Krooninen sairaus

tiivistelmä

tulehdusvälittäjiä kasvaimen mikroympäristössä edistää kasvaimen kasvua, verisuonten kehitystä ja mahdollistavat kiertämisen kasvainten vastaisten immuunivasteiden poistamalla soluttautumalla dendriittisolut. Kuitenkin aineosat kasvaimen mikroympäristössä, jotka vaikuttavat suoraan dendriittisten solujen kypsymistä ja toiminta ei ole hyvin karakterisoitu. Tavoitteena oli tunnistaa kasvaimeen liittyvän tulehduksen välittäjäaineiden, jotka vaikuttavat funktio dendriittisolujen. Kasvaimen elatusaine on saatu viljellyistä peräsuolen kasvain eksplantaattikudosta suuria pitoisuuksia kemokiinien CCL2: n, CXCL1, CXCL5 lisäksi VEGF. Esikäsittely monosyyteistä johdettujen dendriittisolujen tämän tuumorin media esti up-regulation of CD86, CD83, CD54 ja HLA-DR vasteena LPS: lle, parantaa IL-10 ja vähentää IL-12p70 eritystä. Tutkimme, jos tietyt yksittäiset komponentit tuumorin media (CCL2, CXCL1, CXCL5) voi moduloida dendriittisten solujen kypsymistä tai sytokiinin eritys vasteena LPS: lle. VEGF arvioitiin myös, koska se on estävä vaikutus dendriittisen solun kypsymiseen. Esikäsittely epäkypsiä dendriittisoluja VEGF inhiboi LPS-indusoitua säätelyä CD80 ja CD54, kun taas CXCL1 esti HLA-DR. Mielenkiintoista on, että hoito dendriittisolujen kanssa CCL2: n, CXCL1, CXCL5 tai VEGF suppressoi merkittävästi niiden kykyä erittää IL-12p70 vasteena LPS: lle. Lisäksi dendriittisolut käsitellään yhdistelmällä CXCL1 ja VEGF erittyy vähemmän IL-12p70 vasteena LPS: lle verrattuna esikäsittely joko sytokiinin yksinään. Lopuksi tuumorin media vaikuttaa voimakkaasti dendriittisolujen kypsymistä ja toiminta.

Citation: Michielsen AJ Hogan AE, Marry J, Tosetto M, Cox F, Hyland JM, et al. (2011) Kasvaimen Tissue mikroympäristölle voi estää dendriittisolujen kypsymistä peräsuolen syövän. PLoS ONE 6 (11): e27944. doi: 10,1371 /journal.pone.0027944

Editor: Francesco Dieli, University of Palermo, Italia

vastaanotettu: toukokuu 30, 2011; Hyväksytty: 28 lokakuu 2011; Julkaistu: 18 marraskuu 2011

Copyright: © 2011 Michielsen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus rahoittivat Irlannin Research tiede- ja tekniikkaan sekä Darren Gibbons Foundation. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Dendriittisolut (DC) ovat tehokkaita antigeeniä esitteleviä soluja, jotka kykenevät aktivoimaan naiiveja T-soluja. DC: t ovat läsnä kudosten kehittymätön tilassa ja näyttää alhainen kypsymisen tai kostimuloivien markkereita, kuten CD83, CD80 tai CD86. Epäkypsiä DC (IDCS) tunnistaa ja tallentaa spesifisiä antigeenejä, mukaan lukien kasvain antigeenejä. DC tehdään toiminnallinen kypsytys vastauksena tulehduksellisten välittäjäaineiden, kuten IFN-α tai Toll kaltainen reseptori (TLR) agonistit. Koska DC: t kypsyvät ne saavat mahdollisen esittelemään antigeenin T-soluja ja aktivoimalla erityinen anti-kasvain T-soluvasteen [1], [2]. DC, jotka erittävät suuria määriä bioaktiivisia IL-12p70 indusoivat optimaalisen anti-kasvain immuniteetin, sillä ne ovat lisänneet kapasiteettia lisätä luonnollisten tappajasolujen aktiivisuuden, vinossa vastaus Th1 ja prime kasvaimen CD8

+ T-solujen [3], [ ,,,0],4].

kuitenkin monet kasvaimet kiertää immuunivastetta erittämällä sytokiineja ja muita tekijöitä, jotka estävät DC erilaistumista tai kypsymistä ja tuumoria infiltroivien DC. [1]. Yksi näistä ”pro-kasvain” tekijät, verisuonten endoteelin kasvutekijä (VEGF) on tunnettu yllä kasvaimen kasvun kautta angiogeenisten ominaisuuksia, mutta voivat myös saada estävä vaikutus DC erilaistumista ja kypsymistä, parantaa tuumorin eloonjäännin kannalta [1], [5] [6], [7], [8]. VEGF on onnistuneesti saavuttamista humanisoitu monoklonaalinen vasta-aine bevasitsumabi (Avastin) [9], mutta vastaus hinnat ovat noin 40% ja monet potilaat kehittävät resistenssin tähän hoitoon. Siksi on tärkeää tutkia mahdollisuuksia muiden tulehduksellisten välittäjäaineiden läsnä kasvaimen mikroympäristössä jotka voivat estää DC kypsymisen, koska ne voivat myös olla mahdollisia terapeuttisia kohteita.

Useat sytokiinit ja kemokiinit ovat läsnä korkeina pitoisuuksina kasvaimen mikroympäris- verrattuna normaaleissa kudoksissa, kuten CCL2 (MCP-1), CXCL1 (GROα) ja CXCL5 (ENA-78) [10], [11], [12]. CCL2 tiedetään houkutella monosyytit, T-solut ja dendriittisolut [10], [13], kun taas päätehtävä CXCL1 ja CXCL5 on houkutella ja aktivoida neutrofiilejä [14], [15]. Lisäksi niiden kemoattraktanttia toimintoja, CCL2, CXCL1 ja CXCL5 myös tärkeä rooli angiogeneesissä [15], [16], [17], jotka osoittavat monimuotoisen näiden kemokiinien. Tiedetään, että ihmisen myeloidinen DC ilmaista CCR2 ja CXCR2, reseptorit CCL2 ja CXCL1 ja CXCL5 vastaavasti [18], [19]. Kuitenkin vaikutus näiden kemokiinien DC kypsymiseen ja toiminta ei ole aiemmin tutkittu.

Tässä tutkimuksessa käytimme irrotetut paksu- ja peräsuolisyövän kudoksen mallintaa kasvain microenvironment [20]. Explant kudosten säilyttää monimutkaisia ​​3D-rakenne kasvaimen, mukaan lukien strooma, jolloin tuotanto monista eri kasvaimeen liittyvien tekijöiden, muistuttaa läheisesti tulehduksellinen miljöö kasvaimen

in situ

. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että supernatantit kasvainsolulinjoja voidaan estää DC kypsymistä [21], [22], mutta on tärkeää erittämät tekijät koko kasvaimen dendriittisten solujen kypsymistä ei ole aiemmin tutkittu.

Osoitamme että Kasvaimen medium (TCM) viljellyistä peräsuolen syövän kasvainten inhiboi merkittävästi LPS-indusoitua DC kypsymistä, huomattavasti lisäämällä IL-10 ja vähentää IL-12p70 eritys vasteena LPS: lle. Olemme havainneet, että TCM sisälsivät merkittäviä määriä kemokiinien CCL2: n, CXCL1 ja CXCL5 lisäksi VEGF. Tasot CCL2, CXCL1 ja CXCL5 että TCM korreloi CD83 ilme ja IL-12p70 eritystä DC käsitelty TCM. Yksilöllisesti, kaikki nämä tulehduksen välittäjäaineiden inhiboi merkittävästi LPS-indusoitua IL-12p70 eritystä, mutta IL-10: n eritystä pysyi ennallaan. Mielenkiintoista on, että vaikutukset CXCL1 ja VEGF: n inhibitioon LPS-indusoitua IL-12p70 erityksen DC olivat lisäaineen. Lisäksi CXCL1 oli myös merkitty estävä vaikutus LPS-indusoitua säätely ylöspäin HLA-DR.

Tulokset

Kasvainten väliaine estää DC kypsymisen ja IL-12p70 eritystä taas kohensi IL-10 eritys vasteena LPS: lle

monosyyttien johdettu DC saatu 2 terveillä vapaaehtoisilla inkuboitiin eri määriä TCM 4 kolorektaalisyövän potilaalla 4 tuntia ennen LPS simulointi vielä 18 tuntia, määrittää optimaalisen pitoisuuden TCM. Olemme tutkineet vaikutus TCM kykyyn DC erittämään IL-10 ja IL-12p70 vastauksena stimulaation LPS. Eritystä IL-12p70, jonka DC täydentää ja ohjaa laajentamista ja erilaistumista kasvaimen tietyn Th1 vasteita, kun taas suuria määriä IL-10: n eritystä edullisesti johtaa laajentamiseen immunosuppressiivisen säätelijä-T-soluja. Hoito DC on 1: 2 laimennos TCM osoitti on voimakkain vaikutus IL-10 nousu ja IL-12p70 inhibition (p = 0,028), vasteena LPS: lle (kuvio 1). Mitään merkittävää eroa ei havaittu CD80: n, CD86: n, CD54: n, CD83: n ja HLA-DR: n (MHC-II), merkkiaineita, jotka liittyvät DC kypsymisen, eri laimennoksia TCM (tuloksia ei ole esitetty). Siksi käytetään 1: 2 laimennos TCM lisäanalyysiä.

Immature monosyyteistä johdettujen dendriittisten solujen (IDCS) (n = 2), käsiteltiin 4 tunnin ajan 01:02, 01:04 ja 01:10 laimennokset Kasvaimen medium (TCM), joka on saatu viljelemällä eksplantoitiin kasvaimia 4 peräsuolen syövän potilaiden

in vitro

72 tuntia. LPS: ää (1 ug /ml) lisättiin ja soluja viljeltiin vielä 18 tuntia. Supernatantit kerättiin soluista viljeltiin, kuten edellä on kuvattu, ja tasot IL-10 ja IL-12p70 eritystä DC mitattiin ELISA: lla. Tilastollisia eroja määritettiin Mann-Whitneyn U-testi.

monosyyttien johdettu DC saatiin 6 terveistä luovuttajista käsiteltiin 1 2 TCM 21 peräsuolen potilaiden 4 tuntia ennen käsittelyä LPS: llä vielä 18 tuntia, ja kiinnostavaa, TCM käsiteltiin DC erittää huomattavasti korkeampi IL-10 vasteena LPS: lle (p 0,0001), mutta huomattavasti vähemmän IL-12p70 (p 0,0001) (kuvio 2A). Lisäksi IL-12p70 osoittivat negatiivista korrelaatiota CD83 ekspression Spearman r = -0,71, p 0,001 (tuloksia ei ole esitetty), joka lisäksi viittaa siihen, että TCM käsitelty DC: iden lisääminen CD83 ilmentyminen on vähenevän IL-12p70 eritystä.

IDC (n = 6) käsiteltiin TCM 21 peräsuolen syöpäpotilaiden 4 tuntia ennen kuin lisättiin LPS; soluja viljeltiin vielä 18 tunnin ajan. Tasot IL-10 ja IL-12p70 eritystä DC mitattiin ELISA: lla. Tilastolliset erot määritettiin ANOVA. (A) ilmentyminen seuraavien kypsymisen markkerit: CD80, CD54, CD86, HLA-DR ja CD83 arvioitiin virtaussytometrialla. Yksi edustava koe on kuusi on esitetty (B). Fold muutos m.f.i.:n Kunkin markkerin laskettiin suhteessa stimuloimattomiin IDCS solujen käsitelty LPS: llä tai TCM + LPS. Tilastollinen merkittävyys laskettiin käyttäen Wilcoxonin testi. (C). *

p

0,05, **

p

0,01 ja ***

p

0,001.

Hoito DC: iden TCM myös merkittävästi esti LPS-indusoidun DC kypsymistä, joilla on alentunut ilmentyminen CD54 (

p

0,0001), CD86 (

p

= 0,0035), HLA-DR (

p

= 0,0474) ja CD83 (

p

= 0,0018) havaittiin (kuvio 2B ei kuitenkaan todettu merkittäviä eroja Näiden sytokiinien tasot määritettiin näissä olosuhteissa (tuloksia ei ole esitetty). Hoito DC: iden CCL2: n, CXCL1, CXCL5 ja VEGF ei vaikuttanut niiden kyky indusoida T-soluproliferaatiota tai tuotanto IFNy (tietoja ei esitetty).

supernatantit DC viljeltiin, kun läsnä on CCL2: n, CXCL1 , CXCL5 ja VEGF (n = 8), otettiin talteen ja pitoisuudet IL-10 ja IL-12p70 määritettiin ELISA: lla. Tilastollinen merkitsevyys määritettiin Mann-Whitney U-testi. * P 0,05, ** p 0,01.

Lisäksi, tutkimme CCL2, CXCL1, CXCL5 ja VEGF voi vaikuttaa DC muuttoliikettä. CCL19 käytettiin positiivisena kontrollina, koska sen tiedetään sitoutuvan kemokiinien reseptoriin CCR7, joka ilmaistaan ​​DC [23]. Olemme havainneet, että ne eivät lisätä siirtolaisuuden CCL19 (tietoja ei esitetty).

CXCL1 ja VEGF olla additiivinen estävä vaikutus IL-12p70 erityksen DC vasteena LPS: lle

TCM on voimakas estävä vaikutus DC kypsymiseen ja toiminto, mutta CCL2 ja CXCL5, jotka ovat läsnä suurina määrinä TCM, ei ole merkittävää vaikutusta dendriittisten solujen kypsymistä merkki ilmaisu, kun taas CXCL1 vain estivät merkittävästi HLA-DR: n ja VEGF merkittävästi estyy CD80 ja CD54 (aineistoa ei esitetty). Siksi me tutkimme, yhdistämällä yhdistelmä-sytokiinien saattaa olla voimakkaampi vaikutus dendriittisen solun kypsymiseen. Tutkimme seitsemän eri yhdistelmiä neljän sytokiinien: CCL2 + CXCL1, CCL2 + CXCL5, CCL2 + VEGF, CXCL1 + CXCL5, CXCL1 + VEGF, CXCL5 + VEGF, CCL2 + CXCL1 + CXCL5 + VEGF: ää. Yhdistelmä CXCL1 ja VEGF eivät merkittävästi estävän LPS-indusoitua kypsymisen merkki ilmaisun DC (CD80

p

= 0,0625, CD54

p

= 0,6, CD86

p

= 0,6, HLA-DR

p

= 0,1, CD83

p

= 0,8) (kuvio 6A). Kuitenkin yhdistämällä CXCL1 ja VEGF vähentää merkittävästi LPS-indusoitua IL-12p70 (

p

= 0,0028), mutta ei muuttanut tasoja IL-10 (kuvio 6B). IL-1β, TNFa, IL-8 tai IL-6 eritteet eivät muuttuneet (tietoja ei esitetä). Mikään muu yhdistelmä oli suora vaikutus LPS-indusoidun DC kypsymisen tai sytokiinin erittymistä DC: iden vasteena LPS: lle, kun verrattiin yksittäisiin sytokiinien (tuloksia ei ole esitetty). Lisäksi sisällyttäminen neutraloivien vasta-aineiden CXCL1 ja VEGF, yksinään ja yhdistelmänä, ei ole oikea TCM indusoi muutoksen DC kypsymisen, IL-10 tai IL-12p70 eritystä DC vasteena LPS: lle (tuloksia ei ole esitetty).

IDCS (n = 5), käsiteltiin yhdistelmä rekombinantti CXCL1 (100 ng /ml) ja VEGF (20 ng /ml), 4 tuntia ennen LPS: n lisäämistä (1 ug /ml). Soluja viljeltiin sitten vielä 18 tuntia, ja tasot CD80, CD54, CD86, HLA-DR ja CD83 arvioitiin virtaussytometrialla. Tulokset esitetään fold-muutos m.f.i. verrattuna käsittelemättömään IDCS. Tilastollinen merkitsevyys määritettiin Wilcoxonin testi (A). Supernatantit poistettiin soluista yllä kuvatulla tavalla käsitelty ja konsentraatio IL-10 ja IL-12p70 määritettiin ELISA: lla. Tilastollinen merkitsevyys laskettiin Mann-Whitney U-testi (B). * P 0,05, ** p 0,01.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet ensimmäistä kertaa, että tuumorin mediaa peräsuolen syöpä kasvain eksplanttien voivat merkittävästi estävän LPS indusoima kypsymisen monosyyteistä johdettujen DC. Lisäksi, hoito DC: iden TCM ennen LPS stimulaation merkittävästi lisääntynyt IL-10, anti-inflammatorinen sytokiini, joka estää Th1-vasteen [24], ja vähentää eritystä IL-12p70, pro-inflammatoristen sytokiinien tarvitaan Th1 vastauksia: DC liittyvä fenotyyppi toleranssi. Myöhemmin havaitsimme, että CCL2: n, CXCL1 ja CXCL5 ilmaistiin korkeilla tasoilla TCM verrattuna VEGF, ja määritetään, onko näiden tulehduksellisten välittäjäaineiden voisi muuttaa toimintoa DC: iden. VEGF oli mukana meidän analyysejä kuin se oli aiemmin osoitettu estävän DC kypsymisen [8], [22]. Lisäämällä yhdistelmä-DNA-VEGF IDCS oli estävä vaikutus LPS-indusoidun ilmentymisen lisääntyminen CD80: n ja CD54: n, ja lisätään yhdistelmä-DNA-CXCL1 on IDCS laski HLA-DR-ekspression jälkeen, LPS hoidon.

Kuitenkin hoito IDCS ihmisen rekombinantti CCL2, CXCL1, CXCL5 tai VEGF, annoksilla linjassa muiden tutkimusten [13], [22], [25], [26], johti selvästi alhaisempia IL-12p70 eritys vasteena LPS stimulaatiota. Nämä tiedot viittaavat siihen, että tulehduksen välittäjäaineiden läsnä kasvaimen mikroympäristössä vähentää kapasiteettia paikallisen DC erittämään IL-12p70 ja siten induktion tehokas anti-kasvaimen vaste.

Samanlaisia ​​tuloksia saatiin tutkimuksessa tutkitaan vaikutus of elatusaine otetaan haimasyövän solulinja BxPC-3 (BxCM), jossa DC erilaistuminen ja kypsyminen estyi BxCM. Tutkimus osoitti, että BxCM vähensi ilmentymä CD83, CD1, CD1c, CD80 ja CD86, jonka DC vastauksena TNFa. Vastaa meidän havaintojen tämä Tutkimuksessa havaittiin merkittävä kasvu IL-10 ja lasku IL-12p70 tuotanto vasteena stimulaatiolle TNFa seuraavien BxCM hoidon [27]. Kuitenkin hoito DC: iden supernatantin RCC-10 (munuaissolukarsinooma soluja), johti ilmentyminen vähenee kypsymisen markkereita, mutta ei vaikuttanut IL-10: n tuotantoa vasteena stimulaatiolle TNFa, IFNa- ja poly I: C [22]. Nämä tutkimukset, yhdessä Tässä esitetyt tiedot viittaavat siihen, että monet kasvaintyypit erittävät tulehduksen välittäjäaineita, jotka voivat estää toimintoja DC; mutta se on todennäköisesti vaihtelua tulehduksellinen miljöössä ja tuloksena vaikutus DC toiminto mukaan kasvaimen tyyppi ja vaihe. Vaikka se olisi ollut mielenkiintoista arvioida ja eristää todellinen taso DC tunkeutuminen kasvain eksplantaattikudosta, tämä ei voitu suorittaa, koska rajoittamisesta eksplantaattikudosta koko saimme leikkauksesta. Tuloksemme osoittavat, että NCM ei merkittävästi vaikuta DC kypsyminen tai sytokiinien eritystä, mikä osoittaa, että normaali viereinen kudos saattaa olla toiminnallisia koskemattomuutta. Ei ollut näyttöä immunosuppressiivisen kentän vaikutus.

VEGF on perustettu tärkeä tekijä kasvaimen kasvua aiheuttamalla angiogeneesin. VEGF on terapeuttinen kohde monissa syövissä, mukaan lukien peräsuolen syöpä, jossa humanisoitu anti-VEGF-mAb, bevasitsumabi (Avastin) käytetään. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että VEGF estää DC kypsymisen ja DC kyky aktivoida T-soluja [5], [8], [22]. Tässä tutkimuksessa osoitamme, että VEGF estää CD80: n ja CD54: n, mutta ei CD86 tai HLA-DR, data vastaa Alfaro

et al.

[22]. Mielenkiintoista on, olemme havainneet, että VEGF-käsitelty DC erittää huomattavasti alhaisempia IL-12p70 vasteena LPS: lle; toteamisesta ei ole aiemmin dokumentoitu. Käytön LPS: n kypsä DC, verrattuna kypsymisen cocktail koostuu TNFa, IFNa ja poly I: C, jota Alfaro

et al.

Voi selittää havaitut erot vaikutus VEGF: n DC kypsymisen ja IL -12p70 eritystä. Meidän havainto, että VEGF: n stimulaation DC: iden ei vaikuta T-solun proliferaation ja sytokiinien erityksen on yhdenmukainen Alfaro

et ai.

, Mutta he löysivät estävää vaikutusta VEGF: n, kun läsnä erilaistumisen vaiheessa DC kehitystä, mikä osoittaa, että eriytetty DC voi olla vähemmän reagoiva vaikutuksille VEGF [22]. Tutkimuksemme osoitti myös, että peräsuolen syöpäpotilaiden eksplantaattikudosta erittyy korkeita CCL2, CXCL1 ja CXCL5 verrattuna VEGF. Mielenkiintoista, CCL2, CXCL1 ja CXCL5 tasot TCM korreloi CD83 ilme TCM käsitelty DC. Tämä on ensimmäinen kerta tänä korrelaatio on havaittu, ja viittaa siihen, että potilailla, joilla on korkeampi CCL2, CXCL1 tai CXCL5 saattanut kohonneeseen CD83 on DC. CD83 on erittäin tärkeää naiivi T-solujen ja B-solujen aktivaation [28], [29], mutta olemme myös havainneet, että parannettu ilmentymistä CD83 DC: issä käsitellään TCM korreloi alentunut IL-12p70 eritystä TCM käsitelty DC. Aikaisemmin on raportoitu, että vaikka eri ärsykkeiden voi kypsä DC: iden vastaavia tasoja, joilla on samanlaiset ilmentymisen CD83, CD80 ja CD86, profiilin sytokiinien, että ne erittävät eroavat toisistaan; ärsykkeet, kuten IFN-γ voi johtaa IL-12 erittävät CD83 + DC jotka stimuloivat Th1 vasteet, kun taas muut ärsykkeisiin kuten prostaglandiini E2 johtaa CD83 + DC jotka erittävät ei IL-12, mutta tehokkaasti edistää Th2-vasteen [30].

Vaikka on raportoitu, että CCL2: n, CXCL1 ja CXCL5 ovat tärkeitä tuumorin kasvua, proliferaatiota ja angiogeneesiä [31], [32], vaikutusta näiden kemokiinien DC: issä ei ole aiemmin dokumentoitu. CCL2, CXCL1 ja CXCL5 tasoilla TCM korreloi käänteisesti IL-12p70 eritys, tämä on ensimmäinen kerta, tämä korrelaatio on havaittu, ja ehdottaa, että lisääntyvää CCL2, CXCL1 ja CXCL5 että TCM, IL-12p70 eritystä DC on vähennetään. CCL2 on kemoattraktantti monosyyttien, muisti-T-soluja ja dendriittisoluja [26], [31]. CCL2 on myös aiemmin raportoitu aiheuttavan angiogeneesiä [17], joka on tärkeä tuumorin kasvulle ja etäpesäkkeiden. Sekä pro- ja anti-kasvain vaikutuksia CCL2 on havaittu, sillä se vaikuttaa monosyytit ja makrofagit [31], kun taas tässä osoitamme, että CCL2 voi myös vaikuttaa kasvaimen vastainen immuunivaste vaikuttamalla kyky DC erittämään IL-12p70 mutta ei muiden sytokiinien, mukaan lukien IL-10, IL-1β, IL-6, IL-8 tai TNF-α vasteena LPS stimulaatiota. Sen sijaan, Braun

et al.

Ovat aiemmin osoittaneet, että CCL2 voi estää IL-12p70 tuotannon monosyyttien ja tämä on pertussistoksiini herkkä, mutta he eivät noudata tätä vähenemistä IL-12p70: n eritys dendriittisoluja käsiteltiin joko SAC + IFNy tai CD40L + IFNy [33]. Vaihtoehtoisesti, Omata

et al.

Löytyi DC erottaa monosyyteistä CCL2 oli vähentynyt kyky erittää IL-12p70 stimulaation jälkeen CD40-ligandin, vaikutusta ei ole herkkä hinkuyskätoksiinilla. Nämä kirjoittajat raportoitu mitään vaikutusta CCL2 erilaistumiseen tai kypsymistä DC. [34]. Siksi tarkka mekanismi, jolla CCL2 kykenee sen vaikutus DC: iden vielä täysin selvitetty.

Vaikka vaikutus CXCL1 ja CXCL5 DC kypsymiseen ja sytokiinien erityksen ei ole aiemmin tutkittu, niiden tunnetuista tehtävänä on houkutella ja aktivoi neutrofiilit [14], [15], joka puolestaan ​​on liitetty kasvaimen solujen kasvua, angiogeneesin ja metastaasin [35]. Koska DC: t ilmentävät CXCR2 [19], joka on reseptori CXCL1 ja CXCL5, ei ole yllättävää, että CXCL1 ja CXCL5 voi vaikuttaa DC-toiminto. Kemokiinit kuten CCL2, CXCL1 ja CXCL5 signaali läpi G-proteiiniin kytkettyjen reseptorien, jotka valvovat solunsisäisiä cAMP-tasoja ja lisätä cAMP-tasot korreloivat alentuneen IL-12 tuotantoa [36]. Kuitenkin mekanismi, jolla nämä kemokiinit vähentävät IL-12p70 eritystä DC ei ole tiedossa, ja se on aiheena tulevaisuuden tutkimuksissa.

Mielenkiintoista CXCL1 ja VEGF olla additiivinen estävä vaikutus IL-12p70 eritystä. Ne toimivat eri reseptoreihin, jotka on aiemmin osoitettu olevan läsnä DC: issä [7], [19], joten ne saattavat aktivoida erilaisia ​​signalointireittejä samanaikaisesti, tai ne voivat aktivoida samaa reittiä tehokkaammin. VEGF: n on osoitettu lisäävän fosfo-ERK1 ERK2 DC: issä ja tämän reitin säätelee negatiivisesti monosyyteistä johdettujen DC kypsymisen [7], [37]. Mitkä signalointipolkujen aktivoituvat CXCL1 läpi CXCR2 dendriittisoluissa ei vielä tunneta, mutta tutkii eri solutyyppejä, kuten syöpäsoluja, osoittavat, että CXCR2 signalointi voi aktivoida NF-KB: tä, STAT3 ja ERK reitit [38], [39] , [40]. Näin ollen, on olemassa useita mahdollisia mekanismeja, jotka CXCR2 ligandit voivat estää eritystä IL-12p70, jonka DC. Kuitenkin immuuni heikentäviä joko Näiden sytokiinien yksittäin tai yhdistelmänä neutraloivien vasta-aineiden ei kääntää inhiboiva vaikutus TCM. Tämä osoittaa, että se on todennäköisesti useita eri tekijöitä yhdessä toimimalla syy DC esto. Tämä on yhdenmukaista aikaisempien tutkimus osoittaa, että esto yhden tekijän, VEGF: n supernatanteissa RCC-10-soluja ei ollut merkittävää vaikutusta DC aktivointi [22].

Havaitsimme, että CCL2: n, CXCL1, CXCL5 ja VEGF eivät peitä DC kypsymistä, eivätkä ne myöskään vaikuta DC kulkeutumista tai T-solujen lisääntymistä. Toisin kuin DC käsitelty TCM, yksittäisten tulehduksen välittäjäaineiden eivät paranna IL-10, mutta ne kaikki estivät IL-12p70 eritys; vaikutusta ei ole aiemmin esitetty CCL2, CXCL1, CXCL5 ja VEGF. Eksplantaatin kasvaimen kudokset erittävät monia erilaisia ​​liukoisia tekijöitä, ja se ei ole kovin yllättävää, että muutamia yksittäisiä tekijöitä omasta ei ole vaikutusta verrattavissa TCM. On hyvin todennäköistä, että monet eri tekijät erittyy TCM jonka explant kasvain toimivat yhdessä estämään DC kypsymisen ja toiminta. Kuitenkin kyky CCL2: n, CXCL1, CXCL5 ja VEGF vähentää merkittävästi IL-12p70 tuotanto DC on tärkeää, koska tämä voi mahdollisesti johtaa vähentää kasvaimen vastaisen Th1 vaste

in vivo

.

Lopuksi löysimme että TCM estää DC kypsymistä sekä indusoi IL-10, samalla kun estetään IL-12p70 eritteiden DC. TCM komponentit CCL2: n, CXCL1, CXCL5 ja VEGF näyttää olevan rooli moduloimaan tulehdusvasteen estämällä IL-12p70 eritystä DC, mahdollisesti suojata kasvaimen voimakas immuunivaste sitä vastaan. Lisäksi, CXCL1 ja VEGF toimia yhdessä inhibitio IL-12p70 eritystä DC. Vaikka CCL2, CXCL1, CXCL5 ja VEGF on läsnä TCM korkealla tasolla, ne eivät ole pääkomponentit TCM jotka vaikuttavat DC kypsymistä ja toiminta. Yhteenvetona olemme osoittaneet, että on tärkeää tuumorin median säätelyssä dendriittisten solujen toimintaa kolorektaalisyövässä potilailla, mutta taustalla olevien mekanismien vielä selvittämättä.

Materiaalit ja menetelmät

Ex vivo kasvaimen explant kulttuuri

Kaikki kudosta saatiin kanssa ilmoitti kirjallinen suostumus potilaan, ja protokolla hyväksyi eettinen komitea St. Vincentin University Hospital.

Kirurgisesti resektoitiin kolorektaalisyövän kasvainkudoksen ( n = 21) ja normaalin kudoksen ( 10 cm kasvain; n = 5) saatiin potilailta keskuksesta peräsuolen Disease n eksplantaattikudosta bio-pankki St. Vincentin University Hospital, Dublin (12 uros, 9 nainen, mediaani ikä 67, 1 vaihe II, 5 vaiheen III, 15 Vaihe IV peräsuolen syöpä). Kudoksen leikattiin vähintään 4 yhtä suureen kappaletta noin 5 mm

3 ja viljeltiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [20]. Lyhyesti, irrotetut kasvaimen kudokset viljeltiin 72 tuntia (24-kuoppalevyillä) 2 ml: ssa RPMI 1640, joka sisälsi 100 U /ml penisilliini, 100 ug /ml streptomysiiniä, 4 ug /ml Fungizonea, 30 ug /ml gentamisiini (Invitrogen; Carlsbad , Kalifornia) ja jota oli täydennetty 20% naudan sikiön seerumia (Invitrogen). Sen jälkeen 72 tunnin viljelyn, Kasvainten medium (TCM) ja normaali medium (NCM) kerättiin ja säilytettiin -20 ° C: ssa, kunnes käytettiin analyyseihin.

dendritic eristämistä ja viljelyä

ihmisen monosyyteistä johdettujen epäkypsien dendriittisolujen (IDCS) muodostettiin perifeerisen veren mononukleaarisissa soluissa (PBMC: t) on saatu buffy coat valmisteet (National veri Centre, St. James Hospital, Dublin). Monosyyttejä eristettiin positiivinen valinta käyttämällä CD14-magneettihelmiä (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Saksa) ja ympättiin tiheydellä 1 x 10

6 solua /ml 6-kuoppaisille levyille 3 ml: ssa RPMI 1640, joka sisälsi 100 U /ml penisilliini, 100 ug /ml streptomysiiniä, 4 ug /ml Fungizonea, ja johon oli lisätty 10% määriteltyä Hyclone naudan sikiön seerumia (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), ihmisen granulosyytti-makrofagipesäkkeitä stimuloiva tekijä (GM-CSF; 50 ng /ml, Immunotools, Friesoythe, Saksa), ja ihmisen IL-4 (70 ng /ml; Immunotools). Soluja ruokittiin päivänä 3 korvaamalla puolet keskipitkän ja lisäämällä tuoretta sytokiineja. Päivänä 6 soluja osoittivat kehittymätön DC fenotyyppi (CD14

-, CD11 c

+, CD86

-, CD54

alhainen, CD83

-, CD80

– ja HLA DR

alhainen).

stimulointi monosyyteistä johdettujen DC

Juuri eristetyt IDC maljattiin kolmena rinnakkaisena 96-kuoppalevyille 1 x 10

5 solua /200 ui RPMI 1640 johon oli lisätty 10% määriteltyä Hyclone FBS (Thermo Fisher Scientific), ja stimuloitiin 1 2, 1 4 ja 1 10 laimennus Kasvainten medium (TCM) 4 viljellyistä eksplantaatista kudosten 4 tuntia ennen kuin lisättiin 1 ug /ml

Escherichia coli

(LPS; Alexis Biochemicals, Lausen, Sveitsi) määrittää paras annos TCM. Tämän jälkeen DC-soluja käsiteltiin 1: 2 laimentaminen TCM kaikkien 21 potilaan eksplantaatin kudosten 4 tuntia, ennen kuin lisättiin 1 ug /ml LPS: ää. Lisäksi DC-solut käsiteltiin 1: 2 laimentaminen NCM 5 potilaan eksplantaatin kudosten 4 tuntia, ennen kuin 1 ug /ml LPS: ää lisättiin. Erillisissä kokeissa 1 x 10

5 IDC /200 ui media käsiteltiin ihmisen rekombinantti 50 ng /ml CCL2 (MCP-1), 100 ng /ml CXCL1 (GROα), 100 ng /ml CXCL5 (ENA-78)