Krooninen sairaus

tiivistelmä

Side väestöstä (SP) solut on raportoitu olevan ominaisuuksia syövän kantasolujen kaltaisia ​​soluja (CSCS) ei-pienisoluisen keuhkosyövän (NSCLC), mutta niiden molekyylitason ominaisuudet eivät ole täysin selvitetty. Täällä näytämme, että NSCLC-SP solut rikastuneet G

0 /G

1 vaiheen solusyklin, oli korkeampi aldehydidehydrogenaasin aktiivisuus sekä korkeammat klonogeeniset ja uudistuva kyky verrattuna valtaväestöön (MP) solut. Mielenkiintoista, SP solut kykenivät myös trans-erilaistua angiogeenisten tubulukset

in vitro

ja olivat erittäin tuumorigeenisia verrattuna MP soluihin. SP-johdettu kasvaimia osoitti kasvaimensisäisenä heterogeenisyys käsittää sekä SP ja MP soluja, mikä viittaa itseuudistumisen ja erilaistumista kyky SP solut ilmenevät

in vivo

samoin. βArrestin-1 (βArr1) on mukana etenemistä erilaisten syöpien, mukaan lukien NSCLCs ja havaitsemme, että ehtyminen βArr1 merkittävästi estetty SP fenotyyppi; kun taas ehtyminen βArr2 oli suhteellisen vähäisiä vaikutuksia. Kohdunulkoinen ilmentyminen βArr1 lisännyt SP taajuus ja ABCG2 ilmentymistä samalla kumota βArr1 ilmaisun tukahdutti itseuudistumisen kasvu ja laajeneminen A549-solut. Antiapoptooppinen proteiini Mcl-1 tiedetään olevan yksi keskeisistä sääntelyviranomaisten itseuudistumisen kudosten kantasolujen ja ajatellaan osaltaan eloonjäämistä NSCLC soluja. Meidän kokeet osoittavat, että korkeampi Mcl-1 ilmennettiin SP-soluissa verrattuna MP soluihin sekä transkription ja translaation tasolla. Lisäksi Obatoclax, farmakologinen estäjä Mcl-1, voi tehokkaasti estää itseuudistumisen sekä EGFR-estäjän herkkiä ja resistenttejä NSCLC soluja. Lopuksi todettakoon, että tulokset viittaavat siihen βArr1 ja Mcl-1 ovat mukana itseuudistumisen ja laajentaminen NSCLC-CSCS ja ovat potentiaalisia kohteita syövän hoitoon.

Citation: Singh S, Bora-Singhal N , Kroeger J, Laklai H, Chellappan SP (2013) βArrestin-1 ja Mcl-1 moduloida itseuudistumisen kasvu Cancer Stem-Like Side-Population solut ei-pienisoluinen keuhkosyöpä. PLoS ONE 8 (2): e55982. doi: 10,1371 /journal.pone.0055982

Editor: Ming Tan, University of South Alabama, Yhdysvallat

vastaanotettu 10 syyskuuta 2012 mennessä; Hyväksytty: 04 tammikuu 2013; Julkaistu: 13 helmikuu 2013

Copyright: © 2013 Singh et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustuksen CA127725 National Cancer Institute. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Srikumar P. Chellappan on Academic Editor PLoS One; Tämä ei muuta tekijöiden sitoutumista kaikkiin PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

Huolimatta merkittävä terapeuttinen edistysaskeleet, keuhkosyöpä aiheuttaa enimmäismäärä syöpään liittyvät kuolemat maailmanlaajuisesti [1 ], [2]. Mukaan Maailman terveysjärjestön (WHO), keuhkosyöpä aiheuttaa noin 2,5 miljoonaa kuolemaa vuodessa vuoteen 2030 mennessä [3]. Yhdysvalloissa noin 85% potilaista on diagnosoitu NSCLCs, kuolee tähän sairauteen viiden vuoden kuluessa [4], [5]. Nämä seikat osoittavat tarvetta ymmärtää paremmin solu- ja molekyylitason tapahtumia taustalla Genesis tämän taudin kehittämään tehokkaampia hoitomuotoja. Cancer kantasolujen malli on tullut elinkelpoinen selitys aloittamista ja etenemistä aggressiivinen syöpien kuten NSCLCs ja potentiaalisia terapeuttisten kohteiden [6], [7], [8], [9], [10].

syöpä kantasolu malli viittaa siihen, että osajoukko soluja kutsutaan kuten syövän kantasoluja kaltaisia ​​soluja (CSCS) sisällä kasvain on vapautettu ominaisuuksia normaaleja kantasoluja, jatkuvia itseuudistumiseen, ja voi tuottaa sekundaarikasvaimia että kerrata heterogeenisyys ja monimuotoisuus alkuperäisen kasvain [9], [11], [12], [13], [14], [15]. Hoechst 33342 väriaine ilman soluja, joita kutsutaan side-populaatiossa (SP-soluja), on kuvattu olevan CSC kaltaisia ​​ominaisuuksia eri kasvaimia, mukaan lukien NSCLCs [16], jossa ne näytetä lisääntynyt kasvainten muodostumiseen, kun istutetaan immuunipuolustus hiirissä [17], [ ,,,0],18] verrattuna valtaväestöön (MP). SP fenotyyppi on riippuvainen ero solujen kyky pumpata Hoechst 33342 väriainetta kautta ATP-sitova kasetti (ABC) perheen kuljettajan proteiineihin, pääasiassa ABCG2 (tunnetaan myös rintasyövän resistance protein, BRCP1), joka on erityisesti ilmentyy solukalvon kantasolujen populaatioiden [19]. Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että on olemassa SP solujen osaa todetuista ihmisen NSCLC solulinjat [16] kuitenkin niiden yksityiskohtainen molekulaarinen sekä toiminnallinen kyky tuottaa heterogeenisiä kasvaimia vielä selvittämättä. Tässä tutkimuksessa, tarjoamme kattavaa näyttöä siitä, että SP-solut eristettiin perustettu ihmisen NSCLC solulinjat ja kasvaimet ovat erittäin rikastettu NSCLC-CSCS. Lisäksi, huomaamme, että ALDH1, joka on tunnistettu markkerina CSC muiden kasvaimia, on rikastettu SP solujen NSCLC. Meidän molekyyli analyysit osoittavat, että kantasolujen kaltaiset ominaisuudet SP solujen säätelevät ainakin osittain rakennustelineet proteiini, β-arrestin-1; Lisäksi selviytymisen proteiini Mcl-1 näyttelee roolia itseuudistumisen näiden solujen. Näin ollen näyttää siltä, ​​että kohdistaminen β-arrestin-1 tai Mcl1 voi olla toteuttamiskelpoinen keino estämään kantasolun kaltaisia ​​ominaisuuksia SP solujen NSCLC.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja reagenssit

Ei-pienisoluinen keuhkosyöpä adenokarsinooma solulinjat, A549, H1650, H460 ja H1975 saatiin ATCC ja ylläpidettiin RPMI tai DMEM containing10% naudan sikiön seerumia (FBS, Mediatech), 5% CO

2 37 ° C: ssa. Vaikka näissä solulinjoissa on alun perin ostettu ATCC: ltä, emme uusimiseen niitä. Fumitremorgin C (FTC) hankittiin Sigma Inc ja Obatoclax ostettiin Selleck Chemicals LLC.

RNA valmistelu ja Real Time qPCR Analysis

RNA ja cDNA valmistetta seurasi kuten aiemmin on kuvattu [20 ], [21], [22]. Reaaliaikainen PCR suoritettiin 1 ui cDNA on MyiQ reaaliaikainen PCR-tunnistusjärjestelmä (Bio-Rad) käyttäen iQ SYBR Green PCR Supermixiä (Bio-Rad) mukaan valmistajan ohjeita. Kertainen Indusoinnit lasketaan kaavalla 2

– (ΔΔCt) käyttäen GAPDH sisäisenä kontrollina geeni. Geenispesifisillä alukepareilla olivat seuraavat. CD31 (F) 5′-CCTGACAGTGTCTTGAGTGGGTG -3 ’, CD31 (R) 5’AGTGATTTTGGCTAGGCGTGGT -3′; βArr1 (F) 5’-AGAGTCTATGTGACGCTGACCTGC -3 ’, βArr1 (R) 5’GTTCCTGCAGCCGCGTCAG -3′, Mcl-1 (F) 5’-ATGCTTCGGAAACTGGACAT -3 ’, Mcl-1 (R) 5’TCCTGATGCCACCTTCTAGG -3 ”, GAPDH (F) 5’-GGT GGT CTC CTC TGA CTT CAA CA-3 ’, GAPDH (R) 5′-GTT GCT GTA GCC AAA TTC GTT GT-3’.

Western Blot analyysi

Lysaatit lajitelluista SP ja MP-solut valmistettiin NP40 hajoamiseen kuten aiemmin on kuvattu [20]. Lyhyesti, lajitellut solut pestiin kahdesti jääkylmällä PBS: llä. Soluja sentrifugoitiin 800

g

ja lyysattiin käyttäen M2-lyysipuskuria (20 mM Tris-HCl, pH 7,6, 0,5% NP-40, 250 mM NaCl: a, 3 mM EGTA: ta, ja 3 mM EDTA: ta), joka sisälsi proteaasi- estäjiä. Yhtä suuret määrät proteiineja (50 ug) erotettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin nitroselluloosamembraaneille (Bio-Rad), estää 5% rasvatonta kuivamaitoa PBS: ssä, joka sisälsi 0,1% Tween-20, ja inkuboitiin sopivan primaarisen vasta-aineita. Monoklonaalisia vasta-aineita ABCG2 ja βArr1 ostettiin Millipore ja polyklonaalinen vasta vastaan ​​E2F1 ja Mcl1 ostettiin Santa Cruz Biotechnology Inc.

Hoechst 33342 Dye ulosvirtausaika määritys SP Analysis and Cell Sorting

tarttuvien solujen kerättiin käyttämällä Accutasella reagenssia (Sigma Inc.). Kasvaimen eksplantaateissa, primäärisistä ihmisen kasvainkudosta kasvatettu kateenkorvattomissa nude-hiirissä on jauhettu, entsymaattisesti pilkottu 0,2% kollagenaasia IV (Worthington Biochemical Corporation), joka valmistettiin 10% FBS: ää sisältävässä väliaineessa 60 minuutin ajan 37 ° C: ssa. Digestion edelleen eriteltynä läpi 10 ml: n pipetti useita kertoja ja suodatetaan 100/70 um: n solusiivilän, jotta saadaan yksisolususpension. Solut pestiin ja suspendoitiin uudelleen DMEM /F12K 2% FBS: llä 1 x 10

6 solua /ml tiheyteen ja inkuboitiin 4 ug /ml Hoechst 33342 väriainetta (Invitrogen) ja 90 minuutin ajan 37 ° C: ssa läsnä ollessa tai poissa 1 uM FTC, kuten ovat kuvanneet Goodell et al. [23]. Soluja inkuboitiin 2 ug /ml propidiumjodidilla (PI; Sigma Inc.) ennen analyysiä visualisoida ja pois ei-elinkelpoisia soluja. Hoechst 33342 väriaine viritettiin 350 nm: ssä UV-laser ja sen fluoresenssi analysoitiin 400-500 nm BP suodatin sinisen emission ja 640-680 nm BP suodatin yhdessä 655 nm LP-suodatin punainen emissio. Virtaussytometreja BD Biosciences käytettiin tiedonkeruu. Tiedot hankittiin käyttäen LSRII tai FACS Vantage (DiVa), ja lajitella FACS Vantage (DiVa) soluerottelupusku-. Tiedot analyysit tehtiin käyttäen FlowJo ohjelmistoa (Puu Star).

Aldefluor Pitoisuus

Aldefluor kit käytettiin profiloida ja erillisten solujen korkea ALDH aktiivisuus kohti valmistajan ohjeiden (Stem Cell Technologies). Lyhyesti, Hoechst 33342 värjättiin soluja inkuboitiin ALDH-proteiinin substraatin BODIPY-aminoasetaldehydi (BAAA) in Aldefluor määrityspuskurissa lisätty 1 uM FTC estämiseksi ulosvirtausta Hoechstin värin. 45 minuutin kuluttua inkuboinnin 37 ° C: ssa, soluja, jotka voivat muuntaa BAAA sen fluoresoiva tuote BODIPY-aminoasetaatti (BAA) pidettiin ALDH-Hi. Portit virtaussytometrianalyysin vedettiin lähtötilanteeseen verrattuna fluoresenssiin, joka määritettiin lisäämällä ALDH-erityisiä estäjä diethylaminobenzaldehyde (DEAB). Näytteitä käsiteltiin DEAB pelkästään toimi negatiivisena kontrollina.

Sphere Formation tai itseuudistumisen Pitoisuus

Lajittele SP tai MP solua maljattiin ultra-low tarttuvuus 96-kuoppaisille levyille (Corning) tiheydellä 10000 solua /ml (1000 solua /kuoppa 100 ul: ssa väliaineessa) seerumittomassa DMEM /F12K (01:01) (Invitrogen), jota oli täydennetty 1 X-N2 täydennys (Invitrogen), 10 ng /ml EGF: ää ja 10 ng /ml bFGF (Sigma) ja annettiin kasvaa 10 päivää. Kuvia sfäärien otettiin käyttäen faasikontrastimikroskooppia (Nikon) ja pallojen kokonaismäärä yli 60 pm laskettiin. Tutkia vaikutus huumeita itseuudistumisen SP soluja, huumeet lisättiin vastaaviin kuoppiin päivänä 1 ja 5 ja koko ( 60 pm) ja numero pallojen analysoitiin päivänä 10.

In vivo

kasvainten muodostumista määrityksessä.

5-viikkoa vanhat naaraspuoliset SCID-beige hiiriä käytettiin näissä kokeissa alle protokolla, joka hyväksyi Institutional Animal käytön ja hoidon komitean University of South Florida (Animal Welfare Assurance Number A4100-01). Lajiteltu SP tai MP soluja H1650-solulinjasta pestiin seerumittomalla DMEM-F12K ja suspendoitiin 01:01 seokseen, kasvutekijän vähentää Matrigel (BD) ja HBSS ilmoitetuilla numeroita ja istutettiin ihonalaisesti. Kasvaintilavuudet määritettiin kerran viikossa mittaamalla pituus (

L

) ja leveys (

W

), ja tilavuus laskettiin käyttäen kaavaa

V =

1/2 x

L

×

W

2as aiemmin on kuvattu [21], [22], [24], [25]. Terveydentilan hiiriä seurattiin päivittäin epämukavuuden merkkejä, kuten toimettomuuden hypoaktiivisuus, hyperaktiivisuus, levottomuus, itsensä trauma, aggressiivisuus, erillään häkki saavat, ataksia, matala, nopea ja /tai vaivalloinen hengitys, vaalea limakalvojen sinerrys jättäminen sulhasen, kuihtuminen, likaiset anogenital alue, ei vastannut ärsykkeisiin, puute uteliaisuuteen ääntely, askites, ja /tai selän asento. Kaikki pyrittiin minimoida kärsimyksen. Lopussa Kokeen eläimet tulee kivuttomasti altistuminen kasvavia pitoisuuksia CO

2 omistettu CO

2 kammiossa; puristettua kaasua käytettiin lähteenä CO

2.

tilastolliset menetelmät

Tulokset esitettiin keskiarvo ± keskihajonta (SD). Arvioida tilastollista merkitystä erojen, opiskelijan

t

suoritettiin. Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen Microsoft Excel-ohjelmiston. Tiedot katsottiin tilastollisesti merkittäviksi, kun

p

arvo oli alle 0,05.

Tulokset

SP Solut NSCLC Osoittaa kantasolun Properties

pyrittiin arvioimaan prosenttiosuus SP solujen neljässä eri ihmisen NSCLC solulinjoissa, valitaan sen perusteella, K-Ras tai EGFR-mutaatio tila. A549 (K-Ras-mutantin villityypin EGFR vahvistus) ja H460 (K-Ras-mutantin) sekä H1650 (EGFR mutantti; Eksoni 20 poistetaan: delE746-A750) ja H1975 (EGFR mutantti, L858R ja T790M mutaatiot) solut sisälsivät SP -solut yhtä usein vaihtelee noin 8% (H1975) ja 40% (H460). Erityinen estäjä ABCG2 [26], Fumitremorgin C (FTC) voi estää ulkonäkö SP soluja (kuvio 1A), mikä viittaa siihen, että tämä erityisesti transporter oma roolinsa säilyttämisessä SP fenotyyppi. Nämä tulokset viittaavat siihen, että SP solut ovat läsnä NSCLC linjat, ja niiden esiintyvyys on riippumaton K-Ras tai EGFR-mutaatio asema.

(A) FACS analyysi yksisolususpensioon ihmisen NSCLC solulinjat värjättiin Hoechst 33342 väriaine osoittaa SP-soluissa. SP solut suljettu alueella rajatulla vaaleanpunainen. Fumitremorgin C esti ulosvirtaus väriaineen ja aiheutti katoaminen SP-soluissa. Taajuus SP-solujen on esitetty. (B, C) Solusyklianalyysiä käyttäen pinta-histogrammi parametri sinisen emission Hoechst 33342, kuten on kuvattu tekstissä. Profiili on esitetty B on edustavan kaikkia neljää solulinjoissa. (D) Aldefluor assay Hoechst 33342 värjätään H1975 ja H1650 soluja. Perusviivasta fluoresenssi määritettiin estämällä ALDH aktiivisuus DEAB (vasen) tuottaa portin tunnistamiseksi ALDH-Hi solujen yhteensä sekä SP ja MP soluja, joita ei ole inkuboitu DEAB (kolme oikea paneelit). Kaikki ALDH-Hi solut suljettu alueella rajatulla vaaleanpunainen. Kansi ero taajuuden ALDH-Hi-solujen välillä SP ja MP-solujen on piirretty.

On ehdotettu, että normaalin kudoksen kantasolujen ja varsi-like kasvain aloittamista soluilla on eri solusyklin profiilit verrattuna erilaistuneet solut, ja ne etenevät solukierron hitaampi [27], [28]. Tätä taustaa vasten me yrittänyt tutkia solusykliä profiilia SP solujen poikkesi Vaihtelevan MP soluja. Tutkia solusyklin jakautumisen, histogrammi profiilin syntyvät alueen parametrin sinisen emission Hoechst 33342 käytettiin tutkimaan solusyklin vaihe jakelu SP ja MP soluja. Koska FTC hoito mahdollistaa sekä SP ja MP-solujen säilyttää Hoechst 33342 väriaine, tämä näytettä käytettiin merkitsemään rajat G

1 ja S-G

2 /M vaihetta, joka perustuu niiden DNA-sisällöstä. Samanlaisia ​​portit sovellettiin näytteisiin, joissa FTC ei lisätty ja näin SP solut näyttivät kuin osa-G

0 /G

1 väestöstä (kuvio 1 B). Kun vertailu jakelun FTC käsiteltyjen ja käsittelemättömien solujen, todettiin, että 80-100% SP soluja G

0 /G

1 vaiheen solusyklin, riippuu solulinjassa (kuvio 1C). Kaikissa tapauksissa, SP-solut oli enemmän G

0 /G

1-soluissa kuin MP soluja samasta solu- linjaa, mikä viittaa siihen, että ne ovat heikennetty solusyklin etenemisen ominaispiirre kantasolujen kaltaisia ​​soluja.

kokeet suoritettiin tutkimaan, onko muita syövän kantasoluja markkereita ilmentyy SP-soluissa. Kohti tätä tarkoitusta varten virtaussytometria suoritettiin aktiivisuuden aldehydin (ALDH-Hi), joka on hiljattain käytetty mahdollisena markkerin tunnistamiseksi CSCS in NSCLCs [29], [30]. Analyysi käyttäen Aldefluor iinianalyysikitissä päälle H1650 ja H1975 solulinjat osoittivat 8 ja 6 kertainen taajuus ALDH-Hi solujen SP-soluissa verrattuna MP soluihin, mikä viittaa siihen, että SP-solut eristettiin NSCLC solulinjoja rikastettu kantasolujen kaltaisia ​​soluja (kuvio 1D), kuten nähdään ilmentymistä eri merkkiaine. Kaiken kaikkiaan noin 1,3% H1650-SP-soluissa ja 2%: H1975-SP solut ALDH-Hi soluissa.

SP Solut Näyttö Stem Cell kaltaiset ominaisuudet

in vitro

In vitro

kokeet suoritettiin edelleen luonnehtia SP ja MP soluja. Kun solujen lajittelu, solut maljattiin suuri tiheys (10000 solua /kuoppa 96-kuoppaisella levyllä) täyteen kasvatusliuokseen ja seurataan 6 päivää MTT: llä. H1650-SP ja MP soluilla oli verrattavissa leviämisen kapasiteettia kun kasvatettiin täydellisessä taltioille kiinnittynyt olosuhteissa (kuvio 2A), mikä viittaa siihen, että molemmat lajitellut solufraktioiden ovat yhtä terveitä ja Hoechst 33342 väriaine värjäystä varten SP-analyysi ja solujen lajittelu protokolla ei ollut haitallista vaikutusta nämä solut. Eräs ominaispiirre kantasolujen on niiden kyky itse uudistaa ja myös aiheuttaa enemmän erilaistuneet solut, kautta epäsymmetrinen jako [15]. Itseuudistuvien normaali tai syövän kantasolujen kaltaisia ​​soluja voi kasvaa tarttumattomat pallojen viljeltynä alhaisella tiheydellä seerumittomassa, kantasolujen selektiivisen alustan; erilaistuneet solut eivät kasva tai muodostaa pallojen tässä väliaineessa [13], [31], [32]. Itsestään uusiminen omaisuutta SP solujen tutkittiin suorittamalla pallo muodostumisen määritys, jossa käytetään SP ja MP-solut eristettiin H1650 soluista. Vaikka SP solut pystyivät kasvamaan palloina, MP soluilla oli selvästi vähemmän kykyä kasvaa samoissa olosuhteissa (kuvio 2B), mikä viittaa, että itseuudistumisen kyky ominaisuus kantasolujen näkyy vain SP-soluissa. Sitten tarkasteltiin klonogeeniset potentiaali sekä SP ja MP-solujen maljaamalla solut ja viljelemällä klo kloonitiheydessä (1000 solua 60 mm levy) 21 vuorokautta FBS sisältävässä väliaineessa. Tässä paneelissa, solut maljataan hyvin alhainen tiheys, ja niiden pitkän aikavälin leviämisen ja pesäkkeenmuodostuskyvyn tarkistettiin. Kuten kuviossa 2C on esitetty, muodostuu suuria pesäkkeitä oli olennaisesti suurempi joukossa SP soluja kuin se oli yksi MP soluja. Elinkelpoisuuden on pesäkkeitä muodostavien solujen määritettiin MTT: llä (kuvio 2D), kollektiivisesti jotka osoittavat, että SP-soluissa lisääntynyttä kyky muodostaa klooneja.

(A) kasvukäyrä 10000 H1650-SP tai MP-solut muodostettiin käyttäen MTT soluproleferaatiomäärityksessä varsinaisella kasvualustaan ​​[22]. (B) SP tai MP soluja H1650-solulinjasta maljattiin seerumittomassa väliaineessa, johon oli lisätty EGF: n ja bFGF: n ja 10 päivää. Keskimääräinen (± SD) pallojen lukumäärä 1000 soluista on piirretty. (C) H1650-SP-soluissa johti suurempia ja pesäkkeitä kuin MP soluja levytettiin tiheys 1000 solua per 60 mm: n levyä. (D) Solujen elinkelpoisuus määritettiin kuluttua 21 päivän pinnoituksen kautta MTT-määritys. (E) SP tai MP solut maljattiin Matrigel ja kasvatettiin endoteelisolujen kasvua väliaineessa (Lonza) yön yli. SP-soluissa johti angiogeenisten kuten siementiehyisiin tehokkaasti. (F) Reaaliaikainen qPCR analyysi SP ja MP-solujen suoritetaan

CD31

mRNA ilmaisun. (G) CD31 ekspressio angiogeenisten tubulukset visualisoituina immunofluoresenssilla.

Tietyt kasvaimia on havaittu osoittaa verisuonten mimicry, koska kyky kasvainsolujen hankkia endoteelisolujen ominaisuuksia ja solun muiden komponentit verisuoniston [33], [34], [35]. Rooli syövän kantasoluja tässä yhteydessä on tarkasteltu, ja viimeaikaiset todisteet viittaavat siihen, että CSCS peräisin gliooman voisi trans-erilaistua endoteelin linjaa [33], [34], [35]. Tätä taustaa vasten, tutkimme kapasiteettia H1650 SP solujen muodostamaan angiogeenisten tubulukset

in vitro

. H1650-SP-solut maljattiin Matrigelillä muodostaneet verkoston angiogeenisten tubulukset käsittelemällä VEGF, kun taas MP solut merkittävästi heikentynyt tätä kykyä (kuvio 2E). Todettiin, että MP solut pysynyt suhteellisen järjestäytymätön, verrattuna järjestäytyneen tubulussolujen kaltaisia ​​rakenteita muodostuu SP soluja. Kokeet suoritettiin sen arvioimiseksi, tubulussolujen kaltaisia ​​rakenteita muodostuu SP solujen näyttää biokemiallisia ominaisuuksia angiogeenisten aluksia. Kohti tätä tarkoitusta varten, reaaliaikainen PCR-analyysi ensimmäisen suoritettiin, jotka osoittivat korkeampaa endoteelin erityisiä

CD31

mRNA: n SP-soluissa verrattuna MP-soluja (kuvio 2F). Edelleen immunofluoresenssivärjäyksen tubulusten osoittivat, että nämä tubulukset muodostama SP solut olivat vahvasti positiivisia CD31 ilmaisu (kuvio 2G), mikä viittaa siihen, että SP-solut voivat saavuttaa endoteelin linjaa. Nämä kokeet reveled että SP solut eristetään NSCLC solulinjasta voidaan transdifferentiate osaksi endoteelisolujen kaltaisia ​​soluja ja voisi aiheuttaa angiogeenisten tubulukset kasvaimissa.

SP Soluja Rikastettu Kasvaimia synnyttävä Solut ja Näyttöä Self uudistaminen ja eriyttäminen SP solut

in vivo

koska kyky SP solujen itse uudistaa ja erilaistua angiogeenisten tubulukset sekä MP soluja, tutkimme seuraavaksi kykyä SP tai MP-solujen muodostaa kasvaimia SCID-hiirissä. SP ja MP soluja H1650 solulinjasta istutettiin ihonalaisesti selkä kyljissä SCID-hiirten ja kasvaimen kasvua arvioidaan viikoittain mittaharppimittauksilla. Kuten kuviossa 3A, neljä hiirtä (n = 5) ruiskutettiin 10000 SP solut tuottivat suuria kasvaimia (volyymi ~1400 mm

3) sisältää enintään 11 ​​viikon istutusta. Kuitenkin yhtä monella MP soluja merkittävästi heikentynyt niiden kyky muodostaa kasvaimia samassa ajassa; kasvaimet olivat suhteellisesti pienempi ja pysyi lähellä istutettu koko (volume~100 mm

3) (kuvio 3B). Edelleen SP solut muodostivat kasvaimia jopa 1000 solua (tilavuus ~471 ± 141 mm

3) Kun 19 viikon istutusta, kun taas vastaava määrä MP solut eivät aiheuta kasvaimia (kuvio 3A).

(A) Lajiteltu SP ja MP soluja H1650 solulinja istutettiin kylkiin SCID hiirillä. Kasvaimen esiintymistiheys ja keskimääräinen tilavuus (± keskivirhe) kasvainten muodostettu ilmoitetun ajan on taulukoitu. (B) kasvukinetiikka kasvainten SP ja MP soluja mitattuna viikoittain. Pisteet edustavat keskiarvoa (± keskivirhe). (C) Ihon alle kasvaimia, jotka ovat peräisin 10000 H1650-SP-soluja tai 100000 H1650-MP-solut resekoitiin ja analysoitiin SP fenotyypin läsnä ollessa tai poissa ollessa FTC. Kasvaimet SP ja MP solut sisälsivät pääasiassa eriytetty MP soluja.

Valaistaan ​​onko kasvaimet syntyvät SP soluista oli heterogeeninen SP ja MP-solujen, Hoechst 33342 värjäys ja SP analyysi suoritettiin jälkeen entsymaattisen dissosiaatiota ihonalainen kasvain ksenograftit. Kasvaimet syntyvät 10000 H1650-SP solut koostuvat pääasiassa MP soluissa, kun taas SP soluja pidettiin noin 3% taajuuden sisällä kasvain (kuvio 3C, yläpaneeli). Nämä tulokset osoittavat, että SP-solut ovat erittäin rikastettu CSCS jotka pystyvät aihetta pelätä kasvaimiin sekä itse uudistaa ja erottaa itse

in vivo

. Kuitenkin kasvaimia syntyy yhdellä hiiren (kolmesta), kun kiinnittymisestä 100000 H1650-MP soluissa osoitti erilaistamattomuuden MP-solujen tuottamiseksi SP soluihin

in vivo

(kuvio 3C, alempi paneeli), 9 viikon kuluttua in näiden hiirten (kuvio 3B). Itse asiassa se on raportoitu, että eriytetty syöpäsolut ehkä de-erilaistua ja hankkia varsi kaltaisia ​​ominaisuuksia tietyissä tapauksissa [36], luultavasti helpottaa viivästynyt kasvainten kasvua.

βArr1 Säätelee itseuudistumisen kasvu SP Cells

βarrestin-1 (βArr1) on rakennustelineet proteiini, jolla on merkittävä rooli siedätyshoito G-proteiiniin kytkeytyvien reseptorien [20], [37], [38], [39], [40]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että βArr1 on rooli aktivaation Src-kinaasien eri reseptorit ja saattaa helpottaa leviämisen keuhkosyövän soluja [38], [41]. Edelleen, βArr1 tasot havaittiin olevan koholla metastaattisen ei-pienisoluisen keuhkosyövän ja muiden syöpien verrattuna normaaliin kudokseen tai primaaristen kasvainten [20], [39], [40], [41]. Koska korrelaatio βArr1 kanssa kasvainprogression ja etäpesäkkeiden, tutkimme, onko tämä proteiini on rooli kantasolujen kaltaisia ​​ominaisuuksia SP soluja. Ensimmäisessä koesarjassa, siRNA: t ja βArr1 tai liittyvät βArr2 geenit transfektoitiin H1650, H1975 ja A549-solut; ei-suunnattu siRNA käytettiin kontrollina. Todettiin, että ohimenevä transfektiolla βArr1 erityisiä siRNA laski taajuus SP-solujen noin 40-70%; lasku oli vain 10-20%, kun βArr2 siRNA transfektoitiin (kuvio 4A); viittaa tärkeä rooli βArr1 säätelyssä SP taajuus. Edelleen selvittämiseksi roolia βArr1 varteen kaltaisia ​​toimintoja SP-soluja, me syntyy A549-soluja, jotka stabiilisti yli-ilmentyvän rotan βArr1, tai jotka on transfektoitu stabiilisti shRNA on βArr1. Todettiin, että solut stabiilisti yli-ilmentävät βArr1 oli noin kolminkertaisiksi enemmän SP-soluissa verrattuna hallita A549-soluja, jotka pysyvästi ilmensivät GFP (A549-GFP). Toisaalta, vakaa ehtyminen βArr1 käyttämällä erityistä shRNA (A549-shβArr1) johti merkittävään laskuun SP taajuus verrattuna kontrolliin solulinja, joka on transfektoitu stabiilisti ei-kohdistuksen shRNA (A549-Control) (kuvio 4B). Reaaliaikainen PCR suoritettiin kokeita sen arvioimiseksi muutoksia SP taajuus korreloi eri ABCG2. Todettiin, että A549 stabiilisti yli-ilmentämään βArr1 oli kaksi kertaisesti enemmän ABCG2 viestin verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu GFP. Toisaalta, solujen tyhjentynyt βArr1 oli huomattavasti pienempi ABCG2 viestin verrattuna ohjata shRNA ilmentävien solujen (kuvio 4C). Nämä tulokset vahvistettiin Western-blottauksella (kuvio 4D); todettiin, että βArr1 null-soluissa oli pienempiä määriä ABCG2 sekä βArr1, mutta vertailukelpoinen määrä β-aktiini ja E2F1, joita käytettiin kontrolleina.

(A) H1650, H1975 ja A549-soluja transfektoitiin siRNA vastaan ​​βArr1 ja βArr2. Taajuus SP solujen verrattiin ei-kohdistuksen ohjaus siRNA transfektoiduista soluista. SP solut suljettu alueella rajatulla vaaleanpunainen. Bar kaaviot edustavat kertainen ero taajuudella siRNA transfektoiduissa soluissa vastaavissa solulinjoissa. (B) SP taajuus analysoitiin ja edustaa A549-soluja ektooppisesti ilmentävät rotan-βArr1 tai GFP ja shRNA vastaan ​​βArr1 tai ei-kohdistuksen ohjaus shRNA. (C) Reaaliaikainen PCR ja (D) western-blot-analyysi ABCG2 ekspressio suoritettiin näiden stabiilit solulinjat. (E, F, G) A549-solut, jotka ekspressoivat stabiilisti shRNA vastaan ​​βArr1 ja ei-kohdistaminen shRNA maljattiin itseuudistumisen määrityksessä. (E) faasikontrastimikroskopialla kuvia pallojen läsnä ollessa tai ilman lääkkeitä on esitetty. (F, G) keskimääräinen lukumäärä ja koko pallojen syntyy kuoppaa kohti 1000 soluista on piirretty (keskiarvo ± SD).

Koska roolia βArr1 vuonna sukupolven SP soluja, me seuraavaksi tutkittava, onko tämä proteiini helpottaa itseuudistumisen samoin. Kohti tätä varten, SP soluja eristettiin A549-solut stabiilisti ekspressoivat shRNA vastaan ​​βArr1 tai ei-kohdistuksen ohjaus shRNA ja itseuudistumisen omaisuus arvioitiin pallo muodostumista määrityksiä. Todettiin, että soluja, joista puuttuu βArr1 oli huomattavasti pienempi määrä palloja (kuvio 4E); edelleen, koko pallojen muodostettu βArr1 null-soluissa oli merkittävästi alhaisemmat kuin muodostetaan SP soluja kontrollisolut (kuvio 4F, G). Nämä kokeet osoittavat selvästi, että telineiden proteiini βArr1 tärkeä rooli perustamalla SP solujen säätelemällä ABCG2 ilmaisun ja helpottaa myös itseuudistumisen ominaisuus näistä NSCLC kantasolujen kaltaisia ​​soluja.

estäjä Mcl- 1 tavoitteet Self-uusiminen kasvu SP Cells

Tehostettu solujen eloonjäämistä ja lääkeresistenssi on ominaisuus syövän kantasolujen [10], [42]. Anti-apoptoottinen proteiini Mcl-1, on yksi useimmin monistettujen geenien ihmisen syövässä, mukaan lukien NSCLCs [22], [43], [44],. Viime aikoina tutkimukset ovat myös liittyvät Mcl-1 toiminto sääntelyä itseuudistumisen hematopoieettisten kantasolujen [48], [49]. Koska mahdollista roolia Mcl-1 in Veren kantasolut, me seuraavaksi tutkitaan onko Mcl-1: n toimintaa edistää itseuudistumisen omaisuutta NSCLC-SP-soluissa. Ensimmäisessä vaiheessa, qRT-PCR suoritettiin RNA eristettiin SP ja MP-solut eristettiin H1650, A549 ja H1975 solulinjat. Mcl-1 viesti ilmentyvät korkeammilla tasoilla SP solujen kaikkien kolmen solulinjoissa (kuvio 5A). MCL-1-proteiinin tason myös koholla SP-soluissa verrattuna MP soluihin kaikissa kolmessa solulinjoissa, kuten nähdään western blottauksella (kuvio 5B).

(A, B) Suhteellinen ilmentyminen Mcl-1 tutkittiin mRNA: ta ja proteiinia tasot osoitettu solulinjoissa RT-PCR: llä ja western blot -analyysillä. (C) rakenne Obataoclax ja sen hoito-ohjelmaa edustettuna. (D) H1650-SP-solut lajiteltiin ja maljattiin itsensä uusimista määritys läsnä ollessa tai puuttuessa Obatoclax on osoitettu pitoisuus. Keskimäärin pallojen syntyy kuoppaa kohti 1000 soluista on piirretty (keskiarvo ± SD). Faasikontrastimikroskopiaa kuvia pallojen läsnä ollessa tai ilman lääkkeitä on esitetty. (E) SP-solut lajiteltiin erlotinibin resistenttejä H1975-solulinjan ja levyille itseuudistumisen määritys läsnä ollessa tai poissa ollessa merkitty huumeita. Keskimäärin pallojen syntyy kuoppaa kohti 1000 soluista on piirretty (keskiarvo ± SD) ja (F) faasikontrastimikroskopiaa kuvia pallojen läsnä tai poissa ollessa lääkeaineiden esittelyyn. (G) Western-blot-analyysi βArr1 ja βArr2 in Obatoclax käsitellyissä soluissa. Inhibition of Mcl-1 ei vaikuttanut ekspressioon βArr1 ja βArr2 missään testatuissa solulinjoissa.

Obatoclax on hydrofobinen molekyyli (kuvio 5C), joka kehitettiin Bcl-2-perheen antagonisti mukaan lukien Mcl-1 [50]. Obatoclax on osoitettu vastustusta apoptoosivälitteisiin nimenomaan Mcl-1 [51]. Näin ollen, tässä käytimme Obatoclax tutkia roolia Mcl-1 itseuudistumista SP-solujen, tekemällä pallo muodostumisen määritykset läsnä ollessa tai poissa ollessa Obatoclax. Kuten kuviossa 5C esitetään, solut ympättiin päivänä 1 pallo muodostumisen määritys ja Obatoclax oli lisätty day1 ja päivänä 5 osoitettuina annoksella. 10 päivän jälkeen pinnoitus pallojen lukumäärä laskettiin ja analysoitiin. Kuten on esitetty kuviossa 5D, inhibitio Mcl-1-aktiivisuuden 200 nM Obatoclax osoittivat 4-5-kertainen väheneminen pallojen; edelleen koko pallojen väheni myös merkitsevästi kuten kuvassa yllä bar (kuvio 5D). 500 nM pitoisuus Obatoclax täysin tukahdutetaan alalla muodostumiseen (kuvio 5D).

Erlotinibi ja gefitinibin jotka estävät EGFR, jotka osoittavat merkittävää tehoa hoidettaessa pienisoluista keuhkosyöpää kätkeminen EGFR mutaatioita [52], [53]. Samaan aikaan, toissijainen pistemutaatio eksonissa 20 EGFR (T790M) liittyy kehittynyt resistenssi EGFR: n estäjien, kuten erlotinibi [52].