verrokeilla. Virtsan TAS aleni, kun taas plasman proteiineihin karbonyyli pitoisuus nostettiin BCA potilailla kontrolleihin verrattuna. Positiivinen korrelaatio metylointi LINE-1 verestä peräisin DNA: ta ja virtsan TAS havaittiin sekä BCA ja kontrolliryhmiin. Virtsan hypometyloidut LINE-1 loci ja plasman proteiineihin karbonyyli tarjoamaa sisältöä parhaiten diagnostiset mahdollisuudet BCA ennustamiseen. Perustuen jälkeistä diagnostisia näytteitä, yhdistelmä testin paransi diagnostinen valta herkkyys on 96% ja spesifisyys 96%. Lopuksi vähentynyt LINE-1 metylaatio liittyy lisääntynyt oksidatiivista stressiä sekä terveillä ja BCA koehenkilöillä poikki eri kudosten tyyppejä, mikä annos-vaste -alueella. Kohonneita LINE-1 hypometylaatio tasoa ja lukumäärää hypometyloidut lokusten sekä veren- ja virtsan peräisin olevien solujen ja lisääntyminen oksidatiivisen stressin löytyivät BCA potilailla. Yhdistelmä testi virtsan hypometyloidut LINE-1 loci ja plasman proteiineihin karbonyyli pitoisuus voi olla hyödyllinen BCA seulontaan ja hoidon seurantaa.

Citation: Patchsung M, Boonla C, Amnattrakul P, Dissayabutra T, Mutirangura , Tosukhowong P (2012) Long välissä Nuclear Element-1 hypometylaatio ja Oksidatiivinen stressi: Korrelaatio ja Virtsarakon syövän Diagnostic Potential. PLoS ONE 7 (5): e37009. doi: 10,1371 /journal.pone.0037009

Editor: Kin Mang Lau, Kiinan University of Hong Kong, Hongkong

vastaanotettu: 13 joulukuu 2011; Hyväksytty: 11 huhtikuu 2012; Julkaistu: May 15, 2012

Copyright: © 2012 Patchsung et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Ratchadapisake Sompote Fund, Chulalongkorn University (PT), jonka biokemian ja molekyylibiologian sekä aineenvaihduntasairaudet tutkimusyksikkö ja Higher Education Research Promotion ja National Research University Project Thaimaan Office of Higher Education komission ja Ratchadaphiseksomphot Endowment Fund (HR 1162A). AM tukee Research Chair Grant 2011, National Science and Technology Development Agency (NSTDA), Thaimaa, ja Four Seasons Hotel Bangkokin 4th Cancer Care hyväntekeväisyyteen hauskaa ajaa koordinoidusti Thaimaan Punaisen Ristin ja Center of Excellence in Molecular Genetics of Cancer ja ihmisen sairauksia, Chulalongkorn University. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Karsinogeneesi virtsarakon on monimutkaista, koska sekä geneettisiä muutoksia ja epigeneettiset muutokset tärkeässä roolissa. Lisäksi tulehdusta ja oksidatiivista stressiä kriittisesti edistää kehitystä virtsarakon syöpä (BCA) [1] – [3]. Eri linjat todisteita ilmoittaa lisääntynyt oksidatiivinen stressi potilailla, joilla on BCA [3] – [6]. Oksidatiivista stressiä on edellytys liiallisen reaktiivisten happiradikaalien (ROS) ja /tai vähenemiseen antioksidantteja. ROS suoraan vahingoittaa solun DNA ja edistää kasvainten kehittymiseen ei vain geneettisiä mutaatioita mutta myös epigeneettiset muutokset [7]. Yhteiset epigeneettiset muutokset ihmisen syövistä ovat maailmanlaajuisia hypometylaatio ja alueellisten (site-specific CpG-saarekkeen promoottori) hypermetylaatiota tuumorisuppressorigeeneille [8], [9]. Hypometylaatio syöpä genomin esiintyy toistuvia sekvenssejä ja retrotransposable elementit [10], mikä nopeuttaa genomin epästabiilisuuden [10] – [13] ja muuttaa geenin ilmentymistä [14]. Parhaiten karakterisoitu ja runsaimmin retrotransposoni nisäkkään genomissa on pitkän välissä ydin- elementin-1 (LINE-1 tai L1), ja tiedetään, että LINE-1 hypometylaatio liittyy monia pahanlaatuisia kasvaimia [15], [16].

urothelial syövän hypometylaatio LINE-1 oli ensimmäinen osoitettiin urothelial solulinjoissa ja kasvain kudosten Schulz ja työtovereiden perustuu kokeet, joissa käytetään metylaatioherkät restriktioentsyymien (

Hpa

II /

Msp

I) ja Southern blotting [17], [18]. LINE-1 hypometylaatio vastasivat hyvin lisäämistä LINE-1-transkriptien ja lasku sisältävä geeni LINE-1 mRNA [14]. Myöhemmin, ryhmämme palveluksessa yhdistetty bisulfiitin restriktioanalyysi (COBRA) PCR osoittaa LINE-1 hypometylaatio eri karsinoomat kudoksissa, kuten virtsarakon syöpä [15]. Choi et ai. käytetty bisulfiitti-PCR pyrosekvensointi ja osoittivat selvää hypometylaatio LINE-1 virtsarakon tuumorikudoksissa suhteessa viereiseen normaaleissa kudoksissa [19]. Vähentäminen 5-metyylisytosiinin tasoa leukosyyttien DNA osoitettiin in Spanish virtsarakon syöpä suhteessa verrokkeihin [20]. Äskettäin hypometylaatio LINE-1 ääreisverisoluissa liittyi suurentunut virtsarakon syövän, erityisesti naisilla [21]. Joukossa nonsmoking kiinalainen, samanlainen tulos, että LINE-1 hypometylaatio lymfosyyteissä liittyi lisääntynyt riski virtsarakon syöpään osoitettiin [22]. Aiemmin metylointi LINE-1 virtsan kuorinnan soluissa ja sen vaikutuksia virtsarakon syöpä ei ole tutkittu. Vaikka LINE-1 hypometylaatio ja lisääntynyt oksidatiivinen stressi ovat hyvin tunnustettu BCA potilailla, yhdistys näiden kahden ilmiön ei ole tutkittu.

Toistaiseksi yleisimmin käytetty tekniikoita mittaamiseen LINE-1 metylointi tasolla pyrosekvensointi ja COBRA PCR. Nämä kaksi menetelmää oli on samanlainen teho havaitsemiseen metylaatiotasoilla ja on rajoitettu virhemarginaali [23]. Pyrosekvensointi LINE-1 havaitsee muutaman CpG dinukleotideissä, yleensä kolme CpG: t, [24] kuin COBRA PCR tunnistaa (yleensä kaksi CpG: t). Kuitenkin LINE-1 metylointi kunkin lokuksen ei ole homogeeninen [23], [25], jotka voivat vaikuttaa ilmaisun ja vakauden genomin cis [16]. Näin ollen LINE-1 metylaatiotasoilla eivät tarkasti edustaa biologinen roolit epigenomic muutos [16]. Parantaakseen LINE-1 metylaatio arviointi, lisäksi yleisen metylaatio tasolle, käytimme COBRA PCR LINE-1 luokittelemaan genominlaajuisia LINE-1 lokusten neljään ryhmään,

mC

mC (hypermetyloitunut),

UC

UC (hypometyloidut),

mC

UC ja

UC

mC (osittainen metyloitu), ja lasketaan prosenttiosuudet kunkin ryhmän (Fig. 1) [26]. Huomattavaa on, että tietyt LINE-1 metylointi määrityksissä on positiivinen metylointi kontrolli pohja, joka voidaan käyttää määrittämään tehoa bisulfiittikäsittelyn.

V: havaitaan 5’UTR LINE-1-sekvenssi sisältää kaksi CpG dinukleotidi loci, ja PCR-amplikonin koko LINE-1 on 160 emäsparia. B: On 4 mahdollisia metylaation LINE-1 sekvenssi (yksi solu sisältää kaksi alleelia). Kiinteä tähdet edustavat metyloidut sytosiinit ja ontto tähdet edustavat metyloimaton sytosiineja. C: COBRA LINE-1 erotti havaitsemaan alueen neljään tuotteet:

mC

mC,

UC

UC,

mC

UC ja

UC

mC. D: Kun bisulfiitti Hoidon unmethylatated sytosiinitähteiden muunnetaan urasiili, mutta metyloituja sytosiinitähteiden eivät muutu. Tämä johtaa säilyminen tai menetys CpG sisältävien restriktioentsyymikohtia, vastaavasti. E: PCR-tuotteet digestoidaan Taql (tunnistussekvenssi: TCGA) ja Tasi (tunnistussekvenssi: AATT) restriktioentsyymeillä. TagI positiivinen Digest tuottaa kaksi 80-emäsparin DNA-fragmentit, kun taas Tasi positiivinen Digest saadaan 62- ja 98-emäsparin fragmentti. F: edustaja geeli kuvan COBRA LINE-1 määrityksessä. Kaistat 1-2: DNA: t BCA potilaista kaistat 3-5: DNA: t terveiden verrokkien, Kaista 6: DNA HeLa-soluista positiivisena kontrollina ja normalisoi näyte, Kaista 7: negatiivinen (N) kontrolli, Lane 8: 25 bp markkereita.

arvioimiseksi yhdistyksen välillä oksidatiivisen stressin ja LINE-1 hypometylaatio, päätimme metylaatiotasot LINE-1 veressä ja virtsassa saadut solut BCA potilaiden ja terveiden yksilöiden välillä. Oksidatiivista stressiä, joka on merkitty virtsan kokonaismäärä antioksidanttien (TAS) ja plasman proteiineihin karbonyyli sisältöä, verrattiin kahden ryhmän välillä. Yhdistys LINE-1 metylaatiotasoilla kanssa oksidatiivisen stressin tila arvioitiin, ja hyödyllisyys LINE-1 hypometylaatio havaitseminen virtsan kuorinnan solut ja koko oksidatiivisen stressin markkereina BCA diagnoosia arvioitiin.

materiaalit ja menetelmät

Osallistujat

Kuusikymmentä potilasta BCA jotka otettiin kuningas Chulalongkorn Memorial Hospital, Bangkok välillä 2009 ja 2010 rekrytoitiin tutkimukseen. Kaikilla potilailla oli histologinen osoitus pinnallinen siirtymäkauden cell carcinoma. Jokainen BCA potilaista, jotka esitetään lihas invasiivisia fenotyyppi jätettiin pois tästä tutkimuksesta. Iän ja sukupuolen Hyväksytty terveiden yksilöiden (n = 45) käytettiin kontrolleina. Kontrollit valittiin jäsenten terveiden iäkkäiden yhteisöä Lumpini Park, Bangkok, mistä ne tulivat jokapäiväiseen tehdä harjoituksen. Terveydentilassa varmistettiin suoralla haastattelu ja niiden vuosittainen lääkärintarkastuksen sen varmistamiseksi, ettei ollut virtsatiet ja mahdolliset syöpäsairauksia. Kaikki koehenkilöt vapaaehtoisesti osallistui tutkimukseen. Tutkimuksen protokolla tarkasteli ja hyväksynyt eettinen komitea lääketieteellisen tiedekunnan, Chulalongkorn University, Bangkok, Thaimaa. Kirjallinen suostumukset saatiin kaikille osallistujille.

Näytteenotto ja DNA: n eristämiseksi

Heparinisoitua verta ja keskivaiheessa spot aamuvirtsasta (08:00-12:00) kerättiin kaikki osallistujat . Verinäytteet sentrifugoitiin kerätä plasma ja buffy coat. Plasman näytteitä pidettiin -80 ° C: ssa, kunnes testaus. Valkosolukerros Näytteet välittömästi altistetaan DNA uutto. Eristämiseksi virtsan kuorinnan soluja, 50 ml virtsanäytteiden sentrifugoitiin 4000 rpm: llä 20 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Solupelletti kerättiin ja säilytettiin RNA stabilointiaine (QIAGEN, Saksa) -80 ° C: ssa analyysiin asti. Niistä 61 BCA potilaista, 14 oli saatavilla syöpäkudokset, joka saatiin toiminnan aikana höyläysleikkaus, tallennetaan välittömästi RNA stabilointiainetta ja pidettiin -80 ° C: ssa LINE-1 mittausta. Alhaisen määrän tumalliset solut virtsoissa, erityisesti terveillä virtsoissa, DNA: t virtsan paisutettu solut onnistuneesti uutetaan 30 BCA potilaista ja 14 tervettä verrokkia. DNA eristettiin ääreisverenkierron buffy coats, virtsan paisutettu soluja ja syöpä- kudoksiin käyttämällä korkean Pure PCR Template valmistelu Kit (Roche Diagnostics, Indianapolis, USA). Epätäydellisen näytteenotosta pidettiin heikkoutena tutkimuksessa. Vuonna BCA ryhmässä, veren, virtsan paisutettu soluja ja syöpä- kudoksia osuus oli 61 (100%), 30 (49,18%) ja 14 (22,95%), tässä järjestyksessä. Neljätoista BCA potilasta (22,95%) oli kaikenlaisia ​​yksilöitä analysoitavaksi. Terveillä kontrolliryhmään, 45 (100%) veri ja 14 (31.11%) virtsaan paisutettu solut analysoitiin. Neljätoista verrokeilla (31,11%) oli kumpaankin näytteeseen analyysia varten. Valta havaita korrelaatio havaittiin n = 14 laskettiin käyttäen G * Virta 3.1.3 ohjelmistojen [27], ja lähtö näkyy valtaa 0,66 (tulot: kaksi-hännät, vaikutus size = 0,56, α = 0,05 , yhteensä otoskoko = 14).

LINE-1 metylaation COBRA PCR

lyhyesti, genomiset DNA: t (250 ng) verestä, virtsasta ja syöpä- kudosnäytteet käsiteltiin natriumbisulfiitin kuten aiemmin on kuvattu [15]. Vetysulfiitilla käsiteltyä DNA alistettiin 35 PCR-sykliä, jossa LINE-1-F (5′-CCGT AAG GGGTTAGGGAGTTTTT-3 ’) ja LINE-1-R (5′-RTAAAACCCTCCRAACCAAAT ATAAA-3’) alukkeina jolloin pariutumislämpötila 50 ° C, jolloin syntyi 160 bp: n PCR-amplikonit. Amplikoneista olivat edelleen pilkottiin

Taq

I (2 U) (tahmea pää) ja

Tas

I (2 U) (tahmea pää) in NEB3 puskurissa (MBI Fermentas, Glen Burnie, MD ) 65 ° C: ssa yön yli. Pilkontatuotteet elektroforeesi 8% denaturoivassa polyakryyliamidigeelissä ja sen jälkeen värjättiin SYBR vihreä. Koe suoritettiin kahtena.

voimakkuudet COBRA LINE-1 fragmenttien polyakryyliamidigeelisuodatuskantajan kvantifioitiin käyttäen phosphoimager ja ImageQuant Software (Molecular Dynamics, GE Healthcare, Slough, UK). Kuten havaitaan COBRA, metylaatiostatus 2 CpG dinukleotidit LINE-1 lokusten luokiteltiin neljään ryhmään seuraavasti: (1) LINE-1 loci sisältää 2 metyloitumattomia CpG: t (

UC

UC); (2) LINE-1 loci sisältää 2 metyloitu CpG: t (

mC

mC); (3) LINE-1 loci sisältävä 5′-metyloitu ja 3′-metyloimatonta CpG: t (

mC

UC); ja (4) LINE-1 loci sisältävä 5′-metyloimattomia ja 3′-metyloitu CpG: t (

UC

mC). Yksityiskohdat bändi intensiteetti kvantitoimiseksi oli täysin kuvattu muualla [28]. Lyhyesti, neljä bändejä, jotka erosivat toisistaan ​​valtioiden metylaation, kuten 98 emäsparin (

UC

UC), 160 (

mC

UC), 80 (

MC) ja 62 (

UC) emäsparin, kvantitoitiin (kuvio. 1). Intensiteetti kunkin kaistan jaettiin sen pariksi pitkä kuin sen jälkeen: 160 bp /160 (A), 98 bp: n /94 (B), 80 bp: n /79 (C) ja 62 bp: n /62 (D). LINE-1 metylointi tason (yleinen tai koko) laskettiin prosenttia metyloitu bändejä (

mC) intensiteetti jaettuna summa

mC ja metyloitumattomat bändejä (

UC) intensiteetit, (C + A) /(C + A + A + B + D) x 100. Prosenttiosuus

UC

UC (hypometyloidut loci) laskettiin seuranneet yhtälöstä: B /(((C-D + B) /2) + A + D) x 100. Olevaa

mC

UC (osittain metyloitu loci) laskettiin yhtälöstä: A /(((C-D + B) /2) + A + D) x 100. Olevaa

mC

mC (hypermetyloitunut loci) laskettiin yhtälöstä: ((C-D + B) /2) /(((C-D + B) /2) + D + A) x 100 . CV LINE-1 metylaatiotasoilla veren, virtsan paisutettu soluja ja syöpä- kudoksiin DNA: t olivat 7,31% (alue: 2,33-12,91%), 7,64% (alue: 2,50-13,17%) ja 8,00% (alue: 3,56-10,54 %), vastaavasti. DNA HeLa-soluista käytettiin kontrollina normalisoida määritysten välinen metylaatio vaihtelu kaikkien kokeiden (Fig. 1 F). Prosenttiosuus LINE-1 metylointi havaittu HeLa-DNA: t oli 28,59%, ja tätä arvoa käytettiin normalisointi välillä kulkee. Keskiarvoa LINE-1 metylointi HeLa-DNA: t oli 27,74 ± 2,33%, ja välillä ylläpitämä CV oli 8,41%.

Yhteensä Antioksidanttistatuksen (TAS) B

2, 2-difenyyli -1-pikryyli-hydrazyl (DPPH) vähentäminen analyysi suoritettiin määrittämään TAS virtsanäytteistä. Lyhyesti, virtsanäyte (20 ui) lisättiin 400 ul: aan 10 mM fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS, pH 7,4) ja 400 ui juuri valmistettua 0,1 mM DPPH metanolissa. Reaktio putkia inkuboitiin huoneen lämpötilassa 20 minuutin ajan pimeässä. Optinen tiheys (OD) 520 nm: ssä mitattiin. Antioksidantti kapasiteetti näytteessä laskettiin perustuen% inhibitioon DPPH radikaalien käyttäen seuraavaa yhtälöä:% inhibitio = (OD

tyhjä-OD

näyte /OD

tyhjä) x 100. L-askorbiinihappo (C-vitamiini) käytettiin pitoisuuksina 0,25, 0,5 ja 1 mM tuottaa standardikäyrän (% estäminen verrattuna pitoisuus). TAS-arvo virtsanäytteen ilmaistiin C-vitamiinia vastaa antioksidantteja (VCEAC mM). Kaikki kokeet tehtiin kahtena kappaleena. CV virtsasta TAS määritys oli 7,81% (alue: 1,02-14,59%).

Protein karbonyyli määritys

proteiini karbonyylipitoisuus käytettiin indikaattorina proteiinin hapettumisen ROS plasmassa. Plasma-näyte laimennettiin (1:20) PBS: llä (10 mM, pH 7,4) ja sentrifugoitiin sitten 10000 rpm: ssä 10 min. Plasman supernatantti (250 ui) lisättiin 1 ml: aan 10 mM 2,4-dinitrofenyylihydratsiinia (DNPH) 2 N HCI: a. Reagenssia varten sokeakoe, 1 ml 2 N HCI: a, lisättiin 250 ui plasmaa supernatantista. Seoksia inkuboitiin huoneen lämpötilassa pimeässä 45 minuutin ajan ja vorteksoitiin 10 minuutin välein. Sitten 1,2 ml 20% kylmää trikloorietikkahappoa lisättiin ja inkuboitiin 10 minuuttia jäillä; tätä seurasi sentrifugointi 3000 rpm 15 minuutin ajan kerätä proteiinin pellettejä. Pelletit pestiin kolme kertaa 2,5 ml: ssa etanolia /etyyliasetaattia (01:01, v /v) kunkin poistamaan ei-reagoinut DNPH. Pesty pellettejä, jotka sisältävät 2,4-dinitrofenyylihydratsoni suspendoitiin uudelleen 6 M guanidiinihydrokloridia /0,5 M yksiemäksistä kaliumfosfaattia, pH 2,5, 37 ° C: ssa 15 min vorteksoimalla. Absorbanssi 375 nm: ssä mitattiin käyttäen vastaavaa reagenssinolla varten nollaanasettelulaite. Ekstinktiokerroin varten 2,4-dinitrofenyylihydratsoni 375 nm on 22000 M

-1 cm

-1 ja proteiini karbonyyli konsentraatio (nmol /ml) laskettiin absorbanssista x 45,45 [29]. Pitoisuus proteiinin karbonyyli plasman ilmaistiin mg: aa kohti kokonais-proteiinien (mitattuna väriaine sitova menetelmä). CV määrittämisessä plasman proteiineihin karbonyyli pitoisuus oli 8,43% (alue: 2,72-13,80%).

Tilastollinen

data normaalijakaumaa esitettiin keskiarvo ± keskihajonta, ja datan vinossa jakeluun esitettiin mediaani (kvartiiliväli, IQR). Välisessä vertailussa kahden itsenäisen ryhmien riippumattoman näyte

t

-testi käytettiin normaalisti jakautunut datan, ja Mann-Whitneyn testiä käytettiin vinossa tietoja. Pearsonin korrelaatio testiä käytettiin arvioimaan korrelaatio jatkuvia muuttujia. Vastaanotin toimii (ROC) analyysi suoritettiin testaamaan kykyä COBRA LINE-1 metylointi testi erottamaan BCA aiheita terveillä koehenkilöillä. Alue ROC-käyrän alla (AUC) 1,0 osoittaa täydellistä tarkkuutta, kun taas AUC 0,5 ilmaisee, että testi ei ole erottelukykyä. Sulku arvo valittiin laskemaan diagnostisia arvoja. SPSS versio 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL) ja STATA versio 8.0 (StataCorp, College Station, Texas) käytettiin kaikissa laskelmissa. AP arvo 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

BCA potilailla (n = 61) olivat välillä 42 ja 89-vuotiaiden (65,11 ± 12,16 vuotta) ja koostui 52 (85.25 %) miehistä ja 9 (14,75%) naisilla. Kontrolliryhmässä oli 45 terveillä henkilöillä välillä 46 ja 81-vuotiaita (61,00 ± 13,25 vuotta); Tässä ryhmässä oli 37 (82,22%) miehillä ja 8 (17.78%) naisilla. Mean painoindeksi (BMI) potilaan ja kontrolliryhmien olivat 22,24 ± 3,71 ja 23,15 ± 2,45 (kg /m

2), tässä järjestyksessä. Sukupuoli jakelu, ikä ja painoindeksi kahden ryhmän välillä eivät olleet merkittävästi erilaiset.

Metylointi taso LINE-1 mitattiin DNA peräisin ääreisveren, virtsan paisutettu soluja ja syöpä- kudoksiin. Prosenttiosuus LINE-1 metylaatio perifeerisen veren solujen BCA potilailla oli merkitsevästi pienempi kuin terveillä verrokeilla (P = 0,001) (Fig. 2A). Samoin LINE-1 metylaatiotasoilla virtsan kuorinnan solut BCA potilailla olivat merkittävästi alhaisemmat kuin terveillä verrokeilla (P = 0,044) (Fig. 2B). LINE-1 metylaatiotasoilla että BCA syöpäkudokset olivat merkittävästi alhaisemmat kuin virtsan kuorinnan solut BCA (P = 0,038) ja terveet (P = 0,001) potilailla (Fig. 2B). Prosenttiosuus

UC

UC lokusten perifeerisen veren soluja ja virtsan kuorinnan solujen BCA potilailla oli merkittävästi suurempi kuin kontrolleilla (P = 0,013 ja 0,001, vastaavasti) (Fig. 2C ja 2D). Määrä

mC

UC loci päässä virtsan kuorinnan solujen BCA potilaista oli merkittävästi pienempi kuin hallintalaitteiden (P = 0,006), mutta tasot

mC

UC lokusten vuonna ääreisverisoluissa päässä BCA ja terve ryhmät eivät olleet erilaisia ​​(P = 0,133) (Kuva S1). Nämä tiedot vahvistivat läsnäolon LINE-1 hypometylaatio virtsarakon syöpään ja osoittivat samanlaisia ​​tuloksia kuin aikaisemmin raportoitu suun syöpä [26], jotka osoittivat spesifisyyttä

UC

UC loci syöpään DNA.

V: prosenttiosuus LINE-1 metylaatiotasoilla perifeerisessä veressä DNA BCA potilaista (n = 61) oli merkittävästi pienempi kuin pois terveiden verrokkien (n = 45). B: LINE-1 metylaatiotasoilla DNA peräisin virtsan kuorinnan solujen BCA potilaista (n = 30) oli merkittävästi vähentynyt verrattuna samat kuin terveillä kontrolleilla (n = 14). LINE-1 metylaatiotasoilla vuonna syöpäkudokset (n = 14) olivat huomattavasti alhaisemmat kuin LINE-1 metylaatiotasoilla virtsateiden kuorinnan solut molemmista BCA ja terveillä koehenkilöillä. C: Tällä

UC

UC pitoisuuksia ääreisverenkierron DNA BCA potilaat olivat huomattavasti korkeammat kuin terveillä verrokeilla. D: Tällä

UC

UC tasoilla virtsan kuorinnan solut BCA potilaista merkittävästi lisääntynyt verrattuna niillä, terveiden verrokkien. Syöpäkudoksen

UC

UC tasot eivät olleet merkittävästi erilaisia ​​kuin

UC

UC tasoilla BCA virtsan kuorinnan solujen (P = 0,721), mutta ne olivat huomattavasti korkeammat kuin virtsan kuorinnan solujen tervettä verrokkia.

määrityksiä virtsan TAS ja plasman proteiineihin karbonyylipitoisuus tehtiin sekä terveillä ja BCA ryhmiä. Merkittävä väheneminen virtsan TAS tasolla BCA potilaiden suhteen terveillä verrokeilla havaittu (P 0,001) (Kuva. 3A). Plasman proteiineihin karbonyyli pitoisuus BCA potilailla oli merkitsevästi korkeampi kuin terveillä verrokeilla (P 0,001) (Kuva. 3B). Meidän Tulokset osoittivat lisääntymiseen oksidatiivista stressiä BCA potilailla.

V: taso virtsan TAS vuonna BCA potilailla oli merkittävästi pienempi kuin terveillä verrokeilla. B: taso plasman proteiineihin karbonyyli pitoisuus BCA potilailla oli merkitsevästi suurempi kuin alkaen terveillä verrokeilla.

BCA potilailla, löysimme vahvan positiivisen ja lineaarinen korrelaatio virtsan TAS ja LINE-1 metylointi verenkierrossa verisolujen (regressio kerroin = 8,017) (r = 0,618, P 0,001) (Kuva. 4A). Lisäksi on olemassa merkittävä positiivinen korrelaatio virtsan TAS ja syöpäkudoksen LINE-1 metylaatiotasoilla havaittiin (regressio kerroin = 5,519) (r = 0,567, P = 0,034) (Kuva. 4B). Kiinnostavaa kyllä, löysimme myös positiivinen korrelaatio virtsan TAS ja taso LINE-1 metylaatio ääreisverisoluissa terveiden yksilöiden (regressio kerroin = 8,937) (r = 0,469, P = 0,001) (Kuva. 4C). Korrelaatiot virtsan TAS ja muut kuviot LINE-1 metylointi (

mC

mC,

UC

UC,

UC

mC ja

mC

UC ) arvioitiin (kuvio S2). Merkittävä käänteinen väliset korrelaatiot virtsan TAS ja

UC

UC tasot BCA perifeerisen veren soluja (r = -0,440, p = 0,001), BCA syöpäkudoksiin (r = -0,440, p = 0,001), ja perifeerisen veren solut terveiden kontrollien (r = -0,315, p = 0,035), havaittiin.

V: virtsan TAS korreloi lineaarisesti LINE-1 metylaatiotasoilla perifeerisessä veressä solujen BCA: lla potilaista. B: Virtsan TAS korreloi lineaarisesti LINE-1 metylaatiotasoilla on syöpäkudoksen saatu BCA potilaista. C: Kun terve ryhmässä virtsan TAS myös korreloi lineaarisesti LINE-1 metylaatiotasoilla perifeerisessä verisoluja. b: regressio kerroin, r: Pearsonin korrelaatiokerrointa. Näytetty P-arvot ovat peräisin Pearsonin korrelaatio testi.

Käyttämällä yksisuuntainen ANOVA testi, merkittäviä eroja LINE-1 metylaatiotasoilla veressä, virtsassa ja syöpäkudoksen DNA: t ei havaittu joukossa BCA potilailla, joilla on eri tupakoinnista (tupakoimattomilla, tupakoivat ja quitted tupakoitsijoiden) (P = 0,477, 0,711 ja 0,964, tässä järjestyksessä). Samoin tasot virtsan TAS ja plasman proteiineihin karbonyylipitoisuus kesken eri tupakoimistilan eivät olleet merkittävästi erilaiset (P = 0,053 ja 0,093, tässä järjestyksessä). Virtsan TAS (P = 0,055 terveitä, P = 0,879 BCA) ja plasman proteiineihin karbonyyli (P = 0,634 terveitä, P = 0,072 BCA) eivät olleet merkittävästi erilaiset miesten ja naisten välillä sekä terveillä ja BCA ryhmiä. Kuitenkin positiivinen korrelaatio virtsan TAS ja ikä terveissä ryhmässä (r = 0,374, P = 0,011) ja negatiivinen korrelaatio plasman proteiineihin karbonyylipitoisuus ja BMI BCA ryhmässä (r = -0,261, p = 0,044) paljastui.

ROC analyysi tehtiin arvioida, kuinka hyvin määrittäminen LINE-1 metylaatio voi syrjiä BCA potilaiden ja terveiden yksilöiden. Eri malleja LINE-1 metylaation, olevaa

UC

UC tasolla virtsan kuorinnan solut oli suurin diagnostinen arvo on korkein AUC 0,848 (95% CI: 0,719-0,977) (taulukko 1 ja kuva . 5A). Tällä 38.43% sulku, herkkyys, spesifisyys ja tarkkuus virtsan

UC

UC määritys oli 80.00%, 85.00% ja 81.82%, tässä järjestyksessä. AUC-arvot% metylaation sekä veren (0,684), ja virtsaan (0,691) solut olivat pienempiä kuin virtsan

UC

UC (kuva S3). Siten määritys

UC

UC virtsateiden kuorinnan solut tarjotaan korkein diagnostinen potentiaali suhteessa muihin metylaation.

V:%

UC

UC vuonna virtsan kuorinnan soluja. B: Virtsan TAS. C: plasman proteiineihin karbonyyli sisältöä. Määrittäminen

UC

UC virtsateiden kuorinnan solut oli suurin AUC, mikä viittaa korkeimman diagnostinen potentiaali.

ROC käyrät virtsan TAS ja plasman proteiineihin karbonyylipitoisuus myös syntyy. Virtsan TAS oli AUC 0,800 (95% CI: 0,711-0,888) ja oli herkkyys, spesifisyys ja tarkkuus 88,52%, 60,00%, ja 76,42%, vastaavasti, sulku 1,32 VCEAC mM (taulukko 1 ja kuva. 5B). AUC-arvo plasmassa proteiinien karbonyyli pitoisuus oli 0,819 (95% CI: 0,733-0,905), ja sen herkkyys, spesifisyys ja tarkkuus kello sulku 0,44 nmol /mg proteiinia, oli 81,97%, 73,33% ja 78,30%, (taulukko 1 ja kuva. 5C).

arvioidaan edelleen, onko yhdistelmä

UC

UC virtsateiden kuorinnan soluja ja plasman proteiineihin karbonyylipitoisuus parantaisi diagnostisia mahdollisuuksia BCA. Testi kriteerit paljasti, että kaksi positiivista tulokset osoittivat suurempi spesifisyys (96.00% kanssa herkkyys 65,58%) ja suurempi herkkyys (96,39% kanssa spesifisyys 62,33%), kun ainakin yksi merkki oli positiivinen (Fig. 6).

lisääntynyt herkkyys (96,39%) saavutettiin, kun joko%

UC

UC virtsan paisutettu soluissa tai plasman proteiineihin karbonyyli pitoisuus oli positiivinen. Lisäksi lisääntynyt spesifisyys (96.00%) kokeen saavutettiin, kun vähintään yksi kummankin merkkiaineiden oli positiivinen.

Keskustelu

Menetys DNA metylaatio LINE-1 elementit on ehdotettu olevan kardinaali tapahtuma syövän kehittymisessä, koska se edistää genomin epästabiilisuuden ja muuttaa geenin ilmentymistä [12] – [16]. Mekanismi, joka aiheuttaa tämän menetyksen DNA: n metylaatio on tuntematon. Arviointi korrelaatiosta LINE-1 metylaatiotasoilla useiden lokusten ehdotti, että LINE-1 hypometylaatio mekanismi on yleistynyt [23]. Ajoitus DNA: n metylaation ja virtsarakon syöpä ei ole vielä selvä. Pikemminkin se on osoitettu olevan biomarkkereiden jälkeisessä diagnostisten näytteiden määritykset, mutta tämä suhde ei ole esitetty käyttäen valmiiksi diagnostisia näytteitä, ja se ei ole vielä selvää, onko alempi metylaatio havaittiin johtui karsinogeeninen itse prosessi [30]. Esillä olevassa tutkimuksessa osoitimme täällä ensimmäistä kertaa merkittävä positiivinen korrelaatio LINE-1 hypometylaatio ja oksidatiivisen stressin paitsi syöpäpotilailla mutta myös terveillä henkilöillä. Siksi oksidatiivisen stressin voi olla yksi syy tai seurauksia LINE-1 hypometylaatio.

Tällä tietojemme mukaan ei ole olemassa biokemiallinen mekanismi, joka merkitsee miten LINE-1 hypometylaatio voi tuottaa ROS. Kuitenkin mekanismi, miten oksidatiivisen stressin vähentää DNA: n metylaatio on ehdotettu [31], ja oksidatiivisen stressin aiheuttama DNA: n metylaatio muutos näyttää olevan ajallista [32], [33]. Hapetetaan DNA vaurioita, jotka indusoituvat ROS, kuten 8-OHdG-pitoisuuksiin (CpG-dinukleotidejä), voi voimakkaasti estää metylaatio DNA-metyylitransferaasi viereiseen C tähteet [34]. Lisäksi, joka on korjaamatta 8-OHdG-pitoisuuksiin voivat ottaa käyttöön G-T transversio aikaansaamaa CpG dinukleotidejä [35]. Lisäksi käytettäessä oksidatiivisen stressin kunnossa, resynthesis glutationin (GSH) vastauksena GSH ehtyminen kautta metioniini kierron yksihiilisten metaboliareittiin lisääntyy. Tämä reitti edellyttää

S

-adenosylmethionine (SAM) syntetisoimiseksi homokysteiinin käytetään GSH synteesiä, mikä johtaa vähentynyt saatavuus SAM on DNA: n metylaatio [36]. Agentit ja olosuhteet, jotka indusoivat GSH ehtyminen on osoitettu heikentävän DNA metylaatio [37], [38]. Näin ollen, oksidatiivisen stressin ajatellaan muuttaa metylaatio DNA, mikä johtaa muutoksiin geenien ilmentymisen, jotka voisivat edistää kasvaimen kehittymisen [7]. Lisäksi vähentynyt saatavuus SAM, ehtyminen metyyli-allas folaatti-puutosta mallit on osoitettu aiheuttavan DNA hypometylaatio [39], [40].

LINE-1 metylaatiotasoilla on tutkittu useita lähteitä DNA parantaa syövän diagnoosi. Valitettavasti on kudosspesifisiä metylaatiotasoilla ja että nämä eroavat riippuen metylaatio biomarkkereiden käytetään mittaamaan metylaatio [15].